CN100567249C - 丹参丹酚酸a的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丹参丹酚酸A的制备方法。将丹参药材用水或醇提取。初步除去固体杂质,柱色谱纯化丹酚酸A,浓缩洗脱液,再经调pH值有机溶剂萃取,浓缩干燥,即得丹酚酸A。用本发明方法制备丹酚酸A提取率高,纯度好,提取物中丹酚酸A含量可达90%以上,且质量稳定,可大规模生产。

Description

丹参丹酚酸A的制备方法
技术领域
本发明涉及一种丹参丹酚酸A的制备方法,丹酚酸A的结构如下:
Figure C20061016577900031
技术背景
丹参是最常用的药材之一,用于治疗心绞痛、高血压、冠心病和中风等心脑血管疾病。但一般用的都是从丹参中提取的粗提物或直接用丹参饮片。近二十多年,丹参的主要活性成分丹酚酸类化合物陆续被发现。体外实验结果显示,丹酚酸类化合物除了用于治疗心脑血管疾病,还可治疗多种疾病,如肝病、肾病、消化溃疡、肿瘤等。丹参总酚酸中以丹酚酸B含量最高,因此,人们开发的重点集中于丹酚酸B,而含量较低而活性较强的丹酚酸A被人们忽略。
杜冠华等人对丹酚酸A的活性进行了大量研究,发现丹酚酸A对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用,对小鼠脑缺血再灌注引起的脑损伤有保护作用,对樟柳碱或东莨菪碱引起的小鼠记忆获得障碍具有明显的改善作用,对大鼠半乳糖性白内障形成有抑制作用,因此在心脑血管方向有良好的疗效。
中国专利CN1397276A,2003年公开了水或醇提、树脂层析,再经硅胶柱层析的纯化制备丹酚酸A的方法。中国专利CN1513848A,2004年公开了采用水温浸、离心、超滤、调酸、有机溶剂萃取再经反相柱层析制备丹酚酸A的方法。
由于丹酚酸A在药材中含量低,甚至没有,因此丹酚酸A产率低,生产成本高,在工业大生产上有一定的局限性,实际上并不能从根本上解决丹酚酸A的工业生产问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷,提供一种丹酚酸A的制备方法。
本发明丹参丹酚酸A的制备方法,其工艺步骤为:
1、提取
在水或乙醇水溶液作为提取溶剂时,温浸温度为50~99℃,采用乙醇水溶液作为提取溶剂时浓度为10%~95%。提取的方法可以采用回流法或温浸法。现以乙醇回流提取的方法为例进行说明。
丹参粗粉,加10倍量60%乙醇回流提取3次,每次1.5小时,滤过。
合并提取液,采用过滤,自然沉淀或离心的方法,初步除去提取液中固体杂质。
2、柱层析纯化丹酚酸A
(1)采用特选填料制备色谱柱;
(2)色谱柱活化;
(3)溶液经色谱柱吸附,用水、醇水溶液或丙酮-水溶液洗脱,除去杂质;
(4)用适当浓度的醇水溶液或丙酮-水溶液或乙腈-水溶液洗脱,减压或常压浓缩至洗脱液无有机溶剂。
在上述步骤(1)中,特选填料是大孔树脂类、离子交换树脂、MCI-GELCHP-20P、Sephadex LH-20凝胶、或C18、C8键合相等色谱柱填料,推荐方案为用非极性或弱极性的大孔树脂做色谱柱填料,优选为聚苯乙烯骨架大孔树脂。
上述步骤(2)中色谱柱活化的方法可用丙酮、甲醇、乙腈或其他有机溶剂与水的混合物,也可用碱-水溶液,或碱醇溶液活化。
上述步骤(3)中,洗脱用水可含微量的酸或无机盐。
上述步骤(3)中,可以单用水洗脱杂质或单用醇水溶液或低浓度的丙酮-水溶剂洗脱杂质,也可先用水洗脱然后再用醇水溶液或低浓度的丙酮-水溶液洗脱杂质。
上述步骤(3)中,醇水溶液等溶剂可以为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等醇的水溶液,也可采用乙腈的水溶液,或它们的混合物。
上述步骤(3)中,醇水溶液等溶剂的浓度一般在40%以下,最好用20-30%的浓度,低浓度的丙酮-水溶液常用的丙酮含量一般在50%以下,最好为10-30%的浓度。
上述步骤(4)中,适当浓度的丙酮-水、醇水溶液或乙腈-水溶液中,有机相所占比例一般大于20%,最好用35%~60%的浓度。所述醇水溶液等溶剂可以为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等醇的水溶液,或它们的混合物。
3、调PH值有机溶剂萃取
将如上溶液用酸或碱调PH值至2~7,经有机溶剂萃取,然后分离有机溶剂得含高含量丹酚酸A溶液。优选PH值范围为3~5。有机溶剂优选为乙酸酯类,可以是乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯等乙酸酯类溶剂,或它们的混合物。
4、干燥
萃取液的干燥可采用一步法,也可采用两步法。两步法为先在常压或减压条件下浓缩,然后采用真空干燥或冷冻干燥等方法干燥。一步法采用减压浓缩干燥得到丹酚酸A成品。
本发明丹参丹酚酸A的制备方法,用水或醇提取,主要是把丹参酚酸类化合物提取完全,是丹酚酸A产率提高的基础。柱层析时由于在洗脱去杂质的过程采用水和低浓度醇溶剂,使提取液中的杂质得到进一步除去。在丹酚酸A的洗脱过程中,由于采用适当浓度的有机溶剂-水溶液,使丹酚酸A与其它成分得到较好分离;经过柱层析后,还有少量杂质存在,经过调节PH值有机溶剂萃取,最终制得了纯度较高的丹酚酸A。最终提取物得量达3‰以上,丹酚酸A含量达到90%以上,且质量稳定、工艺成熟、可以大规模生产。与其它丹酚酸A的制备方法相比,产率大大提高,成本降低。对于提高丹参疗效,充分利用中药材资源等具有很重要的意义。
具体实施例
下面结合具体实施例,对本发明及一步详细说明
实施例一:丹酚酸A的制备方法,其工艺步骤为:
1、水提取(温浸法):丹参粗粉,加8倍量水80℃温浸3次,每次1.0小时,滤过。
2、柱层析纯化丹酚酸A:合并滤液离心(4000转/分钟)10分钟,取上清液过1400大孔吸附树脂柱,先用水洗至糖检测反应为阴性,改用20%乙醇洗脱至FeCl3反应为阴性。
3、再用40%乙醇洗脱至FeCl3反应为阴性,收集洗脱液,60℃减压浓缩至无醇味。
4、调PH值,有机溶剂萃取:加盐酸调节PH值至3~5,用药液1.5倍量体积的乙酸乙酯萃取4次,合并乙酸乙酯相。
5、浓缩干燥:减压浓缩萃取液至浸膏状,60℃真空干燥6小时,得淡黄色粉末,即为丹参丹酚酸A。
实施例二:与实施例一基本相同,所不同的是提取过程为60%乙醇水溶液回流提取。具体方法如下:
丹参粗粉,加10倍量60%乙醇回流提取3次,每次1.5小时,滤过。
实施例三:与实施例一基本相同,所不同的是提取液离心后采用过滤初步除去固体杂质。
实施例四:与实施例一基本相同,所不同的是实施例一中的工艺步骤2中,直接用10%乙醇水溶液洗脱,除去杂质。
实施例五:与实施例一基本相同,所不同的是实施例一中的工艺步骤3中,用80%乙醇水溶液洗脱丹酚酸A。
实施例六:与实施例一基本相同,所不同的是浓缩洗脱液时采用常压浓缩。
实施例七:与实施例一基本相同,所不同的是调PH值有机溶剂萃取时调PH值至2~3。
实施例八:与实施例一基本相同,所不同的是调PH值有机溶剂萃取时采用的有机溶剂为乙酸丁酯。
实施例九:与实施例一基本相同,所不同的是浓缩干燥采用一步法直接减压浓缩干燥得到丹酚酸A成品。
实施例十:与实施例一基本相同,所不同的是在柱层析分离、纯化丹酚酸A的洗脱过程中,采用的是甲醇水溶液。
实施例十一:与实施例一基本相同,所不同的是在柱层析分离、纯化丹酚酸A的洗脱过程中,采用的是丙酮-水溶液。
实施例十二:与实施例一基本相同,所不同的是在柱层析分离、纯化丹酚酸A的洗脱过程中,采用的是乙腈水溶液。
实施例十三:与实施例一基本相同,所不同的是在柱层析分离、纯化丹酚酸A的洗脱过程中,采用的MCI-GEL CHP-20P作色谱柱填料。
实施例十四:与实施例一基本相同,所不同的是在柱层析分离、纯化丹酚酸A的洗脱过程中,采用C18键合相作色谱柱填料。
实施例十五:与实施例一基本相同,所不同的是在柱层析分离、纯化丹酚酸A的洗脱过程中,采用的C8键合相作色谱柱填料。
实施例十六:与实施例一基本相同,所不同的是在柱层析分离、纯化丹酚酸A的洗脱过程中,采用的Sephadex LH-20作色谱柱填料。
本发明所要求保护的具体技术方案,不限于上述实施例(具体试验结果见下页附表1)所表达的技术方案的具体组合。
附表1
  产品序号   丹酚酸A含量
  实施例一产品   96.3%
  实施例二产品   97.3%
  实施例三产品   94.5%
  实施例四产品   94.5%
  实施例五产品   97.8%
  实施例六产品   96.1%
  实施例七产品   97.5%
  实施例八产品   96.9%
  实施例九产品   97.0%
  实施例十产品   97.0%
  实施例十一产品   96.8%
  实施例十二产品   96.0%
  实施例十三产品   97.8%
  实施例十四产品   97.2%
  实施例十五产品   97.8%
  实施例十六产品   96.9%
附图说明
使用仪器类型:高效液相色谱仪    梯度方法:恒流
检测器:紫外检测器              仪器型号:Agilent 1100
检测波长:285nm
柱型号:Kromasil KR100-7C18柱(250×4.6mm)
积分方法:面积归一法
图1实施例四产品高效液相含量测定图
图2实施例六产品高效液相含量测定图
图3实施例八产品高效液相含量测定图
图4实施例十六产品高效液相含量测定图

Claims (7)

1、一种丹参丹酚酸A的制备方法,其工艺步骤为:
步骤一、提取
将丹参饮片或粉碎的丹参,采用水或浓度为10-95%的乙醇水溶液作为提取溶剂,采用温浸或回流法提取,采用过滤、自然沉淀或离心方法初步除去固体杂质,其中温浸温度为50~99℃;
步骤二、柱层析纯化丹酚酸A
(1)采用填料制备色谱柱:用于制备色谱柱的填料是大孔吸附树脂、MCI-GELCHP-20P、Sephadex LH-20凝胶、或C18、C8键合相色谱柱填料;
(2)色谱柱活化;
(3)溶液经色谱柱吸附,用水、40%以下浓度的醇水溶液或50%以下浓度的丙酮水溶液洗脱,除去杂质;
(4)再用有机相占比例大于20%的醇水溶液或丙酮-水溶液或乙腈-水溶液洗脱,减压或常压浓缩至洗脱液无有机溶剂;
步骤三、调PH值有机溶剂萃取
将如上溶液用酸或碱调PH值至3~5,经乙酸酯类有机溶剂萃取,然后分离有机溶剂得丹酚酸A溶液;
步骤四、浓缩干燥萃取液:浓缩采用减压浓缩或常压浓缩,干燥采用真空干燥或冷冻干燥。
2、权利要求1所述的丹参丹酚酸A的制备方法,步骤二柱层析纯化丹酚酸A:
(1)采用填料制备色谱柱,其采用的填料为非极性或弱极性的大孔吸附树脂。
3、权利要求2所述的丹参丹酚酸A的制备方法,其中所选用的大孔树脂吸附是聚苯乙烯骨架的大孔吸附树脂。
4、权利要求1所述的丹参丹酚酸A的制备方法,其中乙酸酯类有机溶剂是乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯或它们的混合物。
5、权利要求1所述的丹参丹酚酸A的制备方法,步骤二中所述的醇水溶液指的是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇的水溶液,或它们的混合物。
6、权利要求1所述的丹参丹酚酸A的制备方法,步骤二(3)中的醇水溶液和丙酮水溶液是:浓度为20-30%的醇水溶液;浓度为10-30%的丙酮水溶液。
7、权利要求1所述的丹参丹酚酸A的制备方法,步骤二(4)中的丙酮-水溶液、醇水溶液或乙腈-水溶液中,有机相浓度为35~60%。
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