CN112143768A - 一种利用小牛胸腺联合制备dna和胸腺肽的方法 - Google Patents

一种利用小牛胸腺联合制备dna和胸腺肽的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112143768A
CN112143768A CN202011052552.9A CN202011052552A CN112143768A CN 112143768 A CN112143768 A CN 112143768A CN 202011052552 A CN202011052552 A CN 202011052552A CN 112143768 A CN112143768 A CN 112143768A
Authority
CN
China
Prior art keywords
thymosin
dna
enzymolysis
ultrafiltration
supernatant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011052552.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112143768B (zh
Inventor
王永珍
冯恩承
孔双泉
马胜楠
梁东娜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEIJING SAISHENG PHARMACEUTICAL CO LTD
Original Assignee
BEIJING SAISHENG PHARMACEUTICAL CO LTD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING SAISHENG PHARMACEUTICAL CO LTD filed Critical BEIJING SAISHENG PHARMACEUTICAL CO LTD
Priority to CN202011052552.9A priority Critical patent/CN112143768B/zh
Publication of CN112143768A publication Critical patent/CN112143768A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112143768B publication Critical patent/CN112143768B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57581—Thymosin; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及DNA和胸腺肽制备技术领域，具体涉及一种利用小牛胸腺联合制备DNA和胸腺肽的方法。本发明提供的联合制备方法包括：将小牛胸腺经蛋白酶K酶解得到酶解液，将酶解液的上清液经超滤分离后，将超滤的透过液用于分离胸腺肽，将超滤的截留液用于分离DNA。该制备方法可以小牛胸腺为原料同时制备DNA和胸腺肽，胸腺肽的提取效率高，分子量小且均一，便于人体吸收，且没有化学试剂残留，同时DNA的纯度和收率也较高，且DNA提取过程不使用有机试剂，减少了环境污染。

Description

一种利用小牛胸腺联合制备DNA和胸腺肽的方法
技术领域
本发明涉及DNA和胸腺肽制备技术领域，具体涉及一种利用小牛胸腺联合制备DNA和胸腺肽的方法。
背景技术
胸腺是机体重要的免疫器官，其功能与免疫密切相关，是T细胞分化、发育、成熟的场所。成人胸腺有助于T细胞的重建，研究表明，在获得性免疫缺陷疾病患者抗逆转录病毒治疗过程中，增加的幼稚淋巴细胞大部分是从胸腺释放的。胸腺也是内分泌器官，可以分泌胸腺激素和激素类物质，如胸腺肽。胸腺肽是胸腺组织上皮细胞分泌的分子量在10000道尔顿以下的多肽类激素，是一种重要的生物反应调节剂，可以促进淋巴细胞成熟及调节人体免疫功能，适用于原发性和继发性免疫缺陷病，对肿瘤也有很好的辅助治疗效果。
目前，胸腺肽的制备方法主要采用生物提取法，从小牛、猪等胸腺组织或肝脏中提取小分子胸腺肽。常用的生物提取法为采用反复冻融工艺使活性多肽溶出，或将pH调至酸性状态下反复冻融再加热提取胸腺肽。然而，常规冻融工艺不能充分破坏组织细胞，释放小分子肽，导致小分子肽提取率较低；酸性环境会破坏原料的有效活性成分(如引起核酸分子变性等)，不利于其他活性成分的再利用。
脱氧核糖核酸(DNA)是生物遗传物质的基础，具有多种生理功能，被广泛应用于医药、畜牧业、食品等领域。小牛胸腺中细胞核含量比重较大，DNA含量较高，且脱氧核糖核酸酶的活性较低，适用于规模化工业生产DNA。动物组织基因组DNA的提取一般通过将细胞破碎后，用氯仿-异戊醇、苯酚、SDS等蛋白变性剂分离蛋白质和DNA。该方法所得DNA纯度和收率较低，且存在有机溶剂污染的问题。目前，DNA提取过程中的蛋白质一般被作为副产物被丢弃，造成资源的浪费。
专利申请CN 105541996 A公开了一种胸腺组织提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和DNA的方法，其以胸腺组织为原料，采用高温变性和反复冻融工艺，同时提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和DNA。该方法虽然可同时提取胸腺肽和DNA，但是，对胸腺组织的裂解不完全，DNA和胸腺肽的提取收率均较低，DNA提取依赖有机溶剂且纯度仍有待提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用小牛胸腺联合制备DNA和胸腺肽的方法，本发明的另一目的是提供利用该方法制备得到的胸腺肽、DNA。
为实现上述目的，本发明以小牛胸腺为原料，开发联合提取DNA和胸腺肽的方法。与单一目标物的制备不同，在DNA和胸腺肽联合提取过程中，需要同时考虑DNA和胸腺肽的收率、DNA的纯度以及小分子胸腺肽的含量，兼顾DNA和胸腺肽的提取效率。本发明在研发过程中发现，相比于高温蒸煮、反复冻融的方法，酶解法能够更充分地裂解组织细胞，但是，选择不同酶对于胸腺肽的收率以及DNA的收率和纯度的影响较大，通常用于酶解法提取胸腺肽的一些内切蛋白酶、外切蛋白酶虽然能够提高胸腺肽的收率，但是，酶的选择会极大地影响DNA的收率，有些酶的反应条件会破坏DNA，很难同时保证DNA的提取收率和纯度。本发明意外地发现，利用蛋白酶K对小牛胸腺组织进行酶解，不仅能够很好地将胸腺组织蛋白降解为胸腺肽，提高小分子胸腺肽的得率，而且还能够有效显著提高DNA的收率和纯度。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明首先提供一种联合制备DNA和胸腺肽的方法，包括：将小牛胸腺经酶解得到酶解液，将酶解液的上清液经超滤分离后，再将超滤的透过液用于分离胸腺肽，超滤的截留液用于分离DNA；其中，对小牛胸腺进行酶解使用的酶包括蛋白酶K。
现有技术中，在单独制备胸腺肽时，在收取含胸腺肽的透过液后，过滤的截留液通常作为废弃物处理，本发明将截留液用于制备DNA，实现DNA和胸腺肽的联合制备。
本发明所述的酶解使用的酶可仅为蛋白酶K。蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，属于中性蛋白酶，化学性质较为稳定。蛋白酶K在生物工程中常被应用于实验室规模DNA的提取，但在工业生产中很少被用到。随着生物技术的不断发展，蛋白酶K的产量已有较大提高，可将其大规模应用于酶解动物组织蛋白和DNA的制备。
本发明进一步通过控制蛋白酶K的酶解条件、用量和酶解时间，更好地促进了胸腺组织蛋白降解为胸腺肽，同时更有利于保证后续DNA提取的收率和纯度。
具体地，所述酶解为采用蛋白酶K在30～60℃、pH 6～9条件下进行。
优选地，酶解过程中蛋白酶K的用量为与小牛胸腺的匀浆液的质量比为0.2～0.4％，酶解时间为4～8小时。
经上述酶解后，在酶解液的超滤过程中，优选将超滤的截留分子量控制为≤10KD。优选为5～10KD。将超滤设备的截留分子量控制在该范围能够更好地提高胸腺肽和DNA的收率。
现有技术中，动物组织的DNA提取多需要使用SDS、氯仿、酚等蛋白变性剂去除杂蛋白。本发明发现利用经上述酶解和超滤获得的截留液能够在不使用SDS、氯仿、酚等蛋白变性剂、仅采用简单的NaCl分离的情况下获得较高的DNA纯度和收率。
具体地，在所述截留液中先加入5～10倍截留液体积的0.1～0.2M氯化钠溶液，搅拌8～24小时，再加入固体氯化钠，使氯化钠的终浓度为1～3M，搅拌8～24小时后，分离上清液。
DNA和蛋白质在相同浓度氯化钠溶液中的溶解度差异较大，调节溶液盐浓度，可将DNA溶液中的杂蛋白去除，提高DNA纯度。
进一步地，在离心得到的DNA上清液加入沉淀剂，分离DNA。
优选地，所述沉淀剂为80％～100％乙醇或丙酮，沉淀剂的用量为与上清液的体积比为(0.5～2)：1，沉淀处理时间为8～24小时。
本发明利用超滤得到的透过液进行胸腺肽的分离，具体地，将所述透过液经浓缩得到胸腺肽浓缩液。
以上所述的方法中，在超滤前，先将所述酶解液经高温灭酶后，离心收集上清液，再将上清液过滤去除大颗粒。
作为本发明的一种优选方案，所述联合制备DNA和胸腺肽的方法包括如下步骤：
(1)匀浆：将小牛胸腺摘去表面的脂肪和外膜等组织，清洗后切成小块，倒入胶体磨中匀浆，制得匀浆液；
(2)酶解：匀浆液中加入相当于所述匀浆液重量2～4倍的水，搅拌均匀，再加入蛋白酶K，调pH为6～9，30～60℃酶解4～8小时，然后85～90℃保温4～8min灭酶；
(3)离心：将所得酶解液进行离心，得到酶解液的上清液以及脂肪、外模组织等沉淀物；
(4)过滤与超滤：将步骤(3)所得上清液先用1μm过滤器除去大颗粒得到滤过液，然后用截留分子量为5～10KD的中空纤维超滤系统对滤过液进行超滤，得到透过液和截留液；
(5)DNA分离：将上述步骤(4)所得截留液加入5～10倍体积的0.14mol/L氯化钠溶液，搅拌8～24小时；再向溶液中加入固体氯化钠，使盐浓度达到1.5～2mol/l，继续搅拌8～24小时，离心取上清液；
(6)DNA粗品制备：将上述步骤(5)所得上清液加入0.5～2倍体积的95％乙醇，静置8～24小时，离心取沉淀，鼓风干燥得DNA粗品，对DNA粗品检测；
(7)胸腺肽浓缩液制备：将上述步骤(4)所得透过液过150～300Da的纳滤膜浓缩至原体积的0.2～0.5倍，得胸腺肽浓缩液。
优选地，步骤(3)中，于4℃、4000～8000r/min，离心15～30min。
步骤(4)中，所述中空纤维超滤系统采用内压式超滤膜，跨膜压力不超过0.2MPa。
步骤(6)中，在上清液中加入1～1.5倍体积的95％乙醇。
步骤(7)中，纳滤可将水分子和小分子盐类除去，浓缩透过液。
利用以上所述的制备方法制备得到的胸腺肽浓缩液可直接用于胸腺肽制剂的制备。
基于以上制备方法，本发明还提供由以上制备方法制备得到的胸腺肽。
本发明还提供所述制备方法或由所述制备方法制备得到的胸腺肽在制备胸腺肽产品中的应用，所述产品为食品、药品或保健品。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的制备方法可以小牛胸腺为原料同时制备胸腺DNA和胸腺肽，可解决单一产品生产中废弃物多、胸腺组织蛋白或DNA的浪费问题，提高了物料利用率。
(2)本发明的制备方法采用蛋白酶K充分酶解胸腺蛋白，彻底释放胸腺肽，胸腺肽的提取效率高，分子量均一，便于人体吸收，且没有化学试剂残留；另一方面，还可以将组蛋白和核蛋白充分酶解，充分释放DNA，配合后续的DNA提取工艺制备的DNA的纯度和收率均较高(纯度可达94％以上，收率可达3％～4％)，DNA色泽白皙，且提取工艺稳定性高。
(3)本发明的制备方法中，DNA提取过程采用盐溶盐析法，仅采用三类溶剂乙醇或丙酮来沉淀DNA，避免使用氯仿等二类溶剂，对人和环境没有危害。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，蛋白酶K购自上海吉至生化科技有限公司，酶活为30u/mg。
实施例1
本实施例提供一种联合制备DNA和胸腺肽的方法，具体包括以下步骤：
(1)匀浆：将检验检疫合格的小牛胸腺，摘去表面的脂肪和外膜等组织，清洗后用碎肉机切成小块，倒入胶体磨中匀浆，取匀浆液300g；
(2)酶解：匀浆液中加入900ml的水，搅拌均匀，再加入0.6g蛋白酶K，调pH为8，50℃酶解4小时，然后90℃保温5min灭酶；
(3)离心：将所得酶解液在4000r/min、4℃条件下离心30min，得到酶解上清液和脂肪、外模组织等沉淀物；
(4)过滤与超滤：将步骤(3)所得上清液先用1μm过滤器除去大颗粒，然后将滤过液过截留分子量为5KD的中空纤维超滤系统，内压式超滤，跨膜压力不超过0.2MPa，分别收集透过液和截留液；
(5)DNA分离：将步骤(4)所得截留液加入7.5倍体积的0.14mol/L氯化钠溶液，搅拌8小时；再向溶液中加入固体氯化钠，使盐浓度达到1.71mol/L，继续搅拌8小时，于4000r/min、4℃条件下离心30min，取上清液；
(6)DNA粗品制备：将步骤(5)所得上清液加入1倍体积的95％乙醇，静置8小时，离心取沉淀，40℃鼓风干燥60小时，得DNA粗品；
(7)胸腺肽浓缩液制备：将步骤(4)所得透过液过150～300Da的纳滤膜，将样液浓缩至原体积的0.3倍，得胸腺肽浓缩液。
实施例2
本实施例提供一种联合制备DNA和胸腺肽的方法，具体包括以下步骤：
(1)匀浆：将检验检疫合格的小牛胸腺，摘去表面的脂肪和外膜等组织，清洗后用碎肉机切成小块，倒入胶体磨中匀浆，取1kg匀浆液；
(2)酶解：匀浆液中加入2L的水，搅拌均匀，再加入3g蛋白酶K，调pH为6，30℃酶解8小时，然后90℃保温5min灭酶；
(3)离心：将所得酶解液在6000r/min、4℃条件下离心20min，得到酶解上清液和脂肪、外模组织等沉淀物；
(4)过滤与超滤：将步骤(3)所得上清液先用1μm过滤器除去大颗粒，然后将滤过液过截留分子量为8KD的中空纤维超滤系统，内压式超滤，跨膜压力不超过0.2MPa，分别收集透过液和截留液；
(5)DNA分离：将步骤(4)所得截留液加入5倍体积的0.14mol/L氯化钠溶液，搅拌12小时；再向溶液中加入固体氯化钠，使盐浓度达到1.5mol/L，继续搅拌12小时，于4000r/min、4℃条件下离心30min，取上清液；
(6)DNA粗品制备：将步骤(5)所得上清液加入2倍体积的95％乙醇，静置12小时，离心取沉淀，50℃鼓风干燥50小时，得DNA粗品；
(7)胸腺肽浓缩液制备：将步骤4所得透过液过150～300Da的纳滤膜，将样液浓缩至原体积的0.5倍，得胸腺肽浓缩液。
实施例3
本实施例提供一种联合制备DNA和胸腺肽的方法，具体包括以下步骤：
(1)匀浆：将检验检疫合格的小牛胸腺，摘去表面的脂肪和外膜等组织，清洗后用碎肉机切成小块，倒入胶体磨中匀浆，取10kg匀浆液；
(2)酶解：匀浆液中加入40L的水，搅拌均匀，再加入40g蛋白酶K，调pH为9，60℃酶解6小时，然后90℃保温5min灭酶；
(3)离心：将所得酶解液在8000r/min、4℃条件下离心15min，得到酶解上清液和脂肪、外模组织等沉淀物；
(4)过滤与超滤：将步骤(3)所得上清液先用1μm过滤器除去大颗粒，然后将滤过液过截留分子量为10KD的中空纤维超滤系统，内压式超滤，跨膜压力不超过0.2MPa，分别收集透过液和截留液；
(5)DNA分离：将步骤(4)所得截留液加入10倍体积的0.14mol/L氯化钠溶液，搅拌24小时；再向溶液中加入固体氯化钠，使盐浓度达到2mol/L，继续搅拌24小时，于4000r/min、4℃条件下离心30min，取上清液；
(6)DNA粗品制备：将步骤(5)所得上清液加入0.5倍体积的95％乙醇，静置24小时，离心取沉淀，60℃鼓风干燥45小时，得DNA粗品；
(7)胸腺肽浓缩液制备：将步骤4所得透过液过150～300Da的纳滤膜，将样液浓缩至原体积的0.2倍，得胸腺肽浓缩液。
对比例1
本对比例提供一种联合制备DNA和胸腺肽的方法，其与实施例1的区别仅在于，将蛋白酶K替换为胰蛋白酶，并以胰蛋白酶的最适反应条件酶解。具体包括以下步骤：
(1)匀浆：将检验检疫合格的小牛胸腺，摘去表面的脂肪和外膜等组织，清洗后用碎肉机切成小块，倒入胶体磨中匀浆，取300g匀浆液；
(2)酶解：匀浆液中加入900mL的水，搅拌均匀，再加入1.2g胰蛋白酶，调pH为7.8，37℃酶解6小时，然后90℃保温5min灭酶；
(3)离心：将所得酶解液在4000r/min、4℃条件下离心30min，得到酶解上清液和脂肪、外模组织等沉淀物；
(4)过滤与超滤：将步骤(3)所得上清液先用1μm过滤器除去大颗粒，然后将滤过液过截留分子量为5KD的中空纤维超滤系统，内压式超滤，跨膜压力不超过0.2MPa，分别收集透过液和截留液；
(5)DNA分离：将步骤(4)所得截留液加入7.5倍体积的0.14mol/L氯化钠溶液，搅拌8小时；再向溶液中加入固体氯化钠，使盐浓度达到1.71mol/L，继续搅拌8小时，于4000r/min、4℃条件下离心30min，取上清液；
(6)DNA粗品制备：将步骤(5)所得上清液加入1倍体积的95％乙醇，静置24小时，离心得少量沉淀，40℃鼓风干燥60小时，得DNA粗品；
(7)胸腺肽浓缩液制备：将步骤(4)所得透过液过150～300Da的纳滤膜，将样液浓缩至原体积的0.3倍，得胸腺肽浓缩液。
对比例2
本对比例提供一种联合制备DNA和胸腺肽的方法，其与实施例1的区别仅在于，将蛋白酶K替换为胃蛋白酶，并以胃蛋白酶的最适反应条件酶解。具体包括以下步骤：
(1)匀浆：将检验检疫合格的小牛胸腺，摘去表面的脂肪和外膜等组织，清洗后用碎肉机切成小块，倒入胶体磨中匀浆，取300g匀浆液；
(2)酶解：匀浆液中加入900mL的水，搅拌均匀，再加入0.9g胃蛋白酶，调pH为2.0，45℃酶解4小时，然后90℃保温5min灭酶；
(3)离心：将所得酶解液在4000r/min、4℃条件下离心30min，得到酶解上清液和脂肪、外模组织等沉淀物；
(4)过滤与超滤：将步骤(3)所得上清液调节PH值至7.0，先用1μm过滤器除去大颗粒，然后将滤过液过截留分子量为5KD的中空纤维超滤系统，内压式超滤，跨膜压力不超过0.2MPa，分别收集透过液和截留液；
(5)DNA分离：将步骤(4)所得截留液加入7.5倍体积的0.14mol/L氯化钠溶液，搅拌8小时；再向溶液中加入固体氯化钠，使盐浓度达到1.7mol/L，继续搅拌8小时，于4000r/min、4℃条件下离心30min，取上清液；
(6)DNA粗品制备：将步骤(5)所得上清液加入1倍体积的95％乙醇，静置8小时，离心基本无沉淀；
(7)胸腺肽浓缩液制备：将步骤(4)所得透过液过150～300Da的纳滤膜，将样液浓缩至原体积的0.3倍，得胸腺肽浓缩液。
实验例1
对以上实施例中制备的DNA粗品和胸腺肽浓缩液进行质量分析，具体如下：
DNA的含量检测：采用磷酸二酯酶将DNA水解，再利用高效液相色谱测定DNA的含量。该方法较比260nm与280nm吸光度比值法测定DNA纯度更精确。
肽含量检测：采用福林酚法测定胸腺肽浓缩液的肽含量。
高分子量物质和胸腺肽α1检测：采用高效液相色谱法同时测定胸腺肽浓缩液中的高分子量物质和胸腺肽α1。
根据检测结果计算DNA粗品的纯度，并计算粗品收率。其中，DNA粗品的纯度和收率计算公式如下：
DNA粗品纯度＝(碱基含量×酶解液体积)/样品质量×100％；
DNA粗品收率＝(粗品质量×纯度)/匀浆液质量×100％。
DNA粗品纯度和收率以及胸腺肽浓缩液中的肽含量、高分子物质、胸腺肽α1含量结果如表1所示。
表1DNA粗品以及胸腺肽浓缩液的检测结果
Figure BDA0002709990880000111
由表1结果可见，实施例1～3中DNA粗品的纯度稳定在94％～98％范围内，纯度较高，且不存在生产过程中放大反应引起纯度降低的现象。DNA粗品收率稳定在3％～4％之间，高于现有技术的DNA提取收率。实施例1～3所得胸腺肽浓缩液的肽含量基本稳定在40mg/mL左右，胸腺肽α1的含量在1.2％以上且不含分子量高于10000Da的组分，可用于后续胸腺肽制剂的生产。
由对比例1和对比例2可以看出，使用胰蛋白酶或胃蛋白酶酶解胸腺匀浆液，所得DNA粗品量少(对比例1)甚至得不到沉淀(对比例2)，表明所得截留液中几乎不含DNA，胰蛋白酶和胃蛋白酶不适合联合制备DNA和胸腺肽。
综上，本发明利用小牛胸腺原料可同时实现DNA和胸腺肽的提取，所得产品纯度、得率高，工艺稳定，也避免了蛋白资源的浪费。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种联合制备DNA和胸腺肽的方法，其特征在于，包括：将小牛胸腺经酶解得到酶解液，将酶解液的上清液经超滤分离后，将超滤的透过液用于分离胸腺肽，将超滤的截留液用于分离DNA；
所述酶解使用的酶包括蛋白酶K。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解为采用蛋白酶K在30～60℃、pH6～9条件下进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，蛋白酶K的用量为与小牛胸腺的匀浆液的质量比为0.2～0.4％，酶解时间为4～8小时。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述超滤的截留分子量为≤10KD；优选为5～10KD。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述截留液中先加入5～10倍截留液体积的0.1～0.2M氯化钠溶液，搅拌8～24小时，再加入固体氯化钠，使氯化钠的终浓度为1～3M，搅拌8～24小时后，分离上清液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述上清液中加入沉淀剂沉淀DNA；
优选地，所述沉淀剂为80％～100％乙醇或丙酮溶液，所述沉淀剂的用量为与上清液的体积比为(0.5～2)：1，沉淀处理时间为8～24小时。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述透过液经浓缩得到胸腺肽浓缩液。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，将所述酶解液经高温灭酶后，离心收集上清液，将上清液过滤去除大颗粒后再进行超滤。
9.一种胸腺肽，其特征在于，由权利要求1～8任一项所述的方法制备得到。
10.权利要求1～8任一项所述的方法或权利要求9所述的胸腺肽在制备胸腺肽产品中的应用，所述产品为食品、药品或保健品。
CN202011052552.9A 2020-09-29 2020-09-29 一种利用小牛胸腺联合制备dna和胸腺肽的方法 Active CN112143768B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011052552.9A CN112143768B (zh) 2020-09-29 2020-09-29 一种利用小牛胸腺联合制备dna和胸腺肽的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011052552.9A CN112143768B (zh) 2020-09-29 2020-09-29 一种利用小牛胸腺联合制备dna和胸腺肽的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112143768A true CN112143768A (zh) 2020-12-29
CN112143768B CN112143768B (zh) 2022-08-16

Family

ID=73894343

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011052552.9A Active CN112143768B (zh) 2020-09-29 2020-09-29 一种利用小牛胸腺联合制备dna和胸腺肽的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112143768B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113980115A (zh) * 2021-12-13 2022-01-28 青岛润达生物科技有限公司 一种胸腺多肽的制备工艺

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1390853A (zh) * 2002-05-16 2003-01-15 西安迪赛生物药业有限责任公司 一种制备胸腺肽的工艺方法
CN101921331A (zh) * 2010-08-17 2010-12-22 郑州后羿制药有限公司 一种胸腺肽的制备方法
CN102140448A (zh) * 2010-11-25 2011-08-03 大连海洋大学 动物组织dna提取方法
CN104232623A (zh) * 2014-10-22 2014-12-24 甘肃农业大学 一种改进的动物组织基因组dna提取方法
CN104450676A (zh) * 2014-08-21 2015-03-25 广东省农业科学院动物科学研究所 一种高效提取动物组织dna的方法
CN105541996A (zh) * 2015-12-31 2016-05-04 天津泰创生物科技有限公司 胸腺组织提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和dna的方法
CN106755246A (zh) * 2016-12-13 2017-05-31 国肽生物科技(北京)有限公司 胸腺肽的提取方法
CN110496216A (zh) * 2018-05-18 2019-11-26 山东信得科技股份有限公司 一种胸腺肽注射液的制备方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1390853A (zh) * 2002-05-16 2003-01-15 西安迪赛生物药业有限责任公司 一种制备胸腺肽的工艺方法
CN101921331A (zh) * 2010-08-17 2010-12-22 郑州后羿制药有限公司 一种胸腺肽的制备方法
CN102140448A (zh) * 2010-11-25 2011-08-03 大连海洋大学 动物组织dna提取方法
CN104450676A (zh) * 2014-08-21 2015-03-25 广东省农业科学院动物科学研究所 一种高效提取动物组织dna的方法
CN104232623A (zh) * 2014-10-22 2014-12-24 甘肃农业大学 一种改进的动物组织基因组dna提取方法
CN105541996A (zh) * 2015-12-31 2016-05-04 天津泰创生物科技有限公司 胸腺组织提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和dna的方法
CN106755246A (zh) * 2016-12-13 2017-05-31 国肽生物科技(北京)有限公司 胸腺肽的提取方法
CN110496216A (zh) * 2018-05-18 2019-11-26 山东信得科技股份有限公司 一种胸腺肽注射液的制备方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113980115A (zh) * 2021-12-13 2022-01-28 青岛润达生物科技有限公司 一种胸腺多肽的制备工艺

Also Published As

Publication number Publication date
CN112143768B (zh) 2022-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105331665B (zh) 一种猪脑蛋白酶解制备脑多肽和脑小分子肽的方法
KR910009342B1 (ko) 생물학적 활성 추출물의 제조방법
JPS6267032A (ja) 組換ヒトβ―インターフェロンを含有する医薬組成物及びその製造方法
EP0240348B1 (en) Agent for the removal of nucleic acids and/or endotoxin and method for the removal thereof
CN102526116B (zh) 一种蜂毒的精制方法
CN107674901B (zh) 从大鲵肉骨提取的小分子肽及其提取方法
JPS63169995A (ja) β−インターフェロンの回収及び精製方法
CN112143768B (zh) 一种利用小牛胸腺联合制备dna和胸腺肽的方法
Seibert THE CHEMICAL COMPOSITION OF THE ACTIVE PRINCIPLE OF TUBERCULIN. XI. AN IMPROVED AND SIMPLIFIED METHOD FOR MAKING A STANDARD UNDENATURED TUBERCULIN OF ANY DESIRED STRENGTH AND A METHOD OF CHEMICAL ASSAY.
KR930009336B1 (ko) 유전공학적 미생물로부터 정제된 성장호르몬 회수방법
CN111269290A (zh) 一种鲟鱼抗炎肽的制备方法
RU2386444C1 (ru) Способ получения биологически активного продукта из сырых пантов
CN113584108A (zh) 一种脾氨肽的制备方法
CN106086139A (zh) 一种利用淡水鱼头蛋白酶解制备鱼头多肽的方法
CN105541996A (zh) 胸腺组织提取胸腺肽、中分子量胸腺蛋白和dna的方法
CN103740797B (zh) 一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法
CN116649580A (zh) 小分子阿胶多肽制品的制备方法
CN1264567C (zh) 一种大蒜蛋白酶解物系列产品及其用途
CN112457377B (zh) 美洲大蠊多肽及其应用
CN111763243B (zh) 小公鱼免疫活性肽及其制备方法和用途
US2797184A (en) Process for the recovery of heparin
CN102210372A (zh) 从动物血中提取高纯短肽蛋白粉的方法
CN112941134A (zh) 全羊小分子肽提取工艺
AU2006231531A1 (en) Methods and precipitating reagents for isolating proteins from proteinaceous material
RU2089204C1 (ru) Способ получения пептидов, восстанавливающих функцию предстательной железы

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant