CN103041366B

CN103041366B - 一种骨肽组合物及其制备方法

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Publication number: CN103041366B
Application number: CN201210571589.1A
Authority: CN
Inventors: 方同华
Original assignee: HEILONGJIANG ZBD PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HEILONGJIANG ZBD PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2012-12-25
Filing date: 2012-12-25
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2032-12-25
Also published as: CN103041366A

Abstract

本发明涉及一种骨肽组合物及其制备方法，该组合物中含有以下重量份的成分：骨肽化合物20-45重量份，氨基酸12-26重量份，核酸0-9重量份，游离脂肪酸0-0.01重量份，高分子量物质不超过2份。试验证实，本发明的骨肽组合物具有明显的抗炎活性及明显的促进骨折愈合作用，且效果优于现有技术。

Description

一种骨肽组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及骨肽的制剂，具体涉及骨肽组合物及其制备方法。

背景技术

骨肽注射液（Ossotide Injection）为复方制剂，其主要成分为有机钙、磷、无机钙、无机盐、微量元素、氨基酸等。骨肽注射液有利于骨折修复。也可用于治疗增生性骨关节疾病及风湿、类风湿关节炎等。

骨肽有盐水、酸水、碱水提取及酶解法去除相关杂质，如：

盐水热压提取、过滤，去脂、离心、醇沉、过柱：CN200510076912.8公开了一种制备骨肽注射剂的方法，将哺乳动物骨用盐水热压煮提，离心过滤，合并煮提液，低温放置1-40小时，去除表层脂肪，温热后离心过滤，真空浓缩后加入乙醇，静置沉淀，吸出上层醇液，定容回收乙醇，得水提液，将水提液加等体积蒸馏水，一次通过弱酸性阳离子树脂柱、弱碱性阴离子树脂柱、珠状壳聚糖柱和壳聚糖改性活性炭柱，去杂纯化，得纯净稀药液。此方法中先醇沉后过柱除杂，得到的药液中可能含有树脂的降解物等污染物，且多种树脂柱的使用造成大量酸性氨基酸或碱性氨基酸的损失。

酸水提取：CN201110094765.2公开一种注射用骨肽的制备工艺，其用哺乳动物四肢骨，除去剩肉，粉碎，水洗后用酸水热压2-3次，冷却，分层，然后水层用无水乙醇沉淀，过滤，用酸调PH为1.0-2.0，过滤，去除沉淀；滤液用碱调PH值为7.8-8.8，过滤，去除沉淀，滤液调PH值近中性，过滤，去除沉淀，然后经超滤膜超滤，截留分子量为3000-10000道尔顿，得到骨肽溶液。酸水解法会使色氨酸全部被破坏，丝氨酸和酪氨酸部分被破坏，并产生二次污染。另外，该专利先醇沉，后酸沉碱沉，由酸沉和碱沉产生的杂质不能很好的去除。

碱溶液提取：CN200610150890.X使用碱性提取、酸性提取的方法提取骨肽，取健康新鲜冷冻的哺乳动物的四肢骨，清洗，压碎，将其置夹层锅中，加入5%氢氧化钠溶液30℃~55℃水解12~48小时，取上清液，调pH值酸沉，加热，冷却静置后过滤。碱水解法使含羟基和巯基的氨基酸，全部被破坏且产生消旋，因此增加了新的杂质。

酶解：CN200610033055.8公开了一种制备方法，取新鲜的动物四肢骨，清洗、消毒、粉碎、加入蒸馏水，在恒温反应罐内以蛋白酶控制水解。

而多数工艺包含提取、去脂、浓缩、醇沉、调酸、调碱、超滤膜过滤，类似上述方法的相关文献很多，具体如下：

热压提取、冷却、去脂，浓缩，醇沉、调酸、调碱：CN200610017008.4公开了一种骨肽注射液制备工艺，该发明将猪四肢骨提取、去脂、浓缩，然后沉淀、浓缩，再进行酸性沉淀、碱性沉淀，将加热后的液体冷至室温后置于冷库中，取出除去酸性蛋白，进行过滤及超滤得到骨肽原液，再加水调解、过滤、灌封、灭菌即得骨肽注射液。醇沉可以去除由酸性沉淀及碱性沉淀产生的杂质，该专利先醇沉，后酸沉碱沉，未能达到除杂的效果。

热压提取、冷藏、去脂、调酸、离心、超滤：CN200510051475.4公开了骨肽提取液的制备方法，取哺乳动物四肢骨，加水热压提取3次，热压温度为115-121℃，时间为1-2小时，压力为0.15-0.2Mpa；合并提取液，冷藏12-48小时，除去上层浮脂，上清液调pH值2.0~3.0，放置12-24小时，滤过，滤液加热65-80℃，时间为15-20分钟，冷却后离心，离心条件为3000-4000转/分，离心时间为15-30分钟，过滤，得清液，清液用截留分子量10000以下的超滤膜超滤1-2次，超滤得到骨肽提取物。该发明中仅去除碱性蛋白，未除酸性蛋白。

