CN1191490A - 稳定等渗的冻干蛋白制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明描述一种稳定的冻干蛋白质制剂,它可用合适的稀释剂重建成高蛋白质浓度的重建制剂以适用于皮下给药。例如,抗IgE和抗HER2抗体制剂可通过在溶解保护剂存在时对这些抗体冷冻干燥而制得。获得的冻干混合物可重建成高蛋白质浓度的制剂而蛋白质的稳定性没有明显的丧失。

Description

稳定等渗的冻干蛋白质制剂
发明领域
本发明涉及一种冻干的蛋白质制剂。更具体地，本发明涉及一种稳定的冻干蛋白质制剂，它可用稀释剂重建生成一种适用于皮下给药的稳定的重建的制剂。
相关公开内容描述
在过去的十年内，生物技术的发展使得可以用重组DNA技术来生产各种用于药物用途的蛋白质。由于蛋白质比常用的有机和无机药物更大更复杂(即除了有复杂的三维空间结构外还有多个官能团)，因此这些蛋白质的制剂引起了一些特殊的问题。为了使蛋白质有生物活性，制剂必须保证至少蛋白质氨基酸核心序列的构象完整性，而且同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解。蛋白质降解的途径包括化学不稳定性(即，任何通过键的形成或断裂来修饰蛋白质生成新的化学物质)或物理不稳定性(即，蛋白质高级结构的改变)。化学不稳定性可由脱氨基、外消旋化、水解、氧化、β消去或二硫化物交换引起。物理不稳定性是由例如变性、凝聚、沉淀或吸附引起。三种最常见的蛋白质降解途径是蛋白质凝聚、脱氨和氧化(Cleland等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4)：307-377(1993))。
冷冻干燥是一种常用的保藏蛋白质的技术，它可将所关心的蛋白质制品中的水除去。冷冻干燥或冻干的方法是先将待干燥的物质冷冻，然后在真空环境下升华除去冰或冷冻的溶剂。在冻干前的制剂中可包括一种赋形剂，以在冷冻干燥过程中提高稳定性和/或在保藏时提高冻干产品的稳定性(Pikal，M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等人，Pharm.Res.8(3)：285-291(1991))。
本发明的一个目的是提供一种在保藏和运输时稳定的冻干蛋白质制剂。还有一个目的是提供一种用于皮下给药的稳定的重建的蛋白质制剂。在某些例子中，本发明的一个目的是提供一种多次性使用的制剂，它至少在对病人给药的时间内是稳定的。
发明概述
本发明的根据是发现用一种溶解保护剂(最好是糖类如蔗糖或海藻糖)可制得稳定的冻干蛋白质制剂，冻干的制剂可重建生成稳定的重建制剂，制剂的蛋白质浓度比冻干前的制剂内的蛋白质浓度高的多(如，约高2-40倍，较佳为高3-10倍，更佳的高3-6倍)。具体地说，如果冻干前的制剂内蛋白质浓度为5mg/mL或更低，则重建制剂中的蛋白质浓度通常为50mg/mL或更多。重建制剂中如此高的蛋白质浓度被认为特别适用于当制剂用于皮下给药的情况。尽管重建制剂中的蛋白质浓度非常高，但是发现重建制剂在2-8℃在约至少30天内是稳定的(即，蛋白质没有表现出明显的或不适用的化学或物理不稳定性)。在一些例子中，重建制剂是等渗的。尽管使用了较低浓度的溶解保护剂就可在重建时获得这种等渗制剂，但是发现冻干制剂中的蛋白质基本上在冻干和保藏时保持了其物理和化学的稳定性和完整性。
当用包含防腐剂(如用于注射的抑菌剂，BWFI)的稀释剂来重建时，重建制剂可用作多次性使用的制剂。这种制剂适用于，例如当病人需要经常进行皮下蛋白质给药来治疗慢性疾病。多次性使用制剂的优点是它能更容易地用于患者，通过瓶内含量全部使用可减少浪费，并为生产者节省了很大成本，因为几种药剂被装在一个小瓶中(较低的装料和运输成本)。
根据这里描述的发现，本发明的一个方面是提供一种稳定、等渗的重建制剂，它包括含量至少约为50mg/mL的蛋白质和稀释剂，重建制剂通过蛋白质和溶解保护剂的冻干混合物来制得，其中重建制剂中的蛋白质浓度比冻干前混合物中蛋白质浓度高约2-40倍。
在另一个例子中，本发明提供一种稳定的重建制剂，它包括含量至少约为50mg/mL的抗体和稀释剂，重建制剂通过抗体和溶解保护剂的冻干混合物来制得，其中重建制剂中的抗体浓度比冻干前混合物中抗体浓度高约2-40倍。
前段中冻干制剂中的溶解保护剂与蛋白质之比与例如所选的蛋白质和溶解保护剂以及重建制剂中所需的蛋白质浓度和等渗性有关。在用全长抗体(作为蛋白质)和海藻糖或蔗糖(作为溶解保护剂)制备高蛋白质浓度等渗重建制剂时，比例例如可以是每1摩尔抗体为约100-1500摩尔海藻糖或蔗糖。
通常，蛋白质和溶解保护剂的未冻干制剂还可包括一种缓冲液来根据制剂的蛋白质为制剂提供合适的pH。为了这个目的，发现最好用下述的组氨酸缓冲液，它表现出有溶解保护性能。
制剂还可包括一种表面活性剂(如多乙氧基醚)，发现它可减少重建蛋白质的凝聚和/或减少重建制剂中颗粒的形成。表面活性剂可按需加入未冻干制剂、冻干制剂和/或重建制剂(但最好是未冻干制剂)中。
本发明还提供一种制备稳定的等渗重建制剂的方法，它包括对蛋白质和溶解保护剂的冻干混合物在稀释剂中重建，使得重建制剂中的蛋白质浓度至少为50mg/mL，其中重建制剂中的蛋白质浓度比冻干前混合物中的蛋白质浓度高约2-40倍。
在还有一个实施例中，本发明提供一种制备一种制剂的方法，包括：(a)将蛋白质和溶解保护剂的混合物冻干；和(b)在稀释剂中重建步骤(a)中的混合物，使得重建的制剂是等渗稳定的，且蛋白质浓度至少约为50mg/mL。例如，重建制剂中的蛋白质浓度可以是约为80mg/mL至约300mg/mL。通常，重建制剂中的蛋白质浓度比冻干前混合物中的蛋白质浓度高约2-40倍。
本发明也提供一种产品，它包括：(a)一个装有蛋白质和溶解保护剂的冻干混合物的容器；和(b)将冻干混合物在稀释剂中重建成重建制剂中蛋白质浓度约为50mg/mL的说明。产品还包括另一个装有稀释剂(如包括一种芳香醇的注射用抑菌剂(BWFI))的容器。
本发明还提供一种治疗哺乳动物的方法，包括对哺乳动物施用这里公开的治疗有效量的重建制剂，其中哺乳动物患有用制剂中的蛋白质来治疗的疾病。例如，制剂可进行皮下给药。
下面详述的例子中发现了一种有用的抗HER2抗体的未冻干制剂，它包括含量为约5-40mg/mL(如20-30mg/mL)的抗HER2和含量为约10-100mN(如40-80mM)的蔗糖或海藻糖，缓冲液(如组氨酸，pH6或琥珀酸，pH5)和表面活性剂(如多乙氧基醚)。发现冻干制剂在40℃下在至少3个月内保持稳定，在30℃下在至少6个月内保持稳定。这种抗HER2制剂可用一种稀释剂重建成适用于静脉内给药的制剂，它包含含量约为10-30mg/mL的抗HER2，并在2-8℃下在至少约30天保持稳定。当需要更高浓度的抗HER2抗体时(例如，当抗体皮下输递是对患者给药的方式时)，冻干制剂可重建生成稳定的蛋白质浓度为50mg/mL或更多的重建制剂。
这里发现的一种所需的抗IgE抗体未冻干制剂包含含量约为5-40mg/mL(如20-30mg/mL)的抗IgE和含量约为60-300mM(如80-170mM)的蔗糖或海藻糖，缓冲液(最好是组氨酸，pH6)和表面活性剂(如多乙氧基醚)。冻干的抗IgE可在30℃下在至少1年内保持稳定。该制剂可重建生成一种抗IgE含量约为15-45mg/ml(如15-25mg/mL)的制剂，它适用于静脉内给药，且在2-8℃下在至少1年内保持稳定。或者，当制剂中需要更高浓度的抗IgE时，冻干制剂可重建以生成一种抗IgE浓度≥50mg/mL的制剂。
附图简述
图1表示重建体积对冻干的rhuMAb HER2的稳定性的影响。冻干制剂是从包含25mg/mL蛋白质、60mM海藻糖、5mM琥珀酸钠pH5.0和0.01％吐温20TM的未冻干制剂制得的。将冻干饼放在40℃下培育，然后用4.0mL(o)或20.0mL(●)的BWFI重建。用非变性大小排阻色谱测定重建制剂中的完整蛋白质的组份，并根据相对于包括凝聚物在内的总峰面积的非变性蛋白质的峰面积来确定。
图2描述了海藻糖浓度对冻干rhuMAb HER2的稳定性的影响。25mg/mL蛋白质在5mM琥珀酸钠，pH5.0(圆圈)或5mM组氨酸，pH6.0(方块)和浓度为60mM(360摩尔比)至200mM(1200摩尔比)的海藻糖中冻干。冻干的蛋白质放在40℃下培育30天(实心)或91天(空心)。在用20mL BWFI重建冻干蛋白质后测定完整的蛋白质的量。
图3描述了海藻糖浓度对于保藏在40℃下的冻干rhuMAb HER2的长期稳定性的影响。25mg/mL蛋白质在5mM琥珀酸钠，pH5.0，0.01％吐温20TM和60mM海藻糖中(■)或5mM组氨酸，pH6.0，0.01％吐温20TM和60mM海藻糖中(□)冻干或21mg/mL蛋白质在10mM琥珀酸钠，pH5.0，0.2％吐温20TM和250mM海藻糖中(●)冻干。冻干的蛋白质放在40℃下培育，然后用20mL BWFI重建。重建后测定完整的蛋白质的量。
图4表示在38.4mM甘露糖醇(7mg/mL)、20.4mM蔗糖(7mg/mL)、5mM组氨酸、pH6.0、0.01％吐温20TM中冻干的rhuMAb HER2稳定性。冻干蛋白质在40℃下培育，然后用4.0mL(○)或20.0mL(●)的BWFI重建。重建后测定完整的蛋白质的量。
图5表示rhuMAb HER2在5mM琥珀酸钠、pH5.0、60mM海藻糖、0.01％吐温20TM中冻干后重建的稳定性。样品用4.0mL(方块)或20.0(圆圈)的BWFI(20mL：0.9％苯甲醇；4mL：1.1％苯甲醇)重建，然后保藏在5℃(实心)或25℃(空心)下。非变性蛋白质％通过相对于总峰面积的非变性(未降解)蛋白质的峰面积来确定，峰面积用阳离子交换色谱测定。
图6表示rhuMAb HER2在5mM组氨酸、pH6.0、60mM海藻糖、0.01％吐温20中冻干后重建的稳定性。样品用4.0mL(方块)或20.0(圆圈)的BWFI(20mL：0.9％苯甲醇；4mL：1.1％苯甲醇)重建，然后保藏在5℃(实心)或25℃(空心)下。非变性蛋白质％通过相对于总峰面积的非变性(未降解)蛋白质的峰面积来确定，峰面积用阳离子交换色谱测定。
图7表示rhuMAb HER2在5mM组氨酸、pH60、38.4mM甘露糖醇、20.4mM蔗糖、0.01％吐温20中冻于后重建的稳定性。样品用4.0mL(方块)或20.0(圆圈)的BWFI(20mL：0.9％苯甲醇；4mL：1.1％苯甲醇)重建，然后保藏在5℃(实心)或25℃(空心)下。非变性蛋白质％通过相对于总峰面积的非变性(未降解)蛋白质的峰面积来确定，峰面积用阳离子交换色谱测定。
图8表示rhuMAb HER2在10mM琥珀酸钠、pH5.0、250mM海藻糖、0.2％吐温20中冻干后重建的稳定性。样品用20.0mL BWFI(0.9％苯甲醇)重建，然后保藏在5℃(●)或25℃(○)下。非变性蛋白质％通过相对于总峰面积的非变性(未降解)蛋白质的峰面积来确定，峰面积用阳离子交换色谱测定。
图9表示rhuMAb E25加入pH5至pH7、缓冲液浓度为10mM、抗体浓度为5mg/mL的缓冲液中的凝聚情况。冻干样品并测定保藏在2-8℃时0、4星期、8星期和52星期后的凝聚。缓冲液是：磷酸钾pH7.0(○)；磷酸钠pH7.0(□)；组氨酸pH7.0(◇)；琥珀酸钠pH6.5(●)；琥珀酸钠pH6.0(●)；琥珀酸钠pH5.5(◆)和琥珀酸钠pH5.0(▲)。
图10表示在5mM组氨酸缓冲液中冻干的rhuMAb E25在pH6和pH7时在下列保藏时测定的凝聚情况。缓冲液是为：pH6.0，保藏在2-8℃下(○)；pH6，保藏在25℃下(□)；pH6，保藏在40℃下(◇)；pH7，保藏在2-8℃下(●)；pH7，保藏在25℃下(■)；和pH7，保藏在40℃下(◆)。
图11表示在pH5的10mM琥珀酸钠及加入的溶解保护剂浓度为275mM(等渗的)中配制的5mg/mL rhuMAb E25的凝聚情况。溶解保护剂是：对照，不含溶解保护剂(○)；甘露糖醇(□)；乳糖(◇)；麦芽糖(●)；海藻糖(●)；和蔗糖(◆)。冻干样品并测定在2-8℃下保藏0、4星期、8星期和52星期后的凝聚情况。
图12表示在pH5的10mM琥珀酸钠及加入的溶解保护剂浓度为275mM(等渗的)中配制的5mg/mL rhuMAb E25的凝聚情况。溶解保护剂是：对照，不含溶解保护剂(○)；甘露糖醇(□)；乳糖(◇)；麦芽糖(●)；海藻糖(■)；和蔗糖(◆)。冻干样品并测定在40℃下保藏0、4星期、8星期和52星期后的凝聚情况。
图13表示20mg/mL的rhuMAb E25在乳糖等渗浓度(即275mM)、pH6的组氨酸缓冲液中冻干，在2-8℃、25℃或40℃下保藏24个星期后重建至20mg/mL的疏水作用色谱结果。
图14表示20mg/mL的rhuMAb E25在pH6的组氨酸缓冲液中冻干，在2-8℃、25℃或40℃下保藏24个星期后重建至20mg/mL的疏水作用色谱结果。
图15表示20mg/mL的rhuMAb E25在蔗糖等渗浓度(即275mM)、pH6的组氨酸缓冲液中冻干，在2-8℃、25℃或40℃下保藏24个星期后重建至20mg/mL的疏水作用色谱结果。
图16表示糖浓度对于在5mM组氨酸(pH6.0)中配制的20mg/mL rhuMAb E25的影响。蔗糖(●)和海藻糖(□)以0至2010(等渗)的摩尔比加入制剂中(见下表1)。冻干样品，测定在50℃下保藏12星期后的凝聚情况。
                     表1
    糖与E25抗体的摩尔比     糖浓度(mM)
    0     0
    260     34.4
    380     51.6
    510     68.8
    760     103.1
    1020     137.5
    1530     206.3
    2010     275
图17揭示在5mM组氨酸(pH6)，85mM蔗糖(○)；85mM海藻糖(□)；161mM蔗糖(◆)或161mM海藻糖(▲)中配制成25mg/mL rhuMAb E25的凝聚情况。冻干样品并保藏在2-8℃下，然后用0.9％苯甲醇重建成抗体浓度为100mg/mL、组氨酸为20mM、pH6的等渗(340mM)和高渗(644mM)糖浓度制剂。
图18揭示在5mM组氨酸(pH6)，85mM蔗糖(○)；85mM海藻糖(□)；161mM蔗糖(◆)或161mM海藻糖(▲)中配制成25mg/mL rhuMAb E25的凝聚情况。冻干样品并保藏在30℃下，然后用0.9％苯甲醇重建成抗体浓度为100mg/mL、组氨酸为20mM、pH6的等渗(340mM)和高渗(644mM)糖浓度制剂。
图19揭示在5mM组氨酸(pH6)，85mM蔗糖(○)；85mM海藻糖(□)；161mM蔗糖(◆)或161mM海藻糖(▲)中配制成25mg/mL rhuMAb E25的凝聚情况。冻干样品并保藏在50℃下，然后用0.9％苯甲醇重建成抗体浓度为100mg/mL、组氨酸为20mM、pH6的等渗(340mM)和高渗(644mM)糖浓度的制剂。
较佳实施例详述
定义
“蛋白质”是指氨基酸序列，链长度足以产生高水平的三级结构和/或四级结构。这是与“多肽”或其它没有这种结构的小分子量药物的区别。通常，这里的蛋白质的分子量至少约为15-20kD，最好至少约为20kD。
这里定义所包括的蛋白质的例子有哺乳动物蛋白质，例如，生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促滤泡激素；降钙素；促黄体素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、组织型因子和血管性血友病因子；抗凝血因子如蛋白质C；心钠素；肺表面活性剂；纤维蛋白溶解酶原激酶，如尿激酶或组织型纤溶酶原激酶(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；趋化因子RANTES(活化后可调节的通常由T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；穆勒氏抑制物；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；鼠促性腺素伴随肽；脱氧核糖核酸酶；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养性因子如骨衍神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子如NGN-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)；胰岛素样生长因子结合蛋白质；CD蛋白质，如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生长素(EPO)；血小板生长素(TPO)；成骨诱导因子(osteoinductive factors)；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；膜表面蛋白质；衰变加速因子(DAF)；病毒性抗原，例如AIDS的部分包被；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；免疫粘附素；抗体；和任何上述多肽的生物活性片段或变异体。
制剂的蛋白质最好是基本上纯净，最好基本上是均相的(即没有杂蛋白等)。“基本上纯净”的蛋白质指的是组分包含至少约90％(重量)(以组分的总重量计)的蛋白质，较佳的为至少约95％(重量)。“基本上均相”的蛋白质指的是以组分的总重量计，组分包含至少99％(重量)的蛋白质。
在一些例子中，蛋白质是抗体。例如抗体可与上述的任一分子结合。本发明中抗体典型的靶分子包括CD蛋白质，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；HER受体家族的成员，例如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，如LFA-1、Mol、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整联蛋白，包括它的α或β亚单元(如，抗-CD11a、抗-CD18或抗CD11b抗体)；生长因子如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；多脂性(OB)受体；蛋白质C等。
术语“抗体”的含义非常广，它特别包含单克隆抗体(包括有免疫球蛋白Fc区域的全长抗体)、有多个表位特异性的抗体组合物、双特异性抗体、二体(diabodies)和单链分子，以及抗体片段(如Fab、F(ab′)2和Fv)。
这里所用的术语“单克隆抗体”指的是从基本上均一的抗体种群中获得的抗体，即单个抗体包括的种群是相同的，除了少量可能发生天然的突变。单克隆抗体对单一的抗原位点有高度的特异性。而且，与常规的(多克隆)抗体制备物，即通常有不同抗体针对不同的决定簇(表位)相反，每个单克隆抗体只针对抗原单一的决定簇。除了特异性外，单克隆抗体的优点是它们是用杂交瘤培育来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰词“单克隆”指从基本上均一的抗体种群中获得的抗体的特征，不应被理解为需要任何特殊的方法来生产抗体。例如，本发明所用的单克隆抗体可用Kohler等人描述的杂交瘤方法(Nature，256：495(1975))来制备，或用重组DNA技术来制备(见美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”也可用如Clackson等人(Nature，352：624-628(1991))和Marks等人(J.Mol.Biol.，222：581-597(1997))描述的技术从噬菌体抗体文库中分离获得。
这里的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，它的部分重链和/或轻链与从特定种类中衍生获得的或属于特定抗体类或亚类的抗体对应顺序是相同或同源，而剩余的链与从另一种类中衍生获得的或属于另一抗体类或亚类的抗体以及这种抗体的片段的对应顺序是相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性(美国专利No.4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。
非人体来源(如鼠源型)的“人源化”抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或包含从非人源型免疫球蛋白中获得的最小序列的片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其它与抗原结合的抗体序列)。人源化抗体的大部分是人源型免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区(CDR)的残基被非人源型的有所需特异性、亲和性和容量的抗体如鼠、大鼠或兔子抗体(供体抗体)的CDR残基替代。在一些例子中，人源型免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人源型残基取代。而且，人源化抗体可包括在受体抗体和输入的CDR或构架序列中均没有的残基。这些修饰可进一步精修并优化抗体的性能。通常，人源化抗体基本上都包含至少一个，典型的包括两个可变区域，其中所有或基本上所有的与非人源型免疫球蛋白对应的CDR区和所有或基本上所有的FR区有人源型免疫球蛋白的序列。人源化抗体还可以任选地包含至少部分免疫球蛋白，通常是人源型免疫球蛋白的恒定区(Fc)。更详细的描述见Jones等人在Nature(321：522-525(1986))、Reichmann等人在Nature(332：323-329(1988))和Presta在Curr.Op.Struct.Biol.(2：593-596(1992))中所作的描述。人源化抗体包括PrimatizedTM抗体，其中抗体的抗原结合区通过对猕猴属(macaque)猴子免疫接种人感兴趣的抗原来产生出的抗体中获得。
“稳定”的制剂是指其中的蛋白质在保藏时可基本上保持其物理和化学稳定性和完整性。该领域中已有多种测定蛋白质稳定性的分析技术，它们在“肽和蛋白质药物传递”(Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee编辑，Marcel Dekker Inc.，纽约，纽约出版社(1991))和Jones在A.Adv.Drug DeliveryRev.(10：29-90(1993))中有所总结。稳定性可在选定的温度下和时间内测定。为进行快速筛选，制剂可在40℃下保藏2星期至1个月并同时测定稳定性。当制剂要保藏在2-8℃时，通常制剂应该在30℃或40℃下稳定至少1个月和/或在2-8℃下稳定至少2年。当制剂要保藏在30℃下时，通常制剂应在30℃下稳定至少2年和/或在在40℃稳定至少6个月。例如在冻干和保藏后的凝聚长度可作为蛋白质稳定性的一个标志(见这里的例子)。例如，“稳定”的制剂是制剂中小于约10％，最好是小于约5％的蛋白质是凝聚物的形式。在另一例子中，在冻干制剂的冻干和保藏后测定了制剂凝聚物的增量。例如，“稳定”的冻干制剂是指当冻干制剂在2-8℃下保藏至少1年时，冻干制剂中凝聚物增量应小于约5％，最好小于约3％。在另一例子中，蛋白质制剂的稳定性可用生物活性测定法来测定(见下面实施例2)。
“重建”制剂是指通过将冻干蛋白质制剂溶解在稀释剂中使蛋白质分散在重建制剂中。在本发明的一些例子中，适用于对需要用所需的蛋白质来治疗的患者给药(如非肠胃给药)的重建制剂可适用于皮下给药。
“等渗”指感兴趣的制剂基本上与人血液的渗透压相等。等渗制剂的渗透压通常为约250至350mOsm。等渗性可用如气压式或冷冻式渗透压计来测定。
“溶解保护剂”指一种分子，当它与感兴趣的蛋白质结合时，能阻止或减少蛋白质在冻干和后续保藏时的化学和/或物理不稳定性。典型的溶解保护剂包括糖类如蔗糖或海藻糖；氨基酸如谷氨酸单钠或组氨酸；甲胺类如甜菜碱；易溶的盐类如硫酸镁；多元醇如三元醇或高级糖醇，如甘油、赤藓醇、甘油、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇；丙二醇；聚乙二醇；Pluronic及其组合。较佳的溶解保护剂是非还原性糖，如海藻糖或蔗糖。
溶解保护剂加入未冻干制剂中的量“溶解保护量”指蛋白质在溶解保护量的溶解保护剂存在时，在冻干和保藏时基本上保持其物理和化学稳定性及完整性。
这里感兴趣的“稀释剂”是药学上可接受的(对于人体给药是安全无毒的)，能用于制备重建制剂。典型的稀释剂包括无菌水、注射用抑菌剂(BWFI)、pH缓冲液(如磷酸盐缓冲液)、无菌盐溶液、林格溶液或葡萄糖液。
“防腐剂”是一种加入稀释剂中以基本上减少重建制剂中的细菌作用的化合物，从而能获得多次性使用重建制剂。有效的防腐剂的例子包括氯化十八烷基二甲基苯基铵、氯化己烷甲铵、氯化苯烷鎓(氯化烷基苯基二甲基铵的混合物，其中烷基是长链化合物)和氯化苯乙铵。其它类型的防腐剂包括芳香醇如酚、丁醇和苯甲醇、烷基paraben如甲基或丙基paraben、邻苯二酚、间苯二酚、环己烷、3-戊醇和间甲酚。这里最佳的防腐剂是苯甲醇。
“填充剂”是一种加入冻干混合物中形成冻干饼物理结构(如使基本上均一的维持开孔结构的冻干饼生产更容易)的化合物。典型的填充剂包括甘露糖醇、甘油。聚乙二醇和山梨糖醇。
“治疗”指医疗治疗和预防措施。那些需要治疗的受用者包括已经患有疾病和预防疾病受用者。
需要治疗的“哺乳动物”指任何归类为哺乳动物的动物，包括人、家畜和农场动物和动物园、运动场动物或宠物，如狗、马、猫、牛等。较佳的哺乳动物是人。
“疾病”是能得益于蛋白质治疗的疾病。它包括慢性和急性疾病或处于病态的使哺乳动物易于得病的疾病。这里待治疗的非限制性的疾病例子包括癌和过敏反应。
II.发明的实施方法
A.蛋白质制备
待配制的蛋白质用该领域已建立的技术来制备，它们包括合成技术(如重组技术和肽合成或这些技术的组合)或从内源性蛋白质中分离出来。在本发明的一些例子中，所选的蛋白质是抗体。产生抗体的技术如下。
(1)多克隆抗体
多克隆抗体通常是通过在动物体内多次皮下(sc)或腹膜内注射相关的抗原和佐剂获得的。用双功能或衍生试剂(如，磺基琥珀酰亚氨马来酰亚氨基苯甲酰酯(通过半胱氨酸残基共轭反应)、N-羟基琥珀酰亚氨(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2、或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基))使相关抗原与待免疫种类中的免疫原性蛋白质(如，匙孔蝛血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)进行共轭是有利的。
对动物免疫接种以抗原、免疫原性共轭物或通过1mg或1ug的肽或共轭物(分别针对兔型或鼠源型)与3倍体积的Freund完全佐剂结合获得的衍生物。1个月后对动物多处皮下注射人Freund完全佐剂中原先肽或共轭物量的1/5至1/10加强免疫。7至14天后对动物抽血，滴定血清中的抗体。对动物加强免疫直至滴度平顶。较佳地，动物可用相同抗原，但与不同蛋白质和/或通过不同的交联剂共轭的共轭物来加强免疫。共轭物可在重组细胞培育中用蛋白质融合来获得。同样，凝聚剂如明矾也适用于提高免疫应答。
(ii)单克隆抗体
单克隆抗体可从基本上均一的抗体种群获得，即包括种群的单个抗体除少量可能发生的自然突变外是相同的。因此，修饰词“单克隆”指的是抗体特性不是具体抗体的混合物。
例如，单克隆抗体可用由Kohler等人(Nature，256：495(1975))首先提出的杂交瘤方法制得，或用重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。
在杂交瘤方法中，鼠或其它合适的宿主动物，如仓鼠，可用上述的方法免疫接种以引起淋巴细胞产生或能够产生与用于免疫反应的蛋白质特异性结合的抗体。或者，淋巴细胞可在体外免疫。然后用合适的融合剂(如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合生成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Anibodies：Principleand Practice，pp.59-103(Academic Press))。
这样获得的杂交瘤细胞接种入合适的培养基中生长，培养基最好含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么通常杂交瘤所用的培养基含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这样可抑制HGPRT缺陷性细胞的生长。
较佳的骨髓瘤细胞是那些充分融合、在选择性抗体产生细胞内可高度稳定地产生抗体的、并且对如HAT培养基敏感的细胞。在它们中，较佳的骨髓瘤细胞系是鼠源型骨髓瘤细胞系，如从MOPC-21和MPC-11鼠肿瘤(从美国加利福尼亚圣地亚哥Salk Institute Cell Distribution Center获得)和从SP-2细胞(从美国马里兰州Rochville的American Type Culture Colletion获得)衍生获得的细胞。人源型骨髓瘤和鼠-人异源骨髓瘤细胞系也在人单克隆抗体的产生中有所描述(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
测定用于杂交瘤细胞生长的培养基来产生针对抗原的单克隆抗体。较佳地，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性用免疫沉淀法或体外结合测定法，如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定。
单克隆抗体的结合亲和性可用如Scatchard分析法(Munson等人，Anal.Biochem.，107：220(1980))来测定。
在鉴定产生所需特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释步骤来亚克隆无性系并用标准方法使其生长(Goding，MonoclonalAntibodies：Principlse and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。用于这个目的的合适的培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水肿瘤生长。
该亚克隆系分泌的单克隆抗体可从培养基、腹水液体或血清中用常规免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白质A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和层析来适当分离获得。
编码单克隆抗体的DNA用常规方法很容易分离获得并测序(如用可与编码鼠源型抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞作为这种DNA的一个较佳的来源。一旦分离后，可将DNA放在表达载体中，然后将载体转染入宿主细胞如大肠杆菌细胞系、猴COS细胞系、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、或不另产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，以使单克隆抗体在重组宿主细胞中合成。关于在细菌中编码抗体的DNA的重组表达的文献有Skerra等人在Curr.Opinion in Immunol.，5：256-262(1993)和Pluckthun在Immunol.Revs.，130：151-188(1992)中的总结。
在另一个例子中，抗体可用McCafferty等人(Nature，348：552-554(1990))描述的技术从抗体噬菌体文库中分离获得。Clackson等人(Nature，352：624-628(1991))和Marks等人(J.Mol.Biol.，222：581-597(1991))分别描述了用噬菌体文库分离鼠源型和人源型抗体的方法。此后，文献公开了用链改组(Marks等人，Bio/Technology，10：779-783(1992))产生高亲和性(nM范围内)的人源型抗体，以及用组合感染和体内重组来构建很大的噬菌体文库(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，这些技术是与常规的分离单克隆抗体的单克隆抗体杂交瘤技术不同的有前途的方法。
DNA还可以通过用同源鼠源型序列替代人源型重链和轻链恒定区的编码序列(美国专利No.4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，81：6851(1984))或通过所有或部分编码非免疫球蛋白多肽的序列与免疫球蛋白编码序列共价结合来修饰。
通常，这种非免疫球蛋白多肽用来替代抗体的恒定区，或替代抗体上与抗原结合的位点的可变区以形成有一个与抗原特异性结合的抗原结合位点和另一个与不同的抗原特异性结合的抗原结合位点的嵌合二价抗体。
嵌合的或杂合的抗体也可用蛋白质合成化学中已知的方法(包括那些用交联剂的方法)在体外制备。例如，通过二硫化合物交换反应或形成硫醚键可构建免疫毒素。用于该目的合适的试剂例子包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚氨酯。
(iii)人源化的和人源型抗体
非人源型抗体的人源化是该领域熟知的。通常，人源化的抗体中引入了非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人源型氨基酸残基通常称作“输入”残基，它们通常是从“输入”可变区中取出的。人源化可基本上根据Winter及其同事的方法(Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Reichman等人，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988))进行，用鼠CDR或CDR序列代替人抗体的相应序列。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816567)，其中基本上小于完整的人源型可变区被非人源型对应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是人源型抗体，其中，一些CDR残基和FR残基被鼠抗体的相同位点的残基替代。
用于产生人源化抗体的重链和轻链人源型可变区对于减少抗原性非常重要。在所谓的“最合适的”方法中，鼠抗体的可变区序列是针对所有已知的人源型可变区序列来筛选的。然后将与鼠型最相近的人源型序列作为人源化抗体中的人源化构架(FR)(Sims等人，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等人.J.Mol.Biol.，196：901(1992))。另一种方法采用了从所有人源型抗体的轻链或重链的特定亚类的共有序列中获得的特定构架。相同的构架可用于几个不同的人源化抗体(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等人，J.Immnol.，151：2623(1993))。
抗体人源化后仍有对抗原的高度亲和性和其它有利的生物性质也是很重要的。为实现该目的，根据较佳的方法，人源化抗体是通过分析亲代序列和用亲代和人源化序列的三维模型产生的各种人源化产物的方法来制备的。免疫球蛋白的三维模型通常是可以获得的，且是该领域技术人员所熟知的。计算机程序可用来描述和显示所选的免疫球蛋白序列可能的三维构象结构。通过观察这些显示可以分析残基在所选的免疫球蛋白序列中可能起的作用，即分析残基对于待选免疫球蛋白与其抗原结合能力的影响。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基，以获得所需的抗体性质，如对靶抗原的亲和性的提高。通常CDR残基对与抗原结合有直接的、很大的影响。
或者，现在可以产生转基因动物(如鼠)，它能在免疫接种时在内源性免疫球蛋白产生缺失的条件下产生人源型抗体的所有组成。例如，有描述说嵌合和种系突变鼠的抗体重链结合区(JH)基因将完全抑制内源性抗体的产生。将人的种系免疫球蛋白基因转移排列在这种种系突变鼠中将导致它在有抗原攻击时产生人源的抗体。见如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.，7：33(1993)。人源抗体也可从噬菌体展示文库中获得(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.，277：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991))。
(iv)双特异性抗体
抗体双特异性抗体(BsAbs)是可特异性结合至少两种不同抗原表位的抗体。这种抗体可从全长抗体或抗体片段中获得(如F(ab′)2双特异性抗体)。
制备双特异性抗体的方法是该领域已知的。全长双特异性抗体的常规产生方法是根据两个免疫球蛋白重链-轻链对的共同表达，而两条链的特异性互不相同(Millstein等人，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白的重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(quadroma)产生了有10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种有正确的双特异性结构。对于正确分子的纯化(通常用亲和色谱步骤)是相当麻烦的，而且产物量很低。同样的步骤在WO93/08829和Traunecker等人在EMBOJ.，10：3655-3659(1991)中有所公开。
根据另一种方法，使有所需特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。最好与免疫球蛋白重链恒定区融合，恒定区包括至少部分铰链区、CH2和CH3区。最好在至少一个融合物中，重链恒定区(CH1)含有轻链结合所需的位点。将编码免疫球蛋白重链(如果需要可以是免疫球蛋白的轻链)融合物的DNA，插入单独的表达载体中，然后共转染入合适的宿主有机体中。在例子中当用三种不同比例的多肽链来构建提供最优得率时，这种方法能灵活地调节三种多肽片段间的比例。然而，当至少两种多肽以相同比例表达能导致高得率时，或当比例没有特别影响时，可以将两种或全部三种多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
在该方法的一个较佳例中，双特异性抗体是由杂交的免疫球蛋白重链(其一个臂中有第一结合特异性)和杂交的免疫球蛋白重链-轻链对(在另一个臂上提供第二结合特异性)组成。也发现该该不对称结构使得所需的双特异性化合物更容易从不需要的免疫球蛋白链组合物中分离出来，因为仅存在于一半双特异性分子中的免疫球蛋白轻链为分离提供了容易的方法。该方法在1994年3月3日公布的WO94/04690中公开。产生双特异性抗体的更详细的细节见例如，Suresh等人在Methods in Enzymology，121：210(1986)中的描述。
双特异性抗体包括交联的或“异源共轭”的抗体。例如，异源共轭物中的一个抗体可与亲和素偶连，而另一个与生物素偶连。这种抗体例如被设计成可使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利No.4,676,980)和治疗HIV传染(WO91/00360，WO92/200373)。异源共轭物抗体可用任何便利的交联方法制得。合适的交联剂是该领域熟知的，并在美国专利No.4,676,980中公开许多交联技术。
从抗体片段产生双特异性抗体的技术也在文献中有所描述。下列技术也可用于产生二价的但不必为双特异性的抗体片段。例如，从大肠杆菌中得到的Fab′片段可在体外化学结合形成二价抗体。见，Shalaby等人，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)。
直接从重组细胞培育中制备和分离二价抗体片段的多种技术已有描述。例如，亮氨酸拉链可产生二价异源二聚体(Kostelny等人，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992))。从Fos至Jun的亮氨酸拉链的肽段蛋白质通过基因融合与两个不同抗体的Fab′部分连接。在铰链区的抗体同源二聚体还原成单体然后重新氧化成抗体异源二聚体。Hollinger等人描述的“二体”技术(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(19993))提供了另一种制备双特异性/二价抗体片段的思路。片段中有一个重链可变区(VH)，它通过很短的接头与轻链可变区(VL)连接从而使同一链上的两个区域间配对。因此一个片段上的VH和VL区被迫与另一个片段上的互补VL和VH区片段配对，因此形成了两个抗原结合位点。另外也报道了用单链Fv制备双特异性/二价抗体片段的思路(见Gruber等人，J.Immunol.，152：5368(1994))。
B.冻干制剂的制备
在如上述制备了感兴趣的蛋白质后，可制得“未冻干制剂”。未冻干制剂中的蛋白质含量可根据所需剂量体积、给药方式等来确定。当所选的蛋白质是完整的抗体(如抗IgE或抗HER2抗体)时，典型的起始蛋白质浓度应约为2mg/mL至50mg/mL，较佳的约为5mg/mL至40mg/mL，最佳约为20-30mg/mL。蛋白质通常存在于溶液中。例如，蛋白质可在pH约为4-8的pH缓冲液中，pH最佳为约5-7。典型的缓冲液包括组氨酸、磷酸盐、Tris、柠檬酸、琥珀酸及其它有机酸。缓冲液浓度约为1mM至20mM，或约3mM至约15mM，这是根据如缓冲液和所需的制剂(如重建制剂)等渗性来确定的。较佳的缓冲液是组氨酸，下面证明它有溶解保护性质。另外琥珀酸也是一种有用的缓冲液。
将溶解保护剂加入未冻干制剂中，在较佳实施例中，溶解保护剂是非还原性糖类如蔗糖或海藻糖。未冻干制剂中的溶解保护剂的量应使在重建时获得的制剂有等渗性。然而，也可用高渗重建制剂。此外，溶解保护剂的量也不宜过低致使在冻干时发生不令人满意量的蛋白质降解/凝聚。当溶解保护剂是糖类(如蔗糖或海藻糖)而蛋白质是抗体时，未冻干制剂中典型的溶解保护剂的浓度为约10mM至约400mM，较佳的为约30mM至约300mM，最好是约50mM至100mM。
每个蛋白质与溶解保护剂的组合均要选择蛋白质与溶解保护剂的比例。当所选的蛋白质是抗体而溶解保护剂是用来生成高浓度蛋白质的等渗性重建制剂的糖类(如蔗糖或海藻糖)时，溶解保护剂与抗体的比例为约100至1500摩尔溶解保护剂比1摩尔抗体，较佳为约200至约1000摩尔溶解保护剂比1摩尔抗体，例如约200至约600摩尔溶解保护剂比1摩尔抗体。
在本发明较佳实施例中，发现需要在未冻干制剂中加入一种表面活性剂。或者，在冻干制剂和/或重建制剂中也需要加入表面活性剂。典型的表面活性剂包括非离子型表面活性剂如多乙氧基醚(如多乙氧基醚20或80)；poloxamer(如poloxamer188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基、十四烷基、亚油基或十八烷酰基磺基甜菜碱；月桂基、十四烷基、亚油基或十八烷酰基肌氨酸；亚油基、十四烷基或十六烷基甜菜碱；月桂酰氨丙基、柯卡酰氨丙基、亚油酰氨丙基、十四烷酰氨丙基、十六烷酰氨丙基或异十八烷基酰氨丙基甜菜碱(如月桂酰氨丙基)；十四烷酰氨丙基、十六烷酰氨丙基或异十八烷基酰氨丙基二甲胺；  甲基椰子基牛磺酸钠或甲基油酰牛磺酸二钠；和MONAQUATTM系列(Mona Industries，Inc.，Paterson，New Jersey)、聚乙二醇、聚丙二醇和乙二醇和丙二醇的共聚物(如Pluronics，PF68等)。表面活性剂的加入量应使得重建时蛋白质凝聚减少并使重建后制剂的颗粒化趋势最小。例如，未冻干制剂中的表面活性剂的量为约0.001-0.5％，较佳的为约0.005-0.05％。
在本发明的一些实施例中，溶解保护剂(如蔗糖或海藻糖)与填充剂(如甘露糖醇或甘氨酸)的混合物可用于未冻干制剂的制备。填充剂可生成均一的冻干饼而没有其中过多的开孔。
未冻干制剂(和/或冻干制剂和/或重建制剂)中可包括其它药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，如Remington′s Pharmaceutical Sciences(16th edition，Osol，A.Ed.(1980))中描述的，只要它们对制剂所需性质没有负效应即可。可接受的载体、赋形剂或稳定剂采用的剂量和浓度对受体应是无毒的，它们包括其它缓冲液、防腐剂、共溶剂、抗氧化剂如抗坏血酸和甲硫氨酸、螯合剂如EDTA、金属配位化合物如Zn-蛋白质配位化合物、可生物降解的聚合物如聚酯和/或成盐抗衡离子如钠。
这里的制剂也可含有多种蛋白质以用于特别的治疗场合，最好这些有互补活性的蛋白质对其它蛋白质没有负效应。例如，在一个制剂中可提供两种或多种与HER2受体或IgE结合的抗体。而且，抗HER2和抗VEGF的抗体可在同一制剂中组合使用。这些蛋白质可以利于目的的量存在于组合中。
用于体内给药的制剂必须无菌。这可通过在冻干和重建前或之后流过无菌过滤膜的过滤来实现。或者，整个混合物可通过例如对除蛋白质外的组分在约120℃高压灭菌30分钟来实现无菌。
在蛋白质、溶解保护剂和其它任意的组分混合后，可冻干制剂。实现该目的可采用不同的冷冻干燥机，如Hull50TM(Hull，USA)或GT20TM(Leybold-Heraeus，Germany)型冷冻干燥机。冷冻干燥是先将制剂冷冻，然后在适于初级干燥的温度下使冷冻的冰升华。在该条件下，产物温度低于制剂的低共熔点或崩溃点。通常初级干燥的搁架温度为约-30℃至25℃(在初级干燥期间产物应保持冷冻态)，合适的压力为50至250mTorr。干燥所需的时间主要由制剂、放置样品的容器(如玻璃瓶)的大小和类型以及液体的体积来确定，时间可在几小时至几天内(如40-60小时)。二级干燥步骤可在0-40℃下进行，这主要是根据所用的容器的类型和大小以及蛋白质的种类。然而，这里发现二级干燥步骤是非必要的。例如，冻干物整个水相除去的搁板温度为约15-30℃(如约20℃)。二级干燥所需的时间和压力应能生成合适的冻干饼，它们与例如温度和其它参数有关。二级干燥时间由产物中所需残余水分水平来确定，通常需要至少5小时(如10-15小时)。压力可与初级干燥步骤中所用的压力相同。冷冻干燥条件可根据制剂和瓶的大小而不同。
在一些例子中，希望在容器中冻干蛋白质制剂，而可在其中进行蛋白质的重建以避免输送步骤。该例子中的容器例如可以是3、5、10、20、50或100cc的瓶。
通常，冻干应使冻干制剂中的水分含量小于约5％，较佳的用小于约3％。
C.冻干制剂的重建
通常当需要对患者给药时，所需步骤是用稀释剂来重建冻干制剂，使得重建制剂中的蛋白质浓度至少为50mg/mL，例如为约50mg/mL至约400mg/mL，更佳为约80mg/mL至约300mg/mL，最佳为约90mg/mL至约150mg/mL。当需要皮下输递重建制剂时，重建制剂中如此高的蛋白质浓度被认为是特别有用的。然而，对于其它给药途径，如静脉内给药，则需要重建制剂中的蛋白质浓度稍低(例如重建制剂中的蛋白质浓度为约5-50mg/mL，或约为10-40mg/mL)。在一些例子中，重建制剂中的蛋白质浓度比未冻干制剂中的浓度高的多。例如，重建制剂中蛋白质浓度是未冻干制剂的2-40倍，较佳为3-10倍，最佳为3-6倍(如至少3倍或至少4倍)。
重建通常是在约25℃下进行，以保证完全水合，但也可按需采用其它温度。重建的时间与例如稀释剂的种类、赋形剂和蛋白质的量有关。典型的稀释剂包括无菌水、注射用抑菌剂(BWFI)、一种pH缓冲液(如磷酸盐缓冲液)、无菌盐溶液、林格溶液或葡萄糖液。稀释剂还可以含有防腐剂，典型的防腐剂如上所述，较佳的是芳香醇如苯基或酚类醇。防腐剂的用量通过测定不同的防腐剂浓度下与蛋白质的相容性和防腐剂效应来决定。例如，如果防腐剂是芳香醇(如苯甲醇)，其含量可为约0.1-2.0％，较佳为0.5-1.5％，但最佳为1.0-1.2％。
较佳地，每一瓶重建制剂中粒径大于等于10μm的颗粒应小于6000个。
D.重建制剂的给药
重建制剂可用已知的方法来对需要用蛋白质来治疗的哺乳动物，最好是人给药，方法如静脉内药给药或通过肌肉间、会阴内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜腔内、鞘内、皮肤表面或吸入途径持续一定时间灌输。
在较佳实施例中，重建制剂通过皮下(即皮肤下面)来对哺乳动物给药。为了这个目的，制剂应用注射器来注射。然而，也可用其它用于给药的设备，如注射装置(如Inject-easeTM和GenjectTM装置)；注射笔(如GenPenTM)；无针装置(如MediJectorTM和BioJectorTM)和皮下输药系统。
蛋白质的合适的剂量(“治疗有效量”)与例如待治疗的疾病、疾病严重性和进程、蛋白质给药用于预防还是治疗、以前的治疗、患者病史和对蛋白质的反应、所用的蛋白质种类以及主治医师的处理有关。蛋白质可一次或在一系列疗程内对病人给药，而且可根据前面的诊断在任何时刻给药。蛋白质可以单独用于治疗或与其它可用于治疗疾病的药物或疗法组合使用。
当所选的蛋白质是抗体时，无论是如一种或多种单独服法，对患者给药的最初所选剂量为约0.1-20mg/kg。然而，也可用其它剂量方案。该治疗法的进展很容易用常规技术来控制。
在抗HER2抗体的例子中，抗体的治疗有效量应可以治疗或预防以HER2载体过度表达为特征的癌。认为抗HER2抗体的重建制剂可用于治疗乳房癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌和/或膀胱癌。例如，抗HER2抗体可用于治疗原位导管癌(DCLS)。一种或多种单独服法中典型的抗HER2抗体剂量为1-10mg/kg。
抗IgE制剂可用于治疗或预防IgE介导的变应性疾病，例如寄生虫传染、间质膀胱炎和哮喘。抗IgE抗体的治疗有效量(如约1-15mg/kg)根据治疗的疾病来对患者给药。
E.生产的产品
本发明的另一方面是提供一种含有本发明的冻干制剂的产品和它的重建和/或用法的说明。产品包括一个容器。合适的容器包括，例如玻璃瓶、小瓶(如双室小瓶)、注射器(如双室注射器)和试管。容器可用各种材料如玻璃或塑料制得。容器中有冻干制剂，容器上的或和容器配套的标签说明了重建和/或施用的方法。例如，标签可以指示将冻干制剂重建至上述蛋白质浓度。标签还可说明制剂适用于皮下注射。装有制剂的容器可以是多次性使用小瓶，它可重复进行重建制剂的给药(如给药2-6次)。产品还可包括另一个有合适稀释剂(如BWFI)的容器。在混合稀释剂和冻干制剂时，重建制剂中的蛋白质最终浓度至少为50mg/mL。从商业和用户角度出发，产品还可包括其它物品，包括其它缓冲液、稀释剂、滤膜、针、注射器以及装有说明书的包裹。
参照下列例子可以充分理解本发明。然而，它们不应被理解为限制本发明的范围。所有的文献均作引证参考。
实施例1
抗HER2制剂
HER2原癌基因产物(p185HER2)的过度表达与各种入侵性人恶性肿瘤有关。称作muMAb4D5的鼠型单克隆抗体可直接作用于p185HER2的胞外区域(ECD)。muMAb4D5分子被人源化以试图通过减少它的免疫原性并使它支持人体效应器功能来提高临床效果(见WO 92/22653)。这个例子描述了开发包含WO 92/22653中描述的全长人源化抗体huMAb4D5-8的冻干制剂。
在开发冻干制剂时，首先通过测定蛋白质在冻干和重建后的稳定性来筛选赋形剂和缓冲液。对每一个制剂中的冻干蛋白质作进一步稳定性研究以测定蛋白质在它保藏期限内的稳定性。这些进一步的研究通常是在上述给出的保藏条件温度下进行的，然后根据阿仑尼乌斯动力学用数据估计降解反应所需的活化能(Cleland等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier System 10(4)：307-377(1993))。然后用活化能计算出在给出的保藏条件下预计的蛋白质制剂的保藏期限。
在早期筛选研究中，在5℃(给出的保藏条件)和40℃(进一步稳定性研究的条件)下培育后来研究一些冻干的重组人源化抗HER2抗体(rhuMAb HER2)制剂的稳定性。在液态时，发现rhuMAB HER2通过脱氨基(轻链的30位天冬酰胺)而降解和通过环状亚胺中间物琥珀酰亚胺形成异天冬氨酸(重链的102位天冬氨酸)。在pH5.0脱氨基反应最小，导致降解基本上为琥珀酰亚胺。在pH6.0时，在液体蛋白质制剂中发现有较高量的脱氨基反应。因此，在(a)5或10mM琥珀酸盐缓冲液，pH5.0和(b)5或10mM组氨酸缓冲液，pH6.0下研究冻干制剂。缓冲液均含有表面活性剂多乙氧基醚20(吐温20TM)，它可用于减少重建蛋白质的凝聚趋势并使重建后颗粒形成最少。这些缓冲液可与及不与各种糖类一起使用。将蛋白质以5.0，21.0或25.0mg/mL的浓度配入缓冲液。然后冻干制剂，在5℃和40℃下保藏2星期后测定蛋白质的稳定性。在冷冻干燥机内，小瓶在约-55℃的搁架温度下冷冻约5小时，然后在5℃搁架温度，150mTorr压力下初级干燥30小时，并用20℃的搁架温度二级干燥10小时以干燥至1-2％的残余水分。该蛋白质在冻干时的主要降解途径是凝聚，因此可用非变性大小排阻色谱测定完整非变性蛋白质的得率来测定蛋白质稳定性(完整蛋白质的％见下表2)。
在10mM琥珀酸钠，pH5.0(表2)中测定各种溶解保护剂糖类对于冻干蛋白质的稳定性的影响。在高糖浓度(250-275mM)和低蛋白质浓度(5.0mg/mL)下，海藻糖和乳糖可使在40℃下保藏2星期的冻干蛋白质稳定并防止它凝聚。然而，乳糖是一种还原性糖，发现它在40℃下长期保藏时将与蛋白质反应。含有山梨糖醇或甘露糖醇的5.0mg/mL的制剂在40℃下保藏2星期后将产生蛋白质凝聚。在高蛋白质浓度下(21.0mg/mL)，由甘露糖醇或甘露糖醇与山梨糖醇或甘氨酸的组合的制剂在两种条件下冻干保藏后含有凝聚的蛋白质。相反，在两种保藏条件下海藻糖和蔗糖可防止凝聚。
现在测定含有250mM海藻糖和250mM乳糖的制剂的长期稳定性。在40℃下保藏9个月或在5℃下保藏12个月后，含海藻糖的制剂中完整蛋白质的百分比没有变化。而对于乳糖制剂，在40℃下保藏3个月后或在25℃下保藏6个月后完整蛋白质的百分比保持恒定(和原来一样)。含海藻糖的制剂可在控制的室温下(15-30℃)下保藏2年而完整蛋白质的百分比没有显著的变化。
在40℃下保藏2星期后，有pH6.0，10mM的组氨酸和甘露糖醇的制剂比有pH5.0，10mM的琥珀酸盐和甘露糖醇的制剂含有更少的凝聚蛋白质。这个结果可能是由于单组氨酸贡献的稳定效果。然而在40℃下保藏2星期后，单用组氨酸或用组氨酸/甘露糖醇的制剂中有显著的凝聚。在组氨酸制剂中加入与甘露糖醇相等的量(10mg/mL)可在两种保藏条件下防止凝聚使蛋白质稳定。用甘氨酸和甘露糖醇没有提高蛋白质的稳定性，而蔗糖/甘氨酸制剂则提供了与蔗糖/甘露糖醇制剂相同的稳定性。该结果进一步表明蔗糖有助于在保藏时防止冻干蛋白质的凝聚。
           表2
    冻干前的组分     完整蛋白质的百分比a
  蛋白质b(mg/mL)     配方 液体(5℃)     冻干(2星期，5℃) 冻干(2星期，40℃)
10mM琥珀酸钠，pH5.0
    5.0 275mM海藻糖，0.01％吐温20TM   98.9     99.1   98.9
    5.0 275mM乳糖，0.01％吐温20TM   96.8     96.5   96.6
    5.0 275mM山梨糖醇，0.01％吐温20TM   99.4     99.3   95.4
    5.0 250mM甘露糖醇，0.01％吐温20TM   100.0     99.9   98.8
    5.0 250mM海藻糖，0.01％吐温20TM   100.0     99.9   100.0
    5.0 250mM乳糖，0.01％吐温20TM   100.0     100.0   100.0
    21.0 250mM海藻糖，0.2％吐温20TM   99.3     99.1   99.1
    21.0 250mM蔗糖，0.2％吐温20TM   99.6     99.6   99.7
    21.0 250mM甘露糖醇，0.01％吐温20TM   100.0     94.6   94.0
    21.0 188mM甘露糖醇/63mM山梨糖醇，0.01％吐温20TM   99.8     98.6   96.5
    21.0 250mM甘露糖醇/25mM甘氨酸，0.01％吐温20TM   99.5     96.5   96.4
10mM组氨酸，pH6.0
    21.0 没有糖，0.01％吐温20TM   100.0     99.9   98.9
    21.0 54.9mM甘露糖醇，0.01％吐温20TM   100.0     99.9   99.2
    21.0 29.2mM蔗糖/266.4mM甘氨酸，0.01％吐温20TM   100.0     100.0   99.6
    21.0 54.9mM甘露糖醇/266.4mM甘氨酸，0.01％吐温20TM   100.0     99.8   98.9
    21.0 54.9mM甘露糖醇/29.2mM蔗糖，0.01％吐温20TM   99.8     100.0   99.7
a.完整蛋白质的组分用非变性大小排阻HPLC和非变性蛋白质的峰面积相对于包括凝聚物的总峰面积的值来测定(TSK3000 SW XL柱，TosoHaas，流速为1.0mL/min；用磷酸盐缓冲液洗脱；在214和280nm下检测)。蛋白质制剂在冻干前(液体，5℃)、冻干后和在5℃或40℃下保藏2星期后分析。
b.含有5mg/mL蛋白质的制剂用蒸馏水重建(20mL，5.0mg/mL蛋白质)，和含有21mg/mL蛋白质的制剂用注射用抑菌剂(BWFI，0.9％苯甲醇；20mL，20mg/mL蛋白质)重建。
由于皮下给药的体积限制(≤1.5mL)和剂量需求(≥100mg)，因此通常需要高蛋白质浓度的输递。然而，由于在高浓度下蛋白质在处理中有凝聚的趋势，对它很难处理和无菌过滤，因此高蛋白质浓度(≥50mg/mL)通常很难在生产过程中实现。另外冻干过程提供了一种允许蛋白质浓缩的方法。例如，将蛋白质以一定体积(Vf)装入小瓶中，然后冻干。然后将冻干蛋白质用较原来体积小的体积(Vr)(如Vr＝0.25Vf)的水或防腐剂(如BWFI)重建，使得重建溶液中有较高的蛋白质浓度。该方法也使缓冲液和赋形剂浓缩。对于皮下给药来说，希望溶液是等渗的。
减少冻干rhuMAB HER2中的海藻糖量以在重建成100mg/mL蛋白质时形成等渗溶液。测定在pH5.0，5mM琥珀酸钠和pH6.0，5mM组氨酸、25.0mg/mL蛋白质下海藻糖随浓度而变的稳定效果(表3)。在海藻糖浓度从60至200mM间，冻干蛋白质在40℃下培育4星期后没有显著的凝聚。这些制剂在20mL注射用抑菌剂(BWFI，USP，0.9％苯甲醇)中重建。50mM海藻糖制剂(5mM琥珀酸钠)在40℃下培育4星期后，在4mL BWFI(100mg/mL蛋白质)中重建，生成的制剂有稍微增加量的凝聚。保藏的重建制剂提供了可从同一小瓶中多次取出而不染菌的优点。当使用接种针时，这一个小瓶内的制剂就可分几次取出。
               表3
    冻干前的组分     完整蛋白质的百分比a
蛋白质(mg/mL)     配方   液体(5℃)     冻干(4星期，5℃) 冻干(4星期，40℃)
5mM琥珀酸钠，pH5.0
 25.0 50mM海藻糖，0.01％吐温20TMb   100.0     100.0   99.5
 25.0 60mM海藻糖，0.01％吐温20TM   100.0     100.0   99.9
 25.0 60mM海藻糖，0.01％吐温20TM   100.0     100.0   99.2
 25.0 100mM海藻糖，0.01％吐温20TM   100.0     100.0   99.7
 25.0 150mM海藻糖，0.01％吐温20TM   100.0     100.0   99.8
 25.0 200mM海藻糖，0.01％吐温20TM   100.0     100.0   100.0
5mM组氨酸，pH6.0
 25.0 38.4mM甘露糖醇/20.4mM蔗糖，0.01％吐温TM   100.0     100.0   99.3
 25.0 38.4mM甘露糖醇/20.4mM蔗糖，0.01％吐温TMc   100.0     100.0   99.4
 25.0 60mM海藻糖，0.01％吐温20TMd   100.0     100.0   99.8
 25.0 60mM海藻糖，0.01％吐温20TM   100.0     100.0   99.4
 25.0 100mM海藻糖，0.01％吐温20TM   100.0     100.0   99.6
 25.0 150mM海藻糖，0.01％吐温20TM   100.0     100.0   100.0
 25.0 200mM海藻糖，0.01％吐温20TM   100.0     100.0   100.0
a.完整蛋白质的组分用非变性大小排阻HPLC测定，并定义为非变性蛋白质的峰面积相对于包括凝聚物的总峰面积的值(TSK3000 SW XL柱，TosoHaas，流速为1.0mL/min；用磷酸盐缓冲液洗脱；在214和280nm下检测)。蛋白质制剂在冻干前(液体，5℃)、冻干后和在5℃或40℃下保藏4星期后分析。制剂用注射用抑菌剂(BWFI，USP，0.9％w/w苯甲醇；20mL，22mg/mL蛋白质)重建。
b.用4mL BWFI(0.9％苯甲醇)重建成蛋白质浓度为100mg/mL。
c.用4mL BWFI(1.1％苯甲醇)重建成蛋白质浓度为100mg/mL。
d.样品在5℃或40℃下培育2星期，然后用20mL BWFI(0.9％苯甲醇)重建成蛋白质浓度为22mg/mL。
现在，研究rhuMAb HER2作为治疗乳房癌的药物。给患者每周服用2mg/kg蛋白质，由于这些患者的平均体重为65kg，因此，平均每周剂量为130mg rhuMAbHER2。对于皮下给药来说，注射体积为或小于1.5ml是可以接收的，因此，每周一次皮下给药的rhuMAb HER2蛋白质浓度约为100mg/mL(130mg平均剂量/1.5mL)。如上所述，这种高蛋白质浓度很难生成并保持稳定。为达到高蛋白质浓度，可将rhuMAb HER2以25mg/mL的蛋白质浓度配制入：(a)5mM琥珀酸钠，pH5.0或(b)5mM组氨酸，pH6.0以及60mM海藻糖、0.01％吐温20TM中并冻干。冻干时将18mL蛋白质制剂分装入50cc小瓶中。在冷冻干燥机中，小瓶在约-55℃的搁架温度下冷冻约5小时，然后在5℃搁架温度，150mTorr压力下初级干燥30小时，并用20℃的搁架温度二级干燥10小时以干燥至1-2％的残余水分。置于含有无效对照剂(不含蛋白质的制剂)中的热电偶显示小瓶中的产品在整个初级干燥中维持在-10℃以下。在冻干时的依序制止研究显示在初级干燥后残余水分通常小于10％。
然后冻干蛋白质用4或20mL BWFI(0.9或1.1％的苯甲醇)重建生成浓缩的蛋白质溶液：
(a)4mL：102mg/mL rhuMAb HER2，245mM海藻糖，21mM琥珀酸钠，pH5.0或21mM组氨酸，pH6.0，0.04％吐温20TM；
(b)20mL：22mg/mL rhuMAb HER2，52mM海藻糖，4mM琥珀酸钠，pH5.0或4mM组氨酸，pH6.0，0.009％吐温20TM。
冻干制剂在40℃下保藏4星期后，重建成22mg/mL的蛋白质浓度，随着海藻糖浓度的减少蛋白质的凝聚量显示出略有上升。冻干蛋白质的稳定性则不受重建体积的影响。如图1所示，冻干蛋白质(60mM海藻糖，5mM琥珀酸钠，pH5.0，0.01％吐温20TM)在40℃下培育后用4或20mL BWFI重建后完整蛋白质的量是相同的。
表3的结果表明海藻糖浓度和蛋白质稳定性间有一定关系。为进一步确定这个关系，在40℃下对含有不同配制浓度的海藻糖的琥珀酸钠或组氨酸制剂进行培育。然后测定在每个海藻糖浓度下随海藻糖与蛋白质摩尔比变化的稳定性。如图2所示，随着海藻糖浓度的下降，两种制剂中蛋白质稳定性均有明显的下降。在这些制剂中采用两种不同的缓冲液，即琥珀酸盐和组氨酸，并没有明显的区别，这表明在这种条件下主要的稳定剂是海藻糖。此外，两种制剂中发现的完整蛋白质的减少对于保藏在2-8℃下的低海藻糖浓度制剂在其保存期内也有发现。然而，如果需要控制室温稳定(最大温度为30℃)，根据产品稳定性标准(保藏2年后剩余的完整蛋白质的量的标准)，可能需要更高的海藻糖浓度(海藻糖∶蛋白质之比≥600∶1)。通常，控制室温保藏条件在40℃下稳定保藏6个月与在30℃下保藏2年等效。
如图3所示，250mM海藻糖制剂在40℃下保藏6个月而无变化，而60mM的海藻糖制剂则较不稳定。如果产品在保存期末的标准是，例如用非变性大小排阻色谱测定有大于98％的完整蛋白质，那么60mM海藻糖浓度的制剂则需要冷冻保藏。
在先前的筛选研究中，也发现蔗糖可在冻干后及后续保藏时防止rhuMabHER2的凝聚。为在重建后获得等渗溶液以用于皮下给药(制剂组分和蛋白质约浓缩4倍)，必须大大减少蔗糖浓度。在筛选研究中，相同质量浓度的蔗糖和甘露糖醇(填充剂)的采用防止了蛋白质的凝聚。现在选择较低浓度的蔗糖和甘露糖醇(相同的质量浓度)用于有效的rhuMAb HER2皮下用制剂。冻干蛋白质溶液(25mg/mL蛋白质，5mM组氨酸，pH6.0，38.4mM(7mg/mL)甘露糖醇，20.4mM(7mg/mL)蔗糖，0.01％吐温20TM)，所用方法和60mM海藻糖的制剂相同，只是初级干燥的周期延长至54小时。在40℃下保藏4星期后，用4.0或20.0mL BWFI重建后凝聚物量略有增加(表3)。蛋白质凝聚量与对重建成22或100mg/mL蛋白质浓度(图4)的结果相同。与60mM海藻糖制剂相同，甘露糖醇/蔗糖制剂在40℃下保藏一定时间将形成较少的完整蛋白质量。该制剂中蔗糖与蛋白质的摩尔比为120比1，这表明在相同摩尔比的稳定化糖条件下甘露糖醇/蔗糖的组合比单用海藻糖更有效(图2和4)。
在先前的例子中，测定了冻干rhuMAb HER2制剂的稳定性随温度的变化情况。这些研究证明海藻糖和甘露糖醇/蔗糖的制剂可在高温(40℃)下防止冻干态的蛋白质降解。然而这些试验并没有确定蛋白质在重建和保藏后的稳定性。当用BWFI重建后，冻干的rhuMAb HER2制剂可用于几种药物给药。特别是，小瓶容量(450mg rheMAb HER2)设计成可平均为三个患者提供药剂(每次剂量为130mgrhuMAb HER2)。由于药物每周服用一次，因此，小瓶必须在重建后保藏至少三星期，为确定rhuMAb HER2在重建后可维持稳定，现在在5℃和25℃下对重建的rhuMAb HER2制剂进行稳定性研究。
对于皮下给药，制剂可重建成蛋白质浓度为100mg/mL(4mL BWFI)。在这个高蛋白质浓度下，蛋白质比重建成22mg/mL蛋白质(20mL BWFI)的静脉用制剂更容易凝聚。测定先前例子中四种rhuMAb HER2制剂的凝聚情况(完整蛋白质的损失)。如表4至6所示，重建成22和100mg/mL蛋白质浓度的制剂的稳定性没有区别。而且，这些制剂在5℃下可使蛋白质保持全部完整90天以及在25℃下可保持蛋白质全部完整30天，这表明重建制剂可冷冻保藏至少90天。与先前例子中的冻干蛋白质稳定性不同，该制剂中海藻糖浓度对于蛋白质稳定性无影响(表7)。
                        表4
蛋白质浓度为25mg/mL的rhuMAb HER2在5mM琥珀酸钠，pH5.0，60mM
       海藻糖，0.01％吐温20TM中冻干后重建制剂的稳定性
    时间(天数)     完整蛋白质的百分比
    22mg/mL蛋白质     100mg/mL蛋白质
    5℃     25℃     5℃     25℃
    0     99.9     99.9     99.7     99.7
    14     ND     100.0     ND     100.0
    30     100.0     100.0     100.0     100.0
    91     99.8     ND     100     ND
样品用4.0mL或20.0mL BWFI(1.1％或0.9％苯甲醇)重建，然后保藏在5℃或25℃下。完整蛋白质的百分比用非变性大小排阻色谱测定，定义为非变性峰面积的组分。ND为没有测定。
                         表5
蛋白质浓度为25mg/mL的rhuMAb HER2在5mM组氨酸，pH6.0，60mM
       海藻糖，0.01％吐温20TM中冻干后重建制剂的稳定性
    时间(天数)     完整蛋白质的百分比
    22mg/mL蛋白质     100mg/mL蛋白质
    5℃     25℃     5℃     25℃
    0     100.0     100.0     100.0     100.0
    14     ND     100.0     ND     100.0
    31     99.3     99.7     100.0     100.0
    61     100.0     ND     ND     ND
样品用4.0mL或20.0mL BWFI(1.1％或0.9％苯甲醇)重建，然后保藏在5℃或25℃下。完整蛋白质的百分比用非变性大小排阻色谱测定，定义为非变性峰面积的组分。ND为没有测定。
                表6蛋白质浓度为25mg/mL的rhuMAb HER2在5mM组氨酸，pH6.0，38.4mM甘露糖醇，20.4mM蔗糖，0.01％吐温20TM中冻干后重建制剂的稳定性
    时间(天数)     完整蛋白质的百分比
    22mg/mL蛋白质     100mg/mL蛋白质
    5℃     25℃     5℃     25℃
    0     99.7     99.7     99.8     99.8
    14     ND     100.0     ND     99.8
    31     100.0     100.0     100.0     100.0
    92     100.0     ND     100     ND
样品用4.0mL或20.0mL BWFI(1.1％或0.9％苯甲醇)重建，然后保藏在5℃或25℃下。完整蛋白质的百分比用非变性大小排阻色谱测定，定义为非变性峰面积的组分。ND为没有测定。
                          表7
蛋白质浓度为21mg/mL的rhuMAb HER2在10mM琥珀酸钠，pH5.0，250mM
       海藻糖，0.2％吐温20TM中冻干后重建制剂的稳定性
    时间(天数)     完整蛋白质的百分比21mg/mL蛋白质
    5℃     25℃
    0     99.8     99.8
    14     ND     100.0
    31     99.9     99.4
    92     99.8     ND
样品用20.0mL BWFI(0.9％苯甲醇)重建，然后保藏在5℃或25℃下。完整蛋白质的百分比用非变性大小排阻色谱测定，定义为非变性峰面积的组分。ND为没有测定。
如上所述，rhuMAb HER2在水性溶液中主要的降解途径脱氨基或形成琥珀酰亚胺。现在测定四种重建的rhuMAb HER2制剂中由于脱氨基或形成琥珀酰亚胺而损失的非变性蛋白质。
rhuMAb HER2脱氨基和形成琥珀酰亚胺可用阳离子交换色谱来分析。Bakerbong Wide-Pore Carboxy Sulfon(CSX)柱(4.6×250mm)的流速为1mL/min。流动相缓冲液是(A)0.02M磷酸钠，pH6.9和(B)0.02M磷酸钠，pH6.9，0.2M NaCl。色谱在40℃下以如下方式进行：
                     表8
    时间(分钟)     缓冲液B的百分数
    0     10
    55     45
    57     100
    62     100
    62.1     10
    63     10
洗脱峰在214nm下检测，每次分析蛋白质上样量为75μg。
同样，重建成22mg/mL和100mg/mL蛋白质浓度的制剂的稳定性也没有差别(图5至7)。每种制剂在25℃下的蛋白质降解速度比5℃下快，而所有保藏在5℃下的制剂的降解速度是类似的。在25℃下含有组氨酸的制剂的降解速度比琥珀酸盐制剂略快。在两个温度下制剂中的海藻糖浓度对降解速度均没有影响(图5至8)。这些结果证明这四种制剂在计划使用期间(在用BWFI重建后的30天内)在冷藏条件下(5℃)的降解速度是可以接受的。
多次性使用制剂要在美国使用必须通过如美国药典(USP)所描述的防腐性测试。将含有25mg/mL蛋白质、5mM组氨酸，pH6.0、60mM海藻糖，0.01％吐温20TM的rhuMAb HER2冻干制剂用20mL浓度w/w为0.9至1.5％的苯甲醇重建。当浓度等于或大于1.3％w/w时，重建制剂在室温(～25℃)下培育过夜后将变混浊。用标准的BWFI制剂(0.9％苯甲醇)重建将使溶液不能始终通过防腐性测试。然而，用1.0或1.1％的与制剂相容浓度的苯甲醇重建的制剂可通过防腐性测试。产品的规格要求溶液浓度在±10％范围内，因此冻干制剂用1.1％苯甲醇(1.1±0.1％)来重建。
现在研究了一种rhuMAb HER2制剂单步冷冻干燥过程。在单步冷冻干燥过程中，25mg/mL的rhuMAb HER2、60mM海藻糖、5mM组氨酸(pH6)和0.01％多乙氧基醚20在搁架温度为20℃、压力为150mTorr的条件下冻干。47小时后，冻干饼的残余含水量小于5％。这种冷冻干燥方法被认为是有利的，它除去二级干燥步骤，简化了生产过程。
实施例2
抗IgE制剂
IgE抗体可与肥大细胞上的特异性高亲和性受体结合，导致肥大细胞脱粒并释放介体如产生变态反应症状的组胺，因此，阻碍IgE与高亲和性受体结合的抗IGE抗体对于治疗变应性疾病有很高的医疗价值。这些抗体也不能在IgE与受体结合后与IgE结合，因为这将引发组胺的解离。该例子描述了对含有如Presta等人描述的全长人源化抗IgE抗体MaE11(J.Immunology，151：2623-2632(1993))的冻干制剂的开发。
材料：高度纯化的rhuMAb E25(重组的人源化的抗IgE抗体MaE11)，在下述所用的制剂中不含有吐温20TM。从Spectrum(Los Angeles，CA)购得Spectra/Por 7透析膜。该研究中其它所有的试剂可从商业上获得并且是分析级的。制剂缓冲液和色谱流动相可通过在容量瓶中混合适当量的缓冲液和盐和Milli-Q级水来制得。
配制：将E25 S琼脂糖集合体在特定的制剂缓冲液中透析。透析用4×2L的最小量交换缓冲液在2-8℃下交换48小时来实现。在透析后，将溶解保护剂按需加入一些制剂中形成等渗浓度。透析后的蛋白质浓度用1.60摩尔吸光系数的紫外分光光度计来测定。将透析后的蛋白质用合适的制剂缓冲液稀释至预定的制剂浓度，用0.22μm Millex-GV过滤器(Millipore)进行无菌过滤，然后分装到预先清洗和高压灭菌过的玻璃小瓶中。小瓶装上硅烷化的特氟隆瓶塞，然后在下列条件下冷冻干燥：E25制剂以80℃/小时的速度冷冻至-55℃，并保持小瓶内物质冷冻4小时。然后将温度以10℃/小时的速度升至25℃进行初级干燥。初级干燥在25℃、50μ容器室压下进行39小时，使得冻干饼中的残余含水量为1-2％。在冷冻干燥后，将每种制剂的一个小瓶取出，在0℃分析，而其余的小瓶则在不同的温度如-70℃、2-8℃、25℃、30℃(对照室温)、40℃和50℃下进行分析。
色谱：在Bio-Rad Bio-SelectTM SEC 250-5柱(300×7.8mm)上进行非变性大小排阻色谱。柱用PBS以0.5mL/min的流速平衡流洗，并使用装有二极管排列检测器的Hewlett Packard 1090L型HPLC仪。用由甲状腺球蛋白(670kd)、γ球蛋白(158kd)、卵白蛋白(44kd)和维生素B12(1.35kd)组成的分子量标准品(Bio-Rad，Inc.)来校正柱。样品上样量为25μg，蛋白质通过用Turbochrom 3软件(PE Nelson，Inc.)监测214nm下的紫外吸光值来获得。
疏水作用色谱：用TosoHass Butyl-NPR柱(3.5×4.6mm)和装有二极管排列检测器的Hewlett Packard 1090L型HPLC仪色谱E25抗体的F(ab′)2。洗脱缓冲液A是：20mM Tris、2M硫酸铵、20％(v/v)甘油，pH8.0，而洗脱缓冲液B是20mMTris、20％(v/v)甘油，pH8.0。柱用10％洗脱缓冲液B以1.0mL/min的流速平衡至少20分钟。样品上样量为5μg，蛋白质通过用Turbochrom 3软件(PE Nelson，Inc.)监测214nm下的紫外吸光值来获得。在注入样品后，使柱在10％的缓冲液B中维持1分钟，然后在20分钟内从10％线性梯度洗脱至62％的缓冲液B。用100％的缓冲液B洗柱5分钟，然后在连续样品注入间用10％缓冲液B重新平衡至少20分钟。
抗体结合活性：如上面Presta等人描述的方法对样品进行IgE受体结合抑制测定(IE25：2)，样品用测定稀释剂(磷酸盐缓冲液，0.5％BSA，0.05％多乙氧基醚20，0.01％乙基汞硫代水杨酸钠)稀释至20μg/mL和30μg/mL。然后重复测定每种稀释液三次，结果再乘上适当的稀释系数就可生成活性浓度。平均6次测定的结果。该测定法测定了rhuMAb E25竞争性结合IgE从而阻止IgE与固定在ELISA盘上的高亲和性受体结合的能力。结果除以紫外吸光值分光法测得的抗体浓度，可得到比活值。先前的试验显示这个测定结果可表示稳定性。
颗粒化测试：合并冻干rhuMAb E25的重建制剂，获得体积约为7mL。用Hiac/Royo型8000计数器测定1mL样品中粒径在2至80μm间的颗粒数。计数器首先用1mL样品洗三次，然后重复测定1mL样品三次。仪器测定每毫升中大于粒径10μm的颗粒数和粒径大于25μm的颗粒数。
制备抗IGE抗体的第一步是决定产品冻干和保藏时合适的缓冲液和pH值。将浓度为5.0mg/mL的抗体配制入pH5.0至6.5的10mM琥珀酸盐缓冲液和pH7.0的磷酸钠、磷酸钾和组氨酸缓冲液中。图9表示在冻干前和冻干后较高pH的制剂中抗体凝聚物量有增加。一个例外是pH7的组氨酸制剂，发现它在2-8℃下保藏时凝聚物量没有增加。图10表示rhuMAb E25在pH6和pH7的5mM组氨酸缓冲液冻干然后在2-8℃、25℃和40℃下保藏1年后的凝聚情况。在每个测定时间点和保藏温度下pH6的制剂的凝聚物量均比pH为7的抗体制剂要少。这个结果表明pH6的组氨酸特别适于用作防止抗体凝聚的缓冲液系统。
为实现溶解保护剂的筛选，可在有或没有溶解保护剂时将抗IgE抗体配制入pH为5的琥珀酸钠中。加至等渗浓度的有效的溶解保护剂可分为3类：
(a)非还原性单糖(如甘露糖醇)；
(b)还原性二糖(即乳糖和麦芽糖)；和
(c)非还原性二糖(即海藻糖和蔗糖)。
制剂在2-8℃和40℃下保藏1年后的凝聚情况显示在图11和12中。在2-8℃下保藏时，单糖制剂(甘露糖醇)的凝聚速度与缓冲液对照中的相同，而含有二糖的制剂在控制凝聚方面均非常有效(图11)。在40℃下保藏的结果是相同的，只是蔗糖制剂的凝聚很迅速(这与冻干饼发生棕黄反应相关联(图12))。后面将显示这是蔗糖在酸性pH和高温下保藏时发生降解而引起的。
配制入pH6的组氨酸缓冲液和乳糖中的抗体的疏水作用色谱显示抗体在40℃下保藏6个月后将发生改变(图13)。色谱峰变宽而保留时间减少。而如图14和15所示，缓冲液对照和蔗糖制剂在相似条件下保藏则没有发现这些变化。而且等电聚焦显示在25℃和40℃下保藏的配制入乳糖的抗体pI有酸性移动。这表明还原性糖不适用作抗体的溶解保护剂。
图16表示了在pH6的组氨酸缓冲液以及各种浓度的蔗糖和海藻糖中浓度为20mg/mL的抗IgE的冻干制剂在50℃下保藏12周后的凝聚情况。当每摩尔抗体的糖浓度大于500摩尔时，两种糖的防止凝聚的效果是相似的。根据这些结果，对蔗糖和海藻糖的等渗和高渗制剂进行进一步研究。制剂在冻干前被加入较低浓度的抗体，冻干的产品用比含0.9％苯甲醇的注射用抑菌剂(BWFI)的用量更少的量重建。这使得在皮下输递前抗体可以浓缩并包括一种防腐剂以用于多次性使用的制剂而避免了长时间保藏时蛋白质和防腐剂间的作用。
等渗制剂：在pH6的5mM组氨酸缓冲液中配制成抗IgE的浓度为25mg/mL，每摩尔抗体的糖摩尔数为500摩尔，即糖浓度等于85mM。这种制剂用比原来加量体积小4倍的BWFI(0.9％苯甲醇)重建。这使得在pH6的20mM组氨酸中抗体浓度为100mg/mL，等渗糖浓度为340mM。
高渗制剂：在pH6的5mM组氨酸缓冲液中配制成抗IgE的浓度为25mg/mL，每摩尔抗体的糖摩尔数为1000摩尔，即糖浓度等于161mM。这种制剂用比原来加量体积小4倍的BWFI(0.9％苯甲醇)重建。这使得在pH6的20mM组氨酸中抗体浓度为100mg/mL，高渗糖浓度为644mM。
等渗和高渗制剂在保藏高达36星期后的抗体凝聚的比较显示在图17至19中。在保藏在2-8℃下的高渗或等渗制剂中均没有发现凝聚变化(图17)。而保藏在控制室温(30℃)下时，高渗溶液中没有发现有凝聚增量，而在等渗制剂中有约1至2％的凝聚物增量(图18)。最后，在50℃下保藏时，在高渗制剂中发现有较小的凝聚物增量，等渗性海藻糖制剂中有4％的凝聚物增量，而在等渗性蔗糖制剂中有12％的凝聚物增量(图19)。这些结果表明等渗性制剂应含有使在高达30℃下保藏的抗体能保持稳定所必需的最小量的糖。
用IgE受体抑制测定法可测定等渗和高渗制剂中抗IgE的结合活性。发现等渗和高渗蔗糖和海藻糖制剂在-70℃、2-8℃、30℃和50℃下保藏36星期后结合活性基本上没有改变。
已知冻干制剂中含有不溶性凝聚物或颗粒(Cleland等人，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，10(4)：307-377(1993))，因此，对加入85mM和161mM蔗糖和海藻糖的pH6，5mM的组氨酸中的浓度为25mg/mL冻干抗体进行颗粒化测定。加入多乙氧基醚20至浓度为0.005％、0.01％和0.02％。冻干样品并在重建成20mM组氨酸，pH6中抗体浓度为100mg/mL，糖浓度为340mM和644mM。下列制剂中的多乙氧基醚20的浓度分别为0.02％，0.04％和0.08％。
下表9表示等渗和高渗的蔗糖和海藻糖制剂中粒径大于10μm的颗粒数和粒径大于25μm的颗粒数。在冻干前将多乙氧基醚20加入制剂中至浓度为0.005％，0.01％和0.02％中。结果表明制剂中加入吐温TM可大大减少每个测试粒径范围内的颗粒数。美国药典(USP)对于小注射剂量的标准是：每个容器中粒径大于或等于10μm的颗粒数不超过6000个，粒径大于或等于25μm的颗粒数不超过600个(Cleland等人，同上)。加入多乙氧基醚20后，高渗和等渗制剂均通过了测试。
                    表9
    制剂   多乙氧基醚20     每毫升的颗粒数
    ≥10μm   ≥25μm
  等渗性蔗糖     没有     16122     28
    0.005％     173     2
    0.01％     224     5
    0.02％     303     6
  高渗性蔗糖     没有     14220     84
    0.005％     73     6
    0.01％     51     0
    0.02％     6
  等渗性海藻糖     没有     33407     24
    0.005％     569     4
    0.01％     991     16
    0.02％     605     9
  高渗性海藻糖     没有     24967     28
    0.005％     310     11
    0.01％     209     6
    0.02％     344     6
下表10显示了一种抗IgE抗体的制剂(即，143mg瓶装rhuMAb E25等渗性制剂)，它被认为适用于该抗体的皮下输递。在10cc小瓶中加入5.7mL浓度为25mg/mL的rhuMAb E25，rhuMAb E25配制在pH6的5mM组氨酸和0.01％多乙氧基醚20中。蔗糖作为溶解保护剂加入至浓度为85mM，相应的糖与抗体的摩尔比为500比1。对小瓶进行冷冻干燥，用0.9％苯甲醇重建成原来加量体积的1/4或1.2mL。制剂组分的最后浓度增加4倍，形成pH6的20mM组氨酸中rhuMAbE25浓度为100mg/mL，多乙氧基醚20为0.04％，蔗糖为340mM(等渗性)和0.9％的苯甲醇。制剂含有pH6的组氨酸缓冲液，因为已证明它能防止抗体凝聚。加入蔗糖作为溶解保护剂是由于以前在药物行业中的使用。糖浓度的选择应使得重建时为等渗性制剂。最后，可加入多乙氧基醚20来防止不溶性凝聚物的形成。
                               表10
未冻干制剂(10cc瓶中加量为5.7mL)     重建制剂(1.2mL 0.9％苯甲醇)
    25mg/mL rhuMAb E25     100mg/mL rhuMAb E25
    5mM组氨酸，pH6.0     20mM组氨酸，pH6.0
    85mM蔗糖     340mM蔗糖
    0.01％多乙氧基醚20     0.04％多乙氧基醚20
    -     0.9％苯甲醇

Claims (25)

1.一种稳定的等渗重建制剂，它包含含量至少为约50mg/mL的蛋白质和稀释剂，重建制剂是从蛋白质和溶解保护剂的混合物制得的，其中重建制剂中的蛋白质浓度比冻干前混合物中的蛋白质浓度高约2-40倍。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中溶解保护剂是蔗糖或海藻糖。
3.根据权利要求1所述的制剂，其中还包含缓冲液。
4.根据权利要求3所述的制剂，其中缓冲液是组氨酸或琥珀酸盐。
5.根据权利要求1所述的制剂，还包括表面活性剂。
6.一种稳定的重建制剂，它包含含量至少为约50mg/mL的蛋白质和稀释剂，重建制剂是从抗体和溶解保护剂的混合物制得的，其中重建制剂中抗体浓度比冻干前混合物中抗体浓度高约2-40倍。
7.根据权利要求6所述的制剂，其中抗体是抗IGE抗体或抗HER2抗体。
8.根据权利要求6所述的制剂，它是等渗性的。
9.一种制备稳定等渗重建制剂的方法，包括在稀释剂中重建蛋白质和溶解保护剂的冻干混合物，使得重建制剂中的蛋白质浓度至少为50mg/mL，其中重建制剂中的蛋白质浓度比冻干前混合物中的蛋白质浓度高约2-40倍。
10.一种制备一种制剂的方法，包括步骤：
(a)对蛋白质和溶解保护剂的混合物进行冷冻干燥；和
(b)在稀释剂中重建步骤(a)的冻干混合物，使得重建制剂是等渗性的，稳定的，且浓度至少为约50mg/mL。
11.根据权利要求10所述的方法，其中重建制剂中的蛋白质浓度为约80mg/mL至约300mg/mL。
12.根据权利要求10所述的方法，其中重建制剂中的蛋白质浓度比冻干前混合物中的蛋白质浓度高约2-40倍。
13.根据权利要求10所述的方法，其中在整个冷冻干燥过程中冷冻干燥是在搁架温度保持在15-30℃下进行的。
14.一种产品，包括：
(a)一个装有蛋白质和溶解保护剂的冻干混合物的容器；和
(b)关于冻干混合物在稀释剂中重建成重建制剂中蛋白质浓度至少为约50mg/mL的说明。
15.根据权利要求14所述的产品，还包含另一个装有稀释剂的容器。
16.根据权利要求15所述的产品，其中稀释剂是包含芳香醇的注射用抑菌剂BWFI。
17.一种包含溶解保护剂和抗体的冻干混合物的制剂，其中溶解保护剂和抗体的摩尔比为100至1500摩尔溶解保护剂比1摩尔抗体。
18.权利要求1所述的制剂用于制备治疗哺乳动物的药物的应用，其中哺乳动物患有需要用制剂中蛋白质来治疗的疾病。
19.根据权利要求18所述的应用，其中制剂用于皮下给药。
20.一种制剂，包含含量为约5-40mg/mL的抗HER2抗体，含量为10-100mM的蔗糖或海藻糖，缓冲液和表面活性剂。
21.根据权利要求20所述的制剂，还包含一种填充剂。
22.根据权利要求20所述的制剂，其中制剂是冻干的并在30℃下至少稳定6个月。
23.根据权利要求20所述的制剂，制剂用稀释剂重建，使得重建制剂中的抗体浓度为约10-30mg/mL，其中重建制剂在2-8℃下至少稳定30天。
24.一种制剂，包含含量为约5-40mg/mL的抗IGE抗体，含量为约80-300mM的蔗糖或海藻糖，缓冲液和表面活性剂。
25.根据权利要求24所述的制剂，它是冻干的并在30℃下至少稳定1年。
CNB961958308A 1995-07-27 1996-07-23 稳定等渗的冻干蛋白制剂 Expired - Lifetime CN1151842C (zh)

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