KR102622003B1 - 어류 생식세포 유래 dna 단편 중합체의 제조 방법 - Google Patents

어류 생식세포 유래 dna 단편 중합체의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 어류의 생식세포로부터 DNA 단편 중합체(PDRN, PN)을 고순도로 제조하는 방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 특정 온도 범위에서 어류 생식세포 용해, 분자저감공정을 통해 단편화된 DNA 중합체에 활성탄, 감마 알루미나, 셀라이트를 첨가하여 단백질, 엔도톡신, 금속이온 등 불순물을 제거하여 고순도 DNA 단편 중합체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명 특유의 방법은 산업적인 대규모 공정에 적용가능하며, 의료기기, 의약품 품질관리 가이드라인에 제시된 불순물(단백질, 엔도톡신 등)을 허용 기준보다 현저히 낮은 수준으로 제거할 뿐만 아니라, 금속이온 등 추가의 유해물질까지도 제거하여, 인체에 완전 무해한(세포 독성이 없는) DNA 단편 중합체 정제물을 제공하는 효과가 현저하다.

Description

어류 생식세포 유래 DNA 단편 중합체의 제조 방법{Manufacturing method of DNA fragment polymer derived from fish germ cells}
본 발명은 어류의 생식세포로부터 DNA 단편 중합체(혼합물)을 고순도로 제조하는 방법에 관한 것이다.
DNA는 세포의 유전정보를 암호화하는 생체고분자로 모든 생명체에 널리 존재하며 4종의 염기(A, 아데닌; G, 구아닌; C, 시토신, T, 티민), 오탄당, 인산으로 구성된 뉴클레오티드 중합체이다. DNA는 세포의 필수 구성성분으로 유전 정보의 저장을 위한 물질로 인식되어 왔으나, 최근에 연구를 통해 그 자체가 기능성 소재로서 상처 부위의 치료 및 조직 재생, 미백, 주름 개선, 아토피 개선 등의 효능이 알려짐에 따라 의약품, 의료기기 등의 소재로 사용되고 있다. DNA 단편 중합체는 분자량의 크기에 따라 폴리데옥시리보뉴클레오티드(Polydeoxyribonucleotide, PDRN)와 폴리뉴클레오티드(Polynucleotide, PN)으로 구분된다.
초기에 PDRN은 사람의 태반에서 추출되어 조직재생 및 항염증 효과를 나타내는 것으로 확인되어 의약품 원료로 사용되고 있다. 사람의 태반으로부터 추출된 PDRN은 함유량 문제, 윤리적 문제 및 생산성 문제 등의 여러가지 어려움이 있는 실정이기 때문에, 현재 PDRN을 양적으로 많이 함유하고 있는 연어과(연어, 송어) 또는 철갑상어의 생식세포(생식기관)으로부터 추출하고 있다.
PN의 경우도 PDRN과 마찬가지로 연어, 송어, 철갑상어와 같은 어류의 생식세포(생식기관)으로부터 추출되고 있다. 앞서 언급한 PDRN과 PN은 DNA 단편 중합체이며, PN이 PDRN 보다 분자량의 크기가 크고, 두 물질 모두 인체 사용 시 부작용이 없는 것으로 보고되고 있다.
종래 동물 및 식물로부터 DNA를 추출하는 방법은, 계면활성제를 사용하는 화학적 방법, 단백질 분해효소(Proteinase) K를 사용한 효소적인 방법, 그리고 냉해동, 분쇄, 고압에 의한 기계적인 방법 등이 혼용되어 사용되고 있다. 세포 파쇄 후 용액상에 존재하는 DNA 혼합물로부터 계면활성제나, PCI(Phenol: Chloroform: Isoamyalcohol=25:24:1) 유기용매로 단백질, 지방, 지질 등의 불순물을 제거하는 방법이 알려졌으며, 이는 DNA 수용액과 PCI 유기용매 간의 층분리를 통하여 순도를 높이는 정제 방법을 사용하고 있다. 그러나, 이와 같은 방법은 금속 이온을 제거할 수 없는 문제점이 있는 실정이다. 또한 PCI 유기용매를 이용한 정제법에 사용되는 페놀(Phenol), 클로로포름(Chloroform)은 유독물질로 분류되는데, 제거 단계에서 이들 용매의 유출 가능성이 높고 휘발성이 높아 작업장의 오염이 수반되어 작업자의 건강에 유해한 영향을 줄 수 있다. 그래서 PCI 유기용매 정제법은 소규모 정제에 제한되어 사용되고 있다(Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001).
한국공개특허 제10-2021-0157629호에는 연어과 어류의 정소 또는 정액으로부터 PCI 유기용매를 사용하여 고순도 DNA 단편 혼합물을 정제하는 방법에 관하여 개시하고 있으나, 전술한 바와 같이 PCI 유기용매는 단백질, 지방, 지질 등의 불순물을 제거할 수 있으나, 금속 불순물을 제거할 수 없다. 또한 유기용매로 인해 작업 공간의 오염 문제가 있고, 용매의 높은 휘발성으로 인해 공기 중에 흩어진 후 호흡기에 노출되는 경우 작업자의 인체에 치명적인 영향을 줄 수 있다. 따라서 이러한 방법은 소규모 생산 및 분석 분야에만 적용될 수 있으며, 산업적 대량생산에 적용하는데 한계가 있다.
