PT1850874E

PT1850874E - Extensão de tempo até a progressão da doença ou sobrevivência em pacientes com cancro de ovário usando pertuzumab

Info

Publication number: PT1850874E
Application number: PT67358382T
Authority: PT
Inventors: Mika K Derynck; Stephen M Kelsey
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2005-02-23
Filing date: 2006-02-21
Publication date: 2013-12-02
Also published as: JP2012211173A; JP2018135369A; US20140186347A1; DOP2006000052A; SI1850874T1; PL1850874T3; NO20074824L; IL214332A0; US20060188509A1; BRPI0606542A2; JP2014240414A; KR101253576B1; IL184884A0; IL184884A; CR9312A; RU2007135185A; US8691232B2; CN103251946A; AU2006216732A1; EP1850874B1

Description

ΕΡ1850874Β1

DESCRIÇÃO

EXTENSÃO DE TEMPO ATÉ A PROGRESSÃO DA DOENÇA OU SOBREVIVÊNCIA EM PACIENTES COM CANCRO DE OVÁRIO USANDO

PERTUZUMAB

Este pedido reivindica o beneficio do pedido provisório US 60/655.277, depositado em 23 de Fevereiro de 2005.

Campo da Invenção A presente invenção refere-se à extensão de tempo até a progressão da doença ou da sobrevivência num paciente com cancro, onde o cancro do paciente apresente activação de HER, por meio do tratamento do paciente com um inibidor de dimerização de HER, tal como o pertuzumab.

Antecedentes da Invenção

Receptores HER e Anticorpos Contra Estes A família HER de receptores tirosina quinase é formada por importantes mediadores de crescimento, diferenciação e sobrevivência celular. A família destes receptores inclui quatro membros distintos, incluindo o receptor do factor de crescimento epidermal (EGFR, ErbBl, ou HER1), HER2 (ErbB2 ou pl85neu) , HER3 (ErbB3) e o HER4 (ErbB4 ou tyro2). O EGFR, codificado pelo gene do erbBl, tem sido casualmente relacionado com a malignidade em seres humanos. Em particular, o aumento da expressão do EGFR foi observado em cancro de mama, bexiga, pulmão, cabeça e pescoço e estômago bem como em glioblastomas. A expressão aumentada do receptor de EGFR está frequentemente associada com a 1 ΕΡ1850874Β1 produção aumentada do ligando de EGFR, factor de transformação de crescimento alfa (TGF-α), pelas mesmas células tumorais tendo como resultado a activação do receptor por uma via estimuladora autócrina. Baselga e Mendelsohn Pharmac. Ther. 64: 127-154 (1994). Os anticorpos monoclonais contra EGFR ou seus ligandos, TGF-α e EGF, foram avaliados como agentes terapêuticos no tratamento de tais malignidades. Veja-se, por exemplo, Baselga e Mendelsohn, supra; Masui et ai., Câncer Research 44: 1002-1007 (1984); e Wu et ai., J. Clin. Invest. 95: 1897-1905 (1995). O segundo membro da familia HER, pl85neu, foi originalmente identificado como um produto do gene de transformação dos neuroblastomas de ratos quimicamente tratados. A forma activada do proto-oncogene neu resulta de uma mutação pontual (de valina a ácido glutámico) na região transmembrana da proteína codificada. A amplificação do homólogo humano de neu é observada em cancros de mama, ovário e correlaciona-se com um mau prognóstico (Slamon et ai., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon et ai., Science, 244: 707-712 (1989); e Patente US 4.968.603). Até hoje, nenhuma mutação pontual análoga ao proto-oncogene neu foi relatada para tumores humanos. A sobre-expressão de HER2 (frequentemente, mas não uniformemente devido à amplificação do gene) foi também observada em outros carcinomas incluindo carcinomas de estômago, endométrio, glândula salivares, de pulmão, rim, cólon, tiróide, pâncreas e bexiga. Veja-se, entre outros, King et al. , Science, 229: 91 A (1985); Yokota et al. , Lancet: 1: 765- 767 (1986); Fukushige et al., Mol Cell Biol, 6: 955-958 (1986); Guerin et al., Oncogene Res., 3: 21-31 (1988);

Cohen et al., Oncogene, 4: 81-88 (1989); Yonemura et al., Câncer Res., 51: 1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol, 38: 364 (1990); Weiner et al., Câncer Res., 50: 421-425 2 ΕΡ1850874Β1 (1990) ; Kern et ai., Câncer Res., 50: 5184 (1990); Parke et al., Câncer Res., 49: 6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3: 254-257 (1990); Aasland et al., Br. J. Câncer 57: 358-363 (1988); Williams et al., Pathobiology 59: 46-52 (1991) ; e McCann et al. , Câncer, 65: 88-92 (1990). HER2 pode ser sobre-expresso no cancro de próstata (Gu et al., Câncer Lett. 99: 185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol. 28: 827-33 (1997); Ross et al., Câncer 79: 2162-70 (1997); e Sadasivane et al., J. Urol 150: 126-31 (1993)).

Anticorpos direccionados contra as proteínas pl35fieu do rato e HER2 humano foram descritos.

Drebin e colaboradores construíram anticorpos contra o produto do gene pl85fieu do rato, Veja-se, Drebin et al., Cell 41: 695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198: 277-290 (1991); e documento WO 94/22478. Drebin et al., Oncogene 2: 273-277 (1988) relatam que misturas de anticorpos reactivos com duas regiões distintas de pl85neu resultam em efeitos sinergísticos anti-tumorais nas células NTH-3T3 neu-transformadas implantadas em ratinhos nus. Veja-se também, Patente US 5.824.311 emitida em 20 de Outubro de 1998.

Hudziak et ai., Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989) descrevem a geração de um painel de anticorpos HER2 que foi caracterizada usando a linha de células humanas SK-BR-3 de tumor de mama. A proliferação relativa da célula SK-BR-3 após a exposição aos anticorpos foi determinada pela coloração com cristal de violeta na monocamada após 72 horas. Usando este ensaio, a inibição máxima foi obtida com o anticorpo chamado 4D5 que inibiu a proliferação celular em 56%. Outros anticorpos no painel reduziram a proliferação celular em pouca extensão neste ensaio. O anticorpo 4D5 foi adicionalmente encontrado por ser mais 3 ΕΡ1850874Β1 sensível nas linhas de células de tumores de mama que sobre-expressam HER2 aos efeitos citotóxicos do TNF-oí. Veja-se também, Patente US 5.677.171 emitido em 14 de Outubro de 1997. Os anticorpos HER2 discutidos em Hudziak et al. são caracterizados adicionalmente em Fendly et al., Câncer Research 50: 1550-1558 (1990); Kotts et al., In vitro 26(3): 59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation 1: 72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol. 11 (3): 117-127 (1991); Kumar et al., Mol. Cell. Biol. 11(2): 979- 986 (1991); Lewis et al., Câncer Immunol Immunother. 37: 255-263 (1993); Pietras et al., Oncogene 9: 1829-1838 (1994); Vitetta et al., Câncer Research 54: 5301-5309 (1994); Sliwkowski et al. , J. Biol. Chem. 269(20): 14661- 14665 (1994); Scott et al. , J. Biol. Chem. 266: 14300-5 (1991); D'souza et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 91: 7202- 7206 (1994); Lewis et al., Câncer Research 56: 1457- 1465 (1996); e Schaefer et al., Oncogene 15: 1385-1394 (1997).

Uma versão recombinante do anticorpo 4D5 murino humanizado HER2 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, trastuzumab ou HERCEPTIN®; Patente US 5.821.337) é activa clinicamente nos pacientes com cancro de mama metastático que sobre-expressa HER2 que receberam extensiva terapêutica anti- cancro previamente (Baselga et al., J. Clin. Oncol 1A:131-1AA (1996). O Trastuzumab recebeu a aprovação para ser comercializado pelo FDA em 25 de Setembro de 1998 para o tratamento de pacientes com tumores de mama metastáticos que sobre-expressam a proteína HER2.

Outros anticorpos HER2 com várias propriedades foram descritos em Tagliabue et al., Int. J. Câncer 47: 933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene 4: 543-548 (1989); Maier et al., Câncer Res. 51: 5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis 3: 350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991); Bacus et al., Câncer 4 ΕΡ1850874Β1

Research 52: 2580 - 2589 (1992); Xu et al., Int. J. Câncer 53: 401-408 (1993); documento WO 94/00136; Kasprzyk et al., Câncer Research 52: 2771-2776 (1992); Hancock et al., Câncer Res. 51: 4575-4580 (1991); Shawver et al., Câncer Res. 54: 1367- 1373 (1994); Arteaga et al., Câncer Res. 54: 3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chern. 267: 15160-15167 (1992); Patente US n° 5.783.186; e Klapper et al., Oncogene 14: 2099-2109 (1997). A selecção da homologia resultou na identificação de dois outros membros da família dos receptores HER; HER3 (Patentes US n° 5.183.884 e 5.480.968, bem como em Kraus et al., PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989)) e HER4 (pedido de Patente EP 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 1746-1750 (1993); e Plowman et al., Nature, 366: 473-475 (1993)). Ambos receptores apresentam aumento na expressão em algumas linhas de células de cancro de mama.

Os receptores HER são geralmente encontrados em várias combinações em células e acredita-se que a heterodimerização aumenta a diversidade das respostas celulares numa variedade de ligandos HER (Earp et al., Breast Câncer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). EGFR pode ser ligado por seis ligandos diferentes; factor de crescimento epidermal (EGF), Factor de transformação de crescimento alfa (TGF-α), anfiregulina, heparina ligada ao factor de crescimento epidermal (HB-EGF), betacelulina e epirregulina (Groenen et al., Growth Factors 11: 235-257 (1994) ) . Uma família das proteínas heregulinas que resultam de um splice alternativo de um único gene é ligando para HER3 e HER4. A família da heregulina inclui as heregulinas alfa, beta e gama (Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992); Patente US 5.641.869; e Schaefer et al., Oncogene 15: 1385-1394 (1997)); factores de diferenciação de neu (NDFs), factores de crescimento glial (GGFs); indutor de 5 ΕΡ1850874Β1 actividade do receptor de acetilcolina (ARIA); e o factor derivado de neurónio sensor e motor (SMDF). Para uma revisão, veja-se, Groenen et al., Growth Factors 11: 235- 257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7: 247-262 (1996) e Lee et al., Pharm. Rev. 47: 51-85 (1995).

Recentemente três adicionais ligandos de HER foram identificados; neuregulina-2 (NRG-2) que foi relatada por ligar a HER3 ou HER4 (Chang et al., Nature 387 509-512 (1997) ; e Carraway et al., Nature 387: 512-516 (1997)); neuregulina-3 que se liga a HER4 (Zhang et al., PNAS (USA) 94(18): 9562-7 (1997)); e neuregulina-4 que liga HER4 (Harari et al., Oncogene 18: 2681-89 (1999)) HB-EGF, betacelulina e epiregulina também se ligam a HER4.

Enquanto EGF e TGFa não se ligam a HER2, EGF estimula o EGFR e HER2 para formar um heterodímero, que activa EGFR e resulta na transfosforilação do HER2 em heterodímero. A dimerização e/ou transfosforilação parecem activar a tirosina quinase HER2. Veja-se, Earp et al., supra. Da mesma forma, quando HER3 é co-expresso com HER2, um complexo activo de sinalização é formado e anticorpos contra HER2 são capazes de romper este complexo (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)).

Adicionalmente, a afinidade do HER3 para a heregulina (HRG) é aumentada para um estado de alta afinidade quando está é co-expressa com HER2. Veja-se também, Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 1431-1435 (1995); e Lewis et al., Câncer Res., 56: 1457-1465 (1996) em relação ao complexo proteico HER2- HER3. HER4, assim como HER3, formam um complexo de sinalização activo com HER2 (Carraway e Cantley, Cell 78: 5-8 (1994)).

Publicações de patentes relacionadas com anticorpos HER incluem: US 5.677.171, US 5.720.937, US 5.720.954, US 6 ΕΡ1850874Β1 5.725.856, US 5.770.195, US 5.772.997, US 6.165.464, US 6.387.371, US 6.399.063, US 2002/0192211A1, US 6.015.567, US 6.333.169, US 4.968.603, US 5.821.337, US 6.054.297, US 6.407.213, US 6.719.971, US 6.800.738, US2004/0236078A1, US 5.648.237, US 6.267.958, US 6.685.940, US 6.821.515, WO 98/17797, US 6.127.526, US 6.333.398, US 6.797.814, US 6.339.142, US 6.417.335, US 6.489.447, WO 99/31140, US2003/0147884A1, US2003/0170234A1, US2005/0002928A1, US 6.573.043, US2003/0152987AI, WO 99/48527, US2002/0141993A1, WO 01/00245, US2003/0086924, US2004/0013667A1, WO 00/69460, WO 01/00238, WO 01/15730, US 6.627.196B1, US6.632.979B1, WO 01/00244, US2002/0090662A1, WO 01/89566, US2002/0064785, US2003/0134344, WO 04/24866, US2004/0082047, US2003/0175845A1, WO 03/087131, US2003/0228663, WO 2004/008099A2, US2004/0106161, WO 2004/048525, US2004/0258685A1, US 5.985.553, US 5.747.261, US 4.935.341, US 5.401. 638, US 5.604.107, WO 87/07646 , WO 89/10412, WO 91/05264, EP · 412.116 Bl, EP 494.135 BI, US 5.824.311, EP 444.181 Bl, EP 1.006.194 A2, US 2002/0155527A1, WO 91/02062, US 5.571.894, US ! 5.939.531, EP 502.812 BI, WO 93/03741, EP ! 554.441 BI, EP 656.367 Al, US 5.288.477, US 5.514.554 , US 5.587.458, WO 93/12220, WO 93/16185, US 5.877.305 , WO 93/21319, WO 93/21232, US 5.856.089, WO 94/22478, US 5.910.486, US 6.028.059, WO 96/07321, US 5.804.396 , US 5.846.749, EP 711.565, WO 96/16673, US 5.783.404 , US 5.977.322, US 6.512.097, WO 97/00271, US 6.270.765 , US 6.395.272, US 5.837.243, WO 96/40789, US 5.783.186 , US 6.458.356, WO 97/20858, WO 97/38731, US 6.214.388 , US 5.925.519, WO 98/02463, US 5.922.845, WO 98/18489, WO 98/33914, US 5.994.071, WO 98/45479, US 6.358.682 Bl, US 2003/0059790 , WO 99/55367, WO 01/20033, US 2002/0076695 Al, WO 00/78347, WO 01/09187, WO 01/21192, WO 01/32155, WO 01/53354, WO 01/56604, WO 01/76630, WO 02/05791, WO 1 02/11677, US 6. 582.919, US2002/0192652A1, US 2003/0211530A1 , WO 02/44413, US 2002/0142328, • US 6.602. 670 7 ΕΡ1850874Β1 Β2, WO 02/45653, WO 02/055106, US 2003/0152572, US 2003/0165840, WO 02/087619, WO 03/006509, WO 03/012072, WO 03/028638, US 2003/0068318, WO 03/041736, EP 1.357.132, US 2003/0202973, US 2004/0138160, US 5.705.157, US 6.123.939, EP616.812B1, US 2003/0103973, US 2003/0108545, US 6.403.630 Bl, WO 00/61145, WO 00/61185, US 6.333.348 Bl, WO 01/05425, WO 01/64246, US 2003/0022918, US 2002/0051785 Al, US 6.767.541, WO 01/76586, US 2003/0144252, WO 01/87336, US 2002/0031515 Al, WO 01/87334, WO 02/05791, WO 02/09754, US 2003/0157097, US 2002/0076408, WO 02/055106, WO 02/070008, WO 02/089842 e WO 03/86467.

Diagnósticos

Os pacientes tratados com o anticorpo para HER2 trastuzumab são seleccionados para a terapêutica baseada na sobre-expressão/amplificação de HER2. Veja-se, por exemplo, documento WO 99/31140 (Paton et ai.), Patente US2003/0170234A1 (Hellmann, S.), e US2003/0147884 (Paton et al.)} bem como, WO 01/89566, US2002/0064785, e US2003/0134344 (Mass et al.). Veja-se, também, US2003/0152987, Cohen et al., dizendo respeito à imunohistoquimica (IHC) e hibridação fluorescente in situ (FISH) para a detecção da sobre-expressão e amplificação de HER2 . O documento WO 2004/053497 e Patente US2004/024815A1 (Bacus et ai.), bem como, a patente US 2003/0190689 (Crosby e Smith), refere-se à determinação ou predição da resposta à terapêutica de trastuzumab. US2004/013297A1 (Bacus et al.) relaciona-se a determinação à predição da resposta a terapêutica com anticorpo para EGFR ABX0303. O documento WO 2004/000094 (Bacus et al.) é direccionado para determinar a resposta ao GW572016, uma molécula pequena, inibidora da tirosina quinase EGFR-HER2. O documento WO 2004/063709, 8 ΕΡ1850874Β1

Amler et al., refere-se à biomarcadores e métodos para determinar a sensibilidade ao inibidor de EGFR, erlotinib HC1. A Patente US2004/0209290, Cobleigh et al., refere-se a marcadores da expressão génica para o prognóstico do cancro de mama. Pacientes tratados com pertuzumab podem ser seleccionados para terapêutica baseada na activação ou dimerização de HER. As publicações de Patentes dizendo respeito ao pertuzumab e a selecção de pacientes para terapêutica com este incluem: Documentos WO 01/00245 (Adams et al.)·, US2003/0086924 (Sliwkowski, M.); US2004/0013667A1 (Sliwkowski, M.); bem como, WO 2004/008099A2, e US2004/0106161 (Bossenmaier et al.).

Cronin et al. , Am. J. Path. 164(1): 35-42 (2004) descreve a mensuração da expressão do gene em tecidos embebidos em parafina de arquivos. Ma et al., Câncer Cell 5: 607-616 (2004) descrevem o perfil do gene usando o microarranjo de oligonucleótidos de genes utilizando o ARN isolado de cortes de tecido de tumores colhidos para o arquivo de biópsias primárias.

