KR102053221B1 - 고순도의 dna 단편 혼합물 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고순도의 DNA 단편 혼합물의 제조를 위한 것으로, (a) 어류 정소를 해동하고, 혈액 및 이물질을 제거한 후 상기 해동된 정소에 정제수를 넣고 분쇄하여 정소 분쇄액을 제조하는 단계;
(b) 염화나트륨 용액과 라우릴황산나트륨 용액을 상기 (a) 단계의 정소 분쇄액에 투입한 후 반응 온도를 90 ~ 100℃로 유지하면서 0.5 내지 10시간 동안 교반하면서 반응시켜 정소세포를 분해하고 분자량을 저감시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계 후 반응액을 실온까지 냉각시킨 후 활성탄으로 처리하여 단백질과 지방을 제거하는 정제 단계를 포함하는 것을 특징으로 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법을 제공한다.

Description

고순도의 DNA 단편 혼합물 제조방법{Manufacturing method of high purity DNA fragments mixtures}

본 발명은 DNA 단편 혼합물의 제조를 위한 것으로, 더욱 상세하게는 활성탄을 이용하여 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로, DNA는 유전정보를 암호화하는 생체 고분자로 모든 생명체에 널리 존재하며, 인산, 4종류의 염기, 데옥시리보오스와 같은 생체 고분자들로 이루어져 있다. DNA는 고유의 물리화학적, 생물학적 특징으로 말미암아, 이에 대한 생리활성이 활발하게 연구되고 있다.

최근에는 DNA 단편 혼합물에 대한 연구가 진행되고 있는데, DNA 단편 혼합물은 분자량이 저감된 단편 형태의 상태로 혼합되어 존재하는 것으로, 세포의 필수 구성성분들로서 이들의 혼합물을 상처부위 등에 주입함으로써 상처 부위의 치료 및 개선 등을 목적으로 하는 의약품이나 세포활성과 관련된 주름 개선 등을 목적으로 하는 화장품, 식품첨가물, 생화학 실험재료 등 활용되는 용도가 다양하여 가치가 높아지고 있다.

종래에 이들 DNA 단편 혼합물을 분리하는 방법으로서 한국공고특허 제1993-0008087호에는 연어, 청어의 정소 등으로부터 분리추출하는 방법으로, 참치 정소로부터 프로타민 황산염을 분리하는 방법이 있으나, 이는 DNA 단편 혼합물의 분리에 목적이 있는 것이 아니라 단지 프로타민이라는 단백질의 분리추출에만 목적이 있는 방법이다.

또한, 한국등록특허 제390529호에는 참치의 정소로부터 한외여과막을 이용하여 핵산복합물질을 분리 추출하는 방법을 개시하고 있다.

그러나 상술한 방법들은 정소, 정액 등에 혼합되어 있는 RNA, 단백질, 지방 성분들은 효율적으로 제거할 수 없어 순도가 높은 DNA 단편 혼합물을 제조하기에는 한계가 있다.

1. 대한민국 공고특허 제1993-0008087호 2. 대한민국 등록특허 제390529호

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기한 한계점을 극복하기 위한 것으로, 단백질, 지방 등의 성분이 포함되지 않는 고순도의 DNA 단편 혼합물 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여,

(a) 어류 정소를 해동하고, 혈액 및 이물질을 제거한 후 상기 해동된 정소에 정제수를 넣고 분쇄하여 정소 분쇄액을 제조하는 단계;

(b) 염화나트륨 용액과 라우릴황산나트륨 용액을 상기 (a) 단계의 정소 분쇄액에 투입한 후 반응 온도를 90 ~ 100℃로 유지하면서 0.5 내지 10시간 동안 교반하면서 반응시켜 정소세포를 분해하고 분자량을 저감시키는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계 후 반응액을 실온까지 냉각시킨 후 활성탄으로 처리하여 단백질과 지방을 제거하는 정제 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법을 제공한다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법에 있어서, 상기 (c) 단계에서 활성탄 처리 효율을 높이기 위하여 원심분리하여 정소 찌거기를 제거한 상등액을 활성탄으로 처리하는 것이 바람직하다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법에 있어서, 상기 (c) 단계에서 활성탄으로 처리한 후에 게르마늄 및 견운모로 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법에 있어서, 상기 어류는 무지개 송어인 것이 바람직하다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 고순도 DNA 단편 혼합물의 제조방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 DNA 단편 혼합물이 포함된 여과액을 이소프로필 알코올 또는 에탄올을 첨가한 후 교반하여 DNA 단편 혼합물을 침전시킨 다음 침전물을 이소프로필 알코올 또는 에탄올로 세척하고 이를 탈수 및 건조하여 DNA 단편 혼합물의 분말을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 DNA 단편 혼합물의 제조방법은 DNA 단편 이외에 다른 성분들이 상대적으로 많은 어류의 정소로부터 DNA 단편 혼합물을 고순도로 분리할 수 있는 효과가 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명의 핵심적인 특징은 정소 분쇄액에 고온으로 분자량 저감 공정을 진행하고 활성탄, 부가적으로 게르마늄과 견운모로 처리하여 종래의 제조 방법보다 단백질과 지방 제거 효과를 높여 고순도의 DNA 단편 혼합물을 제조할 수 있다는 것이다.

