PL244350B1 - Sposób otrzymywania hialuronidazy ze zwierzęcych jąder oraz produkt otrzymany tym sposobem - Google Patents
Sposób otrzymywania hialuronidazy ze zwierzęcych jąder oraz produkt otrzymany tym sposobem Download PDFInfo
- Publication number
- PL244350B1 PL244350B1 PL435319A PL43531920A PL244350B1 PL 244350 B1 PL244350 B1 PL 244350B1 PL 435319 A PL435319 A PL 435319A PL 43531920 A PL43531920 A PL 43531920A PL 244350 B1 PL244350 B1 PL 244350B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- solution
- hyaluronidase
- obtaining
- kda
- mwco
- Prior art date
Links
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 title claims abstract description 57
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 54
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 claims description 19
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 15
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 14
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- -1 calcium cations Chemical class 0.000 claims description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 239000012465 retentate Substances 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 6
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 claims description 6
- 239000012466 permeate Substances 0.000 claims description 6
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 5
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 claims description 5
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 5
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 238000009938 salting Methods 0.000 claims description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 7
- 238000005185 salting out Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 abstract 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 abstract 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 229940043430 calcium compound Drugs 0.000 description 1
- 150000001674 calcium compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000004130 lipolysis Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 1
- 238000000694 mesotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 238000000275 quality assurance Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
- B01D61/145—Ultrafiltration
- B01D61/146—Ultrafiltration comprising multiple ultrafiltration steps
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2474—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
- B01D15/12—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the preparation of the feed
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/34—Size selective separation, e.g. size exclusion chromatography, gel filtration, permeation
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/362—Cation-exchange
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01035—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
- B01D2311/04—Specific process operations in the feed stream; Feed pretreatment
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
- B01D2311/06—Specific process operations in the permeate stream
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
- B01D2311/12—Addition of chemical agents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
- B01D2311/26—Further operations combined with membrane separation processes
- B01D2311/2623—Ion-Exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
- B01D2311/26—Further operations combined with membrane separation processes
- B01D2311/2676—Centrifugal separation
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
- B01D2311/26—Further operations combined with membrane separation processes
- B01D2311/2697—Chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania hialuronidazy zawierający kolejno etapy: rozdrobnienie tkanki, ekstrakcja, precypitacja balastów, filtracja, zatężanie I, inkubacja, ultrafiltracja I, zatężanie II, wysalanie balastów, wirowanie, chromatografia I sączenie żelowe, chromatografia II cieczowa jonowymienna, ultrafiltracja II, zatężanie III, filtracja wyjaławiająca i suszenie. Przedmiotem wynalazku jest również produkt otrzymany tym sposobem.
Description
Przedmiotowy wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania hialuronidazy ze zwierzęcych jąder oraz produktu otrzymanego tym sposobem. Wynalazek znajdzie zastosowanie w takich dziedzinach medycyny jak ortopedia, chirurgia, okulistyka, onkologia, dermatologia, czy ginekologia jak również w medycynie estetycznej i kosmetologii.
Hialuronidaza jest enzymem z grupy hydrolaz o ciężarze cząsteczkowym 70 kDa i punkcie izoelektrycznym pl = 5,2. Hialuronidaza jest bezpostaciowym, higroskopijnym proszkiem o barwie białej do żółtawej, łatwo rozpuszczalnym w wodzie i praktycznie nierozpuszczalnym w etanolu, acetonie i eterze. Hialuronidaza depolimeryzuje kwas hialuronowy - składnik tkanki łącznej, co umożliwia szybsze wchłanianie się substancji czynnych stosowanych miejscowo.
Istnieje bogaty i zróżnicowany stan techniki dotyczący sposób otrzymywania hialuronidazy. Dwa ugruntowane sposoby otrzymywania hialuronidazy to produkcja rekombinowanego białka w komórkach bakteryjnych (np. Hylenexo) i pozyskiwanie jej z ekstraktów tkanek zwierzęcych (np. Vitraseo i Amphadaseo). Sposoby otrzymywania hialuronidazy dostępne w stanie techniki wykazują jednak ograniczenia wpływające na ich efektywność (również finansową) i bezpieczeństwo produktu. Po pierwsze, rutynowo stosowane są łatwopalne rozpuszczalniki. Dla przykładu EP0005751 ujawniono wykorzystanie acetonu. Znawca dziedziny rozumie komplikacje i niebezpieczeństwa związane ze stosowaniem łatwopalnych rozpuszczalników, zwłaszcza na dużą skalę. Po drugie, w wielu sposobach otrzymywania hialuronidazy wykorzystuje się skomplikowaną i nieopłacalną w skali przemysłowej chromatografię powinowactwa, tak jak np. w CN104419689. W związku z tym niektóre metody, pomimo ich wysokiej wydajności, w praktyce mogą nie nadawać się do przemysłowego stosowania z uwagi na koszty i stopień skomplikowania.
Mając na uwadze powyższe ograniczenia dostępnego stanu techniki, niniejszy wynalazek ma na celu zaproponowanie sposobu otrzymywania hialuronidazy ze zwierzęcych jąder, w którym nie wykorzystuje się niebezpiecznych (np. łatwopalnych) substancji, czy który nie byłby niemożliwy do przeskalowania z uwagi na stopień skomplikowania i wymagania finansowo-sprzętowe stosowanych technik (w szczególności chromatografii powinowactwa), a równocześnie umożliwiałby otrzymanie stabilnego produktu o dostatecznej efektywności i bezpieczeństwie (spełniający wymagania farmakopealne).
Przedmiotem wynalazku w pierwszym aspekcie jest sposób otrzymywania hialuronidazy ze zwierzęcych jąder zawierający etapy, w których:
rozdrabnia się tkanki poprzez mielenie ekstrahuje się hialuronidazę w schłodzonym roztworze kwasu octowego filtruje się roztwór prowadzi się chromatografię cieczową jonowymienną ze złożem typu silny kationit wykonując po absorpcji eluację gradientem chlorku sodu przy czym sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że kolejno:
(a) rozdrabnia się tkanki poprzez mielenie (b) ekstrahuje się hialuronidazę w schłodzonym roztworze 0,1M kwasu octowego w pH 3,5 (c) precypituje się balasty poprzez strącanie białek fosforylowanych w obecności kationów wapnia (d) filtruje się tkankę poekstrakcyjną na separatorach sitowych o średnicy porów równej 1 mm, a następnie przetacza się odsączony ekstrakt do zbiornika z chłodzeniem i pozostawia na co najmniej 8 godzin do wypadnięcia białek balastowych, a roztwór klaruje się poprzez filtrację z wykorzystaniem worków ociekowych o średnicy porów równej 1 μm (e) zatęża się poprzez ultrafiltrację na filtrach rurowych o masie cząsteczkowej odcięcia (MWCO) równej 300 kDa (f) inkubuje się roztwór w obecności niejonowego detergentu i chlorku sodu o końcowym stężeniu 0,3M mieszając przez co najmniej 2 godziny (g) ultrafiltruje się roztwór z wykorzystaniem filtrów rurowych o MWCO równej 300 kDa, wykonując diafiltrację w systemie nieciągłym przemywające retentat 6-krotnie 5L objętością wody, gdzie hialuronidaza znajduje się w filtracie (h) zatęża się roztwór 4-krotnie z wykorzystaniem filtrów membranowych o MWCO równej 50 kDA (i) wysala się balasty poprzez wysalanie zatężonego roztworu siarczanem amonu w obecności alkoholu benzylowego (j) wiruje się roztwór w wirówce kubkowej przez co najmniej 30 minut z częstotliwością obrotów około 4800 obrotów/minutę, przekazując supernatant do dalszych etapów oczyszczania (k) sączy się żelowo roztwór przy użyciu złoża typu sito molekularne, gdzie fazę ruchomą stanowi woda oczyszczona (l) prowadzi się chromatografię cieczową jonowymienną ze złożem typu silny kationit wykonując po absorpcji eluację gradientem chlorku sodu w buforze octanowo amonowym (m) ultrafiltruje się roztwór z wykorzystaniem filtrów rurowych o MWCO równej 300 kDa z hialuronidazę w permeacie (n) zatęża się roztwór 4-krotnie z wykorzystaniem filtrów membranowych o MWCO 50 kDA (o) wyjaławia się roztwór filtrując go poprzez sterylny filtr 0,22 μm (p) suszy się roztwór poprzez liofilizację przez pierwsze 24 godziny przy temperaturze kondensora -45°C, temperaturze półki -28°C i ciśnieniu atmosferycznym, następnie obniża się ciśnienie do 0,05 mbar po osiągnięciu zadanego ciśnienia rozpoczyna się podnoszenie temperatury półek do 24°C przez 72 godziny, następnie obniża się ciśnienie do 0,001 mbar i kontynuuje proces przez kolejne 24 godziny.
