CN105541996A - 胸腺组织提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和dna的方法 - Google Patents

胸腺组织提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和dna的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105541996A
CN105541996A CN201511034554.4A CN201511034554A CN105541996A CN 105541996 A CN105541996 A CN 105541996A CN 201511034554 A CN201511034554 A CN 201511034554A CN 105541996 A CN105541996 A CN 105541996A
Authority
CN
China
Prior art keywords
thymus
ultrafiltration
molecular weight
molecular
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201511034554.4A
Other languages
English (en)
Inventor
聂玲玲
马骉
杨蓉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Taichuang Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Tianjin Taichuang Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Taichuang Biotechnology Co Ltd filed Critical Tianjin Taichuang Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201511034554.4A priority Critical patent/CN105541996A/zh
Publication of CN105541996A publication Critical patent/CN105541996A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57581—Thymosin; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及胸腺提取物，具体公开了一种从胸腺组织中提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和DNA的方法。其是由动物胸腺组织经匀浆、变性、冻融后，离心取上清，并经过不同截留分子量的超滤系统超滤，获得截留分子量为30KD～50KD的中分子量胸腺蛋白和截留分子量小于10KD的胸腺肽，此外，收集前述过程中的离心后沉淀与超滤中弃掉的残液，提取得到DNA。本发明通过对提取工艺进行优化，不仅提高了胸腺肽的提取效率及纯度，同时综合利用胸腺肽生产工艺中的废料，提取具有药用价值的中分子量胸腺蛋白及DNA。

Description

胸腺组织提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和DNA的方法
技术领域
本发明涉及胸腺提取物，具体地说，涉及一种从胸腺组织中提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和DNA的方法。
背景技术
胸腺是人体重要的免疫器官，能分泌激素和产生多种细胞因子的器官。由胸腺产生的多肽和蛋白质控制调节着免疫反应。因此，国内外对胸腺提取物的研究广受人们的关注。20世纪60年代，White、Goldstein和其同事在此领域中进行了许多努力，他们首次从胸腺粗提物中纯化得到胸腺素，并且证实了初生胸腺缺陷小鼠注射胸腺素后，死亡率下降，存活率上升，并且恢复了细胞免疫功能如抗皮肤移植能力。近年来，从胸腺组织和血液中已经分离了几十种具有胸腺激素样活性的因子，很多已经研发成药物，用于治疗各种疾病。
胸腺肽是从胸腺素组分5中分化出来的一组蛋白质和多肽激素，是动物免疫系统T淋巴细胞成熟、分化和功能化的必需因子，作为药物是一种免疫调节剂，现行国家药品标准胸腺肽注射剂规定的分子量小于10KD。胸腺肽可用于治疗各种原发性或继发性T细胞缺陷病、某些自身免疫性疾病、各种细胞免疫功能低下的疾病及肿瘤的辅助治疗。胸腺肽在我国临床应用已有20多年的历史，我国胸腺肽制品的市场不断扩大，年销量增长率较快，其产品的市场前景较好。目前，胸腺肽制剂多采用生物提取法来获得。
胸腺肽的制备工艺已经较为成熟，一般包括组织细胞破碎、离心分离、超滤、浓缩等过程。通常包括以下方法：(1)用匀浆器或胶体磨将新鲜的胸腺匀浆，反复冻融，以破碎细胞；(2)适宜温度下酶解并去除细菌热源；(3)离心或过滤去除组织细胞壁等固体杂质；(4)上清液分级过滤，最后经10KD分子量超滤膜超滤收集滤过液即为胸腺肽溶液。在此常规胸腺肽的提取分离过程中，最后截留的分子量10KD以上的部分视为废料倒掉，这样不仅造成了资源的浪费，同时还污染了环境。
目前胸腺提取物主要集中在小分子胸腺肽，分子量小于10KD，而有研究发现，从动物胸腺中提取的分子量小于60KD的中小分子胸腺蛋白复合物，能明显促进成纤细胞、内皮细胞增殖，对胃溃疡有明显促进愈合作用。已上市药物欣洛维(胸腺蛋白口服液)就是从胸腺组织中提取的具有较强生物活性的中分子蛋白物质(分子量30KD～50KD)，是一种新型的消化道粘膜保护剂，可用于治疗胃、十二指肠溃疡，也可用于慢性胃炎、急性胃粘膜病变、口腔溃疡及溃疡性结肠炎的治疗。另外，胸腺组织中细胞核含量比重大，脱氧核糖核酸(DNA)含量较高，而DNA作为生物遗传物质的基础，具有多种生理功能，广泛用于医药、畜牧业、食品等领域。因此，很有必要开发一种综合利用胸腺生产胸腺肽、中分子量胸腺蛋白、DNA的生产工艺，这样不仅使原材料得到充分利用，节约了生产成本，增加了产值，同时也减少对环境的污染。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种从胸腺组织中提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和DNA的方法，综合利用胸腺生产胸腺肽、中分子量胸腺蛋白、DNA。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明首先提供一种从胸腺组织中提取胸腺肽和中分子量胸腺蛋白的方法，由动物胸腺组织经匀浆、变性、冻融后，离心取上清，并经过不同截留分子量的超滤系统超滤，获得截留分子量为30KD～50KD的中分子量胸腺蛋白和截留分子量小于10KD的胸腺肽。
所述方法在提取胸腺肽的同时，还提取了中分子量胸腺蛋白，更好的利用了胸腺资源。
具体地，所述方法包括如下步骤：
(1)匀浆：取动物胸腺组织，摘除多余组织得到胸腺，清洗后倒入胶体磨中匀浆，得匀浆液；
(2)变性：将匀浆液升温至80～90℃，保持10～30min，得变性液；
(3)反复冻融；
(4)离心：将变性液以3000～6000转/分离心10～30分钟，得到上清液和沉淀C1；
(5)澄清过滤：将步骤(4)所得上清液过滤，除去上清液中粒径大于0.45μm的大颗粒，分别收集过滤液及截留物C2；
(6)一次超滤：将步骤(5)所得过滤液用截留分子量50KD的超滤系统超滤，压力不超过0.1MPa，收集透过液及截留液L1；
(7)二次超滤：将步骤(6)所得透过液用截留分子量30KD的超滤系统超滤，压力不超过0.1MPa，收集透过液与截留液A，所述截留液A即为分子量范围为30KD～50KD的水溶性中分子量胸腺蛋白原料；
(8)浓缩：取步骤(7)所得透过液进行浓缩，冷冻保存；
(9)三次超滤：将步骤(8)冷冻保存的浓缩液融化解冻，冻解液用截留分子量10KD的超滤系统进行超滤，压力不超过0.1MPa，收集透过液A及截留液L2，所述透过液A即为胸腺肽原料。
为了提高胸腺肽的提取效率及纯度，同时为了提高中分子量胸腺蛋白及DNA的提取效率，本发明优化了提取工艺如下：
所述步骤(1)具体为：取动物胸腺组织，除去脂肪、导管、外膜后得到胸腺，清洗后控干水分，倒入胶体磨中，按1:0.2～3(w/w)的比例加入纯化水，匀浆1～3min，得匀浆液。
所述步骤(3)具体为将变性液反复冻融2～4次，冷冻温度为-10℃～-20℃，融化温度10～35℃。反复冻融能更加充分的裂解细胞，提高胸腺蛋白和胸腺肽的提取效率。
所述步骤(8)取步骤(7)所得透过液浓缩1～10倍。
在此基础上，本发明还提供了一种从胸腺组织中提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和DNA的方法，按照前述方法获得胸腺肽和中分子量胸腺蛋，并收集前述方法中的离心后沉淀与超滤过程中弃掉的残液，提取其中的DNA。
更为具体地，在前述方法的基础上，还包括如下步骤：
(10)将C1、C2、L1、L2混合，加入NaCl溶液和SDS溶液，混匀；
(11)50～60℃水浴加热，离心取上清液，弃去沉淀。
(12)上清液加入等体积氯仿，涡混，静置过夜；
(13)取上清液，加入乙醇进行沉淀，4℃放置过夜；
(14)离心收集白色沉淀；