한국등록특허 제10-1839061호는 초음파 파쇄를 이용한 분자량이 저감된 폴리데옥시리보뉴클레오티드 제조 및 확인하는 방법만을 언급하고 있을 뿐, 불순물 제거를 위한 정제공정이나 제조산물의 순도를 높이기 위한 정제공정에 관해서는 기술되어 있지 않다. 초음파는 세포 파쇄 및 분자량 저감에 적용될 뿐 수용액상의 불순물을 제거할 수 없다.
한국등록특허 제10-0986603호에는 DNA 중합체 단편 혼합체의 제조공정에 주요하게 효소분해 방법을 사용하고 있는데, 공정에서 pH와 온도 조건만 기술되어 있을 뿐, 파쇄된 세포 내에서 수액상으로 방출된 단백질, 지질, 엔도톡신, 중금속 등의 불순물 제거에 관한 정제공정은 언급되어 있지 않다. 그리고, 초산을 가하여 100~109℃의 온도에서 수행하는 멸균공정은 낮은 pH와 Tm값 이상의 온도는 DNA 안정성에 영향을 줄 수 있어 바람직하지 않다.
또한 각 공정에서 산, 염기, pH 조절 및 온도 조절을 복합적으로 적용할 시 각각 공정단계를 제어하는데 어려움이 있으며, 이 또한 불순물을 제거할 수 없다.
이처럼 기존에 알려진 방법들은, 공정이 지나치게 많으며 복잡하고, 유기용매 등으로 인한 환경문제가 있을 뿐만 아니라, 또한 높은 설비 투자 비용에 비해 수율이 낮아 산업적으로 부적당한 문제가 있는 실정이다. 이에 유독물질을 사용하지 않고, 공정단계의 제어가 용이하며, 대량생산 공정으로 적합하면서도, 고순도의 DNA 단편 중합체를 얻을 수 있는 방법의 필요성이 대두되었다.
한국 공개특허공보 제10-2021-0157629호 (2021.12.29) 한국 등록특허공보 제10-1839061호 (2018.03.19) 한국 등록특허공보 제10-0986603호 (2010.10.08)
Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001.
이에 본 발명자들은, 유독물질을 사용하지 않고, 공정단계의 제어가 용이하며, 대량생산 공정으로 적합하면서도, 고순도의 DNA 단편 중합체를 얻을 수 있는 방법에 관해 연구하던 중,
본원 발명에서 제공하는 특유의 방법이, 산업적인 대규모 공정에 적합하면서도, 의료기기, 의약품 품질관리 가이드라인에 제시된 불순물 허용 기준보다 현저히 낮은 수준으로 불순물을 제거할 뿐만 아니라, 금속이온 등 추가의 유해물질까지도 제거하여, 인체에 완전 무해한(세포 독성이 없는) DNA 단편 중합체 정제물을 제공하는 효과가 현저한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은,
(a) 어류의 생식세포를 분쇄하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 생식세포 분쇄액에 염화나트륨 및 라우릴황산나트륨을 첨가하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 염화나트륨 및 라우릴황산나트륨이 첨가된 분쇄액을 분자저감하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 분자저감된 용액을 원심분리하여 상등액과 찌꺼기를 분리하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 얻어진 상등액에 흡착제를 투입하여 불순물을 제거하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 얻어진 불순물이 제거된 용액에 킬레이트제를 혼합하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 어류 생식세포로부터 DNA 단편 중합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 어류의 생식세포를 분쇄하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 생식세포 분쇄액에 염화나트륨 및 라우릴황산나트륨을 첨가하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 염화나트륨 및 라우릴황산나트륨이 첨가된 분쇄액을 분자저감하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 분자저감된 용액을 원심분리하여 상등액과 찌꺼기를 분리하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 얻어진 상등액에 흡착제를 투입하여 불순물을 제거하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 얻어진 불순물이 제거된 용액에 킬레이트제를 혼합하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 어류 생식세포로부터 DNA 단편 중합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 어류는, 연어, 송어, 철갑상어, 청어, 명태, 및 대구로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 (a) 단계는, 상기 어류의 생식세포가 냉동 상태인 경우 분쇄 전에 이를 해동하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 (b) 단계는, 염화나트륨을 2 내지 5 M 농도로 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 (c) 단계의 분자저감은, 85 내지 95℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, (c) 단계의 분자저감은, 4 내지 12시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 (e) 단계는, 흡착제로서, 활성탄, 감마 알루미나 및 셀라이트를 사용하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 흡착제는
활성탄 0.1 내지 3%(w/v);
감마 알루미나 0.5 내지 2.0%(w/v); 및
셀라이트 1.0 내지 10%(w/v)로 사용되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 활성탄은 입자크기가 1 내지 150μm인 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 (f) 단계는, 킬레이트제를 처리하여 금속 이온을 제거하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 킬레이트제는 EDTA, EGTA, DTPA 및 HEDTA로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 (f) 단계는, EDTA가 0.5 내지 5 mM로 혼합되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 본 발명의 어류 생식세포로부터 DNA 단편 중합체를 제조하는 방법은, 하기 (g) 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
(g) 상기 (f) 단계에서 얻어진 혼합액으로부터 DNA 단편 중합체 침전물을 수득 및 세척하는 단계.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 침전물의 수득은, 상기 (f) 단계에서 얻어진 혼합액에 알코올을 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 알코올은, 에탄올, 이소프로필알코올 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 본 발명의 어류 생식세포로부터 DNA 단편 중합체를 제조하는 방법은, 하기 (h) 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
(h) 상기 (g) 단계에서 얻어진 침전물을 탈수 및 건조하는 단계.