Korzystnie zwierzęcymi jądrami są jądra bydlęce lub owcze.
Korzystnie w etapie (a) rozdrabnia się tkanki poprzez mielenie w elektrowilku.
Korzystnie w etapie (b) ekstrahuje się hialuronidazę w mieszalniku planetarnym poprzez mieszanie rozdrobionej tkanki ze schłodzonym roztworem 0,1M kwasu octowego w pH 3,5.
Korzystnie w etapie (c) precypituje się balasty poprzez strącanie białek fosforylowanych w obecności kationów wapnia dodając roztwór 5M CaCI2 do otrzymania stężenia 50 mM i dodania wodorotlenku sodu (2M roztwór) do uzyskania pH 7.
Korzystnie niejonowym detergentem, w którym inkubuje się roztwór w etapie (f), jest Tween 20.
Korzystnie w etapie (i) wysala się balasty do osiągnięcia stężenia siarczanu amonu co najmniej 190 g/L w obecności 0,1% alkoholu benzylowego.
Korzystnie w etapie (k) sitem molekularnym, na którym sączy się żelowo roztwór, jest poli([dekstran allilu]-ko-N,N’-metylenobisakryloamid) [Sephacryl].
Korzystnie sposób według wynalazku zawiera ponadto co najmniej jeden z etapów wybrany z grupy zawierającej kontrolę wewnątrzoperacyjną, wyjaławianie, sterylizację, kontrolę jakości, przy czym etapy te mogą się powtarzać i występować przed pierwszym etapem, w środku i na końcu sposobu otrzymywania.
Przedmiotem wynalazku w drugim aspekcie jest produkt otrzymany sposobem otrzymywania według wynalazku o aktywności specyficznej 1500 j/mg.
Niniejszy wynalazek posiada wiele korzyści. Po pierwsze, w sposobie otrzymywania hialuronidazy ze zwierzęcych jąder według wynalazku nie wykorzystuje się niebezpiecznych (np. łatwopalnych) substancji, czy skomplikowanych technologicznie i nieopłacalnych technik (takich jak np. chromatografia powinowactwa), a równocześnie uzyskuje się stabilny produkt przy zachowaniu dostatecznie wysokiej efektywności i bezpieczeństwa (spełnia standardy i wymagania farmakopealne). Dodatkowo, dzięki etapowi precypitacji balastów (etap c) udało się skrócić proces precypitacji i zwiększyć poziom czystości hialuronidazy, co przekłada się na lepszą rozpuszczalność gotowego produktu, a dzięki etapowi inkubacji z niejonowym detergentem (etap f) udało się w znaczący sposób poprawić rozpuszczalność gotowego preparatu w roztworach wodnych.
Sposób otrzymywania według wynalazku cechuje się dodatkowo uproszczeniem procesu m.in. pod względem zaawansowania technologicznego etapów, wykluczeniem nieopłacalnych technik i zmniejszeniem wymagań sprzętowych, zredukowaniem strat wody i pośrednio redukcją kosztów i zanieczyszczenia, wykluczeniem łatwopalnych substancji, co sumarycznie sprawia, że sposób według wynalazku jest konkurencyjny do metod charakteryzujących się większą wydajnością.
Hialuronidaza znajdzie zastosowanie w takich dziedzinach medycyny jak ortopedia, chirurgia, okulistyka, onkologia, dermatologia, czy ginekologia np. w zwiększeniu absorpcji leków parenteralnych, poprawie skuteczności znieczulenia miejscowego, zmniejszeniu uszkodzenia tkanek, czy zwiększeniu aktywności leków przeciwnowotworowych. Hialuronidaza znajdzie również swoje zastosowanie w medycynie estetycznej i kosmetologii w mezoterapii igłowej, lipolizie oraz usuwaniu nadmiaru kwasu hialuronowego.
