KR102423569B1 - 고순도 dna 단편 혼합물 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고순도의 DNA 단편 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 계면활성제를 사용하여 미셀이 단백질, 지질, 엔도톡신과 같은 불순물을 포집하게 한 후 용매로 추출하여 매우 낮은 농도까지 불순물을 제거할 수 있으며, PCI 용매 추출 공정에서 원심분리 공정이 아닌 정치 층 분리 공정을 통함으로써 대량 생산이 가능하여 실제 산업 현장에 적용이 가능할 수 있다.

Description

고순도 DNA 단편 혼합물 제조방법{The Manufacturing Method of Highly purified DNA fragments}
본 발명은 어류의 정액 또는 정소로부터 분리된 DNA 단편 혼합물을 고순도로 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 미셀 형성 공정, 용매 추출 공정, 층 분리 공정 등을 통해 세포 용해로 용출되는 단백질, 지질, 엔도톡신 등의 불순물을 효율적으로 제거할 수 있어 고순도의 DNA 단편 혼합물을 제조할 수 있다. 특히, 용매 추출공정에서 원심분리가 아니라 층 분리를 사용하기 때문에 대량생산이 가능하여 실제 산업 현장에 적용이 가능한 것을 특징으로 한다.
동물 또는 식물에서 추출된 DNA 단편 혼합물이 세포 증식, 조직 재생을 위한 의약품 원료로 사용되고 있는데, 이러한 DNA 단편 혼합물로는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide, PDRN)와 폴리뉴클레오티드(polynucleotide, PN)가 있다. PDRN의 경우 1990년대 송어에서 추출되어 그 효능이 이탈리아에서 처음으로 밝혀졌으며, 조직재생 및 항염증 효과를 인정받아 1995년에 의약품으로 개발되었다. PDRN은 대다수의 동물의 정액, 알 또는 정소, 인체의 태반(胎盤)에 포함되어 있는 물질이다. 포유류 및 조류의 경우 바이러스에 의한 조류독감, 구제역 등으로 인체 안전성을 확보하는데 많은 어려움이 있고, 태반의 경우에는 인체 조직에 대한 사용 거부감이 있어, 현재 의약품으로 개발된 사례는 연어과의 정소 또는 정액으로부터 추출된 PDRN이 유일하다. PDRN은 80 ~ 2,200bp의 분자량을 갖는 DNA 단편 혼합물로서 인산, 4종류의 염기 (아데닌, 구아닌, 시토신, 티민), 데옥시리보오스로 이루어진 생체고분자로, 인체 사용시 부작용에 대한 위험성은 없는 것으로 보고되고 있다.
PN의 경우도 PDRN과 마찬가지로 연어나 송어와 같은 어류의 정소 또는 정액으로부터 추출하여 얻을 수 있는 DNA 단편 혼합물이나, PDRN보다 핵산의 길이가 길고 분자량이 크다. 인체 사용시 부작용이나 위험성이 없어 의료기기 원료로 사용되고 있다.
Molecular cloning-A laboratory manual. pp458-460(1982) 등에 개시되어 있는, 종래 동식물로부터 DNA를 추출하는 방법은 첫째 라우릴황산나트륨(SLS) 또는 CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide) 등의 계면활성제를 사용하는 화학적인 방법, 둘째 단백질분해효소 K를 사용한 효소적인 방법 그리고 마지막으로 냉해동 그라인딩(Grinding)에 의한 기계적인 방법 등이 혼용되어 사용되고 있다. DNA를 추출한 이후에는 PCI(Phenol-Chloroform-Isoamylalcohol solution) 유기용매로 유기상에 비해 물에 용해도가 높은 DNA 특성을 활용하여 순도를 높이는 정제 방법이 사용되고 있다. 이때 PCI 용액은 페놀(Phenol), 클로로포름(Chloroform), 이소아밀알코올(Isoamylalcohol) 등이 조합되어 사용되고 있다. 이를 종합해보면 우선 조직 내 세포를 SLS로 용해시킬 때 방출되는 뉴클레아제를 포함한 단백질들을 단백질분해효소 K로 분해시켜 DNA 분해 및 변성을 방지하고 이후 PCI 용매를 사용하여 다수의 세포에서 유리된 단백질 및 지질 성분들로부터 DNA를 순수하게 분리한다. 현재까지 개발된 PCI 유기용매 추출법은 고가의 단백질분해효소 K를 사용해야 되고, 유기상(바닥)과 수상(DNA 함유)의 두 층으로 분리하기 위해서는 원심분리공정이 핵심적으로 요구되며 대량생산에 적용하기 위해서는 연속원심분리를 사용해야 된다. 그러나 유기용매를 제거하는 과정에서 용매의 유출 가능성이 높고 휘발성으로 작업장 환경오염이 수반된다. 따라서 PCI 용매추출방법은 소규모 진단 또는 분석 분야로 제한되어 사용되고 있다. 또한, Scientific Reports 7, Article number: 40745 (2017)에 개시된 DNA 단편 혼합물을 얻는 방법은 연어 속의 정액으로부터 버블링 시스템의 유체역학적 힘으로 DNA 분자량을 감소시킬 수 있으며, 해당 DNA 단편은 진단분야에서 유전정보 시퀀싱을 위한 T4라이게이즈와 접합할 수 있음을 보고할 뿐 후속 공정에 대한 언급은 없다.