이하 실시예를 통하여 상세하게 설명하기로 한다.

<실시예 1. 본 발명에 따른 무지개 송어 정소로부터 고순도의 DNA 단편 혼합물의 제조>

1. 해동 및 분쇄 공정

냉동된 정소 10kg을 해동한 다음 혈액 및 이물질을 제거하고, 정제수 150kg을 넣어준 후 분쇄기로 분쇄하여 정소 분쇄액을 수득하였다.

2. 분자저감공정

스테인레스 재질의 반응기에 정제수 150kg, 염화나트륨 37.4kg, 라우릴황산나트륨 1.2kg을 넣고 용해시킨 다음 정소 분쇄액을 투입하였다. 반응기의 온도를 93.5℃(ㅁ1℃)로 올린 후 5시간 동안 교반하면서 반응시켜 정소세포를 분해하고 분자량을 저감하였다.

3. 정제공정

분자량 저감 후 반응액을 실온까지 냉각시키고 활성탄 3~10중량%로 1시간 동안 처리하였다. 활성탄 처리액을 여과하여 단백질과 지방이 제거된 DNA 단편 혼합물을 포함하는 여과액을 얻었다.

4. 침전공정

에탄올(여과액 부피의 2~2.2배)에 여과액을 서서히 가하여 DNA를 침전시켰다.

5. 세척, 탈수 및 건조 공정

침전물을 여과포 또는 원심분리를 통해 회수하여 이를 70%(v/v) 에탄올로 세척하고, 무수 에탄올 또는 무수 이소프로필 알코올로 탈수한 다음 진공 건조시켜 DNA를 수득하였다.

<실시예 2. 본 발명에 따른 무지개 송어 정소로부터 고순도의 DNA 단편 혼합물의 제조>

상기 실시예 1로 동일하며 다만 정제 공정에서 활성탄으로 처리하기 전에 15,000rpm으로 원심분리하여 정소 찌거기를 제거한 후 상등액에 대해서 활성탄으로 처리하는 것에 차이가 있었다.

<실시예 3. 본 발명에 따른 무지개 송어 정소로부터 고순도의 DNA 단편 혼합물의 제조>

상기 실시예 2로 동일하며 다만 정제 공정에서 활성탄으로 처리한 후 게르마늄과 견운모를 동일한 중량으로 혼합한 혼합물 3~10중량%를 1시간 동안 추가적으로 처리하고 여과하여 단백질과 지방이 제거된 DNA 단편 혼합물을 포함하는 여과액을 얻은 것에 차이가 있다.

<비교예 1. 무지개 송어 정소로부터 DNA 단편 혼합물의 제조>

상기 실시예 1과 동일하게 다만 분자량 저감 공정을 실온에서 실시한 것에 차이가 있다.

<비교예 2. 무지개 송어 정소로부터 DNA 단편 혼합물의 제조>

상기 실시예 1과 동일하게 활성탄으로 처리하는 공정을 생략한 것에 차이가 있다.

<비교예 3. 무지개 송어 정소로부터 DNA 단편 혼합물의 제조>

상기 실시예 1과 동일하며 활성탄을 대신하여 규조토로 처리하는 공정을 실시한 것에 차이가 있다.

<비교예 4. 무지개 송어 정소로부터 DNA 단편 혼합물의 제조>

상기 실시예 1과 동일하며 활성탄을 대신하여 실리카 겔로 처리하는 공정을 실시한 것에 차이가 있다.

<실험예: 순도 측정>

DNA의 순도는 260nm의 흡광도 값과 280nm에서의 흡광도 값의 비율로 결정할 수 있는데, 260nm 흡광도 값/ 280nm 흡광도 값의 비율이 1.8~1.9의 값이면 순도가 높은 것으로 판정할 수 있으며, 비율이 낮으면 단백질 오염도가 높은 것으로 볼 수 있는데 실시예 및 비교예에서 수득한 DNA 단편 혼합물의 분말 1mg을 증류수 10ml에 녹인 다음 TE 완충액(pH 8.0)으로 희석한 후에 분광광도계를 이용하여 260nm 흡광도 값과 280nm 흡광도 값을 구한 다음에 그 비율을 계산하여 하기 표 1에 나타냈다.