PL 244350 Β1
Wynalazek zostanie bliżej przedstawiony w poniższych korzystnych niezawężających zakres wynalazku przykładach wykonania, z odniesieniem do załączonego rysunku, na którym:
Fig. 1 przedstawia schemat blokowy przykładu wykonania sposobu otrzymywania hialuronidazy ze zwierzęcych jąder według wynalazku
Fig. 2 przedstawia produkt otrzymany sposobem otrzymywania według wynalazku
Przykład
Jako surowiec wyjściowy do procesu wykorzystano jądra wołowe. Pobrano surowiec (180 kg) z mroźni i rozdrobniono mieląc na elektrowilku do pojemników polietylenowych. Następnie ręcznie załadowano surowiec do mieszalnika planetarnego i prowadzono ekstrakcję mieszając z 540 L 0,1M schłodzonego kwasu octowego w pH 3,5. Znawca dziedziny doceni szeroki wybór mieszalników, które mogą zastąpić mieszalnik planetarny.
Po godzinie pobrano próbki do badań (Tab. 1 „Przed precypitacją balastów”). Kolejno prowadzono precypitację balastów poprzez strącanie białek fosforylowanych w obecności kationów wapnia. Znawca doceni możliwość strącania białek fosforylowanych w obecności kationów wapnia poprzez dodanie różnych związków wapnia, jednak w sposobie otrzymywania według wynalazku dodano konkretnie roztwór 5M CaCŁ do otrzymania stężenia 50 mM i dodano 2M roztworu wodorotlenku sodu do uzyskania pH 7. Ten krok pozwolił na skrócenie procesu precypitacji balastów i zwiększenie poziomu czystości hialuronidazy, co z kolei przekłada się na lepszą rozpuszczalność gotowego produktu. Po tym, prowadzono separację fizycznie separując tkankę poekstrakcyjną przy użyciu separatorów sitowych o średnicy porów równej 1 mm. Przesącz skierowano na wirówkę talerzową. Znawca doceni, że mogą to być inne wirówki obrotowe, gdyż celem jest usunięcie drobnych fragmentów tkanki organicznej. Uzyskany supernatant umieszczono w mieszalniku z płaszczem chłodzącym i pozostawiono w temperaturze 8°C na około 12 godzin w celu wypadnięcia białek balastowych (bez mieszania). Następnie roztwór filtrowano poprzez dekantowanie klarownego roztworu znad osadu, zlanie mętniej pozostałości roztworu na zestaw worków ociekowych o wielkości porów równych 1 pm. Przesącz po workach przekazano do analizy (Tab. 1 „Po precypitacji balastów”).
Tab. 1 Wpływ precypitacji balastów na aktywność specyficzną i wydajność
| Powtó- rżenia | Przed precypitacją balastów | Po precypitacji balastów | Wzrost aktywn. spec. [%] | Wydajność [%] | ||||
| Stężenie białka [mg/ml] | Aktywn. j/ml] | Aktyw, spec. j/mg] | Stężenie białka [mg/ml] | Aktywn. j/ml] | Aktywn. spec. j/mg] | |||
| 1 | 9,57 | 399 | 41,7 | 5,04 | 354 | 70,2 | 68,3 | 88,7 |
| 2 | 9,82 | 415 | 42,2 | 5,15 | 375 | 72,8 | 72,5 | 90,4 |
| 3 | 9,03 | 370 | 40,9 | 4,88 | 339 | 69,5 | 69,9 | 91,6 |
| średnia | 9,47 | 394 | 41,6 | 5,02 | 356 | 70,8 | 70,2 | 90,2 |
Kolejno zatężono roztwór poprzez ultrafiltrację na filtrach rurowych polimerowych o MWCO 300 kDa. Proces prowadzono do uzyskania 10-krotnej redukcji objętości retentatu. Wyniki zatężania ekstraktu zawierającego hialuronidazę przedstawiono w Tab. 2. Na podstawie wyników można zaobserwować, że w przypadku filtracji (MWCO 300 kDa) roztworu hialuronidazy niezawierającego detergentu i chlorku sodu tylko mniej niż 10% hialuronidazy przechodzi do permeatu. Oznacza to, że znacząca większość zostaje po stronie retentatu. Sytuacja w przypadku białka kształtuje się odwrotnie większa część przechodzi do permeatu (filtratu). Uzyskuje się dzięki temu znaczący wzrost stopnia oczyszczenia z (65,3 j/mg na 321 j/mg).