이외에 등록특허공보 제1839061호에는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 제조방법으로 초음파 파쇄로 DNA 분획물을 용이하고 빠르게 획득할 수 있는 분자량 저감에 관한 방법만 기술하고 있을 뿐 기타 불순물들을 제거하기 위한 정제 및 회수 공정에 대한 언급은 없으며, 등록특허공보 제986603호에서 개시하고 있는 DNA 중합체 단편복합체를 제조 공정은 해동공정, 효소분해공정, 멸균공정, 분자량저감공정, 침전공정 및 건조과립공정 등을 포함하는 공정으로, 모든 공정에서 pH와 온도 조건만 기술되어 있을 뿐 세포 용해로부터 용출되는 단백질, 지질, 엔도톡신 등의 불순물 제거와 관련된 정제공정은 언급되어 있지 않다. 그리고, 상기 공정은 1g/L의 초산을 가해 100 ~ 109℃의 온도에서 수행하는 멸균 공정을 포함하고 있는데, DNA 안정성에 미칠 수 있는 Tm 값 이상의 온도에서 공정을 진행하는 것은 바람직하지 않다. 또한, 공개특허공보 제10-2017-0165088호에는 고순도 DNA 단편 혼합물을 제조하기 위해서 정소 분쇄액을 파리지옥 분쇄액과 혼합하여 단백질 및 지방을 제거하는 공정이 기술되어 있을 뿐 DNA 단편 혼합물을 제조하기 위한 그 구체적인 방법들이 기술되고 있지 않다.
등록특허공보 제1839061호(2018.03.19) 등록특허공보 제986603호 (2010.10.08) 공개특허공보 제10-2017-0165088호(2017.12.04)
T. Maniatis. Molecular cloning-A laboratory manual. pp458-460(1982) K. S. Kirby. Biochim. J., Vol. 66, 494-504 (1957) J. Marmur. J. Mol. Biol., Vol. 3, 208-218 (1961) Lanhui Li 등. Scientific Reports 7, Article number: 40745 (2017)
이에, 본 발명자들은 고분자 게놈 DNA에서 세포 용해로부터 용출되는 단백질, 지질, 엔도톡신 등의 불순물을 효율적으로 제거함과 동시에 대량 생산이 가능하여 실제 산업 현장에 적용이 가능한 DNA 단편 혼합물 제조 방법을 개발하기 위하여 연구한 결과, 어류의 정액 또는 정소를 해동 및 분쇄공정, 열수 추출공정 등을 통해 고분자 DNA를 추출한 다음, 분자량 저감공정, 단백질 제거공정, 미셀 형성 공정, 용매 추출공정, 층 분리 공정, 침전 및 건조공정의 조합을 통해 고순도의 DNA 단편 혼합물의 제조가 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 고순도 DNA 단편 혼합물 제조 방법을 제공하는 것을 해결과제로 하며, 단백질, 지질, 엔도톡신 등의 불순물을 효율적으로 제거함과 산업 현장에 실제 적용 가능한 DNA 단편 혼합물을 제조 방법을 제공하는 것을 구체적인 해결과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 하기와 같은 수단을 개시한다.
일 양태에서, 어류의 정액 또는 정소로부터 해동 및 분쇄 공정, 열수 추출공정, 분자량 저감공정, 단백질 제거공정, 미셀 형성 공정, 용매 추출 공정, 층 분리 공정 및 침전 및 건조공정을 포함하는 어류의 정액 또는 정소로부터 DNA 단편 혼합물 고순도로 제조하는 방법을 개시한다.
구체적으로, (1 공정) 어류의 정액 또는 정소를 해동 및 분쇄하는 단계;
(2 공정) 상기 1공정의 정소분쇄액에 용해(lysis) 버퍼를 투입하고 80~90℃의 온도에서 16 시간이상 열수 추출하는 단계;
(3 공정) 상기 2공정의 열수 추출액에 산성 용액을 첨가하고 72~80℃의 온도에서 2시간 이상 가수분해 하여 분자량을 저감하는 단계;
(4 공정) 상기 3공정에서 발생된 불용성 단백질을 원심분리하여 제거하고 회수된 상등액에 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.5~8.0로 중화시키는 단계;
(5 공정) 상기 4공정의 중화된 상등액에 비이온성 계면활성제 1~3%(v/v), 그리고 염화나트륨 용액을 0.8~1.2M 농도로 첨가하여 미셀 형성을 유도하는 단계;
(6 공정) 상기 5공정의 미셀 제조액에 PCI 용매를 1:1 부피 비로 넣어준 후 교반하고, PCI 용매추출액과 동량의 정제수를 가하고 교반한 후 일정 시간 정치시키는 PCI 용매 추출 및 층 분리 단계; 및
(7 공정) 상기 6공정에서 회수된 수상층에 에탄올을 가하고 교반하여 침전물을 형성시킨 후 에탄올 용액으로 침전물을 세척하고 이를 여과 및 건조하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 고순도 DNA 단편 혼합물 제조 방법을 개시한다.
상기 어류는 송어 또는 연어 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 DNA 단편 혼합물은 폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide) 및 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 상기 DNA 단편 혼합물은 분자량이 80~2,000bp 일 수 있다.
상기 열수 추출공정의 용해(lysis) 버퍼는 라우릴황산나트륨, 에데트산나트륨, 트리스, 염화나트륨 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 미셀 형성 공정에서 사용되는 계면활성제는 Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether(상품명: 트리톤 X-100, 트리톤 X-114), 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol(상품명: Nonidet P-40, NP-40), Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched)(상품명: Igepal® CA-630) 또는 이들의 조합일 수 있다.
다른 양태에서, 추가로 흡착공정 및 여과공정을 포함하는 DNA 단편 혼합물을 고순도로 제조하는 방법을 개시한다.
상기 흡착공정은 상기 (7 공정)의 건조물을 정제수에 용해시키고 약용탄을 투입하여 2시간 이상 흡착시켜 진행할 수 있다.
상기 여과공정은 상기 흡착물을 여과막에 통과시켜 여과액을 회수하여 진행할 수 있다.
상기 약용탄은 NORIT®A SUPRA, NORIT B TEST, NORIT C EXTRA, NORIT METPURE, NORIT SX PLUS, NORIT SX ULTRA, NORIT SX1G, DARCO®G 60, NORIT DX ULTR, NORIT CA1, NORIT CN PREMIUM, NORIT CGP PREMIUM, DARCO S-51, NORIT ROX 0.8, NORIT GAC 1240 PLUS 또는 이들의 조합일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 고순도의 DNA 단편 혼합물 제조 방법은 다음과 같다.
(1 공정) 해동 및 분쇄
본 발명에서의 고순도 DNA 단편 혼합물을 제조하기 위해서 사용되는 출발 물질은 핵산이 풍부한 연어의 정소를 사용하였다. 냉동상태로 보관 중인 연어 정소는 실온에서 해동시켜 사용하였다. 빠른 해동을 위해서 37℃이상에서 진행할 경우 오히려 조직 내 분해효소, 예를 들어 핵산분해효소, 단백질분해효소들이 활성화 되어 조직이 허물어지고 부패가 빠르게 진행되므로 해동 방법으로 적합하지 않다. 해동된 정소는 습식믹서기로 분쇄하였고, 정제수를 투입하여 회수하였다.
(2 공정) 열수 추출
본 발명에서는 용해 버퍼에 정소 분쇄액을 투입하고 고온에서 DNA를 추출하였다. 이는 바이러스를 조기에 불활성화 하고 세포내 존재하는 단백질 분해효소들의 활성을 저해시키고 DNA를 세포 외로 추출하기 위한 것이다.
상기 용해 버퍼로는 정제수에 라우릴황산나트륨(SLS), 에데트산나트륨(EDTA), 트리스(Tris, tris(hydroxymethyl)aminomethane), 염화나트륨(NaCl) 등의 조합으로 용해시켜 사용하였다. 상기 EDTA는 핵산분해효소 활성에 필요한 2가 양이온을 킬레이트 하여 핵산 분해작용을 억제할 수 있고, 상기 SLS의 경우는 세포막을 파괴할 뿐만 아니라 방출되는 단백질들을 변성시켜 이후 공정에서 제거를 용이하게 한다. 또한, 상기 Tris는 알칼리성 버퍼로서 유효 완충 범위(7.0~9.2)에서 핵산의 안정성을 제공한다.
DNA 열수 추출은 80~90℃에서 용해 버퍼 상에서 진행하는 것이 바람직하며, 83~87℃에서 진행하는 것이 더 바람직하다. 또한, 추출공정에서 사용되는 용해 버퍼는 SLS 5~15g/L, EDTA 10~20g/L, Tris base 20~30g/L, NaCl 15 ~ 20g/L를 포함하는 것이 바람직하며, SLS 10g/L, EDTA 14.6g/L, Tris base 24.2g/L, NaCl 17.8g/L를 포함하는 것이 더 바람직하다. 동물유래성분 원재료에서 발견될 수 있는 바이러스를 선정 후 본 열수 추출공정의 조건에서 바이러스 불활성화를 검증하여 본 결과, 추출 2시간 이후부터 바이러스 검출되지 않았다.
(3 공정) 분자량 저감
반응속도이론에 따르면 반응속도는 d[P]/dt =k(T)[A]n[B]m로 정의할 수 있고, 온도가 올라갈수록 반응속도가 증가함을 알 수 있다. 고분자 DNA를 낮은 분자량으로 만들 수 있는 변수는 온도, pH, 시간으로 이 중 2가지 변수를 고정하고 한가지의 변수만 변화시키는 경우 시간이 길어질수록, 온도가 높을수록, pH가 낮을수록 더 낮은 분자량을 가진 DNA 절편 혼합물의 수득이 가능하다. DNA 산가수분해공정 이론을 바탕으로 산성 용액에서 자연스럽게 일어나는 DNA의 분해 반응 과정은 아래 모식도와 같다.
Figure 112020063868412-pat00001
[DNA 산가수분해 모식도]
따라서 산가수분해로 DNA의 분자량을 저감하고자 할 때 시간이 길어질 경우 DNA가 모두 분해될 수 있으므로 반응을 시작한 DNA가 원하는 크기(size)의 DNA로 분해된 시점에 염기성 용액으로 중화시켜 반응을 중지하는 것이 필요하다. 이와 같은 가수분해이론을 바탕으로 분자량 저감에 사용된 산성 용매는 당업계에 공지된 아세트산, 염산, 시트르산 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 아세트산 용액과 염산을 사용할 수 있다.
본 발명에서 분자량 저감 공정은 72~80℃의 온도에서 진행하는 것이 바람직하며, 74~78℃의 온도에서 진행하는 것이 더 바람직하다. 가장 바람직하게는, 3.5% 아세트산 첨가 후 76℃의 온도에서 2시간 이상 반응시켜 DNA 단편 혼합물을 제조할 수 있다.
(4 공정) 단백질 제거
본 발명에서는 고온의 산성조건에서 산가수분해로 발생되는 침전물을 고속 원심분리기를 사용하여 핵단백질로 간주되는 불용성 단백질을 제거할 수 있다. 한국공고특허 제1993-0008087호에 따르면 산성 조건에서 발생될 수 있는 불용성 이물질은 DNA와 결합을 이루고 있는 핵단백질인 히스톤 계열의 단백질로 추정된다. 산성조건에서 DNA로부터 해리되어 불용성 이물질로 석출되나 중성 pH 이상에서는 다시 용해되는 특성으로 인해 분자량 저감 후 원심분리하여 이를 제거하는 것이 중요하다.
이렇게 상기 분자량 저감에서 발생된 불용성 단백질을 원심분리하여 제거하고 회수된 상등액에 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.5 ~ 8.0으로 중화시킨다.
(5 공정) 미셀 제조
본 발명에서는 달성하고자 하는 과제는 세포에서 유래된 지질 및 엔도톡신 성분들을 효과적으로 제거하는 것이며, 이는 이온성 또는 비이온성 계면활성제를 사용하여 미셀 형성을 유도함으로써 가능하다. 비이온성 계면활성제로는 polyethylene glycol tert-octylphenyl ether(상품명: 트리톤 X-100, 트리톤 X-114), 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol(상품명: Nonidet P-40, NP-40), octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched)(상품명: Igepal® CA-630) 또는 그 조합이 사용될 수 있는데, 이러한 트리톤 계열들은 그 구조가 매우 유사하고, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기반 헤드 그룹의 크기 분포에서 차이가 있다. 따라서 미셀 당 평균 단량체 수(n)에서 조금의 차이가 있다(각각 9.6, 8.0, 9.0 및 9.5). 트리톤 X-100은 알킬페닐 소수성 그룹을 포함하여 일반적으로 막 단백질 복합체 분리에 사용되고 있으며, 트리톤 계열의 다른 구성원은 낮은 구름점(미셀이 응집하여 별개의 상을 형성하는 온도)으로 인해 상 분리에 의한 막 단백질 분리에 사용된다.
본 발명에서는 단백질이 제거된 공정액에 비이온성 계면활성제를 1~3%(v/v) 그리고 염화나트륨 용액을 0.8~1.2M로 첨가하여 엔도톡신 성분을 포집한 미셀을 제조하였다.
(6 공정) PCI 용매 추출 및 층 분리
본 발명에서 상기 미셀에 포집된 지질 및 엔도톡신 성분들을 제거는 층 분리로 미셀을 제거함으로써 가능하다. 구체적으로, 미셀 제조액에 동량의 PCI 용매를 투입하여 30분 이상 교반하여 16시간 이상 정치 상태로 유지하여 층 분리 후, 유기상을 제외한 수상의 상층부부터 85% 부피까지 회수한다. 이때 수상층과 유기층으로 층 분리 효과를 극대화 하기 위해서 용매 추출액과 동량의 정제수를 가할 수 있다.
상기 PCI 용매는 페놀(Phenol), 클로로포름(chloroform), 이소아밀알코올(isoamylalcohol)의 조성은 예를 들어 23~27:23~27:1의 범위로 제조하여 사용이 가능하다. 페놀은 DNA 단편 혼합물 추출에 사용되는 시약으로 페놀만 사용할 경우 층 분리 후 수상층에 페놀이 일부 잔존하게 되는데, 클로로포름과 함께 혼합하여 사용하면 수상층에 미량 녹아있는 페놀의 제거가 가능하다. 이소아밀알코올은 DNA 단편 혼합물 추출 과정 시 수상층과 유기 용매층이 섞이는 과정에서 거품의 발생을 줄이고자 넣어주는 시약으로 생략이 가능하다.
(7 공정) 침전 및 건조
본 발명에서는 건조물을 수득하기 위해서 층 분리 상층액에 상층액의 2배 부피(v/v)의 에탄올을 가하고 1시간 교반하여 침전물을 형성시킨 다음 침전물에 에탄올 용액을 70→까지 순차적으로 농도를 높여 세척하고 50℃의 온도에서 진공 하에 건조하여 고순도의 DNA 단편 혼합물의 건조물을 수득한다.
(추가 공정) 흡착 및 여과
본 발명에서는 DNA 단편 혼합물의 순도 조절을 위해 흡착 및 여과 공정의 추가가 가능하다. 구체적으로, 10g/L이하의 농도로 상기 DNA 단편 혼합물의 건조물을 녹인 용액에 약용탄(활성탄, powdered activated carbon (PAC))을 투입하여 흡착시키는 것으로, 바람직하게는 0.1~2.0%(w/v), 보다 바람직하게는 0.4~1.0%(w/v)의 약용탄을 사용할 수 있다.
상기 약용탄으로는 NORIT®A SUPRA, NORIT B TEST, NORIT C EXTRA, NORIT METPURE, NORIT SX PLUS, NORIT SX ULTRA, NORIT SX1G, DARCO®G60, NORIT DX ULTR, NORIT CA1, NORIT CN PREMIUM, NORIT CGP PREMIUM, DARCO S-51, NORIT ROX 0.8, NORIT GAC 1240 PLUS 등의 활성탄들 중에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 NORIT SX ULTRA, NORIT SX1G, NORIT SX PLUS, 보다 바람직하게는 NORIT SX ULTRA 또는 NORIT SX PLUS, 가장 바람직하게는 NORIT SX PLUS이다.
본 발명의 DNA 단편 혼합물 제조방법은 세포 용해로부터 용출되는 단백질, 지질, 엔도톡신 등의 불순물을 효율적으로 제거할 수 있는 효과가 있다. 보다 특별하게, PCI 용매 추출 단계에서 공지의 방법과 달리 원심분리 공정이 아닌 정치 층 분리공정을 사용하기 때문에 대량 생산이 가능하여, 본 발명에 의해 제조된 고순도의 DNA 단편 혼합물은 피부이식, 욕창, 족부궤양 등 상처 난 조직의 치료 및 조직 수복에 효과를 나타내거나 영양성분으로 작용하여 세포재생 의료분야에서 다양하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 제조 공정 중 분자량 저감 공정에서 시간에 따른 DNA 분자량 변화를 확인한 사진이다.
도 2는 본 발명의 제조 방법으로 제조된 DNA 단편 혼합물의 IR spectrum이다.
도 3은 본 발명의 제조 방법으로 제조된 DNA 단편 혼합물의 X-ray 회절 측정 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조
(1 공정) 해동 및 분쇄
냉동 연어정소 600g을 실온에서 16시간 해동 후 정제수로 이물질을 제거하고 분쇄기에서 정소 분쇄액을 제조하였다.
(2 공정) 열수 추출
상기 정소 분쇄액을 SLS 10g/l, EDTA 14.6g/l, Tris base 24.2g/l, NaCl 17.8g/l 등이 6ℓ의 정제수에 용해된 완충용액에 넣어준 후 85℃의 온도에서 16시간 교반하였다. 이후 원심분리하여 세포 용해물을 제거하고 상등액을 회수하였다.
(3 공정) 분자량 저감
상기 상등액을 76℃의 온도에서 3.5%의 아세트산을 첨가한 후 2.0시간 동안 반응시켜 DNA 단편 혼합물을 제조하였다.
(4 공정) 단백질 제거
상기 DNA 단편 혼합물을 원심분리 후 상등액에 1N 가성소다를 가하여 pH를 7.8로 조정하였다.
(5 공정) 미셀 제조
상기 중화된 상등액에 트리톤 X-114을 2.0%(v/v)로 첨가하고 30분 교반 후, 5M 염화나트륨 용액을 상등액의 20%(v/v) 부피 비로 첨가하여 미셀 형성을 유도하였다.
(6 공정) PCI 용매 추출 및 층 분리
(i) 상기 5공정의 미셀 제조액에 동량의 PCI 용매를 첨가해 준 다음 30분 교반하고,
(ii) 상기 (i) 완료된 PCI 추출액에 동량의 정제수를 가하고 30분 교반한 다음 16시간 정치하였다.
이때, PCI (Phenol/chloroform/isoamylalcohol) 조성비는 25:25:1로 하였다.
(7 공정) 침전 및 건조
상기 (6 공정)의 층 분리 상층액을 회수하여 그 상층액의 2배(v/v) 부피의 에탄올을 가한 후 40분 교반하여 침전물을 형성시키고, 정치 후 상층액을 버리고 회수된 침전물에 70→에탄올 용액을 단계적으로 가하여 침전물을 세척하고, 50℃의 온도에서 진공 건조하여 DNA 단편 혼합물 52g을 수득하였다.
실험예 1. 분자량 저감 시간 최적화
(3 공정)에서 최적의 분자량 저감 시간을 확립하기 위해, (2 공정)의 상등액 100ml을 분취하여 76℃의 온도에서 3.5%의 아세트산을 첨가한 후 0.5h, 1.0h, 2.0h, 3.0h 및 4.0h 시점의 샘플들에 대한 분자량 변화를 확인하였으며, 그 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 반응 2 ~ 3시간에서 80 이상 2,000이하의 DNA 단편 혼합물을 제조할 수 있으며, 2시간이 (3 공정)의 최적 시간임을 알 수 있었다.