Pertuzumab (também conhecido como anticorpo humano monoclonal 2C4; OMNTTARG™, Genentech, Inc, South San Francisco) representa o primeiro numa nova classe de agentes conhecidos como inibidores de dimerização de HER (HDI) e as funções por inibir a habilidade do HER2 de formar heterodimeros activos com outros receptores HER (tais como EGFR/HERI, HER3 e HER4) e são activos não relacionados aos niveis da expressão de HER2. Veja-se, por exemplo, Harari e Yarden Oncogene 19: 6102-14 (2000); Yarden e Sliwkowski. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 127-37 (2001); Sliwkowski Nat Struct Biol 10: 158-9 (2003); Cho et al., Nature 421: 756-60 (2003); e Malik et al., Pro Am Soc Câncer Res 44: 176-7 (2003). 9 ΕΡ1850874Β1 0 Pertuzumab, bloqueador da formação de heterodímeros de HER2- HER3 em células de tumor foi demonstrado por inibir a sinalização celular critica, que resulta na proliferação e na sobrevivência reduzida do tumor (Agus et al., Câncer Cell 2: 127-37 (2002)). O Pertuzumab foi submetido a testes como único agente numa clinica com experimentação fase Ia em pacientes com cancro avançado e experimentações fase II em pacientes com cancro de ovário e cancro de mama bem como em cancro de pulmão e próstata. Num estudo fase I, pacientes com tumores incuráveis, localmente avançados, recidivados ou metástases de tumores sólidos que tinham progredido durante ou depois da terapêutica padrão foram tratados com pertuzumab, administrado intravenosamente a cada 3 semanas. O Pertuzumab foi geralmente bem tolerado. A regressão do tumor foi obtida em 3 de 20 pacientes avaliados para a resposta. Dois pacientes tinham confirmado respostas parciais. A doença estável que dura por mais de 2,5 meses foi observada em 6 de 21 pacientes (Agus et al., Pro Am Soc Clin Oncol 22: 192 (2003)). Nas dosagens de 2,0-15 mg/kg, a farmacocinética do pertuzumab foi linear, e a média da depuração de 2,69 a 3,74 ml/dia/kg e a semivida terminal média de eliminação foi de cerca de 15,3 a 27,6 dias. Anticorpos para pertuzumab não foram detectados (Allison et al., Pro Am Soc Clin Oncol 22: 197 (2003)).

Sumário da invenção A presente invenção proporciona dados clínicos de pacientes humanos com cancro tratados com um inibidor de dimerização de HER, pertuzumab. Os pacientes foram avaliados pela activação de HER, determinado pela utilização de um bioensaio fosfo-ELISA. Os benefícios clínicos, como mensurado pelo tempo até a progressão da 10 ΕΡ1850874Β1 doença (TAP) e sobrevivência, foram observados em pacientes que apresentaram activação de HER.

Consequentemente, a invenção refere-se à utilização de um inibidor de dimerização de HER para estender o tempo até a progressão da doença (TAP) ou sobrevivência de um paciente com cancro em que um inibidor de dimerização de HER é administrado ao paciente numa quantidade que estende o TAP ou sobrevivência do paciente, em que o cancro do paciente apresenta activação de HER. A invenção também se refere à utilização de pertuzumab para estender o tempo até a progressão da doença (TAP) ou sobrevivência de um paciente com cancro do ovário, peritónio ou trompa de Falópio em que pertuzumab é administrado ao paciente numa quantidade que estende o TAP ou sobrevivência do paciente, em que o cancro do paciente apresenta activação de HER2. A presente invenção proporciona pertuzumab para utilização num método para estender o tempo até a progressão da doença ou sobrevivência de um paciente com cancro, como definido nas reivindicações.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 proporciona um diagrama esquemático da estrutura da proteína HER2, e das sequências de aminoácidos para os Domínios I-IV (SEQ ID n° 19-22, respectivamente) do domínio extracelular deste.

As figuras 2A e 2B descrevem alinhamentos das sequências de aminoácidos dos domínios variável leve (VL) (Fig. 2A) e variável pesado (VH) (Fig. 2B) do anticorpo monoclonal murino 2C4 (SEQ ID n° 1 e 2, 11 ΕΡ1850874Β1 respectivamente); Domínios VL e VH do variante 574/pertuzumab (ID SEQ no. 3 e 4, respectivamente), e estruturas do consenso humano de VL e VH (hum Kl, leve Capa subgrupo I; humIII, subgrupo pesado III) (SEQ ID n° 5 e 6, respectivamente). Os asteriscos identificam diferenças entre os domínios variáveis do pertuzumab e anticorpo murino monoclonal 2C4 ou entre os domínios variáveis do pertuzumab e da estrutura humana. A complementaridade que determina regiões (CDRs) está entre colchetes.

As figuras 3A e 3B mostram as sequências de aminoácidos de cadeia leve do pertuzumab (Fig 3A; SEQ ID N°. 13) e cadeia pesada (Fig. 3B; SEQ ID n° 14). Os CDRs são mostrados em negrito (realce). A massa molecular calculada da cadeia leve e da cadeia pesada são de 23.526.22 D e 49.216.56 D (cisteínas na forma reduzida). A fracção do hidrato de carbono é ligada ao Asn 299 da cadeia pesada. A Figura 4 descreve, esquematicamente, a ligação do 2C4 no local de ligação heterodimérico do HER2, impedindo desse modo a heterodimerização com o EGFR ou o HER3 activado. A Figura 5 descreve o acoplamento de HER2/HER3 a via da MAPK e Akt. A Figura 6 compara várias actividades do trastuzumab e do pertuzumab.

As Figuras 7A e 7B mostram as sequências do aminoácido de cadeia leve do trastuzumab (Fig. 7A; SEQ ID n° 15) e cadeia pesada (Fig. 7B; SEQ ID n° 16), respectivamente. 12 ΕΡ1850874Β1

As Figuras 8A e 8B descrevem uma sequência da cadeia leve de um variante de pertuzumab (Fig. 8A; SEQ ID n° 17) e uma sequência da cadeia pesada de um variante de pertuzumab (Fig. 8B; SEQ ID n° 18), respectivamente. A Figura 9 proporciona demográficos de linha de base de pacientes tratados no Exemplo 1. A Figura 10 mostra todos os eventos adversos de grau 3-4 (independente da relação com o tratamento). A Figura 11 mostra eventos adversos sérios (independentes ou relacionados com o tratamento). A Figura 12 sumariza eventos adversos sérios julgados como sendo relacionados com fármaco de estudo pelos investigadores. A Figura 13 proporciona informação sobre eventos adversos seleccionados. A Figura 14 representa eventos adversos cardíacos sérios e eventos adversos que requerem relatório imediato. A Figura 15 sumariza resultados de eficácia para o estudo de fase II de pertuzumab no Exemplo 1. A Figura 16 demonstra a eficácia do tempo até a progressão da doença (TAP) para a avaliação de paciente com cancro de ovário tratados com uma dose baixa (420 mg) ou dose elevada (1050 mg) de pertuzumab. A Figura 17 demonstra a eficácia da sobrevivência 13 ΕΡ1850874Β1 total de pacientes avaliados com cancro de ovário tratados com dose baixa (420 mg) ou dose elevada (1050 mg) de pertuzumab. A sobrevivência mediana histórica para os pacientes com cancro de ovário tratados com topotecano era de 43 semanas, e para a doxorrubicina lipossomal era de 36 semanas. A Fig. 18 proporciona respostas de CA-125 para indivíduos com cancro do ovário tratados com 420 mg ou 1050 mg de pertuzumab. A Fig. 19 proporciona status de fosfo-HER2 (pHER2), como determinado por ELISA, para indivíduos com cancro do ovário tratados com 420 mg de pertuzumab. A Fig. 20 proporciona resultados de eficácia clínica por status de pHER2, como determinado por ELISA, para indivíduos com cancro do ovário tratados com 420 mg de pertuzumab. A Fig. 21 proporciona status de pHER2, como determinado por ELISA, para pacientes com cancro de ovário tratados com 420 mg de pertuzumab que mostram evidência de actividade (resposta parcial, RP, ou doença estável, DE, durante mais de 18 semanas) . BSLD refere-se à soma da linha de base de diâmetro mais longo. A Figura 22 mostra a eficácia do TAP pelo status de pHER2. Os pacientes com cancro de ovário foram tratados com 420 mg do pertuzumab. O TAP total foi de 6,6 semanas; TAP em pacientes com pHER positivo foi de 20,9 semanas; TAP nos pacientes pHER2 negativo foi de 6,0 semanas; e TAP nos pacientes com o status de pHER2 desconhecido foi de 9,1 semanas. 14 ΕΡ1850874Β1 A Figura 23 representa a sobrevivência total pelo status de pHER2. Os pacientes com cancro de ovário foram tratados com 420 mg de pertuzumab. A sobrevivência mediana histórica para os pacientes com cancro de ovário tratados com topotecano era de 43 semanas, e para doxorrubicina lipossomal era de 36 semanas.

Descrição Pormenorizada das Formas de Realização Preferidas I. Definições

No presente documento, o "tempo até a progressão da doença" ou "TAP" refere-se ao tempo, medido geralmente em semanas ou meses, da época do tratamento inicial (por exemplo, com inibidor de dimerização de HER, tal como o pertuzumab), até que o cancro progrida ou piore. Tal progressão pode ser avaliada pelo clinico hábil. No cancro de ovário, por exemplo, a progressão pode ser avaliada pelo RECIST (Critérios de Avaliação da Resposta em Tumores Sólidos) (Veja-se, por exemplo, Therasse et al., J. Nat. Câncer Inst. 92(3): 205-216 (2000)). "Estender o TAP" significa aumentar o tempo até a progressão da doença num paciente tratado em comparação com um paciente não tratado (isto é, em comparação com um paciente não tratado com inibidor de dimerização de HER, tal como o pertuzumab) , ou em comparação com um paciente que não apresente activação de HER, e/ou em comparação com um paciente tratado com um agente anti-tumoral aprovado (tal como o topotecano ou a doxorrubicina lipossomal, onde o cancro é cancro de ovário). A "sobrevivência" refere-se ao paciente que permanece vivo, e inclui a sobrevivência global, bem como a 15 ΕΡ1850874Β1 sobrevivência livre de progressão. "Sobrevivência global" refere-se ao paciente gue permanece vivo por um período de tempo definido, tal como 1 ano, 5 anos, etc. A partir da época do diagnóstico ou tratamento. "Sobrevivência livre de progressão" refere-se ao paciente vivo, sem a progressão do cancro ou inicio da piora.

Por "estendendo a sobrevivência" significa aumentar a sobrevivência global ou a sobrevivência livre de progressão num paciente tratado em comparação com um paciente não tratado (isto é, em comparação com um paciente não tratado com inibidor de dimerização de HER, tal como o pertuzumab), ou em comparação com um paciente que não apresente activação de HER, e/ou em comparação com um paciente tratado com um agente anti-tumoral aprovado (tal como o topotecano ou a doxorrubicina lipossomal, onde o cancro é cancro de ovário).

Uma "resposta objectiva" refere-se a uma resposta mensurável, incluindo a resposta completa (RC) ou a resposta parcial (RP).

Por "resposta completa" ou "RC" é entendido o desaparecimento de todos os sinais do cancro em resposta ao tratamento. Isto não significa sempre que o cancro esteja curado. A "resposta parcial" ou "RP" refere-se a uma diminuição no tamanho de um ou mais tumores ou lesões, ou na extensão do cancro no corpo, em resposta ao tratamento. 16 ΕΡ1850874Β1

Um "receptor HER" é um receptor proteína tirosina quinase que pertence à família do receptor HER e incluí os receptores EGFR, HER2, HER3 e HER4. 0 receptor HER compreenderá geralmente de um domínio extracelular, que possa se ligar ao ligando HER e/ou dimerize com outra molécula de receptor HER; um domínio transmembrana lipofílico; um domínio tirosina quinase intracelular conservada; e um domínio sinalizador carboxi- terminal que abriga diversos resíduos de tirosina que pode ser fosforilada. 0 receptor HER pode ser um "sequência nativa" de receptor HER ou uma "sequência de aminoácidos variante" deste. Preferivelmente o receptor HER é uma sequência humana nativo de receptor HER.

Os termos "ErbB 1," "HER1", "receptor de factor de crescimento epidemial" e "EGFR" são usados permutavelmente no presente e referem-se a EGFR como divulgado, por exemplo, em Carpenter et al., Ann. Rev. Biochem. 56: 881-914 (1987), incluindo as formas mutantes naturais deste (por exemplo, uma deleção mutante de EGFR como em Humphrey et al., PNAS (USA) 87: 4207-4211 (1990)). O erbBl refere-se ao gene que codifica o produto da proteína EGFR.

As expressões "ErbB2" e "HER2" são usadas permutavelmente no presente e referem-se à proteína HER2 humana descrita, por exemplo, em Semba et al., PNAS (USA) 82: 6497-6501 (1985) e Yamamoto et al., Nature 319: 230-234 (1986) (número de acesso do Genebank X03363). O termo "erbB2" refere-se ao gene que codifica o ErbB2 humano e "neu" refere-se ao gene que codifica o pl85neu do rato. O HER2 preferido é o da sequência nativa HER2 humana.

No presente documento, "domínio extracelular de HER2" ou "HER2 ECD" refere-se a um domínio de HER2 que está fora de uma célula, ancorada à membrana da célula, ou na 17 ΕΡ1850874Β1 circulação, incluindo fragmentos deste. Numa forma de realização, o domínio extracelular de HER2 pode compreender de quatro domínios: "Domínio I" (resíduos de aminoácido de aproximadamente 1- 195; SEQ ID N°: 19), "Domínio II" (resíduos de aminoácido de aproximadamente 196-319; SEQ ID N°: 20), "Domínio III" (resíduos de aminoácido de aproximadamente 320-488: SEQ ID N° : 21), e "Domínio IV" (resíduos de aminoácido de aproximadamente 489-630; SEQ ID N°: 22) (a numeração do resíduo sem péptido de sinal) . Veja-se Garrett et al., Mol. Cell. 11: 495-505 (2003), Cho et al. Nature 411: 756-760 (2003), Franklin et al., Câncer Cell 5: 317-328 (2004), e Plowman et al. Proc. Natl. Acad. Sei. 90: 1746-1750 (1993), bem como, a Figura 1 no presente documento. "ErbB3" e "HER3" referem-se aos polipéptidos do receptor como divulgado, por exemplo, na Patente US 5.183.884 e US 5.480.968 bem como em Kraus et al., PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989).

Os termos "ErbB4" e "HER4" referem-se no presente ao polipéptido do receptor como divulgado, por exemplo, no pedido de patente EP 599,274; Plowman et al., Pnoc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 1746-1750 (1993); e Plowman et al., Nature, 366: 473-475 (1993), incluindo isoformas deste, por exemplo, como revelado no documento WO 99/19488, publicado em 22 de Abril de 1999. "Ligando de HER" significa um polipéptido que se liga a e/ou activa o receptor HER. O ligando de HER de interesse particular no presente documento é uma sequência humana nativa de ligando de HER, tal como o factor de crescimento epidermal (EGF) (Savage et al. J. Biol. Chem. 247: 7 612-7621 (1972)); factor de transformação de crescimento alfa (TGF-oí) (Marquardt et al. Science 223: 1079-1082 (1984)); 18 ΕΡ1850874Β1 anfiregulina também conhecida como schwanoma ou factor de crescimento autócrino de queratinócito (Shoyab et al. Science 243: 1074-1076 (1989); Kimura et al. Nature 348: 257-260 (1990); e Cook et al. Mol. Cell. Biol. 11: 2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing et al. Science 259: 1604-1607 (1993); e Sasada et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190: 1173 (1993)); factor de crescimento epidermal ligado a heparina (HB-EGF) (Higashiyama et ai. Science 251: 936-939 (1991) ); epiregulina (Toyoda et ai. J. Biol. Chem. 270: 7495-7500 (1995); e Komurasaki et al. Oncogene 15: 2841-2848 (1997)); heregulina a (veja-se a seguir); neuregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al. Nature 387: 512-516 (1997)); neuregulina-3 (NRG-3) (Zhang et al. Proc. Natl. Acad. Sei. 94: 9562-9567 (1997)); neuregulina-4 (NRG-4) (Harari et al. Oncogene 18: 2681-89 (1999)); e cripto (RC-1) (Kannan et al. J. Biol. Chem. 272(6): 3330-3335 (1997)). Os ligandos de HER que se ligam a EGFR incluem EGF, TGF-a, anfiregulina, betacelulina, HB-EGF e epiregulina. Os ligandos de HER que se ligam a HER3 incluem heregulinas. Os ligandos de HER capazes de ligarem-se a HER4 incluem betacelulina, epiregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4, e heregulinas. "Heregulina" (HRG) quando utilizado no presente refere-se a um polipéptido codificado pelo produto do gene da heregulina como divulgado na Patente US 5.641.869, ou Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993). Exemplos de heregulinas incluem a heregulina-a, heregulina-βΐ, heregulina^2 e heregulina^3 (Holmes et al. , Science, 256: 1205-1210 (1992); e Patente US 5.641.869); O factor de diferenciação neu (NDF) (Peles et al., Cell 69: 205-216 (1992) ); indutor de actividade do receptor de acetilcolina (ARIA) (Falis et al. , Cell 72: 801-815 (1993)); factor de crescimento glial (GGFs) (Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)); factor derivado de neurónio motor e sensor 19 ΕΡ1850874Β1 (SMDF) (Ho et al., J. Biol. Chem. 270: 14523-14532 (1995)); γ-heregulina (Schaefer et al., Oncogene 15: 1385-1394 (1997)). "Dímero de HER" é no presente documento um dímero não covalente associado que contém pelo menos dois receptores HER. Tais complexos podem ser formados quando uma célula que expressa dois ou mais receptores HER é exposta a ligando de HER e pode ser isolada por imunoprecipitação e analisada por SDS-PAGE como descrito em Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994), por exemplo. Outras proteínas, tais como uma subunidade do receptor de citocina (por exemplo, gpl30) pode estar associada com o dimero. Preferivelmente, o dímero de HER compreende o HER2.

Um "heterodímero de HER" é no presente documento um heterodímero não covalente associado que consta de pelo menos dois receptores HER diferentes, tais como os heterodímeros EGFR-HER2, HER2-HER3 ou HER2-HER4. "Inibidor de HER" é um agente que interfere com a activação ou função de HER. Exemplos de inibidores de HER incluem anticorpos HER (por exemplo, EGFR, HER2, HER3, ou HER4); fármacos contra EGFR; moléculas pequenas de antagonistas de HER; inibidores de tirosina quinase de HER; inibidores duplos de tirosina quinase de HER2 e EGFR, tais como lapatinib/GW572016; moléculas antissense (veja-se, por exemplo, documento WO 2004/87207); e/ou os agentes a que se ligam, ou interferem com a função das moléculas sinalizadoras a jusante, tais como MAPK ou Akt (veja-se, Fig. 5). Preferivelmente, o inibidor HER é um anticorpo ou pequena molécula que se liga ao receptor HER.