PL 244350 Β1
Tab. 2 Wpływ zatężania ekstraktu (bez detergentu i NaCI) na aktywność, aktywność specyficzną hialuronidazy
| przed inkubacją | Obj. [L] | Stężenie białka [mg/ml] | Aktywn. j/ml] | Aktywn. spec, j/mg] | Ilość białka [g] | Ilość hialuronidazy |
| r-r przed zatężaniem | 600 | 5,02 | 327 | 65,3 | 3012 | 196M |
| retentat 300 kDa | 50 | 10,7 | 3458,5 | 321 | 535 | 173M |
| filtrat 300 kDa | 550 | 4,2 | 25,5 | 6,1 | 2 310 | 14 M |
Filtrat przekazano do utylizacji, a retentat inkubowano w obecności niejonowego detergentu i chlorku sodu w celu usunięcia fragmentów błony komórkowej. W tym przykładzie wykonania do skoncentrowanego roztworu hialuronidazy (około SOL) dodano 25 ml niejonowego detergentu w formie 0,05% roztworu Tween 20 i 1 kg chlorku sodu o końcowym stężeniu 0,3M i cały czas mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Dzięki temu etapowi możliwe jest oddzielenie hialuronidazy od fragmentów błon komórkowych, co umożliwia jej przejście do permeatu w czasie filtracji. W efekcie usunięcia fragmentów błony w znaczący sposób poprawia się rozpuszczalność gotowego preparatu w roztworach wodnych. Znawca dziedziny doceni szeroki wybór niejonowych detergentów. Po czym, roztwór hialuronidazy z detergentem i chlorkiem sodu filtrowano wykorzystując filtry rurowe polimerowe o MWCO 300 kDa wykonując diafiltrację w systemie nieciągłym sześciokrotnie przemywając retentat 5 L wody oczyszczonej. Hialuronidaza znajdowała się w filtracie. Wynik ultrafiltracji roztworu hialuronidazy po inkubacji z detergentem i chlorkiem sodu przedstawiono w Tab. 3 Na podstawie analizy wyników stwierdzono, że dodatek detergentu i chlorku sodu umożliwił przejście hialuronidazy do permeatu, zwiększając jej stopień oczyszczenia oraz poprawiając jej rozpuszczalność.
Tab. 3 Wpływ ultrafiltracji roztworu hialuronidazy po inkubacji z detergentem i chlorkiem sodu
| PO inkubacji | Obj. [L] | Stężenie białka [mg/ml] | Aktywn. j/ml] | Aktywn. spec, j/mg] | Ilość białka [g] | Ilość hialuronidazy |
| r-r po inkubacji | 50 | 10,7 | 3458,5 | 321 | 535 | 173M |
| retentat 300kDa | 5 | 20 | 989 | 49,1 | 100 | 11M |
| filtrat 300kdA | 75 | 5,27 | 2080 | 395 | 395 | 156M |
Następnie prowadzono zatężanie na filtrach polimerowych o MWCO 50 kDa. Roztwór zatężono 4-krotnie. Proces zakończono po uzyskaniu objętości 20 L. Następnie prowadzono etap wysalania związków balastowych z retentatu poprzez wysalanie zatężonego roztworu siarczanem amonu do stężenia 190 g/L siarczanu amonu w obecności 0,1% alkoholu benzylowego. Po tym roztwór wirowano na wirówce kubkowej przez 30 minut z częstotliwością obrotu 4800 obrotów/minutę, osad odrzucając. Uzyskany supernatant oczyszczono poprzez sączenie żelowe przy użyciu złoża typu sito molekularne. W niniejszym sposobie otrzymywania użyto Sephacryl gdzie fazę ruchomą stanowi woda oczyszczona, ale znawca dziedziny doceni szeroki wybór złóż typu sito molekularne. Frakcje zawierające hialuronidazę adsorbowano na kolumnie chromatograficznej cieczowej jonowymiennej ze złożem typu silny kationit. Po absorpcji wykonano eluację gradientem chlorku sodu w buforze octanowo amonowym. Frakcję zawierające hialuronidazę oczyszczano poprzez ultrafiltrację na filtrach rurowych (MWCO 300 kDa). Następnie filtrat zatężono na filtrach membranowych (MWCO 50 kDa). Kolejno, aby zapewnić bezpieczeństwo produktu prowadzono filtrację wyjaławiającą filtrując roztwór z wykorzystaniem sterylnego filtra 0,22 μm. Tak przygotowany roztwór hialuronidazy poddano procesowi liofilizacji. Przez pierwsze 24 godziny przy temperaturze kondensora -45°C, temperaturze półki -28°C i ciśnieniu atmosferycznym. Następnie zmniejszono ciśnienie do 0,05 mbar i po osiągnięciu zadanego ciśnienia podnoszono temperaturę półek do 24°C przez kolejne 72 h godziny. Następnie obniżono ciśnienie do 0,001 mbar i kontynuowano proces przez 24 h.