(15)加入酒精搅拌，对沉淀进行清洗，离心，对离心后沉淀减压干燥，即得DNA粗品。
该方法综合利用了胸腺生产胸腺肽、中分子量胸腺蛋白及DNA。在生产胸腺肽的同时，利用了胸腺肽生产工艺中的废料，提取具有药用价值的中分子量胸腺蛋白及DNA，对胸腺原料实现了最大化的利用。
为了提高DNA的提取效率，本发明优化了提取工艺如下：
所述步骤(10)将C1、C2、L1、L2混合，加入2～3倍体积的1.5～2.5mol/LNaCl溶液和0.05～0.15倍体积的15％～25％(wt％)SDS溶液，混匀。
所述步骤(11)的离心条件为4000转/min，离心40min。
所述步骤(13)具体为取上清液，边搅拌边加入1.5～2.5倍体积的-20℃95％(vt％)乙醇，产生白色絮状沉淀，4℃放置过夜；
取上清时，溶液分为三层，中间层为变性蛋白弃掉，下层氯仿可回收再利用。
所述步骤(14)具体为4℃、4000转/min离心40min，收集白色黏性沉淀。
进一步地，本发明针对胸腺肽及中分子量胸腺蛋白的提取提供一个完整的具体实施方案如下：
1、原料处理：取检验合格的动物胸腺组织，用前除去脂肪、导管、外膜，先用饮用水清洗3～5遍，再用注射用水清洗3～5遍。控干水分。将清洗好的胸腺倒入胶体磨中，按比例1：(0.2～3)加入纯化水，开动胶体磨，匀浆1～3min，将匀浆液导入清洁的夹层锅内。
2、变性：将匀浆液继续升温至80～90℃，保持10～30min，得变性液，变性液冷却后放入不锈钢容器中存放，记录变性液体积。
3、冻融：将变性液反复冻融2～4次：冷冻温度-10℃～-20℃以下，融化温度10～35℃。
4、离心：将变性液离心(3000～6000转/分，离心10～30分钟)，分别收取上清液和沉淀C1。
5、澄清过滤：将上清液用过滤系统过滤，孔径为0.45μm除去上清液中较大颗粒。分别收集过滤液及截留物C2。
6、一次超滤：将过滤液用截留分子量50KD的超滤系统超滤，压力不得超过0.1MPa，收集透过液于清洁的不锈钢容器内，同时收集截留液L1。
7、二次超滤：将一次超滤透过液用截留分子量30KD的超滤系统超滤，压力不得超过0.1MPa，收集透过液于清洁的不锈钢容器内；得到的截留液即为分子量范围为30KD～50KD的水溶性中分子量胸腺蛋白原料。
8、浓缩：取第二次超滤透过液经浓缩系统进行浓缩(1-10倍)，浓缩后的溶液置清洁的容器中冷冻保存。
9、三次超滤：将冷冻保存的浓缩液融化解冻，冻解液用截留分子量10KD的超滤系统进行超滤，压力不得超过0.1MPa，收集透过液于无菌无热原容器内即为胸腺肽原料；收集截留液L2。
进一步地，本发明针对利用胸腺肽生产过程中的废料提取DNA提供了具体的技术方案如下：
1、将上述工艺中的沉淀C1、C2、L1、L2混合，加入2～3倍体积的1.5～2.5mol/LNaCl溶液和0.05-0.15倍体积的15％～25％SDS溶液，涡混混匀。
2、50～60℃水浴加热1h，4000转/min离心40min取上清液，弃去沉淀。
3、上清液加入等体积氯仿，涡混4h，静置过夜。
4、溶液分为三层，取上清液。中间层为变性蛋白弃掉，下层氯仿可回收再利用。
5、上清液边搅拌边加入1.5～2.5倍体积的-20℃95％乙醇，产生白色絮状沉淀，4℃放置过夜。
6、4℃、4000转/min离心40min，收集白色黏性沉淀。
7、加入酒精并强力搅拌，对沉淀进行清洗，离心。
8、对离心沉淀减压干燥，即得到DNA粗品。
本发明的有益效果在于：
本发明克服现有技术的不足，提出一种综合利用胸腺生产胸腺肽、中分子量胸腺蛋白及DNA的方法。此方法对胸腺肽提取工艺进行了优化，不仅提高了胸腺肽的提取效率及纯度，同时综合利用胸腺肽生产工艺中的废料，提取具有药用价值的中分子量胸腺蛋白及DNA。
附图说明
图1为本发明所述胸腺组织提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和DNA的方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1利用胸腺肽生产过程中的废料提取30-50K中分子量胸腺蛋白
1、原料处理：称取620kg的胸腺组织，除去脂肪、导管、筋膜，先用饮用水清洗3遍，再用纯化水清洗3遍。控干水分。将清洗好的胸腺倒入胶体磨中，加入310L纯化水，开动胶体磨，匀浆3min，将匀浆液导入清洁的夹层锅内。
2、变性：将匀浆液继续升温至90℃，保持10min，得变性液，变性液冷却后放入不锈钢容器中存放。
3、冻融：将变性液反复冻融3次：冷冻温度-20℃以下，融化温度20℃。
4、离心：将冻融液解冻，4000转/分离心30分钟，收取上清液，收集沉淀(C1)41kg。
5、澄清过滤：将上清液用无机膜过滤系统过滤，孔径为0.45μm，除去上清液中较大颗粒。收取过滤液，同时收集过滤得到的杂质(C2)22.5kg。
6、一次超滤：将过滤液用截留分子量50KD的超滤系统进行超滤，压力不得超过0.1MPa，收集透过液于清洁的不锈钢容器内。同时收集截留液(L1)21L。
7、二次超滤：将一次超滤透过液用截留分子量30KD的超滤系统进行超滤，压力不得超过0.1MPa，收集透过液于清洁的不锈钢容器内。将得到的截留液浓缩冻干，获得分子量范围为30KD～50KD的水溶性中分子量胸腺蛋白原料2036g。
8、浓缩：取二次超滤透过液，经浓缩系统浓缩后置清洁的容器中，低温或冷冻保存。
9、三次超滤：将浓缩液用截留分子量10KD的超滤系统超滤，压力不得超过0.1MPa，收集透过液于无菌无热原容器内冷冻保存，作为胸腺肽原料使用。同时收取截留液(L2)15L。
实施例2利用胸腺肽生产过程中的废料提取DNA
1、将实施例1中的沉淀C1、C2和L1、L2混合，620kg原料共获得废料约100Kg。
2、加入2mol/L的NaCl溶液200L，20％的SDS溶液5L，混匀。
3、55℃水浴加热1h，4000转/分离心40min，取上清液，弃去沉淀。
4、上清液加入100L氯仿，涡混4h，静置过夜待分层。
5、次日，吸取上清液82L，在搅拌状态下加入-20℃95％乙醇144L，产生白色絮状沉淀，4℃放置过夜。
6、4℃、4000rpm离心40min，收集白色黏性沉淀。
7、加入95％冷乙醇50L，强力搅拌，对沉淀进行充分洗涤，离心，取沉淀。
8、将沉淀减压干燥，即得到DNA粗品。
9、经测定，提取得到的粗品DNA为842.96g，纯度为93.4％，提取效率为0.79％。
实施例3中分子量胸腺蛋白的活性测定
采用内皮细胞、小鼠3T3成纤维细胞增殖法测定。内皮细胞自行制备，小鼠3T3成纤维细胞购买于上海研晶生物科技有限公司。
一、内皮细胞的制备
1、取健康产妇分娩后3小时内的脐带，用D-Hanks液反复冲洗脐静脉至无血迹，灌入0.25％胰蛋白酶5ml置37℃水浴内10分钟，收集消化液；
2、用5ml含10％胎牛血清的1640培养液冲洗脐静脉，收集冲洗液；
3、将上述消化液及冲洗液合并收入离心管内，1000rpm离心10分钟；
4、去上清，加入适量1640培养液(内含10％胎牛血清，2000μg/ml青霉素，0.2μg/ml链霉素，200μg/mlECGS)将沉淀细胞吹散；
5、将细胞悬液接种于玻璃培养瓶内，1640培养液(内含10％胎牛血清，2000μg/ml青霉素，0.2μg/ml链霉素，200μg/mlECGS)，置37℃，5％CO2培养箱内培养，每2-3天换液一次，直至细胞单层形成，进行传代培养；
6、传代培养
6.1用D-hanks液轻洗细胞2-3遍，用0.06％胰蛋白酶在室温消化1-2分钟，弃消化液；
6.2加入1640培养液(内含10％胎牛血清，2000μg/ml青霉素，0.2μg/ml链霉素，200μg/mlECGS)，并用吸管反复吹打，制成细胞悬液；
6.3以1:3的比例传代，用于实验的为第2代或第3代细胞，经VIII因子相关抗原(VIIIR.Ag)的抗体检测，确认为血管内皮细胞后方作为生物效应测定用细胞。
小鼠3T3成纤维细胞(FC)购买于上海研晶生物科技有限公司(含10％胎牛血清的1640培养基)。
二、试验样品的配制
1、血管内皮细胞(EC)：取培养第二代的脐静脉内皮细胞，用含10％胎牛血清的1640培养液稀释成5×104/ml个；
2、小鼠3T3成纤维细胞(FC):购买于上海研晶生物科技有限公司，用10％胎牛血清的1640培养基稀释成5×104/ml个；
3、中分子胸腺蛋白样品(Tp)：用注射用生理盐水稀释成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml(编号分别为Tp1、Tp2、Tp3、Tp4、Tp5)。
三、中分子量胸腺蛋白活性测定
1.取24孔塑料细胞培养板(每孔面积2cm2)，其中一块板每孔加成纤维细胞(FC)悬液0.2ml，另一块板每孔加入血管内皮细胞(EC)悬液0.2ml；
2.分别吸取0.2ml注射用生理盐水及不同浓度中分子胸腺蛋白溶液，加入细胞培养板，每个浓度至少加3孔平行检测；
3.每孔加10％胎牛血清1640培养液1.0ml，培养板置于37℃、5％CO2培养箱内培养72小时；
4.培养结束，倒掉孔内液体，每孔滴入0.2ml台盼蓝染色剂，轻混；
5.在高倍显微镜下计数每孔内活细胞数。
计数方法：每孔随机计数5个视野下的细胞数，取其均值。
按下式换算成每平方厘米的细胞数：
EC(FC)/cm2＝每孔细胞计数均值/0.19625×100
式中：EC为脐静脉内皮细胞数；FC为小鼠3T3成纤维细胞数；0.19625为高倍镜(×400)视野面积，单位mm2；数据经统计学处理。
细胞计数结果见表1和表2.
表1中分子胸腺蛋白对内皮细胞(EC)增殖效应的影响(单位：×104/cm2)
细胞计数 对照组 TP1 TP2 TP3 TP4 TP5
1 1.95±0.02 2.54±0.07 2.92±0.08 3.47±0.07 3.66±0.02 3.49±0.02
2 1.99±0.01 2.37±0.04 2.80±0.04 3.27±0.03 4.07±0.05 3.75±0.03
3 2.01±0.01 2.35±0.04 2.71±0.03 3.31±0.02 3.79±0.02 3.71±0.01
均值 1.98±0.01 2.42±0.05** 2.81±0.05** 3.35±0.04** 3.84±0.03** 3.65±0.02**
(**P＜0.01)
表2中分子胸腺蛋白对小鼠3T3成纤维细胞(FC)增殖效应的影响(单位：×104/cm2)
细胞计数 对照组 TP1 TP2 TP3 TP4 TP5
1 1.78±0.01 2.20±0.02 2.55±0.02 2.88±0.01 3.32±0.03 2.99±0.03
2 1.86±0.02 2.14±0.05 2.64±0.04 2.79±0.03 3.25±0.05 2.79±0.04
3 1.79±0.03 2.35±0.02 2.49±0.03 2.94±0.02 3.06±0.04 3.04±0.05
均值 1.81±0.02 2.23±0.03** 2.56±0.03** 2.87±0.02** 3.21±0.04** 2.94±0.04**
(**P＜0.01)
由表1、表2可以看出，本发明的中分子量胸腺蛋白对脐静脉血管内皮细胞、小鼠3T3成纤维细胞均有明显促增殖的生物效应，与对照组比较，差异非常显著(P＜0.01)；而且，在胸腺蛋白0.1-0.4mg/ml浓度范围内，其增殖效应具有量效关系，超过0.4mg/ml以后增殖效应不再继续增加。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种从胸腺组织中提取胸腺肽和中分子量胸腺蛋白的方法，其特征在于，由动物胸腺组织经匀浆、变性、冻融后，离心取上清，并经过不同截留分子量的超滤系统超滤，获得截留分子量为30KD～50KD的中分子量胸腺蛋白和截留分子量小于10KD的胸腺肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)匀浆：取动物胸腺组织，摘除多余组织得到胸腺，清洗后倒入胶体磨中匀浆，得匀浆液；
(2)变性：将匀浆液升温至80～90℃，保持10～30min，得变性液；
(3)反复冻融；
(4)离心：将变性液以3000～6000转/分离心10～30分钟，得到上清液和沉淀C1；
(5)澄清过滤：将步骤(4)所得上清液过滤，除去上清液中粒径大于0.45μm的大颗粒，分别收集过滤液及截留物C2；
(6)一次超滤：将步骤(5)所得过滤液用截留分子量50KD的超滤系统超滤，压力不超过0.1MPa，收集透过液及截留液L1；
(7)二次超滤：将步骤(6)所得透过液用截留分子量30KD的超滤系统超滤，压力不超过0.1MPa，收集透过液与截留液A，所述截留液A即为分子量范围为30KD～50KD的水溶性中分子量胸腺蛋白原料；
(8)浓缩：取步骤(7)所得透过液进行浓缩，冷冻保存；
(9)三次超滤：将步骤(8)冷冻保存的浓缩液融化解冻，冻解液用截留分子量10KD的超滤系统进行超滤，压力不超过0.1MPa，收集透过液A及截留液L2，所述透过液A即为胸腺肽原料。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：取动物胸腺组织，除去脂肪、导管、外膜后得到胸腺，清洗后控干水分，倒入胶体磨中，按1:0.2～3的比例加入纯化水，匀浆1～3min，得匀浆液。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为将变性液反复冻融2～4次，冷冻温度为-10℃～-20℃，融化温度10～35℃。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(8)中浓缩1～10倍。
6.一种从胸腺组织中提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和DNA的方法，其特征在于，在权利要求1～5任一项所述方法的基础上，还包括如下步骤：
(10)将C1、C2、L1、L2混合，加入NaCl溶液和SDS溶液，涡混混匀；
(11)50～60℃水浴加热，离心取上清液，弃去沉淀。
(12)上清液加入等体积氯仿，涡混，静置过夜；
(13)取上清液，加入乙醇进行沉淀，0～4℃放置过夜；
(14)离心收集白色沉淀；
(15)加入酒精搅拌，对沉淀进行清洗，离心，对离心后沉淀减压干燥，即得DNA粗品。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(10)将C1、C2、L1、L2混合，加入2～3倍体积的1.5～2.5mol/LNaCl溶液和0.05～0.15倍体积的15％～25％SDS溶液，混匀。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(11)的离心条件为4000转/min，离心40min。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(13)具体为取上清液，边搅拌边加入1.5～2.5倍体积的-20℃95％乙醇，产生白色絮状沉淀，4℃放置过夜。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(14)具体为4℃、4000转/min离心40min，收集白色黏性沉淀。
CN201511034554.4A 2015-12-31 2015-12-31 胸腺组织提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和dna的方法 Pending CN105541996A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511034554.4A CN105541996A (zh) 2015-12-31 2015-12-31 胸腺组织提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和dna的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511034554.4A CN105541996A (zh) 2015-12-31 2015-12-31 胸腺组织提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和dna的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105541996A true CN105541996A (zh) 2016-05-04

Family

ID=55821587

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201511034554.4A Pending CN105541996A (zh) 2015-12-31 2015-12-31 胸腺组织提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和dna的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105541996A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106138099A (zh) * 2016-07-12 2016-11-23 浙江华尔成生物药业股份有限公司 药物组合物、药物制剂及其制备方法、用途
CN110760509A (zh) * 2019-07-03 2020-02-07 深圳瑞达生物股份有限公司 河豚精巢的鱼精成分提取方法
CN112143768A (zh) * 2020-09-29 2020-12-29 北京赛升药业股份有限公司 一种利用小牛胸腺联合制备dna和胸腺肽的方法
CN114805541A (zh) * 2022-05-27 2022-07-29 福建农业职业技术学院 一种猪胸腺肽的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1149057A (zh) * 1995-10-20 1997-05-07 中国人民解放军第四五八医院 幼龄动物胸腺生长因子及其提取分离方法
CN1721440A (zh) * 2004-07-12 2006-01-18 张宜俊 胸腺肽的制备方法
CN101167497A (zh) * 2007-12-03 2008-04-30 于忠波 一种含有胸腺多肽提取物的牛奶及其制备方法
CN101921331A (zh) * 2010-08-17 2010-12-22 郑州后羿制药有限公司 一种胸腺肽的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1149057A (zh) * 1995-10-20 1997-05-07 中国人民解放军第四五八医院 幼龄动物胸腺生长因子及其提取分离方法
CN1721440A (zh) * 2004-07-12 2006-01-18 张宜俊 胸腺肽的制备方法
CN101167497A (zh) * 2007-12-03 2008-04-30 于忠波 一种含有胸腺多肽提取物的牛奶及其制备方法
CN101921331A (zh) * 2010-08-17 2010-12-22 郑州后羿制药有限公司 一种胸腺肽的制备方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
徐志鹏 等: "规模化制备小牛胸腺DNA的工艺研究", 《药物生物技术》 *
李如亮: "《生物化学实验》", 31 January 1998, 武汉大学出版社 *
林莹 等: "响应曲面优化小牛胸腺肽提取工艺", 《生物技术》 *
蔡红杰: "小牛胸腺肽生产工艺的改进及制剂的分析", 《中国民康医学》 *
陈庆森 等: "《实用生物化学实验技术指导》", 30 September 2013, 浙江大学出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106138099A (zh) * 2016-07-12 2016-11-23 浙江华尔成生物药业股份有限公司 药物组合物、药物制剂及其制备方法、用途
CN110760509A (zh) * 2019-07-03 2020-02-07 深圳瑞达生物股份有限公司 河豚精巢的鱼精成分提取方法
CN112143768A (zh) * 2020-09-29 2020-12-29 北京赛升药业股份有限公司 一种利用小牛胸腺联合制备dna和胸腺肽的方法
CN114805541A (zh) * 2022-05-27 2022-07-29 福建农业职业技术学院 一种猪胸腺肽的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110499287B (zh) 简易制备胎盘间充质干细胞外泌体的方法
CN109097328A (zh) 一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法
CN105541996A (zh) 胸腺组织提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和dna的方法
CN107988153A (zh) 人脐带血间充质干细胞源分离外泌体的方法和使用的试剂
CN110540956B (zh) 由胎盘间充质干细胞简易制备细胞因子的方法
CN101638637B (zh) 人类骨髓、脐带血、外周血干细胞分离试剂盒及干细胞分离方法
CN109349419B (zh) 一种修复人体细胞的复合牦牛骨胶原蛋白肽粉
CN103275191B (zh) 一种大量快速提取鲎素肽的方法
CN105331665A (zh) 一种猪脑蛋白酶解制备脑多肽和脑小分子肽的方法
CN109825472A (zh) 一种细胞外囊泡的提取方法及试剂盒
CN107674901B (zh) 从大鲵肉骨提取的小分子肽及其提取方法
CN106540249A (zh) 一种禽流感(h5n1)或猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒疫苗的抗原浓缩纯化方法
CN105601735B (zh) 一种静注巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法
CN102250839A (zh) 一种通用型细胞处理试剂盒及其应用方法
CN105542010A (zh) 脂蛋白相关磷脂酶a2单克隆抗体、抗体对及制备方法、用途
CN109601437B (zh) 泥鳅粘液胁迫分泌并收集的方法
CN104387459A (zh) 一种细菌源抗菌肽的工业化分离纯化方法
CN1314359C (zh) 一种海参超细粉体的制备方法
CN103408625B (zh) 一种纯化dna的方法
WO2020024594A1 (en) Preparation method and application of recombinant mutant collagenase
CN112143768B (zh) 一种利用小牛胸腺联合制备dna和胸腺肽的方法
CN113274421A (zh) 一种膝关节治疗用抗炎型外泌体制剂及制备方法和应用
CN103041366B (zh) 一种骨肽组合物及其制备方法
CN102516382A (zh) 一种海南湍蛙抗微生物肽Hainanenin-5及其基因、分离纯化、化学合成和应用
CN103172721B (zh) 一种海南湍蛙抗微生物肽Hainanenin-1及其基因、分离纯化、化学合成和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160504