CN107412718A - 一种高纯药用骨肽溶液的生物提取制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高纯药用骨肽溶液的生物提取制备方法，具体操作步骤为：将猪的四肢骨经热压提取，冷藏去脂肪、醇沉淀、浓缩、酸性碱性和中性100℃×30min加热二次过滤，除去杂蛋白、热吸附、超滤，多级高压电泳分离步骤制取高纯药用骨肽溶液；本发明是一种高纯药用骨肽溶液的生物提取制备方法，所述骨肽溶液具有抗炎、镇痛作用；临床用于治疗骨折愈合、骨质疏松和增生、风湿类风湿性关节炎。

Description

一种高纯药用骨肽溶液的生物提取制备方法
技术领域
本发明属于国家高新技术领域：02生物医药技术，尤其是涉及一种高纯药用骨肽溶液的生物提取制备方法，属于生物技术制备的生物化学药物。
背景技术
我国利用动物组织入药治病具有悠久的历史。《本草纲目》中记载的1892种药物中就有动物药物444种。其中对虎骨、狗骨、猪骨等药用功效均有专门的论述。1976年，我们研制成功了生化药物——骨宁注射液(即骨肽注射液)，适用于增生性关节炎的治疗。本发明提出了新的骨肽溶液制备方法，本项内容可增加历史对骨的使用和市场空间情况。
发明内容
本发明目的在于提供一种高纯药用骨肽的生物制备方法。
本发明技术方案是一种高纯药用骨肽溶液的生物提取制备方法，所述骨肽溶液为从猪的四肢骨中经高温高压提取、超滤和多级高压电泳分离而得一种高纯药用、具有生物活性的小分子多肽，分子量小于10000道尔顿。
优选的，所述的活性小分子多肽分子量小于10000道尔顿，而实际活性多肽分子量为6000~8000道尔顿。
优选的，所述的哺乳动物为猪、狗、牛、羊、马中任意一种，本专利优选为猪。
所述四肢骨提取制备包括如下步骤：
步骤一：取新鲜或冷冻的猪的四肢骨，剔除剩肉，粉碎，水洗后用1倍水热压2次，冷却，冷却后的提取液去脂，分取水层；
步骤二：水层用无水乙醇沉淀，过滤，浓缩；浓缩液加水，调pH至酸性、碱性、中性，100℃×30min加热过滤除去杂蛋白；
步骤三：滤液加活性炭和高岭土，100℃×30min后过滤，再超滤。
步骤四：超滤液采用多级高压电泳分离得到6000~8000道尔顿高纯药用骨肽溶液。
优选的，所述步骤一，热压提取的压力为0.3~0.35MPa，时间2.5h；所述步骤二，醇沉、酸碱中性加热过滤除杂蛋白，过滤采用0.45 μm聚合物滤膜过滤，膜两端压力为<0.15MPa；所述步骤三，溶液加入活性炭吸附去除热原，超滤除去大分子杂蛋白。所述步骤四，多级高压电泳分离大分子胨蛋白，保留小分子活性多肽。
所述骨肽溶液制备方法包括如下步骤：
步骤一：取新鲜或冷冻的猪的四肢骨，剔除剩肉，粉碎，加1倍纯化水，热压提取2次，合并提取液，0~-5℃过夜，次日去除上层油脂；
步骤二：水层加无水乙醇至醇度72~74%，放置一夜，次日过滤，滤液60℃下真空浓缩；
步骤三：浓缩液加水后调pH值为酸性、碱性和中性，加热至100℃×30min后过滤，滤液0~-5℃过夜，次日再过滤除杂蛋白；
步骤四：滤液加入适量活性炭和高岭土，加热100℃×30min后过滤除热原和有色有机物质，得清液；
步骤五：清液用超滤膜过滤一次，超滤液为药用骨肽溶液。
步骤六：超滤液采用多级高压电泳分离技术得到高纯药用骨肽溶液。
优选的，所述骨肽溶液可经处理，制成药剂学上可接受的不同剂型，如口服液、小容量注射剂、大容量注射剂、片剂、胶囊剂或冻干粉针剂，现选小容量注射剂和片剂。
优选的，所述骨肽溶液用来制备临床上用于治疗骨折愈合的药物。
优选的，所述高压为多级高压电泳分离，两端加10~30kv高电压，溶液pH值6到8，温度25-30摄氏度。
本发明的优点：用该方法生产的骨肽工艺简单，稳定，成本低廉，收率达到50％以上，骨肽溶液含量在10 mg/mL以上；收率和含量均高于全国同类产品10%以上；本发明专利采用加水而非加酸水热压提取二次，避免酸水提取时相关杂质的增加，且需采用-15℃以下，冷库存放，避免冷处存放加抑菌剂，易引起化学反应，有效地增加了制剂产品临床使用的安全性。