Um "inibidor de dimerização de HER" é um agente que inibe a formação de um dímero de HER ou heterodímero de 20 ΕΡ1850874Β1 HER. Preferivelmente, o inibidor de dimerização de HER é um anticorpo que se liga, por exemplo, a HER2 no local de ligação heterodimérico deste. 0 inibidor de dimerização de HER mais preferido no presente documento é o pertuzumab ou o MAb 2C4. A ligação do 2C4 ao local de ligação heterodimérico de HER2 está ilustrada na Fig. 4. Outros exemplos de inibidores de dimerização de HER incluem anticorpos que se ligam a EGFR e inibem a dimerização destes com um ou o mais receptores HER (por exemplo, Anticorpo monoclonal 806 de EGFR, o MAb 806, que se liga ao EGFR activado ou "livre"; veja-se, Johns et al., Biol Chem. 279(29): 30375- 30384 (2004). Anticorpos que se ligam a HER3 e inibem a dimerização deste com um ou mais receptores HER; anticorpos que se ligam ao HER4 e inibem a dimerização deste com um ou mais receptores HER; Inibidores de dimerização de péptidos (Patente US 6.417.168); inibidores de dimerização antissense; etc.

Um "inibidor de dimerização de HER2" é um agente que inibe a formação de um dimero ou um heterodímero que conste do HER2.

Um "anticorpo HER" é um anticorpo que se liga ao receptor HER. Opcionalmente, o anticorpo HER interfere adicionalmente com a activação ou função do HER. Preferivelmente, o anticorpo HER se liga ao receptor HER2. Um anticorpo HER2 de interesse particular no presente documento é o pertuzumab. Um outro exemplo de anticorpo HER2 é o trastuzumab. Os exemplos de anticorpos de EGFR incluem o cetuximab e ο ABX0303. "Activação de HER" refere-se a activação, ou fosforilação, de qualquer um ou mais receptores HER. Geralmente, a activação de HER resulta na transdução de sinal (por exemplo, causado por um dominio quinase 21 ΕΡ1850874Β1 intracelular da fosforilação de resíduos de tirosina do receptor HER ou um substrato polipeptídico). A activação de HER pode ser mediada por ligando de HER que se liga ao dímero de HER que contém o receptor HER de interesse. 0 ligando de HER que se liga ao dímero de HER pode activar um domínio quinase de um ou mais receptores HER no dímero resultando desse modo na fosforilação de resíduos de tirosina num ou mais receptores HER e/ou fosforilação de resíduos de tirosina em polipéptido (s) de substrato (s) adicional(ais), tais como Akt ou quinase intracelulares da MAPK, veja-se, por exemplo, Fig. 5. "Fosforilação" refere-se à adição de um ou mais grupos de fosfato a uma proteína, tal como o receptor HER, ou um substrato deste.

Um anticorpo que "inibe a dimerização de HER" é um anticorpo que inibe, ou interfere com a formação de um dímero de HER. Preferivelmente, tal anticorpo inibe a dimerização de HER se liga, por exemplo, a HER2 no local de ligação heterodimérico deste. 0 anticorpo inibidor de dimerização de HER mais preferido no presente documento é o pertuzumab ou o MAb 2C4. A ligação do 2C4 ao local de ligação heterodimérico de HER2 está ilustrada na Fig. 4. Outros exemplos de anticorpo que inibem a dimerização de HER incluem anticorpos que se ligam a EGFR e inibem a dimerização destes com um ou o mais receptores HER (por exemplo, Anticorpo monoclonal 80 6 de EGFR, o MAb 80 6, que se liga ao EGFR activado ou "livre"; veja-se, Johns et al., Biol Chem. 279(29): 30375- 30384 (2004). Anticorpos que se ligam a HER3 e inibem a dimerização deste com um ou mais receptores HER; anticorpos que se ligam ao HER4 e inibem a dimerização deste com um ou mais receptores HER.

Um anticorpo que "bloqueia a activação ligando do 22 ΕΡ1850874Β1 receptor HER mais eficazmente do que o trastuzumab" é aquele que reduz ou elimina a activação do ligando de HER do receptor HER ou do dímero de HER mais eficazmente (por exemplo, pelo menos cerca de 2 vezes mais eficaz) do que o trastuzumab. Preferivelmente, tal anticorpo bloqueia a activação do ligando de HER do receptor HER pelo menos tão eficazmente quanto o anticorpo monoclonal murino 2C4 ou um fragmento Fab deste, ou como pertuzumab ou um fragmento Fab deste. Pode-se avaliar a habilidade de um anticorpo em bloquear a activação ligando do receptor HER estudando directamente os dimeros de HER, ou avaliando a activação de os dimeros de HER, ou a sinalização a jusante, que resulta da dimerização de HER, e/ou pela avaliação do local de ligação do anticorpo- HER2, etc. Ensaios para seleccionar anticorpos com a habilidade de inibir mais eficazmente a activação ligando do receptor HER mais eficazmente do que o trastuzumab está descrito em Agus et al., Câncer Cell 2: 127-137 (2002) e documento WO 01/00245 (Adams et al.). Apenas como exemplo, pode-se realizar um ensaio para: inibição da formação de dimero de HER (veja-se, por exemplo, Fig. 1A-B de Agus et al., Câncer Cell 2: 127-137 (2002); e documento WO 01/00245); redução na activação de ligando de HER de células que expressam dimeros de HER (documento WO 01/00245 e Fig. 2A-B de Agus et al., Câncer Cell 2: 127-137 (2002), por exemplo); bloqueio de ligando de HER ligado a células que expressam dimeros de HER (documento WO 01/00245, e Fig. 2E de Agus et al., Câncer Cell 2: 127-137 (2002)); inibição do crescimento celular de células de cancro (por exemplo, células MCF7, MDA-MD-134, ZR-75-1, MD-MB-175, T-47D) que expressam dimeros de HER na presença (ou na ausência) de ligando de HER (documento WO 01/00245 e Fig. 3A-D de Agus et al., Câncer Cell 2: 127-137 (2002), por exemplo); inibição da sinalização a jusante (por exemplo, inibição da fosforilação de AKT dependente de HRG ou inibição da fosforilação de MAPK dependente de HRG- 23 ΕΡ1850874Β1 ou TGF-α) (veja-se, documento WO 01/00245, e Fig. 2C-D de Agus et ai., Câncer Cell 2: 127-137 (2002), por exemplo). Pode-se também avaliar se o anticorpo inibe a dimerização de HER estudando o local de ligação do anticorpo-HER2, por exemplo, pela avaliação da estrutura ou modelo, tal como uma estrutura de cristal, da ligação do anticorpo ao HER2 (veja-se, por exemplo, Franklin et al., Câncer Cell 5: 317-328 (2004)).

Um "local de ligação heterodimérico" em HER2, refere-se a uma região no domínio extracelular de HER2 que está em contacto, ou em interface com uma região do domínio extracelular do EGFR, HER3 ou HER4 formando um dímero a partir deste. A região é encontrada no Domínio II de HER2. Franklin et al. Câncer Cell 5: 317-328 (2004). O anticorpo HER2 pode "inibir a fosforilação de AKT dependente de HRG" e/ou inibir a "fosforilação de MAPK dependente de TGFa ou HRG" mais eficazmente (por exemplo, pelo menos 2 vezes mais eficaz) do que o trastuzumab (veja-se, Agus et al. Câncer Cell 2: 127-137 (2002) e documento WO 01/00245, por exemplo). O anticorpo HER2 pode ser aquele que, como o pertuzumab, "não inibe a clivagem do ectodomínio de HER2" (Molina et ai. Câncer Res. 61: 4744-4749(2001)). Trastuzumab, por outro lado, pode inibir a clivagem do ectodomínio de HER2.

Um anticorpo HER2 que "se liga a um local de ligação heterodimérico" de HER2, liga-se aos resíduos no Domínio II (e opcionalmente liga-se também aos resíduos de outros domínios extracelular de HER2, tais como os domínios I e III), e pode impedir estericamente, pelo menos em alguma extensão, a formação de um heterodímero de HER2-EGFR, HER2- 24 ΕΡ1850874Β1 HER3, ou HER2-HER4. Franklin et al. Câncer Cell 5: 317-328 (2004) caracterizam a estrutura de cristal de HER2-pertuzumab, depositada com o banco de dados de proteína RCSB (código de ID IS78), ilustrando um anticorpo exemplar que se liga ao local de ligação heterodimérica de HER2.

Um anticorpo que "liga ao Domínio II" de HER2 liga aos resíduos no Domínio II e opcionalmente aos resíduos em outros domínios de HER2, tais como domínios I e III. Preferivelmente o anticorpo que liga ao Domínio II liga à junção entre os domínios I, II e III de HER2. A "expressão" de proteína refere-se à conversão da informação codificada num gene de ARN mensageiro (ARNm) à proteína.

No presente documento, uma amostra ou célula que "expresse" uma proteína de interesse (tal como o receptor HER ou ligando de HER) é aquela em que o ARNm que codifica a proteína, ou a proteína, incluindo fragmentos destes, é determinado por estar presente na amostra ou célula. A técnica de "reacção em cadeia da polimerase" ou "PCR" como usada no presente refere-se geralmente a um procedimento em que pequenas quantidades de uma parte específica do ácido nucleico, de ARN e/ou ADN, são amplificadas como descritas na Patente US 4.683.195 emitida em 28 de Julho de 1987. Geralmente, a informação das sequências dos finais da região de interesse ou além do necessário para ser disponível, tais oligonucleótidos primers podem ser projectados; estes primers serão idênticos ou similares à sequência da cadeia oposta do molde a ser amplificado. Os nucleótidos terminais 5' dos dois primers podem coincidir com as extremidades do material amplificado. PCR pode ser usado para amplificar 25 ΕΡ1850874Β1 sequências específicas de ARN, sequências específicas do ADN do ADN genômico, e ADNc transcrito do ARN celular total, sequências do bacteriófago ou de plasmídeo, etc. Veja-se, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987); Erlich, Ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Como utilizado no presente, PCR é considerado um, mas não o único, exemplo de um método de reacção da polimerase de ácido nucleico para amplificar uma amostra teste de ácido nucleico, que compreende a utilização de um ácido nucleico conhecido (ADN ou ARN) como um iniciador e utiliza uma polimerase de ácido nucleico para amplificar ou gerar uma parte específica de ácido nucleico ou para amplificar ou gerar uma parte específica de ácido nucleico que é complementar a um ácido nucleico particular. "Reacção em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real" ou "qRT-PCR" refere-se a uma forma de PCR em que a quantidade de produto de PCR é mensurada em cada etapa de uma reacção de PCR. Esta técnica foi descrita em várias publicações incluindo Cronin et al., Am. J. Pathol. 164(1): 35- 42 (2004); e Ma et al., Câncer Cell 5: 607-616 (2004). O termo "microarranjo" refere-se a um arranjo ordenado dos elementos hibridados em matriz, preferivelmente sondas de polinucleótido, num substrato. 0 termo "polinucleótido," quando usado no singular ou no plural, refere-se geralmente a qualquer poliribonucleótido ou polideoxribonucleótido, que podem ser ARN ou ADN não modificado ou ARN ou ADN modificado. Assim, por exemplo, os polinucleótidos como definidos no presente incluem, sem se limitar, em ADN de cadeia simples e dupla, ADN incluindo regiões de cadeias únicas e regiões de cadeias duplas, cadeias simples e cadeias duplas de ARN, 26 ΕΡ1850874Β1 incluindo regiões de cadeias únicas e regiões de cadeias duplas, moléculas híbridas contendo ADN e ARN que podem ser cadeia simples ou, mais tipicamente, cadeia dupla. Além disso, o termo "polinucleótido" como usado no presente refere-se às regiões de cadeias triplas que compreendem de ARN ou ADN ou ambos ARN e ADN. As cadeias em tais regiões podem ser da mesma molécula ou de moléculas diferentes. As regiões podem incluir toda ou uma ou mais moléculas, mas envolvem mais tipicamente apenas uma região de algumas moléculas. Uma das moléculas de uma região triplo-helicoidal é frequentemente um oligonucleótido. 0 termo "polinucleótido" inclui especificamente ADNc. 0 termo inclui ADN (incluindo ADNc) e ARN que contêm uma ou mais bases modificadas. Assim, ADN ou ARN com as cadeias principais modificadas para a estabilidade ou por outras razões são "polinucleótidos" assim como o termo é pretendido no presente documento. Além disso, ADN ou ARN que contém bases incomuns, tais como a inosina, ou bases modificadas, tais como bases tritiatadas, estão incluídos dentro do termo "polinucleótidos" como definido no presente documento. Em geral, o termo "polinucleótido" abrange todas as formas quimicamente, enzimaticamente e/ou metabolicamente modificadas de polinucleótido não modificado, bem como as formas químicos de ADN e ARN características dos vírus e das células, incluindo células simples e complexas. 0 termo "oligonucleótido" refere-se a um polinucleótido relativamente curto, incluindo, sem de limitar, aribonucleótidos de cadeia simples ou cadeia dupla dos deoxiribonucleótidos, ARN:ADN híbrido e ADN dupla cadeia. Os oligonucleótidos, tais como sondas de oligonucleótidos de ADN cadeia simples, frequentemente sintetizados por métodos químicos, por exemplo, usando sintetizadores de oligonucleótidos automatizados que são 27 ΕΡ1850874Β1 disponíveis comercialmente. Entretanto, os oligonucleótidos podem ser feitos por uma variedade de outros métodos, incluindo técnicas in vitro recombinantes mediadas por ADN e por expressão de ADN em células e organismos. A frase "amplificação do gene" refere-se a um processo pelo gual as múltiplas cópias de um gene ou de um fragmento do gene são formadas numa célula ou numa linha de célula particular. A região duplicada (um estiramento do ADN amplificado) é freguentemente referida como "amplicão." Geralmente, a guantidade de ARN mensageiro (ARNm) produzido também aumenta na proporção do número de cópias feitas do gene particular expresso. "Restringência" de reacções de hibridação é rapidamente determinável por uma habilidade comum na técnica, e é geralmente um dependente empírico do cálculo do comprimento da sonda, da temperatura de lavagem, e da concentração de sal. Em geral as sondas, mais longas requerem temperaturas mais altas para o anelamento apropriado, enquanto sondas mais curtas necessitam de temperaturas mais baixas. 0 Hibridação depende da capacidade do ADN desnaturado de se re-anelar quando as cadeias complementares estão presentes num ambiente a seguir de sua temperatura de fusão. 0 mais elevado grau de homologia desejado entre a sonda e a sequência hibridizável, mais elevada temperatura relativa que pode ser usada. Como resultado, segue-se que temperaturas relativas mais altas tenderiam a fazer condições de reacção mais estritas, enquanto temperaturas mais baixas menos estritas. Para pormenores e explicações adicionais de restrição de reacções de hibridação, veja-se Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995). 28 ΕΡ1850874Β1 "Condições de restringência" ou "condições altas de restringência", como definido no presente, tipicamente: (1) utilização de baixa a força iónica e alta temperatura de lavagem, por exemplo, 0,015 M de cloreto de sódio/ 0,0015 M de citrato de sódio/ 0,1% de dodecil sulfato de sódio à 50°C; (2) utilização durante a hibridação de um agente desnaturante, tal como a formamida, por exemplo, formamida a 50% (v/v) com 0,1% de albumina soro bovina/ 0,1% de ficol/ 0,1% de polivivilpirolidona/ 50 mM de tampão fosfato de sódio em pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42°C; ou (3) utilização de 50% fomamida 0,2xSSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, Solução de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmão sonicado (50 mg/ml) 0,7% de SDS, 10% de sulfato de dextrano a 42°C, com lavagens a 42°C. Em 0,2xSSC (cloreto de sódio/ citrato de sódio) e 50% de formamida a 55°C, seguido por uma lavagem de alta condição de restrição consistindo de 0,lxSSC contendo EDTA a 55°C. "Condições moderadas de restringência" podem ser identificadas como descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem a utilização de solução de lavagem e condição de hibridação (por exemplo, temperatura, força iónica e percentagem de SDS) mais restritiva do que aquela descrita acima. Um exemplo de condições moderadamente restritivas é incubação durante à noite à 37°C numa solução contendo: formamida 20%, 5xSSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trissódico) , 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5x solução de Denhardt, 10% sulfato de dextrano, e 20 mg/ml de excesso de ADN de esperma de salmão desnaturado, seguido pela lavagem do filtro em IxSSC a cerca de 37 - 50°C. Técnicos hábeis reconheceram como ajustar como necessário a temperatura, força iónica, etc. 29 ΕΡ1850874Β1 para acomodar factores, tais como o comprimento da sonda e etc.

Uma "sequência nativa" de um polipéptido é aquela que tem a mesma sequência de aminoácido que um polipéptido (por exemplo, receptor HER ou ligando de HER) derivado da natureza, incluindo variantes naturais ou alélicas. Tais polipéptidos de sequência nativa podem ser isolados na natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes ou sintéticos. Assim, um polipéptido de sequência nativa pode ter a sequência de aminoácido de um polipéptido humano natural, polipéptido murino, ou polipéptido de qualquer outra espécie de mamífero. 0 termo "anticorpo" é utilizado no presente no sentido mais amplo e inclui especificamente anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a actividade biológica desejada. A expressão "anticorpo monoclonal", da forma como utilizada no presente, designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou ligam o mesmo epítopo, excepto por possíveis variantes que surgem durante a produção do anticorpo monoclonal, em que tais variantes estão geralmente presentes em quantidades menores. Tal anticorpo monoclonal inclui tipicamente um anticorpo que conste de uma sequência de polipéptido que se liga a um alvo, em que a sequência do polipéptido de ligação ao alvo foi obtida por um processo que inclua a selecção de uma sequência de polipéptido de ligação ao alvo único dentre uma variedade 30 ΕΡ1850874Β1 de sequências de polipéptidos. Por exemplo, o processo de selecção pode ser a selecção de um clone original de uma variedade de clones, como um pool de clones de hibridoma, clones de fagos ou clones de ADN recombinante. Deve-se compreender que a sequência de ligação seleccionada pode adicionalmente ser alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade ao alvo, para humanizar a sequência de ligação ao alvo, para melhorar sua produção na cultura de células, para reduzir a imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multiespecifico e etc. e que um anticorpo que contenha a sequência de ligação ao alvo alterada é também um anticorpo monoclonal. Ao contrário das preparações de anticorpos (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos direccionados contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é direccionado contra um único determinante sobre o antigénio. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por serem sintetizados por culturas de hibridoma e não são contaminados por outras imunoglobulinas. 0 adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea e não deve ser considerado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método especifico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser preparados por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, Kohler et al. Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al. Anticorpos: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a Ed. 1988); Hammerling et al. em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, 1981)), métodos de ADN recombinante (veja-se, por exemplo, Patente US 4.816.567), tecnologia de bibliotecas de fagos (veja-se, por exemplo, Clackson et al. Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. 31 ΕΡ1850874Β1

Mol. Biol. 34Q(5): 1013-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), e tecnologias para a produção de anticorpos humanos ou parecidos com de humanos em animais que possuem partes ou todo o loci ou genes que codificam as sequências de imunoglobulinas humanas (veja-se, por exemplo, os documentos WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); Patente US 5.545.806; US 5.569.825; US 5.591.669 (todas da GenPharm); Patente US 5.545.807; Documento WO 1997/17852; Patente US 5.545.807; US 5.545.806; US 5.569.825; US 5.625.126; US 5.633.425; e US 5.661.016; Marks et al. , Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al. Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al. Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol, 13: 65-93 (1995)).

