CN107988302B - 一种鹿瓜多肽的制备方法及鹿瓜多肽在制备特殊医学用途食品中的应用 - Google Patents

一种鹿瓜多肽的制备方法及鹿瓜多肽在制备特殊医学用途食品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鹿瓜多肽的制备方法及鹿瓜多肽在制备特殊医学用途食品中的应用。本发明提供的鹿瓜多肽，以复合蛋白酶对提取液进行酶解，以硫酸钙去除鞣质及生物碱，避免了致敏物质的产生，同时也提高了产品的稳定性，将本发明提供的多肽制成粉，可以通过口服方式给药，提高了给药的便利性。实验表明，本发明提供的鹿瓜多肽能够有效降低模型鼠关节液中的IL‑1β、TNF‑α含量，与对照组呈现显著性差异，p<0.05。

Description

一种鹿瓜多肽的制备方法及鹿瓜多肽在制备特殊医学用途食 品中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鹿瓜多肽的制备方法及鹿瓜多肽在制备特殊医学用途食品中的应用。
背景技术
鹿瓜多肽是鹿科动物梅花鹿(Cervus Nippon Temmick)的骨骼和葫芦科植物甜瓜(Cucumis melo L.)的干燥成熟种子，经分别提取后制成的产品，其富含的多种游离氨基酸，为骨细胞合成BMPs、TGF-β，FGF等骨源性生物因子提供原料，促进骨源性生物因子的合成。有机钙、磷离子可参与钙磷代谢，维持骨容量。临床上，鹿瓜多肽是一种适用于风湿、类风湿性关节炎、骨折的早期愈合、骨关节炎、腰腿疼痛及创伤恢复等的注射液，为淡黄色澄明液体。
然而，由于鹿瓜多肽提取物中常含有生物碱和鞣质。鞣质、生物碱与蛋白质能够发生反应生成不溶于水且不易被消化吸收的沉淀，鞣质与生物碱也能结合形成不溶于水且不易被消化吸收的沉淀，造成过敏反应及多肽功能的丧失。目前，临床中已经获得多例因使用鹿瓜多肽注射液时出现的过敏反应病例。
如何在兼顾鹿瓜多肽功效的同时，提高产品的稳定性、降低过敏反应的发生率仍在不断的研究中。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种鹿瓜多肽的制备方法及鹿瓜多肽在制备特殊医学用途食品中的应用，本发明提供的鹿瓜多肽稳定性高，过敏反应的发生率低，且疗效得到提高。
本发明提供的鹿瓜多肽的制备方法包括：
步骤1：鹿骨粉碎后以水于80℃～110℃、0.05MPa～0.5MPa提取3～5次；提取液经澄清后，上清液与复合蛋白酶混合，于50℃、pH值为5.5～7.5，1000转/min～1500转/min的条件下进行搅拌反应1h～2h；加热灭酶后，分离上清液，依次通过6kDa、3kDa滤膜，得到鹿骨多肽提取液；
步骤2：甜瓜籽以水后于80℃～110℃、0.05MPa～0.5MPa提取3～5次；提取液经澄清后，上清液与复合蛋白酶混合，于50℃、pH值为5.5～7.5，1000转/min～1500转/min的条件下进行搅拌反应1h～2h；加热灭酶后，分离上清液，依次通过6kDa、3kDa滤膜，得到甜瓜籽多肽提取液；
步骤3：按照鹿骨多肽：甜瓜籽多肽＝(3～5):1的质量比，将鹿骨多肽提取液与甜瓜籽多肽提取液混合，在混合液中加入乳酸钙至其质量分数为3％～5％，制得含有鹿瓜多肽的溶液。
一些实施例中，鹿骨粉碎后以水于85℃、0.1MPa～0.3MPa的条件下提取3～5次。
另一些实施例中，鹿骨粉碎后以水于95℃、0.15MPa～0.4MPa的条件下提取3～5次。
另一些实施例中，鹿骨粉碎后以水于105℃、0.35MPa～0.5MPa的条件下提取3～5次。
本发明实施例中，所述鹿骨与水的质量比为1:2，所述提取的pH值为6～7，鹿骨的粒度为60目。
本发明实施例中，步骤1中所述澄清包括：
步骤①：调节pH值为3.5～5.5，3℃～8℃静置15h～20h后，经50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1500～2000转/min离心机离心20min，取上清液；
步骤②：调节所述上清液的pH值为7～9，3℃～8℃静置15h～20h后，经25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1500～2000转/min离心机离心20min，收集上清液。
一些实施例中，步骤1中所述澄清包括：
步骤①：调节pH值为4.0～5.0，4℃～7℃静置15h后，经50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1500转/min离心机离心20min，取上清液；
步骤②：调节所述上清液的pH值为8～9，4℃～8℃静置15h后，经25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1600转/min离心机离心20min，收集上清液。
另一些实施例中，步骤1中所述澄清包括：
步骤①：调节pH值为4.5～5.5，6℃～8℃静置18h后，经50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1800转/min离心机离心20min，取上清液；
步骤②：调节所述上清液的pH值为7～8，4℃～7℃静置18h后，经25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1800转/min离心机离心20min，收集上清液。
另一些实施例中，步骤1中所述澄清包括：
步骤①：调节pH值为4.0～5.5，5℃～7℃静置20h后，经50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用2000转/min离心机离心20min，取上清液；
步骤②：调节所述上清液的pH值为8～9，5℃～8℃静置20h后，经25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用2000转/min离心机离心20min，收集上清液。
本发明实施例中，步骤1中，所述上清液中多肽与蛋白质的质量之和与复合蛋白酶的质量比为(4～5)：1；
一些实施例中，步骤1中，所述上清液中多肽与蛋白质的质量之和与复合蛋白酶的质量比为5：1。
另一些实施例中，步骤1中，所述上清液中多肽与蛋白质的质量之和与复合蛋白酶的质量比为4：1。
一些实施例中，鹿骨提取液经复合蛋白酶消化的条件为：于50℃、pH值为6.0～7.5，1200转/min离心机搅拌反应1h。
另一些实施例中，消化的条件为：于50℃、pH值为5.5～7.0，1300转/min离心机搅拌反应1h。
另一些实施例中，消化的条件为：于50℃、pH值为6.5～7.5，1500转/min离心机搅拌反应1h。
本发明中，鹿骨多肽与甜瓜籽多肽的提取步骤不分先后，亦可同时进行。
一些实施例中，甜瓜籽以水于90℃、0.1MPa～0.45MPa的条件下提取3～5次。
另一些实施例中，甜瓜籽以水于100℃、0.15MPa～0.35MPa的条件下提取3～5次。
另一些实施例中，甜瓜籽以水于105℃、0.35MPa～0.5MPa的条件下提取3～5次。
本发明实施例中，所述甜瓜籽与水的质量比为1:1，所述提取的pH值为7～8。
本发明实施例中，步骤2中所述澄清包括：
步骤①：调节pH值为3.5～5.5，3℃～8℃静置15h～20h后，经50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液1500～2000转/min离心20min，取上清液；
步骤②：调节所述上清液的pH值为7～9，3℃～8℃静置15h～20h后，经25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液1500～2000转/min离心20min，收集上清液。
一些实施例中，步骤2中所述澄清包括：
步骤①：调节pH值为4.0～5.5，3℃～6℃静置15h后，经50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液2000转/min离心20min，取上清液；
步骤②：调节所述上清液的pH值为7～8，4℃静置18h后，经25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液1500转/min离心20min，收集上清液。
另一些实施例中，步骤2中所述澄清包括：
步骤①：调节pH值为4.5～5.5，4℃～7℃静置18h后，经50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液2000转/min离心20min，取上清液；
步骤②：调节所述上清液的pH值为8～9，7℃静置17h后，经25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液1500转/min离心20min，收集上清液。
另一些实施例中，步骤2中所述澄清包括：
步骤①：调节pH值为4.0～5.5，7℃静置17h后，经50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液2000转/min离心20min，取上清液；
步骤②：调节所述上清液的pH值为7～8，4℃静置15h后，经25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液2000转/min离心20min，收集上清液。
本发明实施例中，步骤2中，所述上清液中多肽与蛋白质的质量之和与复合蛋白酶的质量比为(3～5)：1。
一些实施例中，步骤2中，所述上清液中多肽与蛋白质的质量之和与复合蛋白酶的质量比为3：1。
另一些实施例中，步骤2中，所述上清液中多肽与蛋白质的质量之和与复合蛋白酶的质量比为4：1。
另一些实施例中，步骤2中，所述上清液中多肽与蛋白质的质量之和与复合蛋白酶的质量比为5：1。
本发明实施例中，所述加热灭酶的条件为95±3℃加热3～5min。
一些实施例中，所述灭酶的条件为95℃加热3min。
一些实施例中，所述灭酶的条件为92℃加热4min。
一些实施例中，所述灭酶的条件为97℃加热4min。
一些实施例中，所述灭酶的条件为95℃加热5min。
一些实施例中，所述灭酶的条件为93℃加热5min。
本发明中，步骤1和步骤2中，所述灭酶后，经陶瓷膜过滤，离心后收集上清液。
一些实施例中，步骤1中灭酶后，经50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液1000转/min离心15min，收集上清液；
步骤2中灭酶后，经60微米孔径陶瓷膜过滤，滤液1500转/min离心10min，收集上清液。
酶解技术是目前国内外普遍采用的制取蛋白质多肽的技术之一。采用复合酶解技术可以将底物分阶段从蛋白质分子内部或者外部同时将大分子蛋白质酶解成低分子量的小肽，产品的消化吸收性高，但是对于口服的肽而言，一定要充分考虑个别酶本身有轻微的异味，并且酶底复合物比例不能过大，否则容易造成产品轻微异味或者过量有异源大分子酶蛋白混入终产物中。
本发明采用的复合蛋白酶由胰蛋白酶和胃蛋白酶组成，所述胰蛋白酶和胃蛋白酶的活力比为1:1。
本发明实施例中，鹿骨多肽：甜瓜籽多肽＝3:1或4:1。
一些实施例中，混合液中加入乳酸钙至其质量分数为3％。
另一些实施例中，混合液中加入乳酸钙至其质量分数为4％。
另一些实施例中，混合液中加入乳酸钙至其质量分数为5％。
加入乳酸钙后，调整pH为5～6，温度为室温18～30℃，搅拌转速为60转/min。
本发明采用乳酸钙脱除鞣质及生物碱，使鞣质及生物碱与酶解产物聚合成大分子物质的比例大大降低，避免了食用后过敏反应的发生，从而提高了产品的安全性和疗效，在最终产物中起到补钙的作用。
本发明所述制备方法制得的鹿瓜多肽。
本发明所述制备方法制得的鹿瓜多肽在制备防治骨科疾病的药物中的应用；
所述骨科疾病包括风湿性关节炎、类风湿性关节炎、骨折、骨关节炎和/或腰腿疼痛。
本发明还提供了一种防治骨科疾病的药物，包括本发明制备的鹿瓜多肽。
本发明所述药物的剂型为口服制剂。
本发明所述药物的制备方法为：将本发明所述制备方法制得的含有鹿瓜多肽的溶液，与乳糖混合，经干燥制得所述药物；
所述干燥的条件为：物料含水量30％～45％，进料温度20℃～30℃，以空气为干燥介质，进风温度125℃～140℃，出风温度110℃～115℃，环境相对湿度78％。
本发明实施例中，乳糖与含有鹿瓜多肽的溶液的质量比为(75～85)：(15～25)。
一些具体实施例中，乳糖与与含有鹿瓜多肽的溶液的质量比为80:20、85:15或75：25。
一些实施例中，所述干燥的条件为：物料含水量40％，进料温度25℃，以空气为干燥介质，进风温度125℃，出风温度110℃，环境相对湿度75％。
另一些实施例中，所述干燥的条件为：物料含水量35％，进料温度22℃，以空气为干燥介质，进风温度140℃，出风温度115℃，环境相对湿度75％。
另一些实施例中，所述干燥的条件为：物料含水量30％，进料温度25℃，以空气为干燥介质，进风温度130℃，出风温度110℃，环境相对湿度75％。
本发明提供的鹿瓜多肽，以复合蛋白酶对提取液进行酶解，以硫酸钙去除鞣质及生物碱，避免了致敏物质的产生，同时也提高了产品的稳定性，将本发明提供的多肽制成粉，可以通过口服方式给药，提高了给药的便利性。实验表明，本发明提供的鹿瓜多肽能够有效降低模型鼠关节液液中的IL-1β、TNF-α含量，与对照组呈现显著性差异，p<0.05。
具体实施方式
本发明提供了一种鹿瓜多肽的制备方法及鹿瓜多肽在制备特殊医学用途食品中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中，复合蛋白酶购自购自上海安妍生物有限公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
(A)制备鹿骨多肽提取液：
(1)清洗新鲜鹿骨，并将鹿骨粉碎，加入注射用水后在85℃、0.10～0.3MPa的条件下提取3～5次；
(2)合并上述提取液后调节pH值为4.0～5.0，再在4～7℃条件下静置15h，然后用50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1500转/min离心机离心20min；
(3)收集上清液后调节pH值为8～9，再在4～8℃条件下静置15h，然后用25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1600转/min离心机离心20min，收集上清液得到鹿骨粗提液；
(4)凯氏定氮法测定鹿骨粗提液中蛋白质及多肽的含量，调节鹿骨粗提液pH值为6.0～7.5，然后按鹿骨粗提液中蛋白质及多肽与复合蛋白酶5∶1的重量比加入复合蛋白酶；
(5)在50℃、1200转/min的条件下搅拌上一步骤的反应液1h，搅拌过程中适当增加酸碱保持反应液pH值为6.0～7.5；
(6)反应液95℃加热3min后50μm孔径陶瓷膜过滤、1000rpm离心15min，收集的上清液依次进行6KD、3KD过滤，得到鹿骨多肽提取液；
(B)制备甜瓜籽多肽提取液：
(1)清洗新鲜甜瓜籽，加入注射用水后在90℃、0.10～0.45MPa的条件下提取3～5次；
(2)合并提取液后调节pH值为4.0～5.5，再在3℃条件下静置15h，然后用50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用2000转/min离心机离心20min；
(3)收集上清液后调节pH值为7～8，再在4℃条件下静置18h，然后用25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1500转/min离心机离心20min；收集上清液得到甜瓜籽粗提液；
(4)凯氏定氮法测定甜瓜籽粗提液中蛋白质及多肽的含量，调节甜瓜籽粗提液pH值为5.5～7.0，然后按甜瓜籽粗提液中蛋白质及多肽与蛋白酶5∶1的重量比加入复合蛋白酶；
(5)在50℃、1000转/min的条件下搅拌上一步骤的反应液1h，搅拌过程中保持反应液pH值为6.0～7.0；
(6)反应液95℃加热3min后用60微米陶瓷膜过滤、1500转/min离心机离心10min，收集的上清液依次进行6KD、3KD过滤，得到甜瓜籽多肽提取液；
(C)制备口服多肽组合物：
(1)鹿骨多肽提取液中的多肽与甜瓜籽多肽提取液中的多肽按4∶1的重量比混合，并且在混合后的溶液中加入混合液重量份数3％乳酸钙制得多肽溶液。
(2)按多肽：乳糖＝75:25的重量比向多肽溶液中加入乳糖，即得到口服鹿瓜多肽组合物。
(3)鹿瓜多肽组合物是以物料含水量(湿基)40％，进料温度25℃，空气作为干燥介质，进风温度125℃，出风温度110℃，环境相对湿度75％，生产能力为80kg/h，制得粉剂。
实施例2
(A)制备鹿骨多肽提取液：
(1)清洗新鲜鹿骨，并将鹿骨粉碎，加入注射用水后在95℃、0.15～0.4MPa的条件下提取3～5次；
(2)合并上述提取液后调节pH值为4.5～5.5，再在6～8℃条件下静置18h，然后用50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1800转/min离心机离心20min；
(3)收集上清液后调节pH值为7～8，再在4～7℃条件下静置18h，然后用25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1800转/min离心机离心20min，收集上清液得到鹿骨粗提液；
(4)凯氏定氮法测定鹿骨粗提液中蛋白质及多肽的含量，调节鹿骨粗提液pH值为6.5～7.5，然后按鹿骨粗提液中蛋白质及多肽与复合蛋白酶4∶1的重量比加入复合蛋白酶；
(5)在50℃、1300转/min的条件下搅拌上一步骤的反应液1h，搅拌过程中适当增加酸碱保持反应液pH值为5.5～7.0；
(6)反应液92℃加热4min后50微米孔径陶瓷膜过滤、1000转/min离心15min，收集的上清液依次进行6KD、3KD过滤，得到鹿骨多肽提取液；
(B)制备甜瓜籽多肽提取液：
(1)清洗新鲜甜瓜籽，加入注射用水后在100℃、0.15～0.35MPa的条件下提取3～5次；
(2)合并提取液后调节pH值为4.5～5.5，再在4～7℃条件下静置18h，然后用50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用2000转/min离心机离心20min；
(3)收集上清液后调节pH值为8～9，再在7℃条件下静置17h，然后用25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1500转/min离心机离心20min；收集上清液得到甜瓜籽粗提液；
(4)凯氏定氮法测定甜瓜籽粗提液中蛋白质及多肽的含量，调节甜瓜籽粗提液pH值为5.5～7.0，然后按甜瓜籽粗提液中蛋白质及多肽与蛋白酶5∶1的重量比加入复合蛋白酶；
(5)在50℃、1200转/min的条件下搅拌上一步骤的反应液1h，搅拌过程中保持反应液pH值为6.5～7.5；
(6)反应液97℃加热4min后60μm陶瓷膜过滤、1500转/min离心10min，收集的上清液依次进行6KD、3KD过滤，得到甜瓜籽多肽提取液；
(C)制备口服多肽组合物：
(1)鹿骨多肽提取液中的多肽与甜瓜籽多肽提取液中的多肽按3∶1的重量比混合，并且在混合后的溶液中加入混合液重量份数4％乳酸钙得多肽溶液。
(2)按多肽：乳糖＝80:20的重量比向多肽溶液中加入乳糖，即得到口服鹿瓜多肽组合物。
(3)鹿瓜多肽组合物是以物料含水量(湿基)35％，进料温度22℃，空气作为干燥介质，进风温度140℃，出风温度115℃，环境相对湿度75％，生产能力为80kg/h，制得粉剂。
实施例3
(A)制备鹿骨多肽提取液：
(1)清洗新鲜鹿骨，并将鹿骨粉碎，加入注射用水后在105℃、0.35～0.5MPa的条件下提取3～5次；
(2)合并上述提取液后调节pH值为4.0～5.5，再在5～7℃条件下静置20h，然后用50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用2000转/min离心机离心20min；
(3)收集上清液后调节pH值为8～9，再在5～8℃条件下静置20h，然后用25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用2000转/min离心机离心20min，收集上清液得到鹿骨粗提液；
(4)凯氏定氮法测定鹿骨粗提液中蛋白质及多肽的含量，调节鹿骨粗提液pH值为6.5～7.5，然后按鹿骨粗提液中蛋白质及多肽与复合蛋白酶5∶1的重量比加入复合蛋白酶；
(5)在50℃、1500转/min的条件下搅拌上一步骤的反应液1h，搅拌过程中适当增加酸碱保持反应液pH值为6.5～7.5；
(6)反应液95℃加热5min后50μm孔径陶瓷膜过滤、1000rpm离心15min，收集的上清液依次进行6KD、3KD过滤，得到鹿骨多肽提取液；
(B)制备甜瓜籽多肽提取液：
(1)清洗新鲜甜瓜籽，加入注射用水后在110℃、0.35～0.5MPa的条件下提取3～5次；
(2)合并提取液后调节pH值为4.0～5.5，再在7℃条件下静置17h，然后用50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用2000转/min离心机离心20min；
(3)收集上清液后调节pH值为7～8，再在4℃条件下静置15h，然后用25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用2000转/min离心机离心20min；收集上清液得到甜瓜籽粗提液；
(4)凯氏定氮法测定甜瓜籽粗提液中蛋白质及多肽的含量，调节甜瓜籽粗提液pH值为6.0～7.0，然后按甜瓜籽粗提液中蛋白质及多肽与蛋白酶3∶1的重量比加入复合蛋白酶；
(5)在50℃、1500转/min的条件下搅拌上一步骤的反应液1h，搅拌过程中保持反应液pH值为5.5～6.5；
(6)反应液93℃加热5min后60μm陶瓷膜过滤、1500转/min离心10min，收集的上清液依次进行6KD、3KD过滤，得到甜瓜籽多肽提取液；
(C)制备口服多肽组合物：
(1)鹿骨多肽提取液中的多肽与甜瓜籽多肽提取液中的多肽按4∶1的重量比混合，并且在混合后的溶液中加入混合液重量份数5％的乳酸钙得多肽溶液。
(2)按多肽：乳糖＝85:15的重量比向多肽溶液中加入乳糖，即得到口服鹿瓜多肽组合物。
(3)鹿瓜多肽组合物是以物料含水量(湿基)30％，进料温度25℃，空气作为干燥介质，进风温度130℃，出风温度110℃，环境相对湿度75％，生产能力为80kg/h，生产粉剂。
对比例1
(A)制备鹿骨多肽提取液：
(1)清洗新鲜鹿骨，并将鹿骨粉碎，加入注射用水后在85℃、0.10～0.3MPa的条件下提取3～5次；
(2)合并上述提取液后调节pH值为4.0～5.0，再在4～7℃条件下静置15h，然后用50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1500转/min离心机离心20min；
(3)收集上清液后调节pH值为8～9，再在4～8℃条件下静置15h，然后用25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1600转/min离心机离心20min，收集上清液得到鹿骨粗提液；
(4)凯氏定氮法测定鹿骨粗提液中蛋白质及多肽的含量，调节鹿骨粗提液pH值为6.0～7.5，然后按鹿骨粗提液中蛋白质及多肽与复合蛋白酶5∶1的重量比加入复合蛋白酶；
(5)在50℃、1200转/min的条件下搅拌上一步骤的反应液1h，搅拌过程中适当增加酸碱保持反应液pH值为6.0～7.5；
(6)反应液95℃加热3min后50μm超滤膜过滤、1000rpm离心15min，收集的上清液依次进行6KD、3KD过滤，得到鹿骨多肽提取液；
(B)制备甜瓜籽多肽提取液：
(1)清洗新鲜甜瓜籽，加入注射用水后在90℃、0.10～0.45MPa的条件下提取3～5次；
(2)合并提取液后调节pH值为4.0～5.5，再在3～6℃条件下静置15～18h，然后用50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用2000转/min离心机离心20min；
(3)收集上清液后调节pH值为7～8，再在3～5℃条件下静置15～18h，然后用25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1500转/min离心机离心20min；收集上清液得到甜瓜籽粗提液；
(4)凯氏定氮法测定甜瓜籽粗提液中蛋白质及多肽的含量，调节甜瓜籽粗提液pH值为5.5～7.0，然后按甜瓜籽粗提液中蛋白质及多肽与蛋白酶5∶1的重量比加入复合蛋白酶；
(5)在50℃、1000转/min的条件下搅拌上一步骤的反应液1h，搅拌过程中保持反应液pH值为6.0～7.0；
(6)反应液95℃加热3min后60微米陶瓷膜过滤、1500转/min离心10min，收集的上清液依次进行6KD、3KD过滤，得到甜瓜籽多肽提取液；
(C)制备口服多肽组合物：
(1)鹿骨多肽提取液中的多肽与甜瓜籽多肽提取液中的多肽按4∶1的重量比混合，制得多肽溶液。
(2)按多肽：乳糖＝75:25的重量比向多肽溶液中加入乳糖，即得到口服鹿瓜多肽组合物。
(3)鹿瓜多肽组合物是以物料含水量(湿基)40％，进料温度25℃，空气作为干燥介质，进风温度125℃，出风温度110℃，环境相对湿度75％，生产能力为80kg/h，制得粉剂。
对比例2
(A)制备鹿骨多肽提取液：
(1)清洗新鲜鹿骨，并将鹿骨粉碎，加入注射用水后在85℃、0.10～0.3MPa的条件下提取3～5次；
(2)合并上述提取液后调节pH值为4.0～5.0，再在4～7℃条件下静置15h，然后用50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1500转/min离心机离心20min；
(3)收集上清液后调节pH值为8～9，再在4～8℃条件下静置15h，然后用25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1600转/min离心机离心20min，收集上清液得到鹿骨粗提液；
(4)凯氏定氮法测定鹿骨粗提液中蛋白质及多肽的含量，调节鹿骨粗提液pH值为6.0～7.5，然后按鹿骨粗提液中蛋白质及多肽与木瓜蛋白酶5∶1的重量比加入复合蛋白酶；
(5)在50℃、1200转/min的条件下搅拌上一步骤的反应液1h，搅拌过程中适当增加酸碱保持反应液pH值为6.0～7.5；
(6)反应液95℃加热3min后50μm孔径陶瓷膜过滤、1000rpm离心15min，收集的上清液依次进行6KD、3KD过滤，得到鹿骨多肽提取液；
(B)制备甜瓜籽多肽提取液：
(1)清洗新鲜甜瓜籽，加入注射用水后在90℃、0.10～0.45MPa的条件下提取3～5次；
(2)合并提取液后调节pH值为4.0～5.5，再在3～6℃条件下静置15～18h，然后用50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用2000转/min离心机离心20min；
(3)收集上清液后调节pH值为7～8，再在3～5℃条件下静置15～18h，然后用25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液用1500转/min离心机离心20min；收集上清液得到甜瓜籽粗提液；
(4)凯氏定氮法测定甜瓜籽粗提液中蛋白质及多肽的含量，调节甜瓜籽粗提液pH值为5.5～7.0，然后按甜瓜籽粗提液中蛋白质及多肽与蛋白酶5∶1的重量比加入木瓜蛋白酶；
(5)在50℃、1000转/min的条件下搅拌上一步骤的反应液1h，搅拌过程中保持反应液pH值为6.0～7.0；
(6)反应液95℃加热3min后60微米陶瓷膜过滤、1500转/min孔径陶瓷膜离心10min，收集的上清液依次进行6KD、3KD过滤，得到甜瓜籽多肽提取液；
(C)制备口服多肽组合物：
(1)鹿骨多肽提取液中的多肽与甜瓜籽多肽提取液中的多肽按4∶1的重量比混合，并且在混合后的溶液中加入混合液重量份数3％乳酸钙制得多肽溶液。
(2)按多肽：乳糖＝75:25的重量比向多肽溶液中加入乳糖，即得到口服鹿瓜多肽组合物。
(3)鹿瓜多肽组合物是以物料含水量(湿基)40％，进料温度25℃，空气作为干燥介质，进风温度125℃，出风温度110℃，环境相对湿度75％，生产能力为80kg/h，制得粉剂。
效果检测
根据实施例1、2、3制作出产品I、Ⅱ、III，进行动物软骨细胞增殖机制实验，以Hulth造模法造骨性关节炎动物模型。
(1)动物实验分组、给药：
取造模成功的大鼠48只，雌雄各24只，体重18～22g，随机分配成6组，每组8只，分别为阳性对照组，实验组1～5。另取8只未经造模的大鼠作为空白对照，8只造模后，不给予任何药物的大鼠作为阴性对照(也是造模后的大鼠)。
其中，阳性对照组以皮下注射方式给予黑龙江迪龙制药有限公司生产的注射用鹿瓜多肽。
实验组1～5依次给予实施例1～3和对比例1～2制备的鹿瓜多肽口服粉剂。剂量为0.020kg/d/只大鼠，每日3次，实验30d。
(2)软骨细胞增殖细胞因子的测定实验
1天、15天、30天分别获取大鼠的关节液，测定关节液中细胞因子IL-1β和TNF-α的含量，测试采用双抗体夹心ABC-ELISA法，试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供，测定步骤分别按试剂盒说明书操作。结果如表1：
表1.关节液中细胞因子含量
Figure BDA0001555958160000141
Figure BDA0001555958160000142
从表中可以看出，各组干预后细胞因子水平的测定治疗组的关节液细胞因子含量在干预后有明显变化，其关节液细胞因子的含量明显逐渐降低，呈现出第30天<15天<1天的现象，同时其第15天、30天与其第1天的比较有显著性差异(P<0.01)；通过表中对比可以看出各组鹿瓜多肽都能明显降低不同时间段内大鼠关节液细胞因子的水平。其中实验组1～3的因子水平显著低于实验组4～5的大鼠的因子水平，p<0.05，而给予实施例1的大鼠的因子水平最低，显著优于其他实验组，p<0.05。
(3)实验组与对照组的综合疗效的比较
取大鼠320只，雌雄各160只，体重18～22g，随机分配成8组，各组给药方式与(1)一致，评价综合疗效的主要判断指标如下：大鼠精神状态好、运动姿势、体态，动作灵活而协调、运动与行为的变化无异常表现的为显效；大鼠运动姿势、体态，动作基本灵活、运动与行为的变化基本无异常表现的为好转；大鼠运动姿势不稳、动作不灵活、运动与行为的变化异常表现的为无效，其中有效＝显效+好转。
表2 各组综合疗效结果比较例％
Figure BDA0001555958160000151
从上表可以看出，实验组与阳性对照组主要临床症状体征比较结果显示：组间的差异无统计学意义(p>0.05)，表明两组间具有可比性。各实验组与阴性对比例治疗前后自身主要临床症状体征进行比较后表明患者的各项主要临床症状明显下降(p<0.05)，表明各鹿瓜多肽对实验大鼠有疗效。其中，实验组1～3与实验组4～5间进行比较，表明实验组1～3的主要临床症状明显低于实验组4～5(p<0.05)，说明实验组1～3的疗效明显好于实验组4～5。
(4)、过敏反应的评估:
实验组1～4给药后全部无过敏反应。但实验组5在治疗过程中有一例患者出现轻微过敏反应。
(5)、稳定性评估。
各实施例和对比例制备的多肽粉剂，在温度40℃±2℃，相对湿度75％±5％的条件下放置1个月。其中，实施例1～3的多肽未见颜色改变，而对比例1的多肽颜色变深，经检测，酚类和单宁被氧化。
各实施例和对比例制备的多肽粉剂，在温度0℃～4℃，相对湿度60％±5％的条件下放置12个月。其中，实施例1～3的多肽未见颜色改变，而对比例1～2的多肽颜色变深，经检测，酚类和单宁被氧化。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种鹿瓜多肽的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1：鹿骨粉碎后以水于80℃～110℃、0.05MPa～0.5MPa提取3～5次；提取液经澄清后，上清液与复合蛋白酶混合，于50℃、pH值为5.5～7.5，1000转/min～1500转/min的条件下进行搅拌反应1h～2h；加热灭酶后，分离上清液，依次通过6kDa、3kDa滤膜，得到鹿骨多肽提取液；
步骤2：甜瓜籽以水后于80℃～110℃、0.05MPa～0.5MPa提取3～5次；提取液经澄清后，上清液与复合蛋白酶混合，于50℃、pH值为5.5～7.5，1000转/min～1500转/min的条件下进行搅拌反应1h～2h；加热灭酶后，分离上清液依次过6kDa、3kDa滤膜，得到甜瓜籽多肽提取液；
步骤3：按照鹿骨多肽：甜瓜籽多肽＝(3～5):1的质量比，将鹿骨多肽提取液与甜瓜籽多肽提取液混合，在混合液中加入乳酸钙至其质量分数为3％～5％，制得含有鹿瓜多肽的溶液；
所述复合蛋白酶由胰蛋白酶和胃蛋白酶组成，所述胰蛋白酶和胃蛋白酶的活力比为1:1；所述步骤1和步骤2顺序不分先后。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤1中，所述上清液中多肽与蛋白质的质量之和与复合蛋白酶的质量比为(4～5)：1；
步骤2中，所述上清液中多肽与蛋白质的质量之和与复合蛋白酶的质量比为(3～5)：1。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述鹿骨与水的质量比为1:2；所述甜瓜籽与水的质量比为1:1。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1或2中所述澄清包括：
步骤①：调节pH值为3.5～5.5，于3℃～8℃静置15h～20h后，经50微米孔径陶瓷膜过滤，滤液1500～2000转/min离心20min，取上清液；
步骤②：调节所述上清液的pH值为7～9，于3℃～8℃静置15h～20h后，经25微米孔径陶瓷膜过滤，滤液1500～2000转/min离心20min，收集上清液。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述加热灭酶的条件为95±3℃加热3～5min。
6.权利要求1～5任一项所述制备方法制得的鹿瓜多肽。
7.权利要求6所述的鹿瓜多肽在制备防治骨科疾病的药物中的应用；
所述骨科疾病包括风湿性关节炎、类风湿性关节炎、骨折、骨关节炎和/或腰腿疼痛。
8.一种防治骨科疾病的药物，其特征在于，包括权利要求6所述的鹿瓜多肽。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，其剂型为口服制剂。
10.权利要求8或9所述药物的制备方法，其特征在于，将权利要求1～5任一项所述制备方法制得的含有鹿瓜多肽的溶液，与乳糖混合，经干燥制得所述药物；
所述干燥的条件为：物料含水量30％～45％，进料温度20℃～30℃，以空气为干燥介质，进风温度125℃～140℃，出风温度110℃～115℃，环境相对湿度78％。
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