본 발명은 어류 생식세포(특히, 정자 관련)로부터 DNA 단편 중합체(PDRN, PN)를 고순도로 정제 및 수득하는 방법에 관한 것으로, 산업적인 대규모 공정에 적용가능하며, 의료기기, 의약품 품질관리 가이드라인에 제시된 불순물(단백질, 엔도톡신 등)을 허용 기준보다 현저히 낮은 수준으로 제거할 뿐만 아니라, 금속이온 등 추가의 유해물질까지도 제거하여, 인체에 완전 무해한(세포 독성이 없는) DNA 단편 중합체 정제물을 제공하는 효과가 현저하다.
도 1은 본 발명의 제조 방법으로 수득한 DNA 단편 중합체(PDRN, PN)의 전기영동결과이다.
도 2a는 본 발명의 제조 방법으로 수득한 DNA 단편 중합체 중 PDRN의 FT-IR 흡수스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명의 제조 방법으로 수득한 DNA 단편 중합체 중 PN의 FT-IR 흡수스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명의 제조 방법으로 수득한 DNA 단편 중합체 중 PDRN의 세포 독성 및 성장 효과를 확인한 결과이다.
도 3b는 본 발명의 제조 방법으로 수득한 DNA 단편 중합체 중 PN의 세포 독성 및 성장 효과를 확인한 결과이다.
본 발명자들은 어류의 생식세포로부터 DNA 분리 시 세포 용해 후 DNA 이외에 수용액상에 존재하는 단백질, 지질, 엔도톡신, 금속이온 등의 불순물을 제거함과 동시에 산업적 생산이 가능한 DNA 단편 중합체 제조 방법을 개발하기 위해 온도 조절을 통해 세포 파쇄 및 분자저감, 단백질 및 엔도톡신 등 불순물 제거 공정, 금속이온 제거 공정, 침전 및 건조공정을 포함하는 본 발명 특유의 고순도의 DNA 단편 중합체의 제조 방법을 연구하였고, 이후 산업 현장에 적용한 결과 대량생산이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은,
(a) 어류의 생식세포를 분쇄하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 생식세포 분쇄액에 염화나트륨 및 라우릴황산나트륨을 첨가하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 염화나트륨 및 라우릴황산나트륨이 첨가된 분쇄액을 분자저감하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 분자저감된 용액을 원심분리하여 상등액과 찌꺼기를 분리하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 얻어진 상등액에 흡착제를 투입하여 불순물을 제거하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 얻어진 불순물이 제거된 용액에 킬레이트제를 혼합하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 어류 생식세포로부터 DNA 단편 중합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 어류는 당업계에 공지된 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 일례로 연어, 송어, 철갑상어, 청어, 명태, 및 대구로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 어류의 생식세포는 당업계 공지된 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 어류의 정소일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 (a) 단계는, 상기 어류의 생식세포가 냉동 상태인 경우 분쇄 전에 이를 해동하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 해동은 실온에서 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 (b) 단계의 염화나트륨(Sodium chloride)은 'Salting-out(염석)'이라는 과정을 통해 단백질을 제거할 수 있다. 일정 이상 농도의 염화나트륨이 수용액 상에 존재하면 수층에 존재하는 단백질의 용해도가 감소하여 침전물을 형성한다. 염화나트륨의 양이 적으면 제거 효율이 떨어지므로, 본원 발명에서 단백질의 제거에 사용하는 염화나트륨의 농도는 2 내지 5M이 바람직하고 이보다 작으면 제거 효율이 낮아지며, 높으면 과포화된 염화나트륨으로 인해 공정 효율이 떨어지게 된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 (b) 단계의 라우릴황산나트륨(Sodium lauryl sulfate)은, 세포 내 존재하는 DNA가 수용액상으로 방출되도록 세포를 용해하며, DNA에 결합되어 있는 단백질이 분리되도록 한다. 앞에서 언급한 바와 같이 라우릴황산나트륨은 세포 용해를 위해 사용되는데, 정소의 양이 많으면 라우릴황산나트륨이 세포를 완전히 용해하지 못해 수용액상으로 방출되는 DNA양이 적으므로 인해 수율이 낮아지게 된다. 이와 반대의 경우 수율을 높일 수 있지만, 과도하게 투입된 라우릴황산트륨의 제거를 위해 추가적으로 발생하는 공정으로 작업 시간이 길어지는 단점이 있다. 따라서, 본 발명에서 라우릴황산나트륨의 최적 첨가 범위를 확인한 결과 0.2%(w/v) 내지 0.5%(w/v)가 최적임을 확인하였다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 (c) 단계의 분자저감은, 85 내지 95 ℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 (c) 단계의 분자저감은, 4 내지 12 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 더욱 구체적인 일 실시양태에서, 상기 (c) 단계의 분자저감은, 상기 (b) 단계에서 얻어진 염화나트륨 및 라우릴황산나트륨이 첨가된 분쇄액을 85 내지 95℃의 온도에서 4 내지 12시간 동안 열을 가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 (e) 단계는 흡착제로서, 활성탄, 감마 알루미나 및 셀라이트 3종을 이용하는 것을 특징으로 한다. 이들 3종 물질을 사용함으로써 불순물(단백질, 엔도톡신 등) 제거에 있어 시너지 효과(상승 효과)가 나타나는 것이 본원 발명의 특징이다.