	실시예 1	실시예 2	실시예 3	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4
비율	1.77	1.79	1.80	1.55	1.38	1.66	1.66

하기 표 1의 결과를 보면 본 발명에 따른 실시예 1은 그 비율이 1.77 순도가 높게 나타났으며, 이와 비교하여 실온에서 분자량 저감 후 활성탄으로 처리한 비교예 1의 경우 실시예 1과 동일하게 활성탄으로 처리하였음에도 그 순도가 실시예 1보다 매우 낮은 것으로 나와 분자량 저감에서 온도 조건의 중요성을 확인할 수 있었으며, 또한 활성탄으로 처리하지 않은 비교예 2에서는 1.38로 순도가 가장 낮은 것을 확인할 수 있었다.

또한 활성탄을 대신하여 규조토와 실리카 겔로 처리한 비교예 3과 4에서도 실시예 1과는 DNA 순도에 있어 많은 차이를 보였다.

따라서 분자량 저감 공정으로 고온에서 실시하고 활성탄으로 처리하는 본 발명에 따른 제조방법의 순도 향상의 유용성이 입증되었으며, 더더욱 원심 분리는 실시하는 실시예 2 및 게르마늄과 견운모로 추가 처리하는 실시예 3의 경우에는 순도가 더 향상됨을 확인할 수 있어 부가 공정의 우수성까지도 입증이 되었다.

<실험예 2. 단백질 함량 측정>

단백질 함량은 로우리법을 이용하여 측정하였다. DNA 단편 혼합물 100mg을 10mL의 정제수에 녹여 0.1% DNA 용액을 제조하였다. 1mL DNA 용액에 알카리성 구리시액 1mL를 넣은 후 vortexing하였다. 10분간 정치시킨 후 폴린시액 희석액 0.5mL를 넣은 후 vortexing한 다음 상온에서 30분간 정치시킨 후 750nm에서 흡광도를 측정하였다. 단백질 함량은 BSA(bovine serum albumin)을 표준곡선으로 하여 산출하여 표 2에 나타내었다.

	실시예 1	실시예 2	실시예 3	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4
함량(%)	0.3	0.15	0.05	1.8	2.1	0.8	0.8

하기 표 1의 결과를 보면 본 발명에 따른 실시예 1은 단백질 함량 0.3%로 나타나 단백질 오염이 적은 것을 확인할 수 있었으며, 이와 비교하여 실온에서 분자량 저감 후 활성탄으로 처리한 비교예 1의 경우 실시예 1과 동일하게 활성탄으로 처리하였음에도 함량이 실시예 1보다 매우 높은 것으로 나와 분자량 저감에서 온도 조건의 중요성을 확인할 수 있었으며, 또한 활성탄으로 처리하지 않은 비교예 2에서는 2.1%로 단백질 함량이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

또한 활성탄을 대신하여 규조토와 실리카 겔로 처리한 비교예 3과 4에서도 실시예 1과는 단백질 함량에 있어 많은 차이를 보였다.

따라서 분자량 저감 공정으로 고온에서 실시하고 활성탄으로 처리하는 본 발명에 따른 제조방법의 순도 향상의 유용성이 입증되었으며, 더더욱 원심 분리는 실시하는 실시예 2 및 게르마늄과 견운모로 추가 처리하는 실시예 3의 경우에는 단백질 함량이 더 낮아져서 순도 향상에 더욱 유용함을 확인할 수 있었다.

Claims (5)

1. (a) 어류 정소를 해동하고, 혈액 및 이물질을 제거한 후 상기 해동된 정소에 정제수를 넣고 분쇄하여 정소 분쇄액을 제조하는 단계;
   (b) 염화나트륨 용액과 라우릴황산나트륨 용액을 상기 (a) 단계의 정소 분쇄액에 투입한 후 반응 온도를 90 ~ 100℃로 유지하면서 0.5 내지 10시간 동안 교반하면서 반응시켜 정소세포를 분해하고 분자량을 저감시키는 단계; 및
   (c) 상기 (b) 단계 후 반응액을 실온까지 냉각시킨 후 원심분리하여 정소 찌거기를 제거한 상등액을 활성탄으로 처리한 후에 추가적으로 게르마늄 및 견운모로 처리하여 단백질과 지방을 제거하는 정제 단계를 포함하는 것을 특징으로 DNA 단편 혼합물의 제조방법.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 어류는 무지개 송어인 것을 특징으로 하는 DNA 단편 혼합물의 제조방법.
   
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 (c) 단계의 DNA 단편 혼합물이 포함된 여과액을 이소프로필 알코올 또는 에탄올을 첨가한 후 교반하여 DNA 단편 혼합물을 침전시킨 다음 침전물을 이소프로필 알코올 또는 에탄올로 세척하고 이를 탈수 및 건조하여 DNA 단편 혼합물의 분말을 수득하는 단계를 더 포함하는 것으로 특징으로 하는 DNA 단편 혼합물의 제조방법.
   
   
   
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