CN103351373B

CN103351373B - 一种从五味子中提取分离五味子乙素的方法

Info

Publication number: CN103351373B
Application number: CN201310214126.4A
Authority: CN
Inventors: 汪豪; 张敏; 曹涛; 田文桥
Original assignee: ZHEJIANG DINGHUI PHARM Co Ltd
Current assignee: Mengyang Pharmaceutical (Shanghai) Co.,Ltd.
Priority date: 2013-05-31
Filing date: 2013-05-31
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2033-05-31
Also published as: CN103351373A

Abstract

本发明提供了一种从五味子中提取分离五味子乙素的方法，应用大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析和重结晶方法从五味子药材中提取分离得到高纯度的五味子乙素，符合工业化生产的技术特点。本发明的有益效果主要体现在：按照本发明方法，制得五味子乙素纯度可达90～100%，可应用于五味子乙素的工业化大规模制备。

Description

一种从五味子中提取分离五味子乙素的方法

（一）技术领域

本发明涉及一种从五味子中提取分离五味子乙素的方法。

（二）背景技术

五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis的干燥成熟果实，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效。五味子中具有联苯环辛二烯结构的木脂素类化合物是其主要的生物活性成分，主要包括五味子乙素、五味子甲素、五味子醇甲等，其中五味子乙素是含量一般在0.1～0.4%之间。近年来研究发现，五味子乙素具有抗肿瘤、保肝、抗溃疡、抗病毒等多种生物活性，并且对清除自由基也有较好效果。因此五味子乙素作为药用原料开发与应用具有重要研究价值。但五味子乙素来源途径较少，主要靠从五味子药材中提取纯化制得，且五味子药材中所得五味子乙素含量较低，结构类似物较为复杂，故研究开发一个可工业化制备分离药用原料五味子乙素的制备工艺具有重要研究价值。

目前，文献报道五味子乙素的提取纯化方法很多，如孟宪军等发表的《用大孔树脂分离纯化五味子乙素》（食品工业科技，2009年6月，第30卷第9期，191-195页），比较了六种不同型号的大孔吸附树脂对五味子乙素的吸附性质，结果表明，AB-8型树脂对五味子乙素具有很好的吸附特性，确定其工艺参数为：上样浓度0.05mg/ml、上样流速为1ml/min、静态吸附时间为4hr，解析流速为0.5ml/min、解析用量为100ml。采用该方法对五味子提取液进行提取纯化，能提高洗脱液中五味子乙素的质量分数，但未能得到高纯度的五味子乙素单体化合物。

已公开专利“从五味子中提取五味子甲素和五味子乙素的方法”（中国，专利号：CN102050707A；公布日：2011.05.11），所述方法可先后洗脱出五味子甲素和五味子乙素，使它们得到分离，其中五味子甲素的含量为0.8～1.2%，五味子乙素的含量为3～4%，但未能得到高纯度的五味子乙素单体化合物。

已公开专利“一种制备高纯度五味子乙素的方法”（中国，专利号：CN101070314A；公布日：2007.11.14），此发明应用分析型高速逆流色谱仪的小量制备及半制备型高速逆流色谱仪的较大量制备，一次分离制得五味子乙素（纯度可达98%以上）。此方法实施需高速逆流色谱仪等专用设备，工业化生产技术难度较大且生产能力有限。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种从五味子中提取分离五味子乙素的方法，是应用五味子药材加入钙盐沉淀剂后进行含水乙醇提取,可在提取过程有效去除五味子药材果皮中有机酸及鞣质类化合物的浸出，降低药材醇提浓缩液对大孔吸附树脂的不可逆污染。后续步骤采用大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析和重结晶方法从五味子药材中提取分离得到高纯度的五味子乙素，符合工业化生产的技术特点。

本发明采用的技术方案是：

一种从五味子中提取分离五味子乙素的方法，所述方法如下：

（1）药材提取：取五味子药材，粉碎，加入10～15%（w/ｗ，钙盐沉淀剂占五味子药材的质量百分比）钙盐沉淀剂，加80～95%（v/v）乙醇水溶液于50～80℃下浸提，或回流搅拌提取2～3次，乙醇水溶液用量为每次4～10mL/g五味子，每次提取2～4hr，合并醇提液，减压回收溶剂，得五味子醇提浓缩液（1g生药/ml）；所述钙盐沉淀剂为下列之一:氧化钙，氢氧化钙；

（2）大孔吸附树脂柱层析：取五味子醇提浓缩液，滤过，上样于大孔吸附树脂柱（1BV=500mL）（树脂装柱之前通常需要按常规方法进行预处理），加50～60%乙醇水溶液洗脱3～5个柱体积，加75～85%乙醇水溶液洗脱6～10个柱体积，合并含有五味子乙素的流分（TLC检识（硅胶，PE:EtOAc（20:5），UV254nm）），减压回收溶剂至干，加入适量正己烷溶解（以将五味子乙素全部溶解为宜），放置1～3天，抽滤，得五味子乙素粗品，滤余液为五味子乙素结晶母液；所述大孔吸附树脂为下列之一：AB-8、NKA、HPD100、X5、HPD300；

（3）硅胶柱层析：取步骤（2）五味子乙素结晶母液，上样于硅胶层析柱，加洗脱剂洗脱6～10个柱体积，合并含有五味子乙素的流分，减压回收溶剂至干，加入适量正己烷溶解，放置1～3天，抽滤，得五味子乙素粗品；所述洗脱剂为体积比97:3～90:10的石油醚-乙酸乙酯或正己烷-乙酸乙酯二元溶剂系统；

（4）乙醇重结晶：合并步骤（2）和（3）所得五味子乙素粗品，加6～10倍量无水乙醇溶解，抽滤，滤液放置1～3天，抽滤，干燥，得五味子乙素。

优选的，步骤（2）所用大孔吸附树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

优选的，步骤（2）所用钙盐沉淀剂为CaO。

本发明的有益效果主要体现在：按照本发明方法，制得五味子乙素纯度可达90～100%，可应用于五味子乙素的工业化大规模制备。

（四）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：沉淀剂优选试验

五味子药材的乙醇提取液成分较复杂，含有很多鞣质、有机酸类等水溶性成分，该类杂质污染树脂柱并影响树脂的使用寿命。因此考虑在药材提取过程中加入沉淀剂以减少它们在提取液中的含量。本试验以经加入不同沉淀剂提取工艺制备的药材提取液中五味子乙素量、及干膏重量为考察指标，分析沉淀剂的加入是否合理及适合加入量。

提取方法：取五味子药材粗粉（批号：SC03）5g（或者五味子药材粗粉与沉淀剂的混合物）于圆底烧瓶中，加80%EtOH40ml（8倍量），浸渍1hr后，80℃水浴搅拌加热回流提取2次，第二次加入6倍量80%EtOH，滤过，合并二次醇提液至100ml量瓶中，滤渣加10ml（2倍量）80%EtOH分次洗涤洗，液转移至量瓶中，加80%EtOH定容至刻度，摇匀，得五味子药材提取液。

检测方法：

精密吸取上述五味子药材提取液10ml至已干燥恒重称量瓶中，105℃干燥至恒重，记录干膏重量。

精密吸取上述五味子药材提取液1ml于5ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，取样按含量测定项下方法进行HPLC分析，检测醇提液中五味子乙素量。

综合上述未加入沉淀剂提取工艺及加入不同比例（沉淀剂占五味子质量百分比）的钙盐沉淀剂[CaO，或Ca(OH)₂]正交实验结果见表1。

表1：沉淀剂加入单因素考察结果

编号	加入量	五味子乙素量(mg)	干膏重量(mg)
				1	CaO,5%	14.06	655
2	CaO,10%	15.03	530
				3	CaO,15%	15.42	676
4	CaO,5%	16.94	784
				5	CaO,10%	15.08	405
6	CaO,15%	15.52	444
				7	Ca(OH)₂,5%	15.99	1168
8	Ca(OH)₂,10%	15.81	1227
				9	Ca(OH)₂,15%	11.97	600
10	0	16.38	1347

表1结果显示，加入钙盐沉淀剂，如Cao，或Ca(OH)₂后进行乙醇提取对五味子乙素提取率影响较小，而干膏重量可明显降低，提示沉淀剂加入后能明显减少醇提液中鞣质、有机酸等水溶性杂质量，加入量以10%为宜。

实施例2：

1.药材提取：取五味子药材500g，粉碎成粗粒，加入氧化钙50g，加80%乙醇80℃温浸搅拌提取2次，每次3hr，第1次8倍量（4L），第2次6倍量（3L），合并两次醇提液，减压回收乙醇，得五味子醇提浓缩液（1g生药/ml）。

2.大孔吸附树脂柱层析：取五味子醇提浓缩液，上样于已处理好（大孔吸附树脂350g，95%乙醇湿法装注，60%乙醇预平衡1500ml）的AB-8型（天津南开和成科技有限公司）大孔吸附树脂柱（1BV=500mL）上，静置1hr，加60%乙醇洗脱4BV，加80%乙醇洗脱8BV，收集流分，合并含有五味子乙素流分，TLC检识（硅胶，PE:EtOAc（20:5），UV254nm），合并TLC检识斑点相同流份，得五味子乙素包含杂质前段（简称：前段）及纯段流份，合并五味子乙素纯段流份减压回收溶剂至干，加入适量正己烷加热溶解，抽滤，滤液放置2天，抽滤，少量冷正己烷洗涤滤饼，得五味子乙素粗品（约500mg，含量范围83%）及五味子乙素结晶母液（约含五味子乙素800mg）。

3.硅胶柱层析：取五味子乙素结晶母液，加3.0g硅胶（柱层析，100～200目）拌样，粉碎，干法上样于已平衡好的硅胶层析柱[100～200目，10g，1BV=250mL，湿法装柱，石油醚：乙酸乙酯（95:5）预平衡]，加石油醚：乙酸乙酯（95:5）洗脱8BV，收集流分，合并含有SCB的流分。SCB合并流分回收溶剂至干，加入适量正己烷加热溶解，抽滤，滤液放置2天，抽滤，少量冷正己烷洗涤滤饼，得五味子乙素粗品（约300mg，含量85%）。

4.乙醇重结晶：合并大孔树脂柱层析得到的五味子乙素粗品及硅胶柱层析得到的结晶粗品，加8倍量（1g粗品：8mL乙醇）无水乙醇溶解，抽滤，滤液放置2天，抽滤，干燥，得五味子乙素450mg，HPLC测定外标含量为96.35%。

实施例3：

1.药材提取：取五味子药材500g，粉碎成粗粒，加入氢氧化钙50g，加85%乙醇90℃回流提取2次，每次3hr，第1次6倍量（3L），第2次4倍量（2L），合并两次醇提液，减压回收，得五味子醇提浓缩液（1g生药/ml）。

2.大孔吸附树脂柱层析：取五味子醇提浓缩液，上样于已处理好的NKA型大孔吸附树脂柱（1BV=500mL）上，静置2hr，加60%乙醇洗脱4BV，加85%乙醇洗脱8BV，收集流分，合并含有五味子乙素流分，得五味子乙素前段及纯段流份，合并五味子乙素纯段流份减压回收溶剂至干，加入适量正己烷加热溶解，抽滤，滤液放置2天，抽滤，少量冷正己烷洗涤滤饼，得五味子乙素粗品（约500mg，含量78%）及五味子乙素结晶母液（约含五味子乙素800mg）。

3.硅胶柱层析：取五味子乙素结晶母液，加3.0g硅胶（柱层析，200～300目）拌样，粉碎，干法上样于已平衡好的硅胶层析柱[100～200目，10g，1BV=250mL，湿法装柱，石油醚：乙酸乙酯（95:5）预平衡]，加石油醚：乙酸乙酯（95:5）洗脱8BV，收集流分，合并含有SCB的流分。SCB合并流分回收溶剂至干，加入适量正己烷加热溶解，抽滤，滤液放置2天，抽滤，少量冷正己烷洗涤滤饼，得五味子乙素粗品（约300mg，含量范围88%）。

4.乙醇重结晶：合并大孔树脂柱层析得到的五味子乙素粗品及硅胶柱层析得到的结晶粗品，加8倍量无水乙醇溶解，抽滤，滤液放置2天，抽滤，干燥，得五味子乙素450mg，HPLC测定外标含量为94.76%。

实施例4：

1.药材提取：取五味子药材500g，粉碎成粗粒，加入氧化钙50g，加90%乙醇80℃温浸搅拌提取2次，每次3hr，第1次6倍量（3L），第2次4倍量（2L），合并两次醇提液，减压回收，得五味子醇提浓缩液（1g生药/ml）。

2.大孔吸附树脂柱层析：取五味子醇提浓缩液，上样于已处理好的HPD-100型大孔吸附树脂柱（1BV=500mL）上，静置2hr，加60%乙醇洗脱4BV，加80%乙醇洗脱8BV，收集流分，合并含有五味子乙素流分，得五味子乙素前段及纯段流份，合并五味子乙素纯段流份减压回收溶剂至干，加入适量正己烷加热溶解，抽滤，滤液放置2天，抽滤，少量冷正己烷洗涤滤饼，得五味子乙素粗品（约420mg，含量范围81%）及五味子乙素结晶母液（约含五味子乙素880mg）。

3.硅胶柱层析：取五味子乙素结晶母液，加4.0g硅胶（柱层析，200～300目）拌样，粉碎，干法上样于已平衡好的硅胶层析柱[200～300目，12g，1BV=300mL，湿法装柱，石油醚：乙酸乙酯（96:4）预平衡]，加石油醚：乙酸乙酯（96:4）洗脱10BV，收集流分，合并含有SCB的流分。SCB合并流分回收溶剂至干，加入适量正己烷加热溶解，抽滤，滤液放置2天，抽滤，少量冷正己烷洗涤滤饼，得五味子乙素粗品（约340mg，含量范围85%）。

4.乙醇重结晶：合并大孔树脂柱层析得到的五味子乙素粗品及硅胶柱层析得到的结晶粗品，加8倍量无水乙醇溶解，抽滤，滤液放置2天，抽滤，干燥，得五味子乙素400mg，HPLC测定外标含量为95.38%。

实施例5：

1.药材提取：取五味子药材500g，粉碎成粗粒，加入氢氧化钙60g，加80%乙醇80℃温浸搅拌提取2次，每次4hr，第1次8倍量（4L），第2次6倍量（3L），合并两次醇提液，减压回收，得五味子醇提浓缩液（1g生药/ml）。

2.大孔吸附树脂柱层析：取五味子醇提浓缩液，上样于已处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱（1BV=500mL）上，静置1hr，加50%乙醇洗脱4BV，加75%乙醇洗脱10BV，收集流分，合并含有五味子乙素流分，得五味子乙素包含杂质前段及纯段流份，合并五味子乙素纯段流份减压回收溶剂至干，加入适量正己烷加热溶解，抽滤，滤液放置2天，抽滤，少量冷正己烷洗涤滤饼，得五味子乙素粗品（约480mg，含量范围78%）及五味子乙素结晶母液（约含五味子乙素820mg）。

3.硅胶柱层析：取五味子乙素结晶母液，加4.0g硅胶（柱层析，100～200目）拌样，粉碎，干法上样于已平衡好的硅胶层析柱[100～200目，12g，1BV=300mL，湿法装柱，石油醚：乙酸乙酯（97:3）预平衡]，加石油醚：乙酸乙酯（97:3）洗脱10BV，收集流分，合并含有SCB的流分。SCB合并流分回收溶剂至干，加入适量正己烷加热溶解，抽滤，滤液放置2天，抽滤，少量冷正己烷洗涤滤饼，得五味子乙素粗品（约350mg，含量83%）。

4.乙醇重结晶：合并大孔树脂柱层析得到的五味子乙素粗品及硅胶柱层析得到的结晶粗品，加8倍量无水乙醇溶解，抽滤，滤液放置2天，抽滤，干燥，得五味子乙素410mg，HPLC测定外标含量为96.35%。

实施例6：

1.药材提取：取五味子药材120kg，粉碎成粗粒，加入氧化钙12kg，加80%乙醇80℃温浸搅拌提取2次，每次3hr，第1次8倍量（960L），第2次6倍量（720L），合并两次醇提液，减压回收，得五味子醇提浓缩液（1g生药/ml）。

2.大孔吸附树脂柱层析：取五味子醇提浓缩液，上样于已处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱（1BV=120L）上，静置1hr，加60%乙醇洗脱4BV，加80%乙醇洗脱8BV，收集流分，合并含有五味子乙素流分，得五味子乙素前段及纯段流份，合并五味子乙素纯段流份减压回收溶剂至干，加入适量正己烷加热溶解，抽滤，滤液放置3天，抽滤，少量冷正己烷洗涤滤饼，得五味子乙素粗品（约120g，含量范围72%）及五味子乙素结晶母液（约含SCB200g）。

3.硅胶柱层析：SCB母液I，加800g硅胶（柱层析，100～200目）拌样，粉碎，干法上样于已平衡好的硅胶层析柱[100～200目，2500g，1BV=6.5L，湿法装柱，石油醚：乙酸乙酯（95:5）预平衡]，加石油醚：乙酸乙酯（95:5）洗脱8BV，收集流分，合并含有五味子乙素的流分。合并流分回收溶剂至干，加入适量正己烷加热溶解，抽滤，滤液放置2天，抽滤，少量冷正己烷洗涤滤饼，得五味子乙素粗品（约80g，含量78%）。

4.乙醇重结晶：合并大孔树脂柱层析得到的五味子乙素粗品及硅胶柱层析得到的结晶粗品，加8倍量无水乙醇溶解，抽滤，滤液放置1天，抽滤，干燥，得五味子乙素120g，HPLC测定外标含量为92.16%；将所得五味子乙素，加6倍量无水乙醇溶解，抽滤，滤液放置1天，抽滤，干燥，得五味子乙素100g，HPLC测定外标含量为98.24%。

Claims

1.一种从五味子中提取分离五味子乙素的方法，所述方法如下：

(1)药材提取：取五味子药材，粉碎，加入10～15％钙盐沉淀剂，加80～95％乙醇水溶液于50～80℃下浸提，或回流搅拌提取2～3次，乙醇水溶液用量为4～10mL/g五味子，每次提取2～4hr，合并醇提液，减压回收溶剂，得五味子醇提浓缩液；所述钙盐沉淀剂为CaO；

(2)大孔吸附树脂柱层析：取五味子醇提浓缩液，滤过，上样于大孔吸附树脂柱，加50～60％乙醇水溶液洗脱3～5个柱体积，加75～85％乙醇水溶液洗脱6～10个柱体积，合并含有五味子乙素的流分，减压回收溶剂至干，加入适量正己烷溶解，放置1～3天，抽滤，得五味子乙素粗品，滤余液为五味子乙素结晶母液；所述大孔吸附树脂为AB-8型大孔吸附树脂；

(3)硅胶柱层析：取步骤(2)五味子乙素结晶母液，上样于硅胶层析柱，加洗脱剂洗脱6～10个柱体积，合并含有五味子乙素的流分，减压回收溶剂至干，加入适量正己烷溶解，放置1～3天，抽滤，得五味子乙素粗品；所述洗脱剂为体积比97:3～90:10的石油醚-乙酸乙酯或正己烷-乙酸乙酯二元溶剂系统；

(4)乙醇重结晶：合并步骤(2)和(3)所得五味子乙素粗品，加6～10倍量无水乙醇溶解，抽滤，滤液放置1～3天，抽滤，干燥，得五味子乙素。