具体实施方式
为便于本领域技术人员理解本发明方案，现结合具体实施方式对本发明做进一步的说明。
本发明是一种高纯药用骨肽溶液的生物提取制备方法，所述骨肽溶液为从猪的四肢骨中经高温高压提取、生物技术纯化、超滤和多级高压电泳分离而得一种高纯药用、具有生物活性的小分子多肽，分子量小于10000道尔顿。
本发明所述的骨肽为从猪的四肢骨中提取的具有活性成分的小分子多肽，分子量在10000道尔顿以下，而主要活性多肽分子量在6000~8000道尔顿。
本发明所述的哺乳动物为猪、狗、牛、样、马中任意一种。优选为猪。
本发明的技术方案为：本发明所述的骨肽提取物的生物提取的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：取猪的四肢骨，除去剩肉，粉碎，水洗后用纯的水热压提取二次，过120目的筛后的提取液分取水层。
步骤二：水层经0~ -5℃过夜，次日除去上层油脂，水层加热加无水乙醇沉淀，过滤，去除沉淀；滤液60℃以下，真空浓缩；浓缩液加适量纯化水或溶液。
步骤三：溶液用酸调pH值为4.0～4.2，加热至100℃×30min后过滤，0~ -5℃过夜，次日再过滤，去除酸性蛋白。
步骤四：滤液用碱调pH值为8.3～8.5，加热至100℃×30min后过滤，0~ -5℃过夜，次日再过滤，去除碱性蛋白。
步骤五：滤液调pH值为7.0~7.2，加热至100℃×30min后过滤，0~ -5℃过夜，次日再过滤，去除中性蛋白。
步骤六：滤液经超滤膜超滤，截留分子量为10000道尔顿以下，得药用骨肽溶液。
步骤七：超滤液采用多级高压电泳分离得到6000~8000道尔顿高纯药用骨肽溶液。
所述步骤一，加水而不加酸，水提取物保证该药临床使用的安全性，热压提取的压力为0.3~0.35MPa，时间2.5h；所述步骤二，醇沉、酸碱中性加热过滤除去杂蛋白，采用0.45μm聚合物滤膜过滤，膜两端压力为<0.15MPa；所述步骤三，滤液加活性炭吸附除去热原，超滤除去大分子蛋白。所述步骤四，多级高压电泳分离除去大分子胨肽蛋白，进一步保留小分子活性多肽。
所述骨肽溶液生物提取物的制备方法包括如下：
步骤一：取猪的四肢骨，除去剩肉，粉碎，加1倍量纯化水，压力0.3~0.35MPa，时间2.5h，保温30 min，热压提取两次，合并提取液，冷却至0~ -5℃过夜，次日除去上层油脂，得下层水层。
步骤二：水层加入无水乙醇，使溶液醇达72％～74％，0~ -5℃过夜，次日过滤。
步骤三：滤液用1:1的盐酸调pH 7.0～7.2，加热100℃×30 min后过滤，0~ -5℃过夜，次日过滤，去除酸性蛋白。
步骤四：滤液用50％ NaOH 调pH 8.3～8.5，加热100℃×30 min后过滤，0~ -5℃过夜，次日过滤，去除碱性蛋白。
步骤五：滤液用1:1的盐酸调pH 7.0~7.2，加热100℃×30 min后过滤，0~ -5℃过夜，次日过滤，去除中性蛋白。
步骤六：滤液经超滤膜超滤，截取分子量为10000 道尔顿以下，得骨肽提取液。
步骤七：超滤液采用多级高压电泳分离得6000~8000道尔顿高纯药用骨肽溶液。
步骤八：骨肽提取液取样检验(全项)，合格后分装于洁净密闭的不锈钢桶中，经贴签后，存放于-15℃以下的冷库，有效期为12个月。
步骤九：指标：骨肽溶液含量应在10mg/mL 以上。
本发明专利采用加水而非加酸水热压提取二次，避免酸水提取时相关杂质的增加；贮存采用-15℃以下冷库存放，避免冷处存放加抑菌剂（易发生不良化学反应）的弊端；两者均有效地增加了制剂产品临床使用的安全性；为使本发明生产工艺，产品质量稳定，本工艺采用调节pH值酸性、碱性和中性，经100℃×30 min加热，使蛋白质变性后过滤除去，又增加了活性炭和白陶土加热过滤除去热原和有色有机物质；用生物技术方法进行纯化；最后，采用现代超滤技术和多级高压电泳分离技术得到高纯药用骨肽溶液。
本发明所述的高纯骨肽溶液可经后处理，优先制成小容量注射剂和片剂。
最后再采用现代超滤法和高压电泳法，取得高纯药用的骨肽溶液。
本发明的专利特点在于创新性提出和应用超滤和高压电泳相结合进行生物提取和纯化骨肽溶液，得到一种高纯药用原料；并改进产品工艺的核心技术。用于产品的产业化生产，可提高产品纯度和收率，得到的产品性价比更高，产品质量得到进一步提升，使产品临床治疗效果进一步提高；因而亦使最终产品经济效益更好，也提高了产品市场竞争力。
本发明方案在上面具体实施方式对发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性改进，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.本发明是一种高纯药用骨肽溶液的生物提取制备方法，其特征在于，所述骨肽溶液为从哺乳动物的四肢骨中经高温高压提取、超滤和多级高压电泳分离而得一种高纯药用、具有生物活性的小分子多肽，分子量小于10000道尔顿。
2.根据权利要求1所述的一种高纯药用骨肽溶液的生物提取制备方法，其特征在于，所述的活性小分子多肽分子量小于10000道尔顿，而实际活性多肽分子量为6000~8000道尔顿。
3.根据权利要求书1所述的一种高纯药用骨肽溶液的生物提取制备方法，其特征在于，所述的哺乳动物为猪、狗、牛、羊、马中任意一种，优选为猪和胎牛。
4.根据权利要求书1所述的一种高纯药用骨肽溶液的生物提取制备方法，其特征在于，所述四肢骨提取制备包括如下步骤：
步骤一：取新鲜或冷冻的猪的四肢骨，剔除剩肉，粉碎，水洗后用1倍水热压2次，冷却，冷却后的提取液去脂，分取水层；
步骤二：水层用无水乙醇沉淀，过滤，浓缩；浓缩液加水，调pH至酸性、碱性、中性，加热后过滤除去杂蛋白；
步骤三：滤液加活性炭和高岭土，100℃×30min后过滤。
步骤四：滤液先用超滤获取10000道尔顿的药用骨肽溶液，再采用多级高压电泳分离，得到6000~8000道尔顿高纯药用骨肽溶液。
5.根据权利要求4所述一种高纯药用骨肽溶液的生物提取制备方法，其特征在于，所述步骤一，热压提取的压力为0.3~0.35MPa，时间2.5h；所述步骤二，醇沉，酸碱中性加热过滤除去杂蛋白，过滤采用0.45 μm聚合物滤膜过滤，膜两端压力为<0.15MPa；所述步骤三，加活性炭，吸附去除热原，超滤除去高分子蛋白；所述步骤四，多级高压电泳分离大分子混合蛋白，获得小分子活性多肽。
6.根据权利要求4或5所述的一种高纯药用骨肽溶液的生物提取制备方法，其特征在于，所述骨肽溶液制备方法包括如下步骤：
步骤一：取新鲜或冷冻的猪的四肢骨，剔除剩肉，粉碎，加1倍纯化水，热压提取2次，合并提取液，0~-5℃过夜，次日去除上层油脂；
步骤二：水层加无水乙醇至醇度72~74%，放置一夜，次日过滤，滤液在常压和60℃下真空浓缩；
步骤三：浓缩液加水后调pH值为酸性、碱性和中性，加热至100℃×30 min后过滤，滤液0~-5℃过夜，次日再过滤除杂蛋白；
步骤四：滤液加入适量活性炭和高岭土，加热100℃×30min后过滤除热原和有色有机物质，得清液；
步骤五：清液用超滤膜过滤一次，超滤液为药用骨肽溶液；
步骤六：滤液采用多级高压电泳分离，分离液为高纯药用骨肽溶液。
7.根据权利要求1所述的一种高纯药用骨肽溶液的生物提取制备方法，其特征在于，所述骨肽溶液经生物技术处理，制成药剂学上可接受的不同剂型，如口服液、小容量注射剂、大容量注射剂、片剂、胶囊剂或冻干粉针剂，现选小容量注射剂和片剂。
8.根据权利要求1所述的一种高纯药用骨肽溶液的生物提取制备方法，其特征在于，所述骨肽溶液用来制备临床上用于治疗骨折愈合的药物。
9.根据权利要求1所述的一种高纯药用骨肽溶液的生物提取制备方法，其特征在于，所述多级高压电泳分离，为电极两端加10~30kv高电压，溶液pH值6到8，温度25-30℃。
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