DNA 단편 중합체의 순도를 높이기 위해 활성탄을 처리한다. 활성탄은 흡착 효과가 큰 탄소 입자로서 단백질, 지질, 엔도톡신, 냄새 등을 제거할 수 있다. 활성탄은 입자 모양에 따라 분말과 입상으로 구분된다. 분말활성탄은 흡착이 수 분에서 수 시간 내에 이루어진다. 반면, 입상활성탄은 흡착 속도가 수 시간에서 수일까지 소요됨으로 공정 시간이 길어지는 단점이 있다. 수율 또한 분말활성탄보다 낮다. 따라서 활성탄은 분말 형태를 사용하는 것이 바람직하며, 활성탄 입자의 크기(직경)는 1 내지 150μm가 바람직하며, 4 내지 100μm를 사용하는 것이 보다 바람직하다. 활성탄의 처리량이 많을 경우 불순물의 제거에는 효과적이나 DNA 단편 중합체가 흡착되어 수율이 낮아지는 문제가 있고, 이로 인해 발생하는 잔류 활성탄의 색이 후속 공정에서 효율적으로 제거되지 않는다. 활성탄의 양이 적을 경우 활성탄의 색은 쉽게 제거될 수 있으나, 불순물은 효과적으로 제거될 수 없다. 활성탄의 양은 바람직하게 0.1 내지 3%(w/v), 더 바람직하게 0.5 내지 2%(w/v)를 불순물 제거에 사용할 수 있다.
감마 알루미나는 표면에 많은 기공이 있는 다공성 물질로 단백질, 엔도톡신과 같은 물질을 제거하는데 사용할 수 있다. 감마 알루미나를 첨가할 경우 활성탄으로 처리되지 않은 잔류 단백질과 엔도톡신을 효과적으로 제거할 수 있다. 감마 알루미나의 처리량은 0.5 내지 2.0%(w/v)가 바람직하다.
셀라이트는 규산을 주성분으로 하는 다공성의 입자로 여과보조제 또는 흡착제로 사용된다. 분자저감된 용액에 활성탄과 동시에 처리할 경우 활성탄 잔량이 걸러지는 효율과 단백질 제거 효율을 높여준다. 사용되는 셀라이트의 양이 적으면 잔류 활성탄의 제거 효율이 떨어지고, 사용되는 셀라이트의 양이 커지면 잔류 활성탄의 제거 효율은 높아지나 DNA 단편 중합체의 수율이 낮아진다. 따라서 바람직하게 1.0 내지 10%(w/v), 더 바람직하게는 4 내지 6%(w/v)의 셀라이트를 사용할 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따라 원심분리를 통해 찌꺼기를 제거한 다음 바람직하게는 활성탄과 감마 알루미나를 첨가하여 불순물을 흡착시키고 이후 셀라이트를 넣는 순서로 수행할 경우, 또는 활성탄, 셀라이트, 감마 알루미나 순서로 바꾸어 수행할 경우에도 고순도의 DNA 단편 중합체를 정제할 수 있다.
따라서 본 발명의 바람직한 일 실시양태에서, 상기 흡착제는 활성탄 0.1 내지 3%(w/v); 감마 알루미나 0.5 내지 2.0%(w/v); 및 셀라이트 1.0 내지 10%(w/v)로 사용되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으며, 이러한 특정 비율 조합은 본 발명에서 상기 3종(활성탄, 감마 알루미나 및 셀라이트) 물질을 사용함으로써 불순물 제거 효과에 대한 상승 효과가 현저하게 되는 데 더욱 유리한 특성을 부여한다.
본 발명의 더욱 바람직한 일 실시양태에서, 상기 흡착제는 활성탄 0.5 내지 2%(w/v); 감마 알루미나 0.5 내지 2.0%(w/v); 및 셀라이트 4 내지 6%(w/v)로 사용되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 (e) 단계의 불순물 제거는 여과 과정(또는 단계)을 포함하는 것일 수 있다. 상기 여과 과정은 불순물을 흡착한 흡착제(즉, 불순물-흡착제 복합체)를 제거하기 위한 것으로, 당업계에 알려진 여과 수단이라면 본 발명에서 그 방법이 특별히 제한되지 않는다. 당업자가 목적하는 작업 효율에 따라 구체적 여과 방법, 수단, 여과재의 공극 크기, 시간, 횟수 등의 다양한 조건을 당업자가 적절하게 적의 선택 및 변경하여 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 여과는 필터 페이퍼(filter paper, 종이 필터)를 사용하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 (f) 단계는, 킬레이트제를 처리하여 금속 이온을 제거하는 것을 특징으로 한다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 연구를 수행하는 과정에서 정제된 DNA 단편 중합체의 금속이온 함량을 감소시킴으로써 인체에 주사 시 염증반응을 방지할 수 있음을 확인하였다. 일반적으로 DNA 단편 중합체를 의료기기, 의약품으로 사용하기 위해서는 염증을 일으키지 않아야 한다. 의료기기, 의약품 품질관리가이드라인에 기술하고 있는 단백질, 엔도톡신의 기준을 만족하도록 정제하여도 염증반응을 일으킬 수 있음을 발견하여 그 원인이 금속이온에 있다는 연구결과를 확인할 수 있었다. 또한, 인산염을 포함하는 완충용액에 녹였을 때 인산염과 금속이온 간의 결합으로 침전물이 발생하였다. 즉, DNA 단편 중합체는 음이온을 띠기 때문에 양이온을 띠는 금속이온, 특히 알칼리토 금속이온과 결합하므로 정제된 DNA 단편 중합체도 높은 금속이온 함량을 가질 수 있다.
이에 본 발명에서 DNA 단편 중합체에 포함된 금속이온을 제거하기 위해서, 킬레이트제인 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), EGTA(Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid), DTPA(diethylenetriamine pentaacetic acid) 및 HEDTA(Hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid)로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 EDTA를 사용할 수 있다. 금속이온의 제거 단계는 상기 정제 과정 중 어느 단계에도 삽입될 수 있으나, 바람직하게는 활성탄, 감마 알루미나, 셀라이트 모두 처리한 후 EDTA를 첨가함으로써 금속 불순물을 효과적으로 제거할 수 있다. EDTA의 처리 농도는 0.5 내지 5 mM로 하는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명자들은 본 발명에 따른 정제 공정에 따라 활성탄, 감마 알루미나, 셀라이트 처리를 거친 후 EDTA를 처리할 경우 염증반응을 일으키지 않는 의료기기, 의약품으로서 안전한 DNA 단편 중합체를 얻을 수 있었다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 본 발명의 어류 생식세포로부터 DNA 단편 중합체를 제조하는 방법은, 하기 (g) 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(g) 상기 (f) 단계에서 얻어진 혼합액으로부터 DNA 단편 중합체 침전물을 수득 및 세척하는 단계.
상기 (g) 단계에서, 상기 침전물 수득 시의 방법은, 당업계에 공지된 핵산(DNA 단편 중합체) 침전물 수득 방법이라면 본 발명에서 제한 없이 이용가능하며, 본 발명의 일 실시양태에서 바람직하게는 상기 (f) 단계에서 얻어진 혼합액에 알코올을 첨가하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 알코올은, 핵산(DNA 단편 중합체) 수득 시 사용되는 것으로 당업계에 공지된 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 본 발명에서 일례로 에탄올, 이소프로필알코올 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 것을 사용하는 것이 바람직할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (g) 단계에서는, 당업자가 목적하는 작업 효율에 따라, 첨가되는 알코올의 농도 및 이의 첨가량, 교반 시간 등의 다양한 조건을 당업자가 적절하게 적의 선택 및 변경하여 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적 일 실시양태에서, 상기 (g) 단계의 침전물 수득은, 상기 (f) 단계에서 얻어진 혼합액에 2 내지 2.5배(v/v) 부피의 에탄올을 가하고 교반하여 침전물을 형성시킴으로써 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적 일 실시양태에서, 상기 (g) 단계의 세척은, 당업계에 공지된 방법이라면 그 방법이 특별히 제한되지 않으나, 상기 수득된 침전물에 70%(v/v) 에탄올을 가하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 본 발명의 어류 생식세포로부터 DNA 단편 중합체를 제조하는 방법은, 하기 (h) 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(h) 상기 (g) 단계에서 얻어진 침전물을 탈수 및 건조하는 단계.
상기 탈수 및 건조는, 당업계에 공지된 DNA 단편 중합체 수득 시 사용되는 탈수 또는 건조 방법이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않는다.
일례로 상기 탈수는 알코올 처리에 의해 수행되는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 일례로 에탄올을 사용하는 것일 수 있다.
일례로 상기 건조는 열풍건조, 진공건조, 또는/및 동결건조 등 당업계에 공지된 방법이라면 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시 양태에서, 상기 (h) 단계의 건조는 40 내지 50℃의 온도에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체적 일 실시양태에서, 상기 (h) 단계는 상기 (g) 단계에서 얻어진 침전물에 에탄올을 가하여 탈수한 후 40 내지 50℃의 온도에서 건조하여 DNA 단편 중합체를 수득하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 농도 또는 함량의 표시는, 해당 단계에서 공정 처리되는 조성물(ex. 분쇄액, 상등액, 불순물 제거 용액 등) 전체를 기준으로 기재된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 본 발명의 어류 생식세포로부터 DNA 단편 중합체를 제조하는 방법은 하기의 공정 1 내지 공정 7을 포함한다:
(공정 1) 해동 및 분쇄; 어류의 생식세포를 실온에서 해동 후 해동된 정소에 정제수 넣은 다음 분쇄한다. 분쇄액에 염화나트륨 및 라우릴황산나트륨을 투입하고 교반(혼합)한다.
(공정 2) 분자저감; 혼합 후 정소 분쇄액에 85~95℃의 온도에서 4~12시간 동안 열을 공급한다.
(공정 3) 원심분리; 상기 공정 2를 통해 분자저감된 용액을 원심분리하여 상등액과 찌꺼기를 분리한다.
(공정 4) 불순물 제거; 공정 3에서 수득한 원심분리 상등액에 흡착제(활성탄, 감마 알루미나 및 셀라이트)를 투입한 다음 교반 후 여과한다.
(공정 5) EDTA 처리: 공정 4의 여과액에 EDTA를 넣어 준 다음 교반한다.
(공정 6) 침전 및 세척; 상기 공정 5의 여과액에 2~2.5배 부피의 에탄올을 가하고 교반하여 침전물을 형성시킨 후 70%(v/v) 에탄올로 상기 침전물을 세척한다.
(공정 7) 탈수 및 건조; 침전물을 에탄올로 탈수 및 회수한 다음 건조한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
실시예 1. DNA 단편 중합체의 제조
(공정 1) 해동 및 분쇄
냉동 보관된 연어 정소 25g을 실온에서 밤새도록(약 16시간) 해동 후 정제수로 혈액 및 이물질을 제거하고 세척한 정소에 정제수 150mL를 넣고 호모게나이저로 2,000~3,000rpm의 속도로 5~10분 동안 분쇄하였다.
(공정 2) 분자저감
상기 정소 분쇄액에 염화나트륨 60g, 라우릴황산나트륨 2g, 정제수 350mL를 넣어준 다음 1~2시간 교반 후, 90~95℃의 온도에서 5~10시간 교반하였다.
(공정 3) 원심분리
상기 분자저감액을 12,000rpm에서 30분간 원심분리하여 찌꺼기를 제거하고 상등액을 회수하였다.
(공정 4) 불순물 제거
상기 상등액에 활성탄 1%(w/v), 감마 알루미나 1%(w/v)를 가한 후 약 2시간 동안 교반하여 단백질, 엔도톡신 등의 불순물을 흡착시킨 후, 셀라이트 5%(w/v)를 첨가하고 종이필터, 0.45um 및 0.2um 필터에 순차적으로 여과하여 흡착제를 제거하고 여과액을 취하였다.
(공정 5) EDTA 처리
불순물 제거 공정 후의 여과액에 EDTA를 최종농도가 1mM이 되도록 가한 후 30분 동안 교반하였다.
(공정 6) 침전 및 세척
EDTA 처리액에 2~2.5배(v/v) 부피의 에탄올을 가한 후 1시간 동안 교반하여 침전물을 형성시키고 정치하였다. 상층액을 제거한 다음 침전물을 70%(v/v) 에탄올로 세척하였다.
(공정 7) 탈수 및 건조
세척한 침전물에 에탄올을 가하여 탈수한 후 40~50℃의 온도에서 건조하여 DNA 단편 중합체를 수득하였다.
실험예 1. 염화나트륨 양에 따른 단백질 제거 효과
분자저감(공정 2)에서 염화나트륨을 각각 15g, 30g, 60g, 90g, 120g, 150g을 투입하였고, 불순물 제거(공정 4) 및 EDTA 처리(공정 5)를 수행하지 않았다는 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
염화나트륨
투입량 (g)
(몰농도)		 15g
(0.5M)		 30g
(1M)		 60g
(2M)		 90g
(3M)		 120g
(4M)		 150g
(5M)
잔류단백질
%(w/w)		 3 2.5 1.34 1.40 1.34 1.36
염의 농도가 증가함에 따라 수용액에 단백질의 용해도가 낮아지면서 침전되는 현상이 일어난다. DNA 단편 중합체 제조공정에서 단백질 제거 효율을 높이기 위해서 최적 염화나트륨의 양을 확립하였다.