热压提取、去脂、调酸、醇沉、调中性、调碱：CN200710099629.6提供了一种骨肽注射剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤：将猪或牛的四肢骨，洗净、打碎，加入1-4倍重量的纯化水，105-120℃高压提取至少2次，每次1-3小时，合并提取液，过滤，冷藏，除去上层油脂，调pH值1.0-4.0，煮沸，冷藏；过滤，取上清液，减压浓缩，加入乙醇，使其含醇量达到60-80%，静置，过滤，回收乙醇至无醇味，用注射用水稀释，调节pH值6.0-8.0，过滤，灭菌，冷冻，缓化后室温放置，过滤，调pH值6.8-7.2，脱色，调pH值6.8-7.2，灭菌，冷冻至结冰，取出缓化，用注射用水将缓化后的药液稀释，调节pH值6.8-7.5，精滤，得到骨肽注射液。该发明先醇沉，后去除酸性蛋白，且调节pH至弱碱性，不能有效去除酸性蛋白及其杂质。

加压提取、调酸、调碱、超滤膜过滤：CN200410013508.1公开了一种注射用骨肽的制备工艺，其中骨肽的制备方法为：取哺乳动物的骨，加压提取1~2次，合并提取液，调酸性pH值为2.0-5.0，去沉淀，调碱性pH值8.0-9.5，去沉淀，调中性pH值，将所述的沉淀澄清，用超滤膜超滤，截留分子量为3000~10000道尔顿，制得骨肽提取液。该专利未进行醇沉，由酸性沉淀及碱性沉淀产生的大量的杂质不能得到有效去除。

热压提取、去脂、醇沉、碱沉、醇沉：CN200810148842.6公开了一种骨肽提取物的制备方法将猪四肢骨破碎后加水热压提取，提取液浓缩，得浓缩液，先后进行酸沉、碱沉、醇沉，冷藏放置，分子量为10000道尔顿超滤。该专利中大量的浓缩步骤，导致活性物质失活。

而上述方法中，骨肽化合物含量较低，杂质去除不完全，上市产品偶有发热、皮疹等过敏反应。

发明人对其提取技术进行了进一步的改进，得到了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种骨肽组合物。

本发明提供了一种骨肽组合物，该组合物中含有以下重量份的成分：骨肽化合物20-45重量份，氨基酸12-26重量份，核酸0-9重量份，游离脂肪酸0-0.01重量份，高分子量物质不超过2份。

优选地，所述骨肽组合物中含有以下重量份的成分：骨肽化合物26-45重量份，氨基酸17-26重量份，核酸0-5.2重量份，游离脂肪酸0-0.004重量份，高分子量物质不超过1份。

进一步优选，所述骨肽组合物中含有以下重量份的成分：骨肽化合物40-45重量份，氨基酸22-26重量份，核酸0-1.23重量份，游离脂肪酸0-0.003重量份，高分子量物质不超过0.62份。

上述组合物中：

所述的重量份可以是μg、mg、g、kg等医药领域公知的重量单位，也可以是上述单位的倍数，如100倍、10倍、1/100倍、1/10倍。

所述骨肽化合物是由胶原蛋白在适当高温高压条件下，充分水解形成较小分子量的多肽，分子量约为1000-10000道尔顿；

所述氨基酸包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和赖氨酸。

所述核酸是由核苷酸聚合而成的生物大分子化合物；

所述游离脂肪酸为中性脂肪被酵素分解的产物；

所述高分子量物质为分子量高于11000道尔顿的物质。

本发明还提供了一种制备上述骨肽组合物的方法，该方法包括以下步骤：

1）哺乳动物四肢骨经破碎清洗，加入四肢骨重量2倍量水，保温热压提取2次，温度为105-120℃，压力为0.1-0.12Mpa，每次提取1-3小时，滤过，0-7℃冷藏12-36小时；

2）除去上层油脂，滤液用盐酸溶液调节pH值至1.8-3.0，煮沸30-60分钟，0-7℃冷藏12-36小时；滤取上清液，氢氧化钠溶液调节pH值至8.5-11.0，煮沸30-60分钟，0-7℃冷藏12-36小时；

3）滤取上清液，减压浓缩至2.5-3.0g/ml，加入95%乙醇使含醇体积量达到60-80%，静置12小时，经滤纸与0.45μm微孔滤膜过滤，滤液加入药液体积0.5-1.0%的药用炭，30-45℃保温吸附15-30分钟，经滤纸与0.45μm微孔滤膜过滤，回收乙醇至无醇味；