Znawca rozumie potrzebę zapewniania lub kontroli jakości i wedle potrzeby zmodyfikuje powyższy sposób otrzymywania hialuronidazy dodając jeden albo więcej etapów wymaganych lub wskazanych lokalnymi lub międzynarodowymi wytycznymi lub regulacjami prawnymi. W szczególności mogą to być jeden albo większa liczba etapów kontroli wewnątrzoperacyjnej, jeden albo więcej etapów wyjaławiania lub sterylizacji, jeden albo większa liczba etapów kontroli jakości. Etapy te mogą występować na wszystkich etapach sposobu otrzymywania hialuronidazy według wynalazku, również przed pierwszym etapem i po ostatnim etapie. Dodatkowe etapy mogą również po sobie następować.
Surowcem wyjściowym, oprócz jąder bydlęcych mogą być również jądra owcze. Twórca pomyślnie otrzymał hialuronidazę z jąder owczych używając powyżej opisanego sposobu otrzymywania według wynalazku, ale z uwagi na klarowność jak i wydajność powyżej przedstawiono sposób otrzymywania według wynalazku na przykładzie wykonania wykorzystującym jądra wołowe. Określenie jądra wołowe oznacza w szczególności jądra bycze, które zostały wykorzystane w niniejszym przykładzie wykonania, ale nie zawęża zakresu wynalazku co do wieku ani innych przedstawicieli bydła i dzikiej rogacizny. Tak samo z jądrami owczymi. Określenie jądra wołowe lub owcze oznacza również w szczególności mieszanki jąder powyższych.
Powyższy sposób otrzymywania pozwala na uzyskanie hialuronidazy o aktywności specyficznej około 1500 j/mg.
Claims (10)
1. Sposób otrzymywania hialuronidazy ze zwierzęcych jąder zawierający etapy, w których: rozdrabnia się tkanki poprzez mielenie ekstrahuje się hialuronidazę w schłodzonym roztworze kwasu octowego filtruje się roztwór prowadzi się chromatografię cieczową jonowymienną ze złożem typu silny kationit wykonując po absorpcji eluację gradientem chlorku sodu znamienny tym, że kolejno:
(a) rozdrabnia się tkanki poprzez mielenie (b) ekstrahuje się hialuronidazę w schłodzonym roztworze 0,1M kwasu octowego w pH 3,5 (c) precypituje się balasty poprzez strącanie białek fosforylowanych w obecności kationów wapnia (d) filtruje się tkankę poekstrakcyjną na separatorach sitowych o średnicy porów równej 1 mm, a następnie przetacza się odsączony ekstrakt do zbiornika z chłodzeniem i pozostawia na co najmniej 8 godzin do wypadnięcia białek balastowych, a roztwór klaruje się poprzez filtrację z wykorzystaniem worków ociekowych o średnicy porów równej 1 μm (e) zatęża się poprzez ultrafiltrację na filtrach rurowych o masie cząsteczkowej odcięcia (MWCO) równej 300 kDa (f) inkubuje się roztwór w obecności niejonowego detergentu i chlorku sodu o końcowym stężeniu 0,3M mieszając przez co najmniej 2 godziny (g) ultrafiltruje się roztwór z wykorzystaniem filtrów rurowych o MWCO równej 300 kDa, wykonując diafiltrację w systemie nieciągłym przemywające retentat 6-krotnie 5L objętością wody, gdzie hialuronidaza znajduje się w filtracie (h) zatęża się roztwór 4-krotnie z wykorzystaniem filtrów membranowych o MWCO równej 50 kDA (i) wysala się balasty poprzez wysalanie