표 1의 결과를 통해 염화나트륨의 농도가 2M(120g/L)까지 단백질 함량이 점진적으로 낮아졌고, 이후부터 염화나트륨의 양이 증가해도 단백질 함량의 변화가 없었다. 따라서, 이후 모든 실험에는 염화나트륨의 양을 2M(120g/L)로 적용하였다.
실험예 2. 흡착제 종류 및 흡착제 양에 따른 불순물 제거 효과
실시예 1의 불순물 제거 공정(공정 4)에서 흡착제의 종류와 양을 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 변화시켰다. DNA 단편 중합체의 단백질 및 엔도톡신 함량과 600nm에서 흡광도(기타 불순물 존재 여부 확인 목적)를 측정하였다.
흡착제
%(w/v)		 잔류
단백질
%(w/w)		 잔류
엔도톡신
(EU/mg)		 흡광도
(A600)		 DNA 단편 중합체
수율
%(w/w)
무처리 1.36 2.50 0.003 9.2
0.5% 활성탄 0.85 0.12 0.002 8.4
1% 활성탄 0.56 0.13 0.003 8.1
2% 활성탄 0.54 0.10 0.050 6.9
3% 활성탄 0.57 0.12 0.068 6.8
0.5% 감마 알루미나 0.95 0.20 0.003 7.8
1% 감마 알루미나 0.89 0.15 0.002 7.9
2% 감마 알루미나 0.90 0.14 0.003 7.8
1% 셀라이트 1.05 2.61 0.003 7.6
2.5% 셀라이트 0.93 2.46 0.003 7.5
5% 셀라이트 0.88 2.54 0.003 7.5
7.5% 셀라이트 0.84 2.55 0.003 6.7
10% 셀라이트 0.79 2.50 0.003 6.5
0.5% 활성탄 +
5% 셀라이트		 0.50 0.14 0.003 7.7
1% 활성탄 +
2.5% 셀라이트		 0.45 0.13 0.002 7.8
1% 활성탄 +
5% 셀라이트		 0.43 0.13 0.002 7.4
1% 활성탄 +
0.5% 감마 알루미나 +
5% 셀라이트		 0.32 0.01 0.002 7.6
1% 활성탄 +
1% 감마 알루미나 +
5% 셀라이트		 0.18 0.01 0.002 7.5
1% 활성탄 +
2% 감마 알루미나 +
5% 셀라이트		 0.26 0.01 0.003 7.6
표 2의 결과를 통해 알 수 있는 바와 같이, 단백질, 엔도톡신, 및 기타 불순물을 제거함에 있어, 활성탄, 감마 알루미나 및 셀라이트를 각각 단독으로 사용하는 것보다, 모두 함께 사용할 때 시너지 효과(상승효과)를 가짐을 확인하였다.
비교예 1. EDTA 처리에 따른 금속 이온 제거 효과
EDTA를 처리하지 않은 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 수행하여 DNA 단편 복합체를 수득하였다. EDTA 처리 결과물과 EDTA 미처리 결과물의 금속이온 불순물의 함량을 측정하여 비교한 결과를 표 3에 나타내었으며, 이를 통해 EDTA 처리가 금속이온 불순물 제거에 효과적인 것을 확인하였다.
잔류 금속이온 실시예 1 비교예 1
알루미늄 0 0
바륨 1 35
칼슘 4 80
철 1 5
단위: ppm
실시예 2. DNA 단편 중합체 대량 생산
실시예 1의 공정 규모를 1,200배로 높여 수행하였다.
항목 실시예 2
흡광도(A600) 0.002
잔류 단백질 %(w/w) 0.19
잔류 엔도톡신 (EU/mg) 0.002
잔류 금속이온 (ppm) 알루미늄 0, 바륨 1, 칼슘 2, 철 0
표 4에 보이는 바와 같이, 소규모에서 확립된 공정을 대량생산으로 적용하였을 때 단백질, 엔도톡신, 금속이온 등의 불순물이 제거된 순도 높은 DNA 단편 중합체를 수득할 수 있었다. 따라서 본 발명의 제조 방법은 의료기기, 의약품으로 사용하기에 적합한 순도를 가지고 있다는 것을 의미한다.
실시예 3. 본 발명에 따라 수득된 DNA 단편 중합체 분석
3-1. 분자량 분포 확인
본 발명의 방법으로 제조된 DNA 단편 중합체의 분자량 분포를 확인하기 위해서 아가로스 젤 전기영동을 수행하였다. DNA 3ug을 1% 아가로스 젤을 이용하여 1X TAE 완충용액 내에서 전기영동을 수행한 후, EtBr(Ethidium bromide)로 염색하여 Gel-documentation system으로 확인하였다.
그 결과 도 1에서 보는 바와 같이, PDRN은 저분자 형태로 나타났으며 PN은 PDRN 보다 분자량 분포가 높은 형태로 나타났다.
3-2. FT-IR 스펙트럼 분석
본 발명의 방법으로 제조된 DNA 단편 중합체의 FT-IR 스펙트럼은 Jasco사의 FT-IR 4600을 사용하여 650~4,000cm-1의 범위에서 측정하였다. DNA의 FT-IR 스펙트럼은 구조와 상호작용에 의해 3개의 파장 범위에서 특징적으로 나타나는데, 1,750 ~ 1,600cm-1 범위는 DNA의 염기 구조인 C=0, C=N, C=C 형태와 -NH2 결합 형태를 나타낸다. 1,550 ~ 1,400cm-1 범위는 퓨린과 피리미틴의 링 구조와 관련되어 있으며, 1,100 ~ 950cm-1 범위는 phosphodiester-deoxyribose backbone 내의 PO2 - 그룹의 대칭적 또는 비대칭적 구조와 관련되어 있다.
본 발명의 방법으로 제조된 DNA 단편 중합체(PDRN & PN)도 앞에 기술한 파장대에서 DNA의 특징적인 흡수 피크를 나타냈으며, 도 2a의 PDRN과 도 2b의 PN은 동일한 스펙트럼을 나타냈다.
실시예 4. DNA 단편 중합체의 세포 성장 분석
본 발명의 방법으로 제조된 DNA 단편 중합체의 세포 독성 및 성장을 평가하기 위한 실험을 수행하였다.
HDF(Human dermal fibroblast, 인간진피섬유아세포)를 10% FBS (fetal bovine serum)와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium)에서 배양하였고, 배양된 세포에 트립신/EDTA를 처리하여 바닥으로부터 세포를 떼어낸 후 헤마사이토미터(hemacytometer)를 이용하여 세포 수를 측정하였다. 96 웰 플레이트(well plate)에 3x103 세포/웰 농도로 분주하여 4시간 동안 안정화시킨 후, 각 웰의 배지를 제거하고 DNA 단편 중합체 (PDRN & PN)을 각각 50, 100, 200, 500ug/ml 농도로 DEME 배지에 희석한 후 세포에 처리하였다. 5% CO2가 포함된 37℃인큐베이터에서 72시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에 CCK-8(Dojindo, Japan) 용액을 각 웰당 10ul씩 첨가하여 37℃ 5% CO2 조건에서 1시간 동안 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더기(SpectraMax M5, Molecular devices, USA)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 3a 및 도 3b에서 보는 바와 같이 DNA 단편 중합체 (PDRN & PN)를 처리한 모든 농도에서 72시간까지 세포 독성을 보이지 않았으며, 처리한 모든 농도에서 세포가 성장하였다. 이를 통해, 본 발명의 제조 방법으로 수득한 DNA 단편 중합체는 세포 독성을 나타내지 않고 의료기기, 의약품에 안전하게 사용할 수 있는 것임을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (16)

  1. (a) 어류의 생식세포를 분쇄하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 생식세포 분쇄액에 염화나트륨 및 라우릴황산나트륨을 첨가하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 염화나트륨 및 라우릴황산나트륨이 첨가된 분쇄액을 분자저감하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 분자저감된 용액을 원심분리하여 상등액과 찌꺼기를 분리하는 단계;
    (e) 상기 (d) 단계에서 얻어진 상등액에 흡착제를 투입하여 불순물을 제거하는 단계; 및
    (f) 상기 (e) 단계에서 얻어진 불순물이 제거된 용액에 킬레이트제를 혼합하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 어류 생식세포로부터 DNA 단편 중합체를 제조하는 방법으로서,
    상기 (e) 단계는 흡착제로서 활성탄, 감마 알루미나 및 셀라이트를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 어류는,
    연어, 송어, 철갑상어, 청어, 명태, 및 대구로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는,
    상기 어류의 생식세포가 냉동 상태인 경우 분쇄 전에 이를 해동하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는,
    염화나트륨을 2 내지 5M 농도로 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 분자저감은,
    85 내지 95℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 분자저감은,
    4 내지 12시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 흡착제는
    활성탄 0.1 내지 3%(w/v);
    감마 알루미나 0.5 내지 2.0%(w/v); 및
    셀라이트 1.0 내지 10%(w/v)로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 활성탄은
    입자크기가 1 내지 150μm인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (f) 단계는,
    킬레이트제를 처리하여 금속 이온을 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 킬레이트제는
    EDTA, EGTA, DTPA 및 HEDTA로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 (f) 단계는,
    EDTA가 0.5 내지 5 mM로 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 방법은 하기 (g) 단계를 추가로 포함하는 방법:
    (g) 상기 (f) 단계에서 얻어진 혼합액으로부터 DNA 단편 중합체 침전물을 수득 및 세척하는 단계.
  14. 제13항에 있어서, 상기 침전물의 수득은,
    상기 (f) 단계에서 얻어진 혼합액에 알코올을 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 알코올은,
    에탄올, 이소프로필알코올 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 것임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 방법은 하기 (h) 단계를 추가로 포함하는 방법:
    (h) 상기 (g) 단계에서 얻어진 침전물을 탈수 및 건조하는 단계.
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Title
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