4）用注射用水稀配至1-1.5g/ml，调pH值6.0-7.2，经0.22μm滤膜滤过，经10000超滤膜超滤，超滤液浓缩，浓缩液经0.22μm滤膜滤过，经5000-8000超滤膜超滤，即得骨肽组合物。

优选的，上述组合物的制备方法包括以下步骤：

1）猪或牛四肢骨经破碎清洗，加入四肢骨重量2倍量的水，保温热压提取2次，温度为110-120℃，压力为0.11-0.12Mpa，每次提取1-3小时，滤过，0-5℃冷藏18-36小时；

2）除去上层油脂，滤液用盐酸溶液调节pH值至2.0-3.0，煮沸30-60分钟，0-5℃冷藏18-36小时；滤取上清液，40%氢氧化钠溶液调节pH值至9.0-11.0，煮沸30-60分钟，0-5℃冷藏18-36小时；

3）滤取上清液，减压浓缩至2.7-3.0g/ml，加入95%乙醇使含醇体积量达到70-80%，静置12小时，经滤纸与0.45μm微孔滤膜过滤，滤液加入药液体积0.5-1.0%的药用炭，40-45℃保温吸附15-30分钟，经滤纸与0.45μm微孔滤膜过滤，回收乙醇至无醇味；

4）用注射用水稀配至1.2-1.5g/ml，调pH值6.8-7.2，经0.22μm滤膜滤过，经10000超滤膜超滤；超滤液浓缩至2.5g/ml，浓缩液经0.22μm滤膜滤过，经5000-8000超滤膜超滤，即得组合物。

进一步优选，上述组合物的制备方法包括以下步骤：

1）猪或牛四肢骨经破碎清洗，加入四肢骨重量2倍量的水，保温热压提取2次，温度为115-120℃，压力为0.11-0.12Mpa，每次提取1-3小时，滤过，0-4℃冷藏18-36小时；

2）除去上层油脂，滤液用盐酸溶液调节pH值至2.3-3.0，煮沸40-60分钟，0-4℃冷藏18-36小时；滤取上清液，40%氢氧化钠溶液调节pH值至10.2-11.0，煮沸40-60分钟，0-4℃冷藏18-36小时；

3）滤取上清液，减压浓缩至2.7-3.0g/ml，加入95%乙醇使含醇体积量达到70-75%，静置12小时，经滤纸与0.45μm微孔滤膜过滤，滤液加入药液体积0.8-1.0%的药用炭，40-45℃保温吸附20-30分钟，经滤纸与0.45μm微孔滤膜过滤，回收乙醇至无醇味；

4）用注射用水稀配至1.2-1.5g/ml，调pH值7.0-7.2，经0.22μm滤膜滤过，经10000超滤膜超滤；超滤液浓缩至2.5g/ml，浓缩液经0.22μm滤膜滤过，经6000-8000超滤膜超滤，即得组合物。

上述方法中：

所述水为纯化水、矿物质水或注射用水，优选为注射用水。

所述稀配或浓缩g/ml均是以每ml液体中含的四肢骨的重量计算。

本发明还提供了上述骨肽组合物特征图谱的测定方法，该方法包括以下内容：使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1%三氟醋酸水溶液为流动相A，以体积比为400:100:0.5的水-乙腈-三氟醋酸为流动相B，柱温37℃，检测波长为257nm，线性梯度洗脱。

具体的，所述特征图谱的测定方法，该方法包括以下步骤：

1）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（如ACQUITYUPLC HSST3，2.1mm×50mm，1.8μm）；以0.1%三氟醋酸水溶液为流动相A，以水-乙腈-三氟醋酸（400:100:0.5）为流动相B；柱温37℃；流速为每分钟0.3ml；检测波长为257nm；按表1进行线性梯度洗脱，采样速率为每秒5点；理论板数按黄嘌呤峰计算不低于5000；

表1梯度洗脱表

2）对照品溶液制备：取黄嘌呤对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含黄嘌呤3.6μg的溶液，即得；

3）供试品溶液的制备：取本品，用水稀释制成每1ml约含多肽类物质5mg的溶液，即得；

4）测定法：分别取供试品溶液与对照品溶液各1μl，注入UPLC，记录色谱图；供试品色谱图应与对照特征图谱基本一致；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算1分钟至5分钟之间的色谱峰的相似度，供试品特征图谱与对照特征图谱的相似度不得低于0.90。

本发明还提供了上述骨肽组合物中黄嘌呤的检测方法，该方法包括以下内容：

使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1%三氟醋酸水溶液为流动相A，以体积比为400:100:0.5的水-乙腈-三氟醋酸为流动相B，柱温37℃，检测波长为257nm，线性梯度洗脱。

具体的，所述黄嘌呤的检测方法，该方法包括以下步骤：

1）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（如ACQUITYUPLC HSST3，2.1mm×50mm，1.8μm）；以0.1%三氟醋酸水溶液为流动相A，以水-乙腈-三氟醋酸（400:100:0.5）为流动相B；柱温37℃；流速为每分钟0.3ml；检测波长为257nm；按表1进行线性梯度洗脱，采样速率为每秒5点，理论板数按黄嘌呤峰计算不低于5000；

4）测定法：分别取供试品溶液与对照品溶液各1μl，注入UPLC，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。

本发明还提供了含上述骨肽组合物的制剂，由骨肽组合物和药学上可接受的载体组成。

所述制剂为注射液或冻干粉针。

所述载体为甘露醇、乳糖、葡聚糖、丙二醇、聚乙二醇、右旋糖酐-20、右旋糖酐-40、山梨醇、氯化钠、葡萄糖或水中的一种或几种。

当制剂为冻干粉针时，本发明还提供了一种制备冻干粉针的方法，该方法为常规方法制备的冻干粉针剂。

本发明还提供了上述骨肽组合物及其制剂在制备治疗骨关节疾病的药物中的应用。

本发明提供的骨肽组合物具有以下优点：

1、提取方法

1）105-120℃热压0.1-0.12Mpa保温提取，使胶原蛋白在适当高温高压条件下，充分水解成较小分子量的多肽，易被人体吸收，有效的提高了骨肽化合物的收率；

2）将溶液的pH值调酸性、碱性后，将溶液煮沸，有效去除溶液中酸性蛋白及碱性蛋白；

3）将醇沉步骤放在酸沉及碱沉后，并调节醇沉参数，去除了由于调酸或调碱带来的杂质及新产生的杂质，随后加入活性炭保温吸附，杂质去除完全；

4）分别经过10000及5000-8000道尔顿分子量滤膜超滤，有效的控制骨肽化合物分子量的范围，并使高分子量物质在2%以下；

5）两次超滤前分别过0.22μm滤膜，有效去除热原，保证组合物的质量安全性。

6）使用40%氢氧化钠调pH，能够快速将溶液pH值调节至9.0-11.0，使酸性蛋白迅速沉淀，酸性蛋白去除完全。

2、组成：现有技术中，只测定多肽的含量，其他成分未进行测定，但是从工艺上，发明人从酸性蛋白、碱性蛋白等杂质是否去除完全来判断工艺是否更优，并通过药效对比来证明。

本发明提供的骨肽组合物，显著提高了骨肽化合物的含量，通过核酸、嘌呤及高分子量的测定，从多指标控制产品质量，确保产品的稳定性及安全性。

3、检测方法

通过控制多肽、氨基酸、特征图谱、活性测定及游离脂肪酸、黄嘌呤、核酸、高分子量物质的含量测定，严格控制组合物质量，确保骨肽组合物的稳定性及安全性。

4、试验证实，本发明的骨肽组合物具有明显的抗炎活性及明显的促进骨折愈合作用，且效果优于现有技术。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：骨肽组合物

1、猪四肢骨4kg经破碎清洗，加入8kg（四肢骨重量的2倍量）注射用水，热压提取2次，温度为105℃，压力为0.10Mpa，第一次2小时，第二次1小时，滤过，7℃冷藏12小时；

2、除去上层油脂，滤液用盐酸溶液调节pH值至1.8，煮沸30分钟，7℃冷藏12小时，滤取上清液，40%氢氧化钠溶液调节pH值至8.5，煮沸30分钟，7℃冷藏12小时；

3、滤取上清液，减压浓缩至1600ml（约为2.5g生药/ml），加入95%乙醇使含醇体积量达到60%，静置12小时，经滤纸与0.45μm微孔滤膜过滤，滤液加入药液体积0.5%的药用炭，30℃保温吸附20分钟，经滤纸与0.45μm微孔滤膜过滤，回收乙醇至无醇味；

4、用注射用水稀配至4000ml（约为1g生药/ml），调pH值6.0，经0.22μm滤膜滤过，经10000超滤膜超滤。超滤液浓缩至1588ml（约为2.5g生药/ml），浓缩液经0.22μm滤膜滤过，经5000超滤膜超滤，即得骨肽组合物。

实施例2：骨肽组合物

1、猪四肢骨4kg经破碎清洗，加入8kg（四肢骨重量的2倍量）注射用水，热压提取2次，温度为110℃，压力为0.11Mpa，每次2小时，滤过，5℃冷藏24小时；

2、除去上层油脂，滤液用盐酸溶液调节pH值至2.0，煮沸30分钟，5℃冷藏24小时。滤取上清液，40%氢氧化钠溶液调节pH值至9.0，煮沸30分钟，5℃冷藏12小时；

3、滤取上清液，减压浓缩至1340ml（约为3g生药/ml），加入95%乙醇使含醇体积量达到80%，静置24小时，经滤纸与0.45μm微孔滤膜过滤，滤液加入药液体积0.5%的药用炭，40℃保温吸附15分钟，经滤纸与0.45μm微孔滤膜过滤，回收乙醇至无醇味；

4、用注射用水稀配至2665ml（约为1.5g生药/ml），调pH值6.8，经0.22μm滤膜滤过，经10000超滤膜超滤。超滤液浓缩至1590ml（约为2.5g生药/ml），浓缩液经0.22μm滤膜滤过，经5000超滤膜超滤，即得骨肽组合物。

实施例3：骨肽组合物

1、牛四肢骨4kg经破碎清洗，加入8kg（四肢骨重量的2倍量）注射用水，热压提取2次，温度为115℃，压力为0.11Mpa，第一次2小时，第二次1小时，滤过，0℃冷藏18小时；

2、除去上层油脂，滤液用盐酸溶液调节pH值至3.0，煮沸40分钟，0℃冷藏18小时。滤取上清液，40%氢氧化钠溶液调节pH值至11.0，煮沸40分钟，0℃冷藏18小时；

3、滤取上清液，减压浓缩至1500ml（约为2.7g生药/ml），加入95%乙醇使含醇体积量达到70%，静置12小时，经滤纸与0.45μm微孔滤膜过滤，滤液加入药液体积1.0%的药用炭，40℃保温吸附20分钟，经滤纸与0.45μm微孔滤膜过滤，回收乙醇至无醇味；

4、用注射用水稀配至3345ml（约为1.2g生药/ml），调pH值7.2，经0.22μm滤膜滤过，经10000超滤膜超滤。超滤液浓缩至1602ml（约为2.5g生药/ml），浓缩液经0.22μm滤膜滤过，经8000超滤膜超滤，即得骨肽组合物。

实施例4：骨肽组合物

1、牛四肢骨4kg经破碎清洗，加入8kg（四肢骨重量的2倍量）注射用水，热压提取2次，温度为120℃，压力为0.12Mpa，第一次3小时，第二次2小时，滤过，4℃冷藏36小时；

2、除去上层油脂，滤液用盐酸溶液调节pH值至2.3，煮沸60分钟，4℃冷藏36小时，滤取上清液，40%氢氧化钠溶液调节pH值至10.2，煮沸60分钟，4℃冷藏36小时；

3、滤取上清液，减压浓缩至1355ml（约为3g生药/ml），加入95%乙醇使含醇体积量达到75%，静置12小时，经滤纸与0.45μm微孔滤膜过滤，滤液加入药液体积0.8%的药用炭，45℃保温吸附30分钟，经滤纸与0.45μm微孔滤膜过滤，回收乙醇至无醇味；

4、用注射用水稀配至2690ml（约为1.5g生药/ml），调pH值7.0，经0.22μm滤膜滤过，经10000超滤膜超滤。超滤液浓缩至1594ml（约为2.5g生药/ml），浓缩液经0.22μm滤膜滤过，经6000超滤膜超滤，即得骨肽组合物。

实施例5：含骨肽组合物的冻干粉针剂

1、组成：骨肽组合物（实施例2的方法制备）5.0g、甘露醇100g，注射用水加至1000ml。

2、制备方法：

1）先用注射用水将甘露醇溶解后，再加入0.5%活性炭脱色，过滤得水溶液；

2）将水溶液加入到骨肽组合物中，0.45μm滤膜粗滤，调pH值6.8，0.22μm微孔滤膜精滤，冷冻干燥，得骨肽冻干粉针剂。

实施例6：含骨肽组合物的冻干粉针

1、组成：骨肽组合物（实施例3的方法制备）10.0g、乳糖150g，注射用水加至1000ml。

2、制备方法：

1）先加注射用水将乳糖溶解后，再加入1%活性炭脱色，过滤得水溶液；

2）将水溶液加入到实骨肽组合物中，0.45μm滤膜粗滤，调pH值7.5，0.22μm微孔滤膜精滤，冷冻干燥，得骨肽冻干粉针剂。

实施例7：含骨肽组合物的冻干粉针

1、组成：骨肽组合物（实施例4的方法制备）15.0g、葡聚糖200g，注射用水加至1000ml。。

2、制备方法：

1）先加注射用水将葡聚糖溶解后，再加入0.3%活性炭脱色，过滤得水溶液；

2）将水溶液加入到骨肽组合物中，0.45μm滤膜粗滤，调pH值7.0，0.22μm微孔滤膜精滤，冷冻干燥，得骨肽冻干粉针剂。

对比例1：骨肽提取物

200410013508.1的实施例4，具体提取方法为：

取哺乳动物的骨，加压提取1次，合并提取液，调酸性pH值为2.0，去沉淀，调碱性pH值8.0，去沉淀，调中性pH值，将所述的沉淀澄清，用超滤膜超滤，结瘤分子量为3000道尔顿，即得。

对比例2：骨肽提取物

参考200610017008.4的实施例，具体提取方法为：

1、提取、去脂、浓缩：取健康新鲜猪四肢骨，洗净，打碎，称重，每75kg原料加水75-150kg，1.2kg/cm²热压1.5小时，用双层纱布过滤，骨渣再加水75kg，同上操作热压1小时，过滤，合并两次滤液，立即置于夹层锅中，通冷却水，冷至室温，放置于-20~-30的冷库中，待冷却至0-5℃转入冷室中静置12-24小时，撇去上层脂肪，加温使冻状物融成液体，浓缩或真空浓缩，得体积为50L的浓缩液。

2、沉淀、浓缩：取浓缩液加入乙醇至浓度为70%，静置沉淀24-36小时，除去杂蛋白，得上清，再于60℃下真空浓缩至20L；

3、酸性沉淀、碱性沉淀：上述液体在搅拌下加入6mol/L盐酸，调节pH至4，常压加热100℃，45分钟，冷至室温，立即置于-20~-30的冷库中，降至0-5℃后，移入0-5℃冷库或冷柜，放置过夜，次日取出除去酸性蛋白，收集上清液，在搅拌条件下加入5%氢氧化钠溶液，调节pH至8.5，加热100℃，45分钟，冷至室温，立即放入-20~-30的冷库中，降至0-5℃后，移入0-5℃冷库或冷柜中；

4、过滤及超滤：上清液调体积为18升左右，过纸浆或滤纸，再过10万道尔顿分子量的超滤柱超滤，再过1万道尔顿分子量超滤柱超滤一次，即得骨肽原液。

对比例3：骨肽提取物

参考200710099629.6的实施例1，具体方法包括以下步骤：

将新鲜的猪四肢骨，剔除残肉、洗净、打碎成10cm的小块，加入2倍量的纯化水，120℃、0.1Mpa压力下提取2次，分别为2小时和1小时，合并提取液，过滤，于5℃冷藏24小时；

除去上层油脂，用10%盐酸调节pH值2.6，煮沸40分钟，冷藏12小时，滤取上清液，在75℃下减压浓缩至2.8g/ml，待温度降至30℃以下加入乙醇，使得含醇量得到70%，静置12小时后过滤至澄清，回收乙醇至无醇味，用注射用水稀释至1g/ml，40%的氢氧化钠溶液调节pH值7.3，滤纸过滤，0.22μm滤膜过滤，6000分子量卷膜式超滤器超滤，灌装，115℃灭菌40分钟，冷冻至结冰，取出缓化后置室温放置1周，倒出药液，0.2μm滤膜过滤，调pH值6.8，用6000分子量卷膜式超滤器超滤，超滤后的药业搅拌均匀，20%的氢氧化钠溶液调pH值为7.2，加入0.2%活性炭，加热煮沸15分钟内哄，冷却至50℃，0.2μm滤膜过滤，调pH值7.2，灌装，115℃霉菌40分钟，冷冻至结冰，取出缓化。

对比例4：骨肽提取物

参考200810148842.6的实施例3，具体方法包括以下步骤：

1、提取：将破碎后猪四肢骨的物料投入提取罐，加入投料重量3倍的纯化水，热压提取，压力控制在0.11-0.12mPa，热压提取2次，每次1小时；

2、浓缩：将热压提取后所得的药液浓缩，滤液先分别浓缩至原料重量的50±2%；

3、酸沉：合并浓缩液，去上层油脂，继续浓缩至原料重量的65%，冷却至室温，用1：1盐酸（纯化水与36-38%的盐酸按体积比配比）调pH值至2.0，100℃保温60分钟，冷却至室温，0-5℃静置12h以上；

4、碱沉：酸沉液过滤，滤液用20%氢氧化钠调pH值至9.0，100℃保温60分钟，冷却至室温，0-5℃静置12h以上；

5、醇沉：碱沉液过滤，滤液用1：1盐酸（纯化水与36-38%的盐酸按体积比配比）调pH值至7.0，减压浓缩至原料重量的28%，冷却至60℃，不断搅拌下加入乙醇，使含醇量达到70%，0-5℃静置12小时以上；

6、超滤：将药液用截流分子量为10KDa的中空纤维柱进行超滤，工作压力不高于0.1MPa，收集超滤液，将超滤液混合均匀，冷冻存放，即得。

实验例1：含量检测

对实施例1-4和对比例1-4进行含量检测，包括多肽、游离脂肪酸、核酸、高分子量物质、黄嘌呤、活性物质，具体检测方法为：

1、多肽含量测定

取本品适量，加水适量使内容物溶解，制成每1ml中约含多肽类物质5mg的溶液，精密量取2ml置试管中，精密加入双缩脲试液（取硫酸铜CuSO₄·5H₂O）1.5g和酒石酸钾钠（NaKC₄H₄O₆·4H₂O）6.0g，加水500ml使溶解，边搅边加入10%氢氧化钠溶液300ml，用水稀释至1000ml，混匀，即得。室温放置30分钟。照紫外-可见光光度法（中国药典2010年版二部附录ⅣA），在540nm的波长处测定吸光度。

另取酪蛋白对照品适量，精密称定，加0.05mol/L氢氧化钠溶液溶解并定量稀释成每1ml中约含7mg的溶液，精密量取2ml置试管中，从“精密加入双缩脲试液……”开始，同法操作，测定吸光度，计算，即得。

2、游离脂肪酸：取本品适量，用水稀释制成每1ml中约含多肽类物质5mg的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml，置20ml具塞试管中，加异丙醇-正庚烷0.5mol/L硫酸溶液（40:10:1）5.0ml，振摇1分钟，放置10分钟。精密加入正庚烷和水各3ml，密塞，上下翻转10次，静置至少15分钟，使分层，精密量取上层液3ml，置10ml离心管中，加尼罗蓝指示液（取尼罗蓝0.04g，加水200ml，使溶解后，加正庚烷100ml，振摇，弃去上层液正庚烷，反复操作4次。取下层水溶液20ml，加无水乙醇180ml，摇匀。本液置棕色瓶中，室温下可存放一个月）1ml，在通氮气的条件下，用氢氧化钠滴定液（0.01mol/L）滴定至溶液显淡紫色。

3、核酸：精密量取本品适量，用水稀释制成每1ml中约含多肽类物质5mg的溶液，精密量取2ml，置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。照紫外-可见分光光度法（中国药典2010年版二部附录ⅣA），在260nm的波长处测定吸光度，按吸收系数（E^1% _1cm）为200计算核酸含量。

4、高分子量物质：取本品，用水稀释制成每1ml中约含多肽类物质1mg的溶液，作为供试品溶液。另取细胞色素C对照片适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为对照品溶液。照分子排阻色谱法（中国药典2010年版二部附录ⅤH）测定。用凝胶色谱柱（TSK GEL G2000SWXL）；以水-乙腈-三氟醋酸（90:10:0.05）为流动相，流速为每分钟1.0ml；检测波长为214nm。理论板数按细胞色素C峰计算不低于2000。精密量取对照溶液和供试品溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中，将先于细胞色素C保留时间的峰定为高分子量物质，按面积归一化法计算。

5、黄嘌呤

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（如ACQUITYUPLC HSST3，2.1mm×50mm，1.8μm）；以0.1%三氟醋酸水溶液为流动相A，以水-乙腈-三氟醋酸（400:100:0.5）为流动相B；柱温37℃；流速为每分钟0.3ml；检测波长为257nm；按表1进行线性梯度洗脱，采样速率为每秒5点，理论板数按黄嘌呤峰计算不低于5000。

对照品溶液制备：取黄嘌呤对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含黄嘌呤3.6μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品，用水稀释制成每1ml约含多肽类物质5mg的溶液，即得。

测定法：分别取供试品溶液与对照品溶液各1μl，注入UPLC，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。

6、活性测定方法

供试品溶液的制备：取样品，分别以MEM培养液稀释成0.25mg/ml、0.5mg/ml两种浓度的供试品溶液。

细胞型号：人成骨肉瘤细胞MG-63（来源：南京凯基生物科技发展有限公司）。MG-63人成骨肉瘤细胞在复苏后的第2至第12代内均可用于活性测定试验。

培养液：10%优级胎牛血清MEM培养液（来源：MEM培养液：南京凯基生物科技发展有限公司；优级胎牛血清：澳大利亚）。

细胞悬液的制备：将复苏后的第2至第12代的MG-63人成骨肉瘤细胞，用0.25%胰酶消化液消化，以10%优级胎牛血清MEM培养液稀释成每ml中含（3-4）×10⁴个细胞浓度的细胞悬液。

细胞的接种：将上述细胞悬液分别接种于2个96孔培养板上，每孔100μl，其中留6孔加10%小牛血清DMEM高糖培液100μl作为空白对照，置37℃、5%二氧化碳饱和水汽培养箱中培养。

加入供试品溶液的时间及方法：其中一个培养板在培养24小时后加入供试液，而另一个培养板在培养48小时后加入供试液。每孔加供试品溶液100μl，每种浓度供试液均做6孔。细胞对照组和空白对照组每孔分别加DMEM高糖培养液100μl，加入供试液后，振荡混匀，继续培养24小时。

细胞的染色：在培养结束前4小时取出培养板，每孔加入MTT溶液20μl，振荡混匀，继续培养

测定法：培养结束后，吸出培养液，每孔加入100μl二甲基亚砜，振荡混匀，在酶标仪上550nm的波长处测定其吸收度值。

结果见表2：

表2：实施例与对比例的含量比较

表2结果显示：与对比例组比较，各实施例样品中多肽与氨基酸的含量显著提高，杂质成分游离脂肪酸、核酸及高分子量物质的量显著降低，使用MG-63人成骨肉瘤细胞进行的活性测定试验结果表明，实施例组样品活性较高。

实验例2：抗炎活性试验

1、实验动物：体重200-230g雄性Wistar大鼠。

2、实验分组：

将90只大鼠随机分为5组：对照组、实施例1-4组、对比例1-4组，每组10只；其中：

对照组：等量的生理盐水溶液；

给药组：实施例1-4组、对比例1-4组供试样品，剂量为1ml/100g体重（1ml样品相当于含生药2g）。

3、实验方法：

向给药组大鼠注射实施例1-4组及对比例1-4组供试样品，1小时后，测量右侧踝关节周长，向大鼠右后足掌皮内注射入新鲜蛋清0.1ml，分别于0.5、1、2、4、6小时测量右侧踝关节周长，并与注射蛋清前的周长比较，计算周长之差为肿胀程度。

4、统计方法：采用SPSS11.0统计软件包进行统计学分析。

5、实验结果：见表3

表3：实施例与对比例组合物抗炎活性试验比较

注：与对照组相比，^＊P<0.05，^**P<0.01；分别与对比例组比较，^＃p<0.05。

表3结果显示：

与注射前相比，在注射蛋清0.5小时后，对照组的右踝关节明显肿胀；

与对照组相比，在注射蛋清0.5、1、2、4、6小时后，实施例1-4各组肿胀程度显著减轻（P<0.01）；对比例1-4组明显减轻（P<0.05）；

分别与对比例1-4组相比，实施例1-4各组的肿胀程度明显减轻（P<0.05）。

结果表明：本发明的组合物具有明显的抗炎活性，效果优于现有技术。

实验例3：促进骨折愈合试验

1、实验动物：体重200-230g雄性Wistar大鼠。

2、实验分组：同实验例2。

3、实验方法：

将大鼠小腿人为造成闭合性人工骨折，每组分别腹腔注射实施例1-4组、对比例1-4组组合物，对照组注射生理盐水，然后于用药后的第15天、30天处死大鼠，观察骨折愈合情况。

4、统计方法：采用SPSS11.0统计软件包进行统计学分析。

5、实验结果：见表4

表4实施例与对比例组合物促进大鼠骨折愈合试验结果

注：1、上表中“——”表示已进入骨愈合的下一阶段。

2、与对照组相比，^＊P<0.05，^**P<0.01；分别与对比例组比较，^＃p<0.05。

表4结果显示：

15天后，对照组5只大鼠骨折断区域有中等量纤维成骨，均未见新生骨质；实施例组77%大鼠骨折断区域可见大量新生骨质，且新生骨质有规则排列；对比例组约55%大鼠出现新生骨质，与实施例比较，明显少于实施例。

30天后，对照组的80%大鼠骨折断区域可见纤维成骨，少数可见新生骨质，未见软骨组织及骨膜形成；实施例组全部出现新生骨质，75%可见软骨组织，近半数形成新骨膜；对比例组极少数可见软骨组织及骨膜，与实施例比较，明显少于实施例。

实验结果表明：本发明的骨肽组合物具有明显的促进骨折愈合作用，且效果优于现有技术。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种骨肽组合物，其特征在于，该组合物中含有以下重量份的成分：骨肽化合物40-45重量份，氨基酸22-26重量份，核酸0-1.23重量份，游离脂肪酸0-0.003重量份，高分子量物质不超过0.62份，其由以下方法制备：

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述骨肽化合物是由胶原蛋白在适当高温高压条件下，充分水解形成较小分子量的多肽，分子量约为1000-10000道尔顿。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述氨基酸包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和赖氨酸。

4.一种制备权利要求1-3任一项所述的组合物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1）猪或牛四肢骨经破碎清洗，加入四肢骨重量2倍量水，保温热压提取2次，温度为110-120℃，压力为0.11-0.12Mpa，每次提取1-3小时，滤过，0-5℃冷藏18-36小时；

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

7.含权利要求1-3任一项所述的组合物的制剂，其特征在于，所述制剂由骨肽组合物和药学上可接受的载体组成。

8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述制剂为注射液或冻干粉针。

9.权利要求1-3任一项所述的组合物或权利要求7所述的制剂在制备治疗骨关节疾病的药物中的应用。