zatężonego roztworu siarczanem amonu w obecności alkoholu benzylowego (j) wiruje się roztwór w wirówce kubkowej przez co najmniej 30 minut z częstotliwością obrotów około 4800 obrotów/minutę, przekazując supernatant do dalszych etapów oczyszczania (k) sączy się żelowo roztwór przy użyciu złoża typu sito molekularne, gdzie fazę ruchomą stanowi woda oczyszczona (l) prowadzi się chromatografię cieczową jonowymienną ze złożem typu silny kationit wykonując po absorpcji eluację gradientem chlorku sodu w buforze octanowo-amonowym (m) ultrafiltruje się roztwór z wykorzystaniem filtrów rurowych o MWCO równej 300 kDa z hialuronidazą w permeacie (n) zatęża się roztwór 4-krotnie z wykorzystaniem filtrów membranowych o MWCO równej 50 kDA (o) wyjaławia się roztwór filtrując go poprzez sterylny filtr 0,22 μm (p) suszy się roztwór poprzez liofilizację przez pierwsze 24 godziny przy temperaturze kondensora -45°C, temperaturze półki -28°C i ciśnieniu atmosferycznym, następnie obniża się ciśnienie do 0,05 mbar po osiągnięciu zadanego ciśnienia rozpoczyna się podnoszenie temperatury półek do 24°C przez 72 godziny, następnie obniża się ciśnienie do 0,001 mbar i kontynuuje proces przez kolejne 24 godziny.
2. Sposób otrzymywania hialuronidazy według zastrz. 1, znamienny tym, że zwierzęcymi jądrami są bydlęce lub owcze jądra.
3. Sposób otrzymywania hialuronidazy według któregokolwiek z zastrz. 1-2, znamienny tym, że w etapie (a) rozdrabnia się tkanki poprzez mielenie w elektrowilku.
4. Sposób otrzymywania hialuronidazy według któregokolwiek z zastrz. 1-3, znamienny tym, że w etapie (b) ekstrahuje się hialuronidazę w mieszalniku planetarnym poprzez mieszanie rozdrobionej tkanki ze schłodzonym roztworem 0,1M kwasu octowego w pH 3,5.
5. Sposób otrzymywania hialuronidazy według któregokolwiek z zastrz. 1-4, znamienny tym, że w etapie c) precypituje się balasty poprzez strącanie białek fosforylowanych w obecności kationów wapnia dodając roztwór 5M CaCl2 do otrzymania stężenia 50 mM i dodania wodorotlenku sodu (2M roztwór) do uzyskania pH 7.
6. Sposób otrzymywania hialuronidazy według któregokolwiek z zastrz. 1-5, znamienny tym, że niejonowym detergentem, w którym inkubuje się roztwór w etapie (f), jest Tween 20.
7. Sposób otrzymywania hialuronidazy według któregokolwiek z zastrz. 1-6, znamienny tym, że w etapie (i) wysala się balasty do osiągnięcia stężenia siarczanu amonu co najmniej 190 g/L w obecności 0,1% alkoholu benzylowego.
8. Sposób otrzymywania hialuronidazy według któregokolwiek z zastrz. 1-7, znamienny tym, że w etapie (k) sitem molekularnym, na którym sączy się żelowo roztwór, jest poli([dek stran allilu]-ko-N,N’-metylenobisakryloamid).
9. Sposób otrzymywania hialuronidazy według któregokolwiek z zastrz. 1-8, znamienny tym, że zawiera ponadto co najmniej jeden z etapów wybrany z grupy zawierającej kontrolę wewnątrzoperacyjną, wyjaławianie, sterylizację, kontrolę jakości, przy czym etapy te mogą się powtarzać i występować przed pierwszym etapem, w środku i na końcu sposobu otrzymywania.
10. Produkt otrzymany sposobem otrzymywania opisanym, w którymkolwiek z zastrz. 1-9, o aktywności specyficznej 1500 j/mg.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL435319A PL244350B1 (pl) | 2020-09-15 | 2020-09-15 | Sposób otrzymywania hialuronidazy ze zwierzęcych jąder oraz produkt otrzymany tym sposobem |
| PCT/PL2021/050066 WO2022060235A1 (en) | 2020-09-15 | 2021-09-14 | Method of obtaining hyaluronidase from bovine testes |
| EP21810152.5A EP4240838A1 (en) | 2020-09-15 | 2021-09-14 | Method of obtaining hyaluronidase from bovine testes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL435319A PL244350B1 (pl) | 2020-09-15 | 2020-09-15 | Sposób otrzymywania hialuronidazy ze zwierzęcych jąder oraz produkt otrzymany tym sposobem |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL435319A1 PL435319A1 (pl) | 2022-03-21 |
| PL244350B1 true PL244350B1 (pl) | 2024-01-15 |
Family
ID=78650030
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL435319A PL244350B1 (pl) | 2020-09-15 | 2020-09-15 | Sposób otrzymywania hialuronidazy ze zwierzęcych jąder oraz produkt otrzymany tym sposobem |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4240838A1 (pl) |
| PL (1) | PL244350B1 (pl) |
| WO (1) | WO2022060235A1 (pl) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102528707B1 (ko) * | 2022-11-01 | 2023-05-04 | 한국코러스 주식회사 | 고순도의 히알루로니다제 정제 방법 |
| CN117723682B (zh) * | 2023-11-20 | 2024-06-11 | 山东丰金美业科技有限公司 | 一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2027759C1 (ru) * | 1992-02-03 | 1995-01-27 | Пак Владимир Николаевич | Способ получения гиалуронидазы |
-
2020
- 2020-09-15 PL PL435319A patent/PL244350B1/pl unknown
-
2021
- 2021-09-14 WO PCT/PL2021/050066 patent/WO2022060235A1/en unknown
- 2021-09-14 EP EP21810152.5A patent/EP4240838A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4240838A1 (en) | 2023-09-13 |
| WO2022060235A1 (en) | 2022-03-24 |
| PL435319A1 (pl) | 2022-03-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4108849A (en) | Process for extracting and processing glycoproteins, mucopolysaccharides and accompanying substances | |
| KR910009342B1 (ko) | 생물학적 활성 추출물의 제조방법 | |
| PL244350B1 (pl) | Sposób otrzymywania hialuronidazy ze zwierzęcych jąder oraz produkt otrzymany tym sposobem | |
| CN100431599C (zh) | 脑蛋白水解物及其冻干制剂的生产方法 | |
| US20070166798A1 (en) | Isolating chondroitin sulfate | |
| KR20190028633A (ko) | 일종 흡수율이 96%에 달하는 나노급 콜라겐 정제 방법 | |
| CN1228082C (zh) | 脑蛋白水解物制剂的制备方法 | |
| KR101916759B1 (ko) | 고농도, 고순도의 동종 콜라겐 제조 방법 및 동종 콜라겐 지지체의 제조방법 | |
| CN101333245B (zh) | 一种人血白蛋白的分离方法 | |
| JPS5837001A (ja) | ヒアルロン酸の製造法 | |
| JP5100980B2 (ja) | 化学物質の精製方法 | |
| KR100703947B1 (ko) | 콜라겐의 제조방법 | |
| JPS62502833A (ja) | ヒアルロン酸の製法 | |
| KR102155509B1 (ko) | 이취가 제거된 고수율 콜라겐의 제조 방법 | |
| WO2022035334A2 (en) | Method of obtaining aprotinin and product obtained thereby | |
| RU2657499C1 (ru) | Способ получения меланина из лузги подсолнечника | |
| RU2305548C1 (ru) | Способ комплексной переработки плоских морских ежей | |
| KR100577075B1 (ko) | 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염을 이용한 히아루론산정제방법 | |
| RU2189990C1 (ru) | Способ получения высокоочищенного агара и агарозы из красной водоросли анфельции тобучинской | |
| RU2765951C1 (ru) | Способ очистки гиалуроната от эндотоксинов | |
| KR102531611B1 (ko) | 고순도 dna 단편 혼합물의 제조 방법 | |
| RU2671537C2 (ru) | Препарат гиалуронидазы и способ его получения | |
| KR102622003B1 (ko) | 어류 생식세포 유래 dna 단편 중합체의 제조 방법 | |
| NL8001693A (nl) | Werkwijze voor de bereiding van orgaanextracten met een groot heparinegehalte. | |
| CN107595924A (zh) | 一种骨瓜提取物注射液制备方法及相应的药物组合物 |