실시예 2. DNA 단편 혼합물 특성
1) FT-IR
상기 실시예 1로 제조된 DNA 단편 혼합물의 IR spectrum은 대한민국약전(11 개정) 42. 적외부스펙트럼측정법의 브롬화칼륨정제법에 따라 THERMO사 Nicolet iS10 FT-IR Spectrometer를 사용하여 600-4000 cm-1의 범위에서 측정하였을 때 도 2와 같이 reference(TCI 3545, Lot. PSHAM-GO)와 동일한 spectrum으로 나타났다.
상기 DNA 단편 혼합물의 분자식은 (C10H12O5N5P)n(C10H12O6N5P)m(C9H12O6N3P)l(C10H13O7N2P)kNa(n+m+l+k)이다.
2) X-ray diffractometer
상기 실시예 1로 제조된 DNA 단편 혼합물의 결정다형을 측정하기 위해 Rigaku사의 Ultima III X-ray diffractometer를 사용하여 시료의 X-ray 회절을 측정하였을 때 도 3과 같이 무정형으로 나타났으며, 1mm 이하의 입자가 99% 이상을 나타낸다.
비교예 1. (5 공정) 미셀 제조를 포함하지 않은 방법으로 제조된 DNA 단편 혼합물
실시예 1에서 (5 공정)만을 제외하고 동일한 방법으로 DNA 단편 혼합물을 제조하였다.
실험예 2. 단백질 및 엔도톡신 함량 비교
실시예 1 및 비교예 1로부터 제조된 DNA 단편 혼합물의 단백질 및 엔도톡신 함량과 비교하였으며, 그 결과는 아래 표 1과 같다. 미셀 제조 공정을 포함하지 않는 비교예 1의 경우 단백질 및 엔도톡신의 함량이 높게 나타났는데, 이는 본 발명의 경우 미셀 제조 공정을 통해 단백질 및 엔도톡신이 미셀에 포집되고 이것이 후속 공정을 통해 감소되었으나 비교예 1은 그렇지 못하였음을 의미한다.
주요 성능 실시예 1 비교예 1
흡광도 (at 260/280nm) 1.87 1.88
단백질 (%) 0.45 0.70
엔도톡신 (EU/mg) <0.01 1.6898
함량 (%) 99.5% 104.8%
실시예 2 및 3. 트리톤 계열 계면활성제를 사용하여 제조된 DNA 단편 혼합물
실시예 1의 (5 공정)에서 트리톤 X-114 대신 비이온성 계면활성제로 동량의 트리톤 X-100 또는 Nonidet P-40 (NP-40)을 사용하고 실시예 1과 동일한 방법으로 실시예 2 및 3의 DNA 단편 혼합물을 제조하였다.
비교예 2 및 3. 트리톤 계열 외 계면활성제를 사용하여 제조된 DNA 단편 혼합물
실시예 1의 (5 공정)에서 트리톤 X-114 대신 tween 20 또는 tween 80을 사용하고 실시예 1과 동일한 방법으로 비교예 2 및 3의 DNA 단편 혼합물을 제조하였다.
실험예 2. 계면활성제 종류에 따른 단백질 및 엔도톡신 함량 비교
실시예 1 내지 3, 비교예 2 및 3으로부터 제조된 DNA 단편 혼합물의 단백질 및 엔도톡신 함량을 비교하였으며, 그 결과는 아래 표 2와 같다. 이를 통해 트리톤 계열의 계면활성제를 사용한 경우에 단백질과 엔도톡신 값이 모두 낮게 나타날 수 있음을 확인하였다.
성능 엔도톡신 (EU/mg) 단백질 (%)
실시예 1(Triton X-114) <0.01 0.45
실시예 2(Triton X-100) >0.01, <0.1 0.53
실시예 3(Nonidet P-40 (NP-40)) >0.01, <0.1 0.63
비교예 2(Tween 20) >0.1, <1.0 0.75
비교예 3(Tween 80) >0.1, <1.0 0.73
실시예 2. 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조
(a) 약용탄 흡착
1L의 정제수에 상기 실시예 1에서 제조된 건조물 10g을 녹인 용액에 4g의 활성탄을 넣고 4시간 동안 흡착반응 시킨 다음, 뎁스여과막 및 미세여과막(0.22㎛)에 순차적으로 통과시켜 여과액을 회수하였다.
(b) 침전 및 건조
상기 (a) 단계 여과액에 여과액의 2배 부피(v/v)로 에탄올을 가한 후 1시간 교반하여 침전물을 형성시키고 정치하여 상층액을 버리고 회수된 침전물에 70→에탄올 용액을 단계적으로 가하여 침전물을 세척하고, 50℃의 온도에서 진공 건조하였다. 아래 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 약용탄으로 SX PLUS 및 SX ULTRA 사용한 경우 모두 단백질이 낮게 나타남을 확인하였다.
1. 성능 NORIT SX PLUS NORIT SX ULTRA
흡광도 (at 260/280nm) 1.88 1.89
단백질 (%) 0.21 0.25
엔도톡신 (EU/mg) <0.01 <0.01
함량 (%) 99.6% 99.5%
활성탄(SX PLUS 또는 SX ULTRA) 흡착에 따른 주요 성능평가
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 고순도의 DNA 단편 혼합물은 피부이식, 욕창, 족부궤양 등 상처 난 조직의 치료 및 조직 수복에 효과를 나타내거나 영양성분으로 작용하여 세포재생 의료분야에서 사용될 수 있다.

Claims (9)

  1. (1 공정) 어류의 정액 또는 정소를 해동 및 분쇄하는 단계;
    (2 공정) 상기 1공정의 정소분쇄액에 라우릴황산나트륨(SLS), 에데트산나트륨(EDTA), 트리스(Tris) 및 0.3 M 염화나트륨(NaCl)을 조합한 용해(lysis) 버퍼를 투입하고 80~90℃의 온도에서 16 시간이상 열수 추출하는 단계;
    (3 공정) 상기 2공정의 열수 추출액에 산성 용액을 첨가하고 72~80℃의 온도에서 2시간 이상 가수분해 하여 분자량을 저감하는 단계;
    (4 공정) 상기 3공정에서 발생된 불용성 단백질을 원심분리하여 제거하고 회수된 상등액에 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.5~8.0로 중화시키는 단계;
    (5 공정) 상기 4공정의 중화된 상등액에 계면활성제로 폴리에틸렌 글리콜 테르트옥틸페닐에테르(polyethylene glycol tert-octylphenyl ether, Triton X-114) 1~3%(v/v) 및 0.8~1.2M 염화나트륨 용액을 첨가하여 미셀 형성을 유도하는 단계;
    (6 공정) 상기 5공정의 미셀 제조액에 PCI 용매를 1:1 부피 비로 넣어준 후 교반하고, PCI 용매추출액과 동량의 정제수를 가하고 교반한 후 일정 시간 정치시키는 PCI 용매 추출 및 층 분리 단계;
    (7 공정) 상기 6공정에서 회수된 수상층에 에탄올을 가하고 교반하여 침전물을 형성시킨 후 에탄올 용액으로 침전물을 세척하고 이를 여과 및 건조하는 단계; 및
    (8 공정) 상기 7 공정에서 회수된 건조물을 녹인 용액을 활성탄에 흡착 시킨 후 정제하는 단계;
    를 포함하는 어류의 정액 또는 정소로부터 고순도의 DNA 단편 혼합물 제조 방법으로,
    상기 DNA 단편은 52 내지 1,300kDa의 분자량을 갖는 DNA 단편 혼합물 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 정제공정은 제 1항의 건조물을 정제수에 용해시킨 후 약용탄을 투입하여 2시간 이상 흡착시켜 진행하는 단계;
    상기 흡착물을 뎁스필터와 제균여과막에 순차적으로 통과시켜 여과액을 회수하여 진행하는 단계; 및
    상기 회수된 여과액에 에탄올을 가하고 교반하여 침전물을 형성시킨 후 에탄올 용액으로 침전물을 세척하고 건조하는 단계;
    를 포함하는 고순도의 DNA 단편 혼합물 제조 방법.
  8. 제 1항에 의해 제조된 DNA 단편 혼합물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 DNA 단편 혼합물이 폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide), 폴리뉴클레오티드(polynucleotide) 또는 그 조합인 DNA 단편 혼합물.
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