Os anticorpos monoclonais do presente documento incluem especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) , em que uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica, ou pertencente a uma classe ou subclasse específica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a actividade biológica desejada (US 4.816.567; Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos de interesse no presente incluem anticorpos "primatizados", 32 ΕΡ1850874Β1 que compreendem sequências de ligação de antigénios de domínio variável derivadas de primatas não humanos (por exemplo, Macacos do Velho Mundo, chipanzé etc.) e sequências da região humana constante, bem como anticorpos humanizado.

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos guiméricos gue contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não-humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais os resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo dador), tal como ratinho, rato, coelho ou primata não humano que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as FRs são as de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também compreenderá, opcionalmente, pelo menos uma porção da região constante (Fc) da imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para pormenores adicionais, veja-se Jones et al. , Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). 33 ΕΡ1850874Β1

Anticorpos HER2 humanizados incluem huMAb4D5-l, huMAb4D5- 2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 ou trastuzumab (HERCEPTIN®) como descrito no Quadro 3 da patente US 5.821.337; anticorpo 520C9 humanizado (documento WO 93/21319); e anticorpo 2C4 humanizado, tal como o pertuzumab como descrito no presente documento.

Para as finalidades no presente, "trastuzumab", "HERCEPTIN®" e "huMAb4D5-8" refere-se a um anticorpo que contenha as sequências da cadeia pesada do aminoácido SEQ ID n° 15 e 16, respectivamente.

No presente documento, "pertuzumab", "OMNITARG™" refere-se a um anticorpo que contenha as sequências da cadeia leve e pesada do aminoácido SEQ ID n° 13 e 14, respectivamente.

Diferenças entre as funções do trastuzumab e pertuzumab estão ilustradas na Figura 6.

Um "anticorpo intacto" no presente documento é aquele que tem duas regiões de ligação e uma região Fc. Preferivelmente, o anticorpo intacto possui uma região Fc funcional. "Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de anticorpo intacto, que compreende, preferencialmente, de um local de ligação de antigénios. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia única e anticorpos multiespecificos formados por fragmentos de anticorpos. "Anticorpos nativos" são normalmente glicoproteínas 34 ΕΡ1850874Β1 heterotetraméricas de cerca de 150.000 D, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto a quantidade de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isótopos de imunoglobulina. Cada cadeia leve e pesada também contém pontes dissulfeto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada contém, numa extremidade, um domínio variável (VH) seguido por uma série de domínios constantes. Cada cadeia leve contém um domínio variável numa extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve é alinhado ao domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácidos específicos formam uma superfície intermediária entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. O termo "variável" indica o fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem extensamente na sequência entre os anticorpos e são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico ao seu antigénio específico. A variabilidade não é, entretanto, distribuída regularmente ao longo dos domínios variáveis de anticorpos. Tal variabilidade é concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis de cadeia leve quanto de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas regiões de estrutura (FRs). Os domínios variáveis de cadeias leve e pesada nativas compreendem quatro FRs cada um, adotando em grande parte uma configuração folha-β, conectadas por três regiões hipervariáveis, que formam alças que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura folha-β. As regiões 35 ΕΡ1850874Β1 hipervariáveis de cada cadeia são mantidas ligadas em boa proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação de antigénios de anticorpos (veja-se Kabat et ai., Seguences ofProteins of Immuriological Interest, 5a edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, Estados Unidos). (1991)). Os domínios constantes não estão directamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem diversas funções efectoras, tais como a participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). A expressão "região hipervariável", quando utilizada no presente, designa os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antigénios. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma "região de determinação de complementaridade" ou "CDR" (ou seja, resíduos 24 a 34 (Ll), 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31 a 35 (Hl) , 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et ai., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, Estados Unidos (1991)) e/ou os resíduos de uma "alça hipervariável" (ou seja, os resíduos 26 a 32 (Ll), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26 a 32 (Hl), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Resíduos de "estrutura" ou "FR" são os resíduos de domínios variáveis diferentes dos resíduos de região hipervariável conforme definido no presente documento. A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos de ligação de antigénios idênticos, denominados 36 ΕΡ1850874Β1 fragmentos "Fab", cada qual com um único local de ligação de antigénios, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete a sua capacidade de rápida cristalização. 0 tratamento com pepsina gera um fragmento F(ab')2 que contém dois locais de ligação de antigénios e ainda é capaz de reticular o antigénio. "Fv" é o menor fragmento de anticorpo, que contém um local completo de reconhecimento e de ligação de antigénios. Esta região consiste num dimero de um domínio variável de cadeia pesada e num de cadeia leve em forte associação não-covalente. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação de antigénios sobre a superfície do dimero VH-VL. Colectivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação de antigénios ao anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável isolado (ou a metade de um Fv que compreende apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antigénio) possui a capacidade de reconhecer e se ligar ao antigénio, embora em afinidade mais baixa que o local de ligação completo. 0 fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no carboxi- terminal do domínio CHI de cadeia pesada, que inclui uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab'-SH é a denominação do presente para Fab', em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contém pelo menos um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpos F(ab')2 foram originalmente produzidos na forma de pares de fragmentos de Fab' que contêm cisteínas de articulação entre tais fragmentos. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de 37 ΕΡ1850874Β1 anticorpos também sao conhecidos.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados capa (K) e lambda (λ) , com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. 0 termo "região Fc" é usado definir a região do C-terminal de uma cadeia pesada da imunoglobulina que possa ser gerada pela digestão da papaína num anticorpo intacto. A região de Fc pode ser uma sequência nativa ou variante da região Fc. Embora os limites da região Fc da cadeia pesada de uma imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada da IgG humana é normalmente definida como se estendendo a partir de um resíduo de aminoácidos por volta da posição Cys226, ou por volta da posição Pro230, até a região carboxi-terminal da região Fc. A lisina C-terminal (resíduo 477 de acordo com sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo, ou pela construção de um ácido nucleico recombinante codificador da cadeia pesada do anticorpo. Consequentemente, uma composição de anticorpos intactos pode conter populações de anticorpos com todos os resíduos K447 removidos, anticorpos com todos os resíduos K447 não removidos, e populações de anticorpos tendo uma mistura de anticorpos com e sem resíduos K447. A menos que indicado de outra maneira, no presente a numeração dos resíduos numa cadeia pesada da imunoglobulina é aquela indexada pelo EU como em Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). 0 "índice EU como em Kabat" refere-se a numeração do resíduo do anticorpo humano IgGl EU. 38 ΕΡ1850874Β1

Uma "região Fc funcional" possui uma "função efectora" de uma região Fc de sequência nativa. Exemplos de funções efectoras incluem ligação de Clq; citotoxicidade dependente de complemento; ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa dos receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B; BCR), e similares. Ditas funções efectoras requerem, geralmente, a região Fc a ser combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um anticorpo de domínio variável) e pode ter-se acesso através de diversos testes, como, por exemplo, os descritos na presente invenção.

Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácido idêntica à sequência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza. Regiões Fc humanas de sequência nativa incluem uma região Fc de IgGl humana de sequência nativa (não-A e alotipos A) ; região Fc de IgG2 humana de sequência nativa; região Fc de IgG3 humana de sequência nativa; e região Fc de IgG4 humana de sequência nativa, bem como variantes de ocorrência natural das mesmas.

Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere da região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido. Preferivelmente, a região Fc variante pode apresentar pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com a região Fc de sequência nativa ou a uma região Fc de um anticorpo parental, e pode apresentar, por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 10 substituições de aminoácidos, ou de cerca de 1 a cerca de 5 substituições de aminoácido sem uma região Fc de sequência nativa ou numa região Fc do anticorpo parental. A região Fc variante pode apresentar pelo menos cerca de 80% de identidade com uma região Fc de 39 ΕΡ1850874Β1 sequência nativa e/ou com uma região Fc do anticorpo parental, e pode apresentar cerca de 90% de identidade, ou apresentar pelo menos cerca de 95% identidade com a mesma.

Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, anticorpos podem ser atribuídos a classes diferentes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, igE, IgG e IgM, e várias delas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de anticorpos são denominados α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. "Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos" e "ADCC" designam uma reacção mediada por células na qual células citotóxicas não-específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células matadoras naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado a uma célula alvo e, em seguida, promovem a lise da célula alvo. As células primárias para a mediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FeyRII e FcyRMI. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida no Quadro 3, pág. 464, de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Para determinar a actividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode-se realizar um teste ADCC in vitro, conforme descrito na patente US 5.500.362 ou US 5.821.337. Células efectoras úteis para tais testes incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) e células matadoras naturais (NK). Alternativamente ou adicionalmente, a actividade ADCC da molécula de interesse 40 ΕΡ1850874Β1 pode ser determinada in vivo, por exemplo, num modelo animal conforme descrito em Clynes et al., PNAS (USA) 95: 652-656 (1998). "Células efectoras humanas" são leucócitos que expressam uma ou mais FcRs e realizam funções efectoras. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e realizam função efectora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares sanquineas periféricas (PBMC), células matadoras naturais (NK) , monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; de modo que PBMCs e células NK são preferidas. As células efectoras podem ser isoladas de uma fonte nativa desta, por exemplo, do sangue ou PBMCs como descrito no presente documento.

As expressões "receptor Fc" ou "FcR" são utilizadas para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. 0 FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (receptor y) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcYRIII, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formas divididas desses receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de activação") e FcYRIIB (um "receptor de inibição"), que possuem sequências de aminoácidos similares que diferem, principalmente, nos seus domínios citoplasmáticos. 0 receptor de activação FcyRIIA contém uma unidade de activação imuno-receptora baseada em tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático. 0 receptor de inibição FcYRIIB contém uma unidade de inibição imuno-receptora baseada em tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático (veja-se Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcRs são analisadas em Ravetch e Kinet,

Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capei et al., 41 ΕΡ1850874Β1

Immunomethods 4: 25-34 (1994); e de Haas et ai., J. Lab.

Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Outras FcRs, incluindo aquelas a serem identificadas no futuro, são englobadas pelo termo "FcR" no presente documento. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) e Kim et al. , J. Immunol. 24: 249 (1994)), e regula a homeostasia das imunoglobulinas. "Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" designa a capacidade de uma molécula de lisar um alvo na presença de complemento. A via de activação de complementos é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (Clq) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) em complexo com um antigénio cognato. Para determinar a activação do complemento, pode ser realizado um teste de CDC, conforme descrito, por exemplo, em

Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996) .

Fragmentos de anticorpos "Fv de cadeia única" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que esses domínios estão presentes numa única cadeia de polipéptidos. Preferencialmente, o polipéptido Fv compreende adicionalmente um ligando de polipéptido entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação de antigénios. Para uma análise de scFv, veja-se Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds, Springer-Verlag, Nova Iorque, Estados Unidos, págs. 269-315 (1994). Fragmentos scFv do anticorpo HER2 estão descritos no documento WO 93/16185; Patente US 5.571.894; e Patente US 5.587.458. O termo "diacorpos" designa pequenos fragmentos de 42 ΕΡ1850874Β1 anticorpos com dois locais de ligação de antigénios, que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VI) na mesma cadeia de polipéptido (VH-VL) . Utilizando um ligando que é curto demais para permitir o emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são obrigados a parear-se com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação de antigénios. Os diacorpos são descritos de maneira mais completa, por exemplo, na patente EP 404.097 e no documento WO 93/11161 e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993).

Um "anticorpo nu (naked antibody)" é um anticorpo não conjugado a uma molécula heteróloga, tal como uma fraeção ou um radiomarcador citotóxico.

Um anticorpo "isolado" é aquele que tenha sido identificado, separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interferem em utilizações de diagnóstico ou terapêuticas para o antagonista e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteáceos ou não proteáceos. Em realizações preferidas, o antagonista será purificado (1) até mais de 95% em peso de antagonista, conforme determinado por meio do método Lowry e, de maior preferência, mais que 99% em peso; (2) até grau suficiente para a obtenção de pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos interna ou N-terminal, utilizando um sequenciador de copo de fiação (spinning cup)\ ou (3) até a homogeneidade por meio de SDS-PAGE, sob condições redutoras ou não-redutoras, utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, manchas de prata. O antagonista isolado inclui o antagonista in situ em células recombinantes, desde que pelo menos um componente 43 ΕΡ1850874Β1 do ambiente natural do antagonista não esteja presente documento. Normalmente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

Anticorpo "maturado por afinidade" é aquele com uma ou mais alterações numa ou mais de suas regiões hipervariáveis, o que resulta em aumento da afinidade do anticorpo para o antigénio, em comparação com anticorpo parental que não possui essa(s) alteração(ões). Os anticorpos maturados por afinidade preferidos possuirão afinidades nanomolares ou até picomolares para o antigénio alvo. Os anticorpos maturados por afinidade são produzidos através de procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al. Bio/Technology, 10: 779-783 (1992) descreve a maturação por afinidade através de troca de domínios VH e VL. A mutagénese aleatória de resíduos de estrutura e/ou CDR é descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sei, USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al. J. Immunol. 154(7): 3310-9 (1995); e Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992). O termo "anticorpo principal da espécie" refere-se no presente a uma estrutura de anticorpo numa composição que seja a molécula quantitativamente predominante de anticorpo na composição. Numa forma de realização, o anticorpo principal da espécie é um anticorpo HER2, tal como um anticorpo que se liga ao Domínio II de HER2, anticorpo que inibe a dimerização de HER mais eficazmente do que o trastuzumab, e/ou um anticorpo que se liga a um local de ligação heterodimérica de HER2. A forma de realização preferida no presente do anticorpo principal da espécie é aquele que compreende da sequência de aminoácidos de cadeia leve e pesada da SEQ ID N° 3 e 4, e conste mais preferivelmente das sequências de aminoácidos da cadeia 44 ΕΡ1850874Β1 leve e pesada da SEQ ID N° 13 e 14 (pertuzumab).

Um anticorpo de "sequência variante de aminoácido" no presente documento é um anticorpo com uma sequência de aminoácido que difere de um anticorpo principal da espécie. Ordinariamente, as sequências de aminoácidos variantes possuirão pelo menos a homoloqia de aproximadamente 70% com o anticorpo principal da espécie, e preferivelmente, pelo menos aproximadamente 80%, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 90% de homoloqia com o anticorpo principal da espécie. As sequências variantes de aminoácidos possuem substituições, deleções e/ou adições em determinadas posições dentro ou junto à sequência de aminoácido do anticorpo principal da espécie. Exemplos da sequência de aminoácido variantes no presente incluem uma variante acidica (por exemplo, variante do anticorpo desamidado), um variante básico, um anticorpo com uma extensão amino-terminal (por exemplo, VHS-) numa ou duas cadeias leves deste, um anticorpo com resíduo de lisina C- terminal numa ou duas cadeias pesadas deste, etc., e incluem combinações das variações das sequências de aminoácido de cadeias leves e/ou pesadas. 0 variante do anticorpo de interesse particular no presente, isto é, o anticorpo que contém uma extensão do líder aminoterminal numa ou duas cadeias leves deste, opcionalmente contendo outra sequência de aminoácido e/ou diferenças na glicosilação relativa ao anticorpo principal da espécie.

Um anticorpo com "glicosilação variante" no presente documento é um anticorpo com uma ou mais fracções de hidrato de carbono ligado ao anticorpo que diferem de uma ou mais fracções de hidrato de carbono ligado a um anticorpo principal da espécie. Exemplos de glicosilação variante no presente incluem anticorpo com uma estrutura de oligossacárido G1 ou G2, ao invés de uma estrutura de 45 ΕΡ1850874Β1 oligossacárido GO, ligando a região de Fc deste, anticorpo com uma ou duas fracções do hidrato de carbono ligado a uma ou duas cadeias leves deste, anticorpo com nenhum hidrato de carbono ligado a uma ou duas cadeias pesadas do anticorpo, etc., e combinações de alterações de glicosilação.

Quando o anticorpo tem uma região Fc, uma estrutura de oligossacárido pode ser ligada a uma ou duas cadeias pesadas do anticorpo, por exemplo, no resíduo 299 (numeração dos resíduos EU 298). Para o pertuzumab, GO foi a estrutura predominante do oligossacárido, com outras estruturas do oligossacárido tais como GO-F, G-l, Man5, Man6, Gl-1, G1 (1-6), G1 (1-3) e o G2 que é encontrado em pequenas quantidades na composição do pertuzumab. A menos que indicada de outra maneira, uma "estrutura do oligossacárido Gl" inclui no presente as estruturas G-l, Gl-1, Gl (1-6) e Gl (1-3).

Uma "extensão do líder amino-terminal" refere-se no presente a um ou mais resíduo da sequência do líder amino-terminal que esta presente no amino-terminal de qualquer anticorpo de cadeia pesada ou leve. Uma extensão exemplar do líder amino-terminal consta ou consiste em três resíduos dos aminoácidos, VHS, presente numa ou ambas as correntes leves e de um anticorpo variante.

Um anticorpo "deamidado" é aquele em que um ou o mais resíduo de asparagina deste foi derivatizada, por exemplo, a um ácido aspártico, uma succinimida, ou um ácido iso-aspártico.

Os termos "cancro" e "canceroso" designam ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente 46 ΕΡ1850874Β1 caracterizada pelo crescimento celular desregulado. Exemplos de cancro incluem, mas sem limitar-se a, carcinoma incluindo, carcinoma, linfoma, blastoma (incluindo meduloblastoma e retinoblastoma), sarcoma (incluindo lipossarcoma e sarcoma de células sinoviais), tumores neuroendócrinos, (incluindo tumores carcinóides, gastrinoma, e cancro de células de ilhotas), mesotelioma, schwannoma (incluindo neuroma acústico), meningioma, adenocarcinoma, melanoma, e leucemia ou malignidades linfóides. Exemplos mais particulares de tais cancros incluem cancros de células escamosas (por exemplo, cancro de células escamosas epiteliais), cancro de pulmão de pequenas células (SCLC), cancro de pulmão de células não pequenas (NSCLC), adenocarcinoma de pulmão e carcinoma de pulmão, cancro de peritónio, cancro hepatocelular, cancro gastrointestinal, cancro pancreático, glioblastoma, cancro cervical, cancro do ovário, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro de mama (incluindo cancro de mama metastático), cancro do cólon, cancro colo-rectal, carcinoma do endométrio ou uterino, carcinoma de glândulas salivares, cancro dos rins, cancro do fígado, cancro de próstata, cancro da vulva, cancro da tireoide, carcinoma hepático, e vários tipos cancro de cancro da cabeça e pescoço.

Um cancro "avançado" é aquele que se espalha para fora do local ou órgão de origem, pela invasão ou pela metástase local.

Um cancro "refractário" é aquele que progride mesmo que um agente anti-tumoral, tal como um agente quimioterápico, esteja a ser administrado ao paciente com cancro. Um exemplo de um cancro refractário é aquele que é refractário da platina. 47 ΕΡ1850874Β1

Um cancro "recorrente" é aquele que tem o crescimento novamente, no local inicial ou num local distante, após uma resposta à terapêutica inicial. "Paciente" no presente documento é um paciente humano. 0 paciente pode ser um "paciente com cancro", isto é, aquele que está sofrendo ou tem o risco de sofrer de um ou mais sintomas do cancro.

Uma "amostra de tumor" é no presente documento uma amostra derivada, ou que contenha células do tumor, ou tumor de um paciente. Exemplos de amostras de tumor no presente incluem, mas não são limitados a, biópsias de tumor, células circulantes de tumor, proteínas circulantes do plasma, líquido ascítico, culturas de células primárias ou linha de células derivadas de tumores ou que exibam propriedades parecidas com de um tumor, bem como-amostras preservadas de tumor, tais como amostras fixadas em formalina, amostras de tumores embebidos em parafina ou amostras de tumor congelado.

Uma amostra de tumor "fixado" é aquela que foi histologicamente preservada pela utilização de um fixador.

Uma amostra de tumor "fixada em formalina" é aquela que foi preservada pela utilização do formaldeído como fixador.

Uma amostra de tumor "embebida" é aquela imersa num meio firme e geralmente rígido, tal como a parafina, cera, celoidina ou uma resina. 0 embebimento torna possível realizar cortes finos para a examinação por microscópica ou a geração de arranjos teciduais e matriz (TMAs).

Uma amostra de tumor "embebida em parafina" é aquela 48 ΕΡ1850874Β1 imersa numa mistura purificada de hidrocarbonetos sólidos derivados do petróleo.

No presente documento, uma amostra "congelada" de tumor refere-se a uma amostra de tumor que esteja, ou foi, congelada.

Um cancro ou amostra biológica que "apresente expressão, amplificação, ou activação de HER" são aquelas que, num teste diagnóstico, expressam (incluído a sobre-expressão) o receptor HER, amplificam o gene HER, e/ou demonstram de outra maneira a activação ou a fosforilação do receptor HER.

Um cancro ou amostra biológica que "apresente activação de HER" é aquela que, num teste diagnóstico, demonstra a activação ou a fosforilação do receptor HER. Tal activação pode ser determinada directamente (por exemplo, mensurando a fosforilação de HER por ELISA) ou indirectamente (por exemplo, pelo perfil de expressão do gene ou detectando heterodímeros de HER, como descrito no presente).

No presente documento, o "perfil de expressão do gene" refere-se a uma avaliação da expressão de um ou mais genes como um substituto para a determinação da fosforilação de HER directamente.

Um "ensaio de fosfo-ELISA" é no presente documento um ensaio em que a fosforilação de um ou mais receptores HER, especialmente HER2, é avaliado por um ensaio por enzimas imuno-adsorvidas (ELISA) que utiliza um reagente, geralmente um anticorpo, para detectar o receptor HER fosforilado, substrato, ou molécula sinalizadora a jusante. Preferivelmente, um anticorpo que detecta HER2 fosforilado 49 ΕΡ1850874Β1 é usado. 0 ensaio pode ser executado em lisados de células, preferivelmente em amostras biológicas frescas ou congeladas.

Uma célula de cancro com "sobre-expressão ou amplificação de receptor HER" é aquela que apresenta niveis significativamente mais elevados de proteína ou gene do receptor HER comparada a uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Tal sobre-expressão pode ser causada pela amplificação do gene ou pela transcrição ou tradução aumentada. A sobre-expressão ou amplificação do receptor HER pode ser determinada num ensaio diagnóstico ou prognóstico avaliando níveis aumentados da proteína HER presente na superfície de uma célula (por exemplo, através de um ensaio imuno-histoquímico; IHC). Alternativamente, ou adicionalmente, pode-se medir níveis de ácido nucleico codificador de HER na célula, por exemplo, através da hibridação in situ fluorescente (FISH; veja-se, documento WO 98/45479 publicado em Outubro de 1998), técnicas de Southern blotting, ou reacção em cadeia da polimerase (PCR), tais como PCR quantitativo em tempo real (qRT- PCR). Também é possível estudar a sobre-expressão ou amplificação do receptor HER mensurando o antigénio vertente (por exemplo, domínio extracelular de HER) num líquido biológico, tal como o soro (veja-se, por exemplo, Patente US 4.933.294 emitida em 12 de Junho de 1990; documento WO 91/05264 publicado em 18 de Abril de 1991; Patente US 5.401.638 emitida em 28 de Março de 1995; e Sias et al., J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). Com excepção dos ensaios acima, vários ensaios in vivo estão disponíveis aos profissionais hábeis. Por exemplo, um ensaio que possa expor célula do corpo do paciente a um anticorpo que esteja opcionalmente marcado com um marcador detectável, por exemplo, um isótopo radioactivo, e a ligação do anticorpo às células do paciente podem ser avaliados, por exemplo, pela exploração 50 ΕΡ1850874Β1 externa de radioactividade ou pela análise de uma biópsia retirada de um paciente que foi exposto previamente ao anticorpo.

De modo oposto, um cancro que "não sobre-expressa ou amplifica o receptor HER" é aquele que não possui níveis maiores do que os normais de proteína ou gene do receptor HER em comparação com uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Os anticorpos que inibem a dimerização de HER, tal como o pertuzumab, podem ser usados para tratar o cancro que não sobre-expressa ou amplifica o receptor HER2.

No presente documento, um "agente anti-tumoral" refere-se a um fármaco usado para tratar o cancro. Não se limitado aos exemplos de agentes anti-tumoral no presente incluem agentes quimioterápicos, inibidores de dimerização de HER, anticorpos anti-HER, anticorpos direccionados contra antigénios associados ao tumor, compostos anti-hormonais, citocinas, fármacos contra EGFR, agentes antiangiogénicos, inibidores da tirosina quinase, agentes e anticorpos inibidores de crescimento, agentes citotóxicos, anticorpos que induzem a apoptose, inibidores de COX, inibidores de farnesil transferase, anticorpos que se ligam a proteína oncofetal CA 125, vacinas HER2, inibidores de Raf ou ras, doxorrubicina lipossomal, topotecano, taxano, inibidores duplos da tirosina quinase, TLK286, EMD-7200, pertuzumab, trastuzumab, erlotinib, e bevacizumab.

Um "agente anti-tumoral aprovado" é um fármaco usado para tratar o cancro que foi aprovado por uma autoridade regulatória tal como a Food and Drug Administration (FDA) ou equivalente estrangeira desta.

Quando um inibidor de dimerização de HER é administrado como um "único agente anti-tumoral" ele é o 51 ΕΡ1850874Β1 único agente anti-tumoral administrado para tratar o cancro, isto é, não é administrado em combinação com um outro agente anti-tumoral, tal como a quimioterapia.

Por "padrão de cuidado" no presente significa o agente ou os agentes anti-tumoral que são utilizados rotineiramente para tratar uma forma particular de cancro. Por exemplo, para o cancro de ovário resistente a platina, o padrão de cuidado é o topotecano ou a doxorrubicina lipossomal.

Um "agente inibidor de crescimento" quando usado n presente refere-se a um composto ou a uma composição que iniba o crescimento de uma célula, especialmente uma célula de cancro expressando HER in vitro ou in vivo. Assim, o agente inibidor de crescimento pode ser aquele que reduz significativamente a percentagem de células na fase S. Os exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem os agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em uma outra fase com excepção da fase S) , como os agentes que induzem à parada do ciclo celular em G1 parada da fase M. Os bloqueadores clássicos da fase M incluem os vincas (vincristina e vimblastina) , taxol, e inibidores de topo II, tais como, a doxorrubicina, a epirrubicina, a daunorrubicina, a etopósido, e a bleomicina. Estes agentes que param o ciclo celular em G1 também se difundem para a suspensão da fase S, por exemplo, agentes alquilantes do ADN como o tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracil, e ara-C. Informações adicionais podem ser encontradas em The Molecular Basis of Cancro, Mendelsohn e Israel, eds. Capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente na página 13. 52 ΕΡ1850874Β1

Os exemplos de anticorpos "inibidores de crescimento" são aqueles que se ligam a HER2 e inibem o crescimento das células de cancro que sobre-expressam HER2. Os anticorpos inibitórios de crescimento HER2 preferidos inibem o crescimento de células de tumor do mama SK-BR-3 em cultura de células em mais de 20%, e preferivelmente mais de 50% (por exemplo, aproximadamente de 50% a 100%) numa concentração de anticorpo de aproximadamente 0,5 a 30 pg/ml, onde a inibição de crescimento é determinada seis dias após a exposição das células SK-BR-3 ao anticorpo (veja-se, Patente US. 5.677.171 emitida em 14 de Outubro de 1997). O ensaio de inibição de crescimento da célula SK-BR-3 está descrito mais pormenorizadamente nesta patente e a seguir no presente documento. O anticorpo inibidor de crescimento preferido é um anticorpo monoclonal murino variante humanizado 4D5, por exemplo, o trastuzumab.

Um anticorpo que "induz a apoptose" é aquele que induz a morte celular programada como determinada pela ligação da anexina V, fragmentação do ADN, retracção celular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação da célula, e/ou da formação de vesículas da membrana (chamadas de corpos apoptóticos). A célula é geralmente aquela que sobre-expressa o receptor HER2. Preferivelmente a célula é uma célula de tumor, uma célula, por exemplo, de mama, de ovário, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tiróide, pâncreas ou bexiga. In vitro, a célula pode ser uma célula SK-BR-3, BT474, Caiu 3, MDA-MB-453, MDA-MB- 361 ou SKOV3. Vários métodos estão disponíveis para avaliar os eventos celulares associados com a apoptose. Por exemplo, a translocação do fosfatidil serina (PS) pode ser mensurada pela ligação da anexina; A fragmentação do ADN pode ser avaliada através da escala de ADN; e condensação nuclear/cromatina junto com a fragmentação do ADN pode ser avaliada por qualquer aumento em células hiplóides. 53 ΕΡ1850874Β1

Preferivelmente, o anticorpo que induz a apoptose é aquele que resulta em aproximadamente 2 a 50 vezes, preferivelmente aproximadamente 5 a 50 vezes, e mais preferivelmente a aproximadamente 10 a 50 vezes, a indução da anexina a liga-se a célula comparada a uma célula não tratada num ensaio de ligação da anexina utilizando células BT4 7 4 (veja-se a seguir) . Os exemplos de anticorpos HER2 que induzem a apoptose são 7C2 e 7F3. O "epítopo 2C4" é a região no domínio extracelular de HER2 ao qual o anticorpo 2C4 se liga. A fim de seleccionar anticorpos que se ligam ao epítopo 2C4, um ensaio de bloqueio cruzado rotineiro, tal como aquele descrito em Anticorpos, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow e David Lane (1988), pode ser executado. Preferivelmente o anticorpo bloqueia a ligação do 2C4 ao HER2 em aproximadamente 50% ou a mais. Alternativamente, pode ser executado o mapeamento do epítopo para avaliar se o anticorpo se liga ao epítopo 2C4 de HER2. O epítopo 2C4 contém resíduos do Domínio II no domínio extracelular de HER2. 2C4 e pertuzumab ligam-se ao domínio extracelular de HER2 na junção dos domínios I, II e III. Franklin et al., Câncer Cell 5: 317-328 (2004). O "epítopo 4D5" é a região no domínio extracelular de HER2 ao qual o anticorpo 4D5 (ATCC CRL 10463) e trastuzumab se ligam. Este epítopo está próximo do domínio transmembrana de HER2, e dentro do Domínio IV de HER2. Para seleccionar os anticorpos que se ligam ao epítopo 4D5, um ensaio de bloqueio cruzado rotineiro, tal como aquele descrito em Anticorpos, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow e David Lane (1988), pode ser executado. Alternativamente, pode ser executado o mapeamento do epítopo para avaliar se o anticorpo liga-se ao epítopo 4D5 do HER2 (por exemplo, qualquer resíduo na 54 ΕΡ1850874Β1 região próxima do resíduo 529 ao -esíduo 625, inclusive do ECD de HER2, a numeração do resíduo inclui o péptido de sinal).

Um "epítopo 7C2/7F3" é a região N-terminal, dentro do Domínio I, Domínio extracelular de HER2 ao qual os anticorpos 7C2 e/ou 7F3 (cada um depositado com o ATCC, veja-se a seguir) se ligam. Para seleccionar os anticorpos que se ligam ao epítopo 7C2/7F3, um ensaio de bloqueio cruzado rotineiro, tal como aquele descrito em Anticorpos, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow e David Lane (1988), pode ser executado. Alternativamente, pode ser executado o mapeamento do epítopo para avaliar se o anticorpo se liga ao epítopo 7C2/7F3 em HER2 (por exemplo, qualquer resíduo na região próxima do resíduo 22 ao resíduo 53 do ECD de HER2, a numeração do resíduo inclui o péptido de sinal). "Tratamento" refere-se ao tratamento terapêutico e medidas profilácticas ou preventivas. Aqueles na necessidade do tratamento incluem aqueles já com cancro, bem como, aqueles em que o cancro deve ser prevenido. Portanto, o paciente a ser tratado no presente pode ter sido diagnosticado como tendo cancro ou pode estar predisposto ou ser susceptível ao cancro. A expressão "quantidade eficaz" designa uma quantidade do fármaco que é eficaz para tratar o cancro num paciente. A quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células cancerígenas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (ou seja, reduzir até certo ponto e, preferencialmente, suspender) a infiltração de células cancerígenas em órgãos periféricos; inibir (ou seja, reduzir até certo ponto e, preferencialmente, suspender) a metástase tumoral; inibir, até certo ponto, o crescimento 55 ΕΡ1850874Β1 de tumores; e/ou melhorar, até certo ponto, um ou mais dos sintomas associadas ao cancro. Para extensão, o fármaco pode impedir o crescimento e/ou para matar as células cancerígenas existentes, esta pode ser citostática e/ou citotóxica. A quantidade eficaz pode estender a sobrevivência livre de progressão (por exemplo, como medido pelos Critérios de Avaliação da Resposta em Tumores Sólidos RECIST, ou CA-125), resultando numa resposta objectiva (incluindo resposta parcial, RP, ou resposta completa, RC), aumenta o tempo de sobrevivência total, e/ou melhora um ou mais sintomas do cancro (por exemplo, como avaliado por FOSI). A expressão "agente citotóxico", da forma utilizada no presente, indica uma substância que inibe ou evita o funcionamento das células e/ou causa destruição das células. A expressão destina-se a incluir isótopos radioactivos (tais como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterápicos e toxinas tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente activas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos destes.

Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tratamento de cancro. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquilo tais como busulfano, improsulfano e piposulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metilamelaminas, que incluem altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; TLK 286 (TELCYTA™); acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta- 9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, 56 ΕΡ1850874Β1 MARHNTOL®); beta-lapacona; lapacol; colcicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina, e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficin 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo seus análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; a sarcodictina; espongistatina; mostardas de azoto tais como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalana, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo; nitrosuréias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; bifosfonatos, como por exemplo, clodronato; uma esperamicina; bem como o cromóforo neocarzinostatina e antibiótico cromóforo cromoproteína enedina, (por exemplo, caliqueamicinas especialmente caliqueamicina gama e caliqueamicina ómega Agnew, Chem Intl. Ed. Engl, 33: 183-186 (1994)) e antraciclinas, tal com anamicina, AD 32, alcarubicina, daunorubicina, dexrazoxano, DX-52-1, epirubicina, GPX-100, idarubicina, KRN5500, menogaril, dinemicina, incluindo a dinemicina A; bifosfonatos, como por exemplo, clodronato; uma esperamicina; bem como o cromóforo neocarzinostatina e antibiótico cromóforo cromoproteína enedina, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, chromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN® doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-dexorubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e deoxidoxorrubicina), esorubicina, marcelmicina, mitomicinas, tal como mitomicina C, ácido 57 ΕΡ1850874Β1 micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, streptozotocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, e zorubicina; análogos do ácido fólico, tal como denopterina, pteropterina, e trimetrexato; análogos da purina, tal como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, e tioguanina; pirimidina, tal como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, e floxuridina; andrógenos, tal como calusterono, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostane, e testolactona; antiadrenais, tal como aminoglutetimida, mitotano, e trilostano; repositores de ácido fólico, tal como ácido folinico (leucovorin); aceglatona; agentes antifolato anti neoplásicos, tal como ALIMTA®, LI231514 pemetrexed, inibidores da dihidrofolato redutase, tal como metotrexato, antimetabólitos, tal como 5- fluorouracil (5-FU) e suas pró-f ármacos, tais como UFT, S-l e capecitabina, e inibidores da timidilato sintase e inibidores do ribonucleótido glicinaamida formiltransferase, tal como raltitrexed (TOMUDEXRM, TDX); inibidores da dihidropirimidina desidrogenase, tal como eniluracil; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulinico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinana; lonidamina; maitansinoides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitacrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilinico; 2-etilidrazida; procarbazina; Complexo polissacaridico PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; (especialmente a toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina 58 ΕΡ1850874Β1 (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, por exemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)»· ABRAXANO™ formulação do paclitaxel desenvolvidas com nanoparticulas de albumina livres de Cremofor (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), e TAXOTERE® doxetaxel (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); cloranbucilo; GEMZAR® gencitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE® vinorelbina, novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; esperamicinas; capecitabina e os sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima; bem como, combinações de dois ou mais dos acima, tal como o CHOP, uma abreviatura para uma terapêutica combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviatura para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN) combinada com 5-FU e leucovorina.

Também estão incluídos nesta definição agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir a acção hormonal sobre tumores, tais como antiestrogénios e moduladores selectivos de receptores de estrogénio (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo o NOLVADEX® tamoxifen) , raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, e FARESTON toremifeno; inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, o qual regula a produção de estrogénio pelas glândulas adrenais, como por exemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE® acetato de megestrol, AROMASIN® 59 ΕΡ1850874Β1 exemestana, formestano, fadrozolo, RIVISOR® vorozolo, FEMARA® letrozolo, e ARIMIDEX® anastrozolo; e antiandrógenos, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; bem como, troxacitabina (um análogo da citisona 1,3-dioxolano nucleósido); oligonucleótidos antissense, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes envolvidos na via de sinalização da proliferação celular aberrante, tais como, PKC- alfa, Raf e H-Ras, receptor de factor de crescimento epidermal (EGF-R); vacinas de terapêutica génica, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, e vacina VAXID®; PROLEUKIN® rlL-2; inibidor da topoisomerase 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima. Um "agente quimioterápico antimetabólito" é um agente que seja estruturalmente similar a um metabólito, mas não pode ser usado pelo corpo de maneira produtiva. Muitos agentes quimioterápicos antimetabólitos interferem na produção dos ácidos nucleico s, ARN e ADN. exemplos de agentes quimioterápicos antimetabólitos incluem a gemeitabina (GEMZAR®), 5- fluorouracil (5-FU), capecitabina (XELODA™), 6-mercaptopurina, metotrexato, 6-tioguanina, pemetrexedo, raltitrexedo, arabinosileitosina ARA-C, citarabina (CYTOSAR-U®), dacarbazina (DTIC-DOME®), azocitosina, deoxicitosina, piridmideno, fludarabins (FLUDARA®), cladrabina, 2-desoxi-D-glicose etc. 0 agente quimioterápico antimetabólito preferido é a gencitabina. "Gencitabina" ou "monohidrocloreto de 2'-deoxi-2',2'-difluorocitidina (isómero-b)" é um análogo do nucleósido que exibe actividade anti-tumoral. A fórmula empírica para a gencitabina HC1 é CgHi^NsC^-HCl. A Gentacitabina HC1 é vendida por Eli Lilly sob a marca registada GEMZAR®.

Um "agente quimioterápico a base de platina" 60 ΕΡ1850874Β1 compreende de um composto orgânico que contenha platina como parte integral da molécula. Exemplos de agentes quimioterápicos a base de platina incluem a carboplatina, cisplatina, e oxaliplatina. "Quimioterapia baseada em platina" significa a terapêutica com um ou mais agentes quimioterápicos a base de platina, opcionalmente em combinação com um ou mais agentes quimioterápicos diferentes.

Cancro "resistente a quimioterapia" significa que o paciente com cancro progrediu enquanto recebia um regime de quimioterapia (isto é, o paciente é "refractário a quimioterapia"), ou o paciente progrediu dentro de 12 meses (por exemplo, dentro de 6 meses) após ter terminado um regime de quimioterapia.

Cancro "resistente a platina" significa que o paciente com cancro progrediu ao receber uma quimioterapia baseada em platina (isto é, o paciente é "refractário a platina"), ou o paciente progrediu dentro de 12 meses (por exemplo, dentro de 6 meses) após ter terminado um regime de quimioterapia baseada em platina.

Um "agente antiangiogénico" refere-se a um composto que bloqueia, ou interfere em algum grau, o desenvolvimento de vasos sanguíneos. 0 factor antiangiogénico pode, por exemplo, ser uma molécula pequena ou anticorpo que se liga a um receptor do factor de crescimento ou ao receptor do factor de crescimento envolvido em promover a angiogénese. 0 factor antiangiogénico preferido no presente documento é um anticorpo que se liga ao factor de crescimento endotelial. vascular (VEGF), como o bevacizumab (AVASTEST®). 61 ΕΡ1850874Β1 0 termo "citocina" é um termo genérico para proteínas liberadas por uma população celular que agem sobre outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos dessas citocinas são linfocinas, monocinas e hormonas de polipéptidos tradicionais. Encontram-se incluídos entre as citocinas hormonas do crescimento, tais como hormona do crescimento humano, hormona do crescimento humano N-metionilo e hormona do crescimento bovino; hormona paratireóide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; pró-relaxina; hormonas de glicoproteínas tais como hormona folículo estimulante (FSH), hormona estimulante da tireoide (TSH) e hormona luteinizante (LH); factor do crescimento hepático; factor de crescimento dos fibroblastos; prolactina; lactogénio da placenta; factor de necrose tumoral α e β; substância inibidora mulleriana; péptido associado a gonadotropina de ratinhos; inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); factores de crescimento neural tais como NGF-β; factor de crescimento das plaquetas, factores de crescimento de transformação (TGFs) tais como TGF-α e TGF-β; factor de crescimento similar à insulina I e II; eritropoietina (EPO); factores osteo-indutivos; interferões, tais como interferão-α, β e γ; factores estimulantes de colonias (CSFs) tais como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-11, IL-12, IL-15; factor de necrose tumoral tal como TNF-α ou TNF-β; e outros factores de polipéptidos que incluem LIF e ligando de kits (LK). Da forma como utilizada no presente, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura celular recombinante e equivalentes biologicamente activos das citocinas de sequências nativas.

Como utilizado no presente, o termo "Fármaco contra 62 ΕΡ1850874Β1 EGFR" refere-se a um agente terapêutico que se liga ao EGFR e, opcionalmente, inibe a activação do EGFR. Exemplos de tais agentes incluem anticorpos e moléculas pequenas que se ligam ao EGFR. Exemplos de anticorpos que se ligam ao EGFR incluem MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (veja-se, Patente US 4.943.533, Mendelsohn et al.) e variantes deste, tal como o 225 quimerizado (C225 ou Cetuximab; ERBUTIX®) e "reshaped" humano 225 (H225) (veja-se, documento WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, um anticorpo humano completo, anticorpo contra EGFR (Imclone); anticorpos que se ligam ao EGFR tipo II mutante (Patente US 5.212.290); anticorpos quiméricos e humanizados que se ligam a EGFR como descrito na patente US 5.891.996; anticorpos humanos que se ligam ao EGFR, tal como ABX-EGF (veja-se, documento WO 98/50433, Abgenix) ; EMD 55900 (Stragliotto et al., Eur. J. Câncer 32A.636- 640 (1996)); EMD7200 (matuzumab) um anticorpo EGFR humanizado contra EGFR que compete tanto com EGF quanto com TGF-α para se ligar ao EGFR; e mAb 806 ou mAb 806 humanizado (Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29): 30375-30384 (2004)). O anticorpo anti-EGFR pode ser conjugado com um agente citotóxico, formando assim um imunoconjugado (veja-se, por exemplo, EP659.439A2, patente Merck GmbH). Exemplos de pequenas moléculas que se ligam ao EGFR incluem ZD1839 ou Gefitinib (IRESSA™; Astra Zeneca); CP-358774 ou Erlotinib (TARCEVA™; Genentech/OSI); e AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen); EMD-7200.

Um "inibidor de tirosina quinase" é uma molécula que inibe a actividade da tirosina quinase, tal como o receptor HER. Exemplos de tais inibidores incluem os fármacos contra EGFR notáveis no parágrafo precedente; Inibidores de tirosina quinase de pequenas moléculas de HER2, tal como TAK165 disponível pela Takeda; CP-724,714, um inibidor 63 ΕΡ1850874Β1 selectivo do receptor ErbB2 tirosina quinase oral (Pfizer e OSI); inibidor de HER duplo, tal como EKB-569 (disponível pela Wyeth) que se liga preferencialmente ao EGFR mas inibe ambas sobre-expressão de células HER2 e EGFR; GW572016 (disponível pela Glaxo) um inibidor de tirosina quinase HER2 e EGFR oral; PKI-166 (disponível pela Novartis); inibidores pan-HER, tal como (CI-1033; Pharmacia); inibidores de Raf-1, tal como o agente antissense ISIS-5132 disponível pela ISIS Pharmaceuticals que inibe a sinalização de Raf-1; inibidor de HER contra TK, tal como mesilato de Imatinib (Gleevec™) disponível pela Glaxo; inibidor da MAPK extracelular regulada pela quinase I CI-1040 (disponível pela Pharmacia); quinazolinas, tal como PD 153035,4-(3-cloroanilina) quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas; pirrolopirimidinas, tal como CGP 59326, CGP 60261 e CGP 62706; pirazolopirimidinas, 4-(fenilamina)-7H-pirrol[2,3-d] pirimidinas; curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis(4-fluoroanilino)ftalimida); tirfostinas contendo fracções de nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lamber); moléculas antissense (por exemplo, aquelas que se ligam ao codificador de ácido nucleico de HER) ; quinoxalinas (Patente US 5.804.396); trifostinas (Patente US 5.804.396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); inibidores de pan-HER, tal como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato de Imatinib (Gleevac; Novartis); PKI166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer) ; EKB-569 (Wyeth); Semaxinib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG) ; INC-1C11 (Imclone); ou como descrito em qualquer uma das seguintes Patentes US 5.804.396; documento WO 99/09016 (American Cyanimid); documento WO 98/43960 (American Cianamid); documento WO 97/38983 (Warner Lambert); documento WO 99/06378 (Warner Lambert); documento WO 99/06396 (Warner Lambert); documento WO 96/30347 (Pfizer, Inc); documento WO 96/33978 (Zeneca); 64 ΕΡ1850874Β1 documento WO 96/3397 (Zeneca); e documento WO 96/33980 (Zeneca).

Uma dose "pré-determinada" ou "exacta" de um agente terapêutico no presente refere-se a uma dose que seja administrada a um paciente humano sem levar em consideração o peso (P) ou a área de superfície corpórea (ASC) do paciente. A dose pré-determinada ou fixa consequentemente não é fornecida como uma dose em mg/kg ou mg/m2, mas preferivelmente como uma quantidade absoluta do agente terapêutico.

Uma dose de "ataque" no presente compreende geralmente de uma dose inicial de um agente terapêutico administrado a um paciente, e é seguido por uma ou mais dose de manutenção deste. Geralmente, uma única dose de ataque é administrada, mas doses de ataque múltiplas são contempladas no presente documento. Frequentemente, a quantidade de dose(s) de ataque administrada(s) excede(m) a quantidade de dose(s) de manutenção administrada(s) e/ou a(s) dose(s) de ataque é(são) administrada(s) mais frequentemente do que a(s) dose(s) de manutenção, a fim de se obter mais precocemente a concentração do agente terapêutico no estado estacionário desejado, quando comparado ao que pode ser obtido apenas com dose(s) de manutenção.

Uma dose de "manutenção" no presente refere-se a uma ou mais doses de um agente terapêutico administrado ao paciente sobre um período do tratamento. Geralmente, as doses de manutenção são administradas em intervalos espaçados de tratamento, tais como aproximadamente a cada semana, aproximadamente a cada 2 semanas, aproximadamente a cada 3 semanas, ou aproximadamente a cada 4 semanas. 65 ΕΡ1850874Β1 II. Produção De Anticorpos

Visto que, preferivelmente, o inibidor de dimerização de HER é um anticorpo, uma descrição seguida como técnicas exemplares para a produção de anticorpos HER. 0 antigénio HER a ser usado para a produção de anticorpos pode ser, por exemplo, uma forma solúvel do domínio extracelular do receptor HER ou uma parte deste, contendo o epítopo desejado. Alternativamente, células que expressam HER em suas superfícies (por exemplo, as células NIH- 3T3 transformadas para sobre-expressar HER2; ou uma linha celular de carcinoma, tal como as células SK-BR-3, veja-se, Stancovski et al. PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991)) podem ser utilizadas para gerar anticorpos. Outras formas de receptor HER útil para gerar anticorpos serão evidentes para os peritos na especialidade. (i) Anticorpos Policlonais

Os anticorpos policlonais são preferencialmente formados em animais por meio de múltiplas injecções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antigénio relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antigénio relevante a uma proteína que seja imunogénica na espécie a ser imunizada. Por exemplo, hemocianina de molusco keyhole, albumina de soro, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja, utilizando um agente bifuncional ou derivatizante, tal como sufossuccinimida de maleimidobenzoiléster (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, S0C12 ou R1N=C=NR, em que R e R1 são grupos alquilo diferentes.

Os animais são imunizados contra o antigénio, conjugados imunogénicos ou derivados por meio de 66 ΕΡ1850874Β1 combinação, por exemplo, 100 pg ou 5 pg da proteína ou conjugado (para coelhos ou ratinhos, respectivamente) com três volumes de adjuvante completo de Freund e injecção da solução de forma intradérmica em diversos locais. Um mês mais tarde, os animais são estimulados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de péptido ou conjugado em adjuvante completo de Freund, por meio de injecção subcutânea em diversos locais. Sete a 14 dias mais tarde, os animais são sangrados e o soro é testado para titulação de anticorpos. Os animais são estimulados até a paralisação do título. Preferencialmente, o animal é estimulado com o conjugado do mesmo antigénio, mas conjugado a uma proteína diferente e/ou através de um reagente de reticulação diferente. Os conjugados podem também ser feitos em cultura celular recombinante. Além disso, agentes agregantes tais como alúmen são apropriadamente utilizados para aumentar a resposta imune. (ii) Anticorpos Monoclonais Vários métodos para produzir anticorpos monoclonais no presente estão disponíveis no estado da técnica. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando o método de hibridoma descrito primeiramente por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), por método de ADN recombinante (Patente US n° 4.816.567).

No método de hibridoma, um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado na forma descrita acima para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são fusionados em seguida a células de mieloma, utilizando um agente de fusão apropriado, tal como 67 ΕΡ1850874Β1 o polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, págs. 59 a 103 (Academic Press, 1986)).

As células de hibridoma preparadas desta forma são germinadas e cultivadas num meio de cultura apropriado que contém, preferencialmente, uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não-fusionadas. Caso as células de mieloma parentais não contenham a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase (HGPRT ou HPRT), por exemplo, o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT) , com substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência em HGPRT. Células de mieloma preferidas são aquelas que se fusionam eficientemente, apoiam a produção estável em alto nível de anticorpos pelas células produtoras de anticorpos seleccionadas e são sensíveis a um meio, tal como meio HAT. Dentre estas, as linhas preferidas de células de mieloma são, linhas de mieloma murino, tais como as derivadas de tumores de ratinhos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis pela Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis pela Colecção Americana de Culturas Tipo, Rockville, Maryland, Estados Unidos. As linhas celulares de mieloma humano e heteromieloma humano/de ratinhos também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol. , 133: 3001 (1984); e Brodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc, Nova Iorque, Estados Unidos, 1987)). O meio de cultura em que são cultivadas células de 68 ΕΡ1850874Β1 hibridoma é analisado para determinar a produção de anticorpos monoclonais direccionados contra o antigénio. Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por meio de imunoprecipitação ou de um teste de ligação in vitro, tal como o radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunoadsorção ligado á enzima (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, por meio da análise de Scatchard descrita em Munson et ai. Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

Após a identificação de células de hibridoma gue produzem anticorpos de especificidade, afinidade e/ou actividade desejadas, os clones podem ser subclonados por meio da limitação de procedimentos de diluição e cultivados por meio de métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, págs. 59 a 103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura apropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo na forma de tumores de ascite num animal.

Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro por meio de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, tais como proteína A-Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, electroforese em gel, diálise ou cromatografia por afinidade. O ADN codificador dos anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo, sondas de oligonucleótidos que sejam capazes de se ligar, 69 ΕΡ1850874Β1 especificamente, a genes codificadores das cadeias pesada e leve de anticorpos murinos). As células de hibridoma servem como fonte preferida de tal ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são transfectados em seguida em células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de simios, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de imunoglobulina para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de análise sobre a expressão recombinante em bactérias de ADN que codificam o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992) .

Numa forma de realização adicional, anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorpos geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al. , J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), que descrevem o isolamento de anticorpos humanos e murinos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (no intervalo de nM) por meio da mistura de cadeias (Marks et al. Bio/Technology, 10: 779-783(1992)), bem como infecções combinatórias e recombinação in vivo como estratégia para a construção de bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al. Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Desta forma, essas técnicas alternativas são viáveis para o isolamento de anticorpos monoclonais pelas técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpos monoclonais. O ADN pode também ser modificado, por exemplo, por 70 ΕΡ1850874Β1 meio da substituição da sequência codificadora por domínios constantes de cadeia leve e pesada humana no lugar das sequências murinas homologas (Patente US 4.816.567; Morrison et al. Proc. Natl Acad. Sei. USA, 81: 6851 (1984)), ou por meio de ligação covalente da sequência codificadora de imunoglobulina, no todo ou em parte, com a sequência codificadora para um polipéptido não imunoglobulina.

Tipicamente, tais polipéptidos que não são imunoglobulina são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo ou são substituídos pelos domínios variáveis de um local de combinação de antigénio de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico que consta de um local de combinação ao antigénio especificidade para um antigénio e outro local de combinação de antigénio que possui especificidade para um antigénio diferente. (iii) Anticorpos Humanizados Métodos de humanização de anticorpos não humanos foram descritos no estado da técnica. Preferencialmente, um anticorpo humanizado contém um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes denominados resíduos "importados", que são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), por meio de substituição de sequências de regiões hipervariáveis pelas sequências correspondentes de anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos 71 ΕΡ1850874Β1 "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente US 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto tenha sido substituído pela sequência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que alguns resíduos de regiões hipervariáveis e, possivelmente, alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores. A selecção de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem utilizados no fabrico dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método denominado "melhor adequação", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é seleccionada em comparação com toda a biblioteca de sequências de domínio variável humanas conhecidas. A sequência humana mais próxima da sequência do roedor é aceita como a região estrutural humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Outro método utiliza uma região de estrutura específica derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol, 151: 2623 (1993)). E adicionalmente importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objectivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por meio de um processo de análise das sequências parentais e diversos 72 ΕΡ1850874Β1 produtos humanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e são familiares para os técnicos no assunto. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveis estruturas de conformação tridimensional de possíveis sequências de imunoglobulina seleccionadas. A inspecção dessas exibições permite a análise da provável função dos resíduos no funcionamento da possível sequência de imunoglobulina, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de ligar-se ao seu antigénio. Desta forma, os resíduos FR podem ser seleccionados e combinados a partir das sequências receptora e importada, de forma que seja atingida a característica desejada, tal como maior afinidade para o (s) antigénio (s) alvo(s). Geralmente, os resíduos da região hipervariável estão directamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação de antigénios. 0 documento WO 01/00245 descreve a produção dos anticorpos HER2 humanizados exemplares que se ligam a HER2 e bloqueiam a activação ligando do receptor HER. O anticorpo humanizado de interesse particular no presente bloqueia EGF, TGF-α e/ou a activação de MAPK mediada por HRG tão eficazmente quanto o anticorpo monoclonal murino 2C4 (ou um fragmento Fab deste) e/ou se liga a HER2 tão eficazmente quanto o anticorpo monoclonal murino 2C4 (ou um fragmento Fab deste). O anticorpo humanizado no presente pode, por exemplo, conter resíduos hipervariáveis de regiões não humanas incorporados no domínio variável pesado humano e pode adicionalmente conter uma substituição na região estrutural (FR) na posição seleccionada do grupo que consiste em 69H, 71H e 73H utilizando o sistema de numeração do domínio variável determinado em Kabat et al. 73 ΕΡ1850874Β1

Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Numa forma de realização, o anticorpo humanizado contém substituições em FR em duas ou todas as posições 69H, 71H e 73H.

Um exemplo de anticorpo humanizado de interesse no presente consta da complementaridade do domínio variável pesado determinado pelos resíduos GFTFTDYTMX, onde X é preferivelmente D ou S (SEQ ID No: 7); DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID No: 8); e/ou NLGPSFYFDY (SEQ ID No: 9), contendo opcionalmente modificações nos aminoácido dos resíduos da CDR, por exemplo, onde as modificações essencialmente mantêm ou melhoram a afinidade do anticorpo. Por exemplo, o anticorpo variante de interesse pode ter de aproximadamente 1, aproximadamente 7, ou aproximadamente 5 substituições de aminoácidos nas sequências pesadas variáveis do CDR acima. Tais anticorpos variantes podem ser preparados pela maturação por afinidade, por exemplo, como descrito a seguir. 0 anticorpo humanizado mais preferido consta da sequência de aminoácidos do domínio variável pesado SEQ ID No : 4 . 0 anticorpo humanizado pode constar de complementaridade no domínio leve variável determinado pelos resíduos KASQDVSIGVA (SEQ ID No: 10); SASYX1 X2X3, onde X1 é preferencialmente R ou L, X2 é preferencialmente Y ou E, e X3 é preferencialmente T ou S (SEQ ID No: 11); e/ou QQYYIYPYT (SEQ ID No: 12), por exemplo, além daqueles 2 resíduos do domínios variáveis pesado do CDR no parágrafo precedente. Tais anticorpos humanizados constam opcionalmente de modificações nos resíduos de CDR acima, por exemplo, quando as modificações essencialmente mantêm ou melhoram a afinidade do anticorpo. Por exemplo, o anticorpo variante de interesse pode ter aproximadamente de 74 ΕΡ1850874Β1 uma, aproximadamente sete ou aproximadamente cinco substituições na sequência de aminoácidos dos domínios leves variáveis do CDR acima. Tais anticorpos variantes podem ser preparados pela maturação por afinidade, por exemplo, como descrito a seguir. 0 anticorpo humanizado mais preferido consta da sequência de aminoácidos do domínio variável leve SEQ ID No: 3. 0 presente pedido contempla também os anticorpos maturados por afinidade que se ligam a HER2 e bloqueiam a activação ligando do receptor HER. 0 anticorpo de origem pode ser um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado, por exemplo, um que contenha as sequências variáveis leve e/ou pesada das sequências SEQ ID n° 3 e 4, respectivamente (isto é, contendo o VL e/ou VH do pertuzumab) . Os anticorpos maturados por afinidade se liga preferivelmente ao receptor HER2 com uma afinidade superior a do 2C4 murino ou do pertuzumab (por exemplo, tem aproximadamente duas ou quatro vezes, aproximadamente 100 vezes ou aproximadamente 1000 vezes a afinidade melhorada, por exemplo, avaliado utilizando ELISA para o domínio de HER2 extracelular (ECD)). Exemplos de substituições nos resíduos variáveis pesado do CDR incluem H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99, ou combinações de dois ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, ou sete destes resíduos). Exemplos de alterações nos resíduos variáveis leves do CDR incluem L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 ou combinações de dois ou mais (por exemplo, de dois a três, quatro, cinco ou até aproximadamente dez destes resíduos). Várias formas de anticorpo humanizado ou de anticorpo maturado por afinidade são contemplados. Por exemplo, o anticorpo humanizado ou anticorpo maturado por afinidade podem ser um fragmento de anticorpo, tal como uma porção Fab, a qual é opcionalmente conjugada com um ou mais agente 75 ΕΡ1850874Β1 citotóxico a fim gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo humanizado ou anticorpo maturado por afinidade pode ser um anticorpo intacto, tal como um anticorpo intacto de IgGl. 0 anticorpo intacto de IgGl preferido contém a seguência da cadeia leve SEQ ID No: 13 e a sequência da cadeia pesada SEQ ID No: 14. (iv) Anticorpos Humanos

Como uma alternativa para a humanização, podem ser gerados anticorpos humanos. É agora possível produzir, por exemplo, animais transgénicos (por exemplo, ratinhos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena. Descreveu-se, por exemplo, que a deleção homozigótica do gene da região de ligação de cadeia pesada de anticorpos (JH) em ratinhos quiméricos e mutantes de linha germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência do conjunto de genes de imunoglobulina da linha germinativa humana nesses ratinhos com mutação da linha germinativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante desafio dos antigénios. Veja-se, por exemplo, Jakobovits et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Yearin Immuno., 7: 33 (1993); e Patentes US 5.591.669, US 5.589.369 e US 5.545.807. Alternativamente, pode-se utilizar tecnologia de exibição de fagos (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)) para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitro a partir de repertórios génicos de domínio variável (V) de imunoglobulina de dadores não-imunizados. De acordo com esta técnica, os genes do domínio V de anticorpos são clonados estruturalmente num gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, 76 ΕΡ1850874Β1 tal como M13 ou fd, e exibidos na forma de fragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula do fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de ADN de cadeia simples do genoma do fago, as selecções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na selecção do gene codificador do anticorpo que exibe essas propriedades. Desta forma, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A exibição dos fagos pode ser realizada numa série de formas; para sua análise, veja-se, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Diversas fontes de segmentos de gene V podem ser utilizadas para exibição do fago. Clackson et al. Nature, 352: 624-628 (1991) isolaram um conjunto diverso de anticorpos antioxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados de baços de ratinhos imunizados. Um repertório de genes V de dadores humanos não-imunizados pode ser construído e anticorpos para um conjunto diverso de antigénios (incluindo auto-antigénios) podem ser isolados seguindo-se, essencialmente, as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), ou Griffith et al. , EMBO J. 12: 725-734 (1993). Veja-se também as Patentes US 5.565.332 e US 5.573.905 .

Como discutido acima, anticorpos humanos podem também ser gerados in vitro em células B activadas (veja-se as Patentes US 5.567.610 e US 5.229.275)

Os anticorpos HER2 humanos estão descritos na Patente US 5.772.997 emitida em 30 de Junho de 1998 e documento WO 97/00271 publicado em 3 de Janeiro de 1997. 77 ΕΡ1850874Β1 (v) Fragmentos de Anticorpos

Foram desenvolvidas diversas técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por meio da digestão proteolitica de anticorpos intactos (veja-se, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser agora produzidos directamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados, por exemplo, a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidos acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados directamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al. Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados directamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Outros métodos de produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo seleccionado é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Veja-se o documento WO 93/16185 e as patentes US 5.571.894 e US 5.587.458. O fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpo linear", por exemplo, conforme descrito na patente US 5.641.870. Tais fragmentos de anticorpos lineares podem ser monoespecificos ou biespecificos. (vi) Anticorpos Biespecificos

Os anticorpos biespecificos são anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Os anticorpos biespecificos podem exemplarmente se ligar a dois epítopos diferentes da proteína HER2. Outros anticorpos biespecificos podem combinar um local de 78 ΕΡ1850874Β1 ligação com HER2 com um EGFR, HER3 e/ou HER4. Alternativamente, um braço de HER2 pode ser combinado a um braço que se liga a uma molécula activadora de leucócito, tal como uma molécula do receptor da célula T (por exemplo, CD2 ou CD3) , ou a receptores Fc para IgG (FcyR) , como o FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD 16) para focar mecanismos de defesa celulares à célula expressando HER2. Os anticorpos biespecíficos podem também ser usados localizar agentes citotóxicos em células que expressam HER2. Estes anticorpos possuem um braço de ligação à HER2 e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, a saporina, anti-interferão-α, alcaloide vinca, cadeia de ricina A, metotrexato ou um isótopo hapteno radioactivo). Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento completo ou fragmentos destes (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2)· 0 documento WO 96/16673 descreve um anticorpo biespecífico de HER2/FcyRIM e a Patente US 5.837.234 divulga um anticorpo biespecífico HER2/FC7RI IDM1 (Osidem). Um anticorpo biespecífico de HER2/Fca é demonstrado no documento WO 98/02463. A patente US 5.821.337 ensinam um anticorpo biespecífico HER2/CD3. MDX-210 é um anticorpo biespecífico HER2-FcyRI11. Métodos de fabrico de anticorpos biespecíficos são conhecidos no estado da técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias possuem especificidades diferentes (Millstein et al. Nature, 305: 537-539 (1983)). Devido à selecção aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a 79 ΕΡ1850874Β1 estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é normalmente realizada por meio de etapas de cromatografia por afinidade é um tanto problemática, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares estão descritos no documento WO 93/08829 e em Traunecker et al. EMBOJ. 10: 3655-3659 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação de anticorpos e antigénios) são fusionados a sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão ocorre, preferencialmente, com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende de pelo menos parte das regiões de articulação, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) contendo o local necessário para ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os ADN que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vectores de expressão separados e são co- transfectados num organismo hospedeiro apropriado. Isso proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipéptidos em realizações quando razões desiguais das três cadeias de polipéptidos utilizadas na construção fornecerem os rendimentos ideais. É possível, entretanto, inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipéptidos num vector de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipéptidos em razões iguais resulta em altos rendimentos ou quando as razões não apresentarem uma significância específica.

Numa forma de realização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade 80 ΕΡ1850874Β1 de ligação num braço, e um par de cadeias leve e cadeia pesada de imunoglobulina híbrida (que proporciona uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Concluiu-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, pois a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica proporciona uma forma fácil de separação. Esta abordagem é descrita no documento WO 94/04690. Para pormenores adicionais de geração de anticorpos biespecíficos, veja-se, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210(1986).

De acordo com uma outra abordagem descrita na Patente US 5.731.168, a superfície intermediária entre um par de moléculas de anticorpos pode ser construída de forma a maximizar o percentual de heterodímeros que é recuperado na cultura de células recombinantes. A interface preferida consta de pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante do anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenos da superfície intermediária da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (tais como tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas sobre a superfície intermediária da segunda molécula de anticorpo por meio da substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos com cadeias menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isso proporciona um mecanismo de aumento do rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros.

Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Um dos anticorpos heteroconjugados pode ser acoplado, por exemplo, a avidina 81 ΕΡ1850874Β1 e o outro a biotina. Esses anticorpos foram propostos, por exemplo, para direccionar as células do sistema imunológico contra as células indesejadas (Patente US 4.676.980) e para o tratamento de infecções por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 e patente EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser fabricados utilizando qualquer método reticulante conveniente. Agentes reticulantes apropriados são bem conhecidos no estado da técnica e estão descritos na Patente US 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas de reticulação.

As técnicas de geração de anticorpos biespecificos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Anticorpos biespecificos podem ser preparados, por exemplo, utilizando ligações quimicas. Brennan et al. Science, 229: 81 (1985) descreve um procedimento em que anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante de ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditíóis vicinais e evitar a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são, então, convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-TNB é então reconvertido no Fab-tiol por meio da redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecifico. Os anticorpos biespecificos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização selectiva de enzimas.

Recentes progressos facilitaram a recuperação directa de fragmentos Fab'-SH da E. coli, que pode ser acoplada quimicamente para formar anticorpos biespecificos. Shalaby et al. J. Exp. Med., 175: 217 - 225 (1992) descrevem a produção de um anticorpos biespecifico F(ab')2 inteiramente 82 ΕΡ1850874Β1 humanizado. Cada fragmento de Fab segregado foi separado da E. coli e submetido ao acoplamento químico directo in vitro para formar o anticorpo biespecífico. 0 anticorpo biespecífico formado podia assim se ligar às células que sobre-expressavam o receptor HER2 e as células T normais de ser humano, bem como activar a actividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra o tumor de mama humano.

Diversas técnicas para o fabrico e o isolamento de fragmentos de anticorpos biespecíficos directamente a partir da cultura celular recombinante também foram descritas. Anticorpos biespecíficos foram produzidos, por exemplo, utilizando zíperes de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992). Os péptidos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por meio de fusão génica. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de articulação para formar monómeros e, em seguida, novamente oxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia de "diacorpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para o fabrico de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligando que é curto demais para permitir o emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia. Consequentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelharem-se com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, de maneira a formar dois locais de ligação de antigénios. Outra estratégia de fabrico de fragmentos de anticorpos biespecíficos utilizando dímeros Fv de cadeia 83 ΕΡ1850874Β1 única (sFv) também foi relatada. Veja-se Gruber et ai., J. Immunol., 152: 5368 (1994). São contemplados anticorpos com mais de duas valências. Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991). (vii) Outras Modificações na Sequência de Aminoácidos É(são) contemplada(s) modificação(ões) na sequência de aminoácidos de anticorpo descritos no presente documento. Pode ser desejável, por exemplo, aprimorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de sequências de aminoácidos do anticorpo são preparados por meio da introdução apropriada de mudanças de nucleótidos no ácido nucleico do anticorpo ou por meio da síntese de péptidos. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As mudanças de aminoácidos podem também alterar os processos pós-tradução do anticorpo, tais como a mudança do número ou posição dos locais de glicosilação.

Um método útil de identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são locais preferidos para a mutagénese é denominado "mutagénese por varredura de alanina", conforme descrito por Cunningham e Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989). No presente, um resíduo ou grupo de resíduos desejados é identificado (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (de maior preferência, alanina ou polialanina) 84 ΕΡ1850874Β1 para afectar a interacção dos aminoácidos com o antigénio. Esses locais de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições são refinados, em seguida, por meio da introdução de outras variações ou adicionais nos locais de substituição ou para os mesmos. Desta forma, embora o local para introdução de uma variação de sequência de aminoácidos seja previamente determinado, a natureza da mutação per se não necessita ser previamente determinada. Para analisar o desempenho de uma mutação num dado local, por exemplo, a varredura de ala ou mutagénese aleatória é conduzida ao codão alvo ou região alvo e as variantes de anticorpos expressas são seleccionadas para a actividade desejada.

As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões de amino- e/ou carboxi-terminais que variam de comprimento de um resíduo até polipéptidos que contenham 100 ou mais resíduos, bem como inserções intra- sequenciais de resíduos de aminoácidos isolados ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionilo N- terminal ou o anticorpo fusionado a um polipéptido citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N- ou C-terminal do anticorpo de uma enzima (por exemplo, por ADPET) ou um polipéptido que aumente a semivida do anticorpo em soro.

Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácidos. Estas variantes contêm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo é substituída por um resíduo diferente. Os locais de maior interesse para a mutagénese de substituição de anticorpos incluem as regiões hipervariáveis, mas também são contempladas alterações de FR. As substituições conservadoras são exibidas no Quadro 1 sob o título "substituições preferidas". Caso tais substituições 85 ΕΡ1850874Β1 resultem numa mudança da actividade biológica, mudanças mais substanciais, denominadas "exemplos de substituições" no Quadro 1 ou conforme descrito a seguir com referência a classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos seleccionados.

Quadro 1

Resíduo original Exemplos de substituições Substituições preferidas Ala (A) Val; Leu; De Val Arg (R) Lys; Gin; Asn Lys Asn (N) Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gin (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gin Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg He (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu Leu (L) Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Vai (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu

Modificações substanciais das propriedades biológicas do anticorpo são atingidas por meio da selecção de substituições que diferem significativamente no seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeia principal de polipéptido na área da substituição, por exemplo, na forma de folha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ou 86 ΕΡ1850874Β1 hidrofobicidade da molécula no local desejado; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, em Biochemistry, segunda Ed., págs. 73-75, Worth Publishers, Nova Iorque (1975)): (1) apoiar Ala (A), Vai (V), Leu (L) , Ile (I), Pro (P), Fen (F) , Trp (W) , Met (M) (2) polar não carregada: Gly (G) , Ser (S) , Tre (T) , Cis (C) , Tyr (Y), Asn (N), Gin (Q) (3) ácido: Asp (D), Glu (E) (4) básico: Lis (K), Arg (R), His (H)

Alternativamente, os resíduos naturais podem ser divididos em grupos baseados nas propriedades comuns da cadeia lateral. (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ile; (2) hidrofílico neutro: Cis, Ser, Tre, Asn, Gin; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lis, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Fen 87 ΕΡ1850874Β1

Substituições não conservadoras causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada do anticorpo pode também ser substituído, geralmente com serina, para aprimorar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar uma reticulação aberrante. Por outro lado, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para aumentar a sua estabilidade (particularmente, quando o anticorpo for um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).

Um tipo particularmente preferido de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a(s) variante (s) resultante (s) seleccionada (s) para desenvolvimento adicional terá(ão) propriedades biológicas aprimoradas com relação ao anticorpo parental do qual é(são) gerado (s) . Uma forma conveniente de geração de tais variantes de substituição é a maturação por afinidade utilizando exibição de fagos. Resumidamente, diversos locais de regiões hipervariáveis (por exemplo, 6 a 7 locais) sofrem mutações para gerar todas as substituições amino possíveis em cada local. As variantes de anticorpos geradas desta forma são exibidas de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos na forma de fusões para o produto de gene III de M13 embalado dentro de cada partícula. As variantes exibidas por fago são, então, seleccionadas de acordo com a sua actividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) conforme descrita no presente documento. A fim de identificar possíveis locais de regiões hipervariáveis para modificação, mutagénese por varredura de alanina pode ser realizada para identificar 88 ΕΡ1850874Β1 resíduos de regiões hipervariáveis que contribuem significativamente para a ligação de antigénios. Alternativamente ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar a estrutura cristalina do complexo de antigénio e anticorpo para identificar pontos de contacto entre o anticorpo e o HER2 humano. Tais resíduos de contacto e resíduos vizinhos são candidatos à substituição de acordo com as técnicas elaboradas no presente documento. Após a geração de tais variantes, o quadro de variantes é submetido à selecção conforme descrito no presente e os anticorpos com propriedades superiores num ou mais testes relevantes podem ser seleccionados para desenvolvimento adicional.

Um outro tipo de variante de aminoácidos do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Tal alteração inclui a deleção de uma ou mais porções de hidrato de carbono encontradas no anticorpo e/ou a adição de um ou mais locais de glicosilação que não estejam presentes no anticorpo. A glicosilação de polipéptidos é tipicamente N-ligada ou 0- ligada. N-ligado designa a ligação da porção de hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripéptidos asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido, com excepção de prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática da porção hidrato de carbono à cadeia lateral de asparagina. Por esta razão, a presença de qualquer dessas sequências de tripéptidos num polipéptido cria um local de glicosilação potencial. A gl icosilação 0-ligada designa a ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora também possam ser utilizadas 5-hidroxiprolina ou 5- 89 ΕΡ1850874Β1 hidroxilisina. A adição de locais de glicosilação ao anticorpo é convenientemente conseguida por meio da alteração da sequência de aminoácidos, de forma que contenha uma ou mais das sequências de tripéptidos descritas acima (para locais de glicosilação N-ligados). A alteração pode também ser feita por meio da adição ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para locais de glicosilação O-ligados).

Quando o anticorpo consta de uma região Fc, o hidrato de carbono ligado a tal anticorpo pode ser alterado. Por exemplo, anticorpos com uma estrutura de hidrato de carbono madura que não contém fucose ligada a uma região Fc do anticorpo, são descritos no pedido de patente US 2003/0157108 Al, Presta, L. veja-se também a Patente US 2004/0093621 Al (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) . Anticorpos com N-acetilglucosamina (GlcNAc) bisseccionada no hidrato de carbono ligado a uma região Fc do anticorpo são indicados no documento WO 03/011878, Jean-Mairet et al., e na patente US 6.602.684, Umana et al., Anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacárido ligado a uma região Fc do anticorpo são relatados no documento WO 97/30087, Patel et al. Veja-se, também os documentos WO 98/58964 (Raju, S.) e WO 99/22764 (Raju, S.) referentes a anticorpos com hidrato de carbono alterado ligados a sua região Fc.

Pode ser desejável modificar o anticorpo com respeito à função efectora, por exemplo, de modo a melhorar a citotoxicidade mediada por célula dependente de antigénio (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) d anticorpo. Isto pode ser conseguido pela introdução de uma ou mais substituições de aminoácido numa região de Fc 90 ΕΡ1850874Β1 do anticorpo. Alternativamente ou adicionalmente, resíduos de cisteína podem ser introduzidos na região Fc, deste modo permitindo a formação deligação dissulfureto intercadeia nesta região. 0 anticorpo homodimérico gerado deste modo pode ter capacidade melhorada de internalização e/ou morte de célula mediada por complemento aumentada e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Veja-se Caron et al., J. Exp Med. 17 6:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com actividade anti-tumoral melhorada pode may também ser preparado ao utilizar reticulantes heterobifuncionais como é descrito em Wolff et al. Câncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, um anticorpo can ser modificado por engenharia que tem regiões duais Fc e pode deste modo ter lise de complemento melhorada e capacidades de ADCC. Veja-se Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). O documento WO00/42072 (Presta, L.) descreve anticorpos com de ADCC melhorada na presença de células efectoras humanas, onde os anticorpos compreendem substituições de aminoácido na região Fc do mesmo. Preferivelmente, o anticorpo com ADCC melhorado consta de substituições nas posições 298, 333, e/ou 334 da região de Fc (numeração Eu de resíduos). Preferivelmente a região alterada de Fc é uma região IgGl humano constando ou que compreende de uma, duas ou três destas posições. Tais substituições são opcionalmente combinadas com as substituições que aumentam a ligação de Clq e/ou CDC.

Os anticorpos com ligação Clq e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) alterada são descritos no documento WO 99/51642, patentes US 6.194.551 Bl, US 6.242.195 Bl, US 6.528.624 Bl e US 6.538.124 (Idusogie et al.). Os anticorpos compreendem uma substituição de 91 ΕΡ1850874Β1 aminoácido numa ou mais das posições de aminoácidos 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 e/ou 334 de sua região Fc (numeração Eu de resíduos).

Para aumentar a semivida do anticorpo no soro, pode-se incorporar um epítopo ligado ao receptor de recuperação do anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo), conforme descrito, por exemplo, na patente US 5.739.277. Da forma como utilizada no presente, a expressão "epítopo de ligação do receptor recuperado" designa um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgGi IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da semivida em soro in vivo da molécula de IgG.

Anticorpos com substituições numa de suas regiões Fc neonatal (FcRn) e maior semivida em soro também estão descritos no documento WO 00/42072 (Presta, L.) e patente US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estes anticorpos constam de uma região Fc com uma ou mais substituição nestes que melhoram a ligação da região Fc a região FcRn. Por exemplo, a região Fc pode ter substituições numa ou mais das posições 238.250, 256, 265.272.286, 303, 305, 307, 311, 312.314, 317.340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382.413.424, 428 ou 434 (numeração Eu de resíduos). O anticorpo contendo uma região Fc variante preferido com ligação ao FcRn melhorada contém substituições de aminoácido numa, duas ou três das posições 307, 380 e 434 da região de Fc deste (numeração Eu de resíduos).

Anticorpos elaborados com três ou mais (preferencialmente quatro) locais de ligação de antigénios funcionais também são contemplados (pedido de patente US 2002/0004587 Al, Miller et al.).

Moléculas de ácidos nucleicos que codificam variantes 92 ΕΡ1850874Β1 da sequência de aminoácidos do antagonista são preparadas por meio de uma série de métodos conhecidos no estado da técnica. Estes métodos incluem, mas não se limitam a, o isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de sequências de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por meio de mutagénese mediada por oligonucleótido (ou local-direccionada), mutagénese por PCR e cassete de mutagénese de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não-variante do anticorpo. (viii) Selecção de Anticorpos com Propriedades Desejadas

As técnicas para produção de anticorpos foram descritas acima. É possível adicionalmente seleccionar anticorpos com determinadas características biológicas, como for desejado.

Para identificar um anticorpo que bloqueie a activação ligando do receptor HER, a habilidade do anticorpo de bloquear HER se ligando às células que expressam receptor HER (por exemplo, na conjugação com outro receptor com o qual o receptor HER de interesse forma um hetero-oligomero HER) pode ser determinada. Por exemplo, células que expressam naturalmente, ou foram transfectadas para expressar, receptores HER de hetero-oligomero HER podem ser incubadas com anticorpo e então serem expostos ao ligando de HER marcado. A habilidade do anticorpo de bloquear o ligando que liga ao receptor HER no hetero-oligomero HER pode então ser avaliada.

Por exemplo, a inibição da ligação do HRG na linha de células de tumor de mama MCF7 pelos anticorpos HER2 pode ser executada utilizando culturas em monocamadas de MCF7 em gelo em placas de 24 poços como descrito no documento WO 01/00245. Os anticorpos monoclonais HER2 podem ser 93 ΕΡ1850874Β1 adicionados a cada poço e incubados durante 30 minutos com ΓΗΚΘβΙ 177-224 marcada com I125 (25 pm) e então pode ser adicionado, e a incubação pode durar de 4 a 16 horas. As curvas de dose resposta podem ser preparadas e o valor de IC50 pode ser calculado para o anticorpo de interesse. Numa forma de realização, o anticorpo que bloqueia a activação ligando do receptor HER terá um IC50 para inibir a ligação do HRG nas células MCF7 neste ensaio a aproximadamente 50 nM ou menos, mais preferivelmente 10 nM ou menos. Quando um anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fab, o IC50 para inibir a ligação do HRG nas células MCF7 neste ensaio pode, por exemplo, ser cerca de 100 nM ou menos, mais preferivelmente 50 nM ou menos.

Alternativamente, ou adicionalmente, a habilidade de um anticorpo bloquear a fosforilação de tirosina do receptor HER estimulada por um ligando de HER presente num hetero-oligomero HER pode ser avaliada. Por exemplo, as células que expressam ou células transfectadas para expressar endogenamente o receptor HER, podem ser incubadas com o anticorpo e então realizado o ensaio para avaliar a actividade de fosforilação de tirosina dependente de ligando de HER utilizando um antifosfotirosina monoclonal (que é opcionalmente conjugado com um marcador detectável). O ensaio de activação do receptor quinase descrito na patente US 5.766.863 é também disponível para determinar a activação e o bloqueio desta actividade por um anticorpo.

Numa forma de realização, pode-se seleccionar um anticorpo que iniba a fosforilação da tirosina pl80 pela estimulação do HRG em células essencialmente MCF7 como descrito no documento WO 01/00245. Por exemplo, as células MCF7 podem ser plaqueadas em placas de 24 poços e os anticorpos monoclonais HER2 foram adicionados a cada poço e incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente; então 94 ΕΡ1850874Β1 o rHRGpii77-244 foi adicionado a cada poço a uma concentração final de 0,2 nM, e a incubação durou durante 8 minutos. Os meios de cada poço foram aspirados, e as reacções paradas pela adição de 100 μΐ de tampão de amostra SDS (5% SDS, 25 mM de DTT, e 25 mM de Tris-HCl, pH 6,8) . Foi feita a electroforese de cada amostra (25 μΐ) em gel com gradiente de 4-12% (Novex) e então electroforeticamente transferidos à membrana de difluorido polivinilideno. Imunoblots de antifosfotirosina (em 1 pg/ml) podem ser desenvolvidos, e a intensidade da banda reactiva predominante no M, -180.000 pode ser quantificada por densitometria da reflectividade. O anticorpo seleccionado ira preferivelmente inibir significativamente a fosforilação da tirosina pl80 pela estimulação do HRG a aproximadamente 0-35% do controlo neste ensaio. As curvas de dose resposta para a inibição da fosforilação da tirosina pl80 pela estimulação do HRG podem ser preparadas e o valor de IC50 pode ser calculado para o anticorpo de interesse. Numa forma de realização, o anticorpo que bloqueia a activação ligando do receptor HER terá um IC50 para inibir a fosforilação da tirosina pl80 pela estimulação do HRG neste ensaio a aproximadamente 50 nM ou menos, mais preferível mente a 10 mM ou menos. Quando um anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fab, o IC50 para inibir a fosforilação da tirosina pl80 pela estimulação do HRG neste ensaio pode, por exemplo, ser cerca de 100 nM ou menos, mais preferivelmente 50 nM ou menos.

Pode também avaliar-se os efeitos inibitórios de crescimento do anticorpo nas células MDA-MB-175, por exemplo, essencialmente como descritas em Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997). De acordo com este ensaio, as células MDA-MB-175 podem ser tratadas com um anticorpo monoclonal HER2 (10 pg/ml) durante 4 dias e coradas com cristal de violeta. A incubação com o anticorpo HER2 pode 95 ΕΡ1850874Β1 demonstrar um efeito inibitório do crescimento nesta linha de célula similar àquela indicada pelo anticorpo monoclonal 2C4 . Numa forma de realização adicional, o HRG exógeno não inverterá significativamente esta inibição. Preferivelmente, o anticorpo inibe a proliferação celular das células MDA-MB-175 a uma extensão maior do que do anticorpo monoclonal 4D5 (e opcionalmente a uma extensão maior do que do anticorpo monoclonal 7F3), na presença e na ausência de HRG exógeno.

Numa forma de realização, o anticorpo HER2 de interesse pode bloquear a associação de HER2 dependente de heregulina com o HER3 em ambas as células MCF7 e SK-BR-3 como determinadas numa experiência de co-imunoprecipitação, tal como o descrito no documento WO 01/00245 substancialmente mais eficaz do que o anticorpo monoclonal 4D5, e preferivelmente mais eficaz do que o anticorpo monoclonal 7F3.

Para identificar anticorpos HER2 inibidores de crescimento, pode ser feita a selecção de anticorpos que inibem o crescimento de células de cancro que sobre-expressam HER2. Numa forma de realização, o anticorpo inibidor de crescimento de escolha pode inibir o crescimento das células SK- BR-3 em cultura de células em aproximadamente 20-100% e preferivelmente aproximadamente 50-100% numa concentração do anticorpo de aproximadamente 0,5 a 30 yg/ml. Para identificar tais anticorpos, o ensaio com SK-BR-3 descrito na patente US 5.677.171 pode ser executado. De acordo com este ensaio, as células SK-BR-3 são crescidas numa mistura de 1: 1 do meio F12 e DMEM suplementada com o soro bovino fetal 10%, glutamina e estreptomicina /penicilina. As células SK-BR-3 são plaqueadas a 20.000 células numa placa de cultura celular de 35 mm (placas de 2 mls/35 mm) . 0,5 a 30 pg/ml de 96 ΕΡ1850874Β1 anticorpo HER2 são adicionados por placa. Após seis dias, o número de células comparado as células não tratadas são contadas utilizando um contador de células electrónico COULTER™. Aqueles anticorpos que inibem o crescimento das células SK-BR-3 em aproximadamente 20-100% ou aproximadamente 50-100% podem ser seleccionadas como anticorpos inibidores de crescimento. Veja-se, patente US 5.677.171 para ensaios de selecção de anticorpos inibidores de crescimento, tais como 4D5 e 3E8. A fim de seleccionar os anticorpos que induzem a apoptose, um ensaio de ligação da anexina que utiliza células BT 4 7 4 está disponível. As células BT474 são cultivadas e semeadas nas placas como discutidas no parágrafo precedente. O meio é então removido e substituído por somente meio ou meio que contêm 10 pg/ml de anticorpo monoclonal. Depois de um período de incubação de três dias, as monocamadas de células são lavadas com PBS e descoladas pela tripsinização. As células são então centrifugadas, resuspendidas em tampão de Ca2+ e aliquotadas em tubos como discutido acima para o ensaio de morte celular. Os tubos recebem então a anexina marcada (por exemplo, anexina V-FTIC) (1 pg/ml). As amostras podem ser quantificadas utilizando-se um citómetro de fluxo FACSCAN™ e o programa FACSCONVERT™ CelIQuest (Becton Dickinson). Aqueles anticorpos que induzem a níveis estatisticamente significantes de ligação da anexina comparada ao controlo são seleccionados como anticorpos indutores de apoptose. Além do ensaio de ligação da anexina, um ensaio de coloração de ADN que usa células BT474 está disponível. A fim de executar este ensaio, as células BT474 que foram tratadas com o anticorpo de interesse como descrito nos dois parágrafos precedentes foram incubadas com 9 pg/ml de HOECHST 33342™ durante 2 horas a 37°C, e em seguida analisadas num citómetro de fluxo EPICS ELITE™ (Coulter 97 ΕΡ1850874Β1

Corp.) que usa o software MODFIT LT™ (Verity Software House). Os anticorpos que induzem uma mudança na percentagem de células apoptóticas 2 vezes maior (e preferivelmente 3 vezes maior) do que células não tratadas (até 100% de células apoptóticas) podem ser seleccionados como anticorpos pró-apoptóticos utilizando este ensaio. Veja-se, documento WO 98/17797 para ensaios de selecção de anticorpos que induzem a apoptose, tal como o 7C2 e 7F3.

Para seleccionar anticorpos que se ligam a um epítopo na local de HER2 de interesse, um ensaio de bloqueio cruzado rotineiro, tal como aquele descrito em Anticorpos, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow e David Lane (1988), pode ser executado, tal como um 2C4 ou pertuzumab, para HER2. Alternativamente ou adicionalmente, o mapeamento do epítopo pode ser executado por métodos conhecidos no estado da técnica e/ou pode-se estudar a estrutura do anticorpo HER2 (Franklin et al. Câncer Cell 5: 317-328 (2004)) para ver qual o(s) domínio(s) do HER2 está (estão) ligados pelo anticorpo. (ix) Composições do Pertuzumab

Numa forma de realização de uma composição do anticorpo HER2, a composição consta de uma mistura de anticorpo pertuzumab e um ou mais variantes principais da espécie deste. A forma de realização preferida de um anticorpo pertuzumab variante principal da espécie no presente documento é aquele que contém a as sequências de aminoácidos variável leve e variável pesada nas SEQ ID n° 3 e 4, e conste mais preferivelmente de sequências de aminoácidos variável leve e variável pesada seleccionada das SEQ ID No: 13 e 17, e sequências de aminoácidos da cadeia pesada seleccionada SEQ ID No: 14 e 18 (incluindo sequências variantes deamidatadas e/ou oxidadas). Numa 98 ΕΡ1850874Β1 forma de realização, a composição consta de uma mistura de anticorpos variantes principais da espécie pertuzumab e de uma sequência de aminoácidos variante que contém uma extensão do amino-terminal principal. Preferivelmente, a extensão do lider amino-terminal está numa cadeia leve variante do anticorpo (por exemplo, numa ou duas cadeias leves variantes do anticorpo). 0 anticorpo HER2 principal da espécie ou anticorpo variante podem ser um anticorpo inteiro ou um fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos Fab de F(ab')2)r mas ambos são preferencialmente anticorpos de comprimento completo. Os anticorpos variantes no presente podem conter uma extensão lider amino-terminal em qualquer uma ou mais cadeias leves ou pesadas destes. Preferencialmente, a extensão amino-terminal lider está numa ou duas cadeias leves do anticorpo. A extensão amino-terminal lider compreende ou consiste em VHS-. A presença da extensão amino-terminal lider na composição pode ser detectada por várias técnicas analíticas incluindo, mas não limitadas à análise de sequência N-terminal, ensaio de carga de heterogeneidade (por exemplo, cromatografia de troca catiónica ou electroforese de zona capilar), espectrometria de massa, etc. A quantidade de variante de anticorpo na composição varia geralmente de uma quantidade que constitua o limite de detecção de qualquer ensaio (preferivelmente na análise de sequência N-terminal) usado para detectar uma quantidade de variante para uma quantidade menor que a quantidade de anticorpo principal da espécie. Geralmente, aproximadamente 20% ou menos (por exemplo, aproximadamente de 1% a 15%, por exemplo, de 5% a 15%) das moléculas de anticorpo da composição contém uma extensão do amino-terminal. Tais quantidades de percentagem são determinadas preferivelmente usando a análise quantitativa da sequência N-terminal ou a análise da troca catiónica (que usam preferivelmente uma coluna de alta resolução, coluna de troca fraca de catião, tal como uma 99 ΕΡ1850874Β1 coluna de troca de catião PROPAC WCX-10™). Com excepção da variante da extensão amino-terminal líder, alterações adicionais na sequência de aminoácido do anticorpo principal da espécie e/ou o variante são contemplados, incluindo mas não limitados a, um anticorpo contendo o resíduo N-terminal de lisina numa ou ambas cadeias pesadas, um anticorpo variante deamidatado, etc.

Além disso, o anticorpo principal da espécie ou variante podem adicionalmente conter variações de glicosilação, não se limitando exemplos dos quais incluem o anticorpo que consta da estrutura de oligossacárido G1 ou G2 ligada à região Fc deste, anticorpo que contém uma fracção de hidrato de carbono ligada a uma cadeia leve deste (por exemplo, uma ou duas fracções de hidrato de carbono, tais como a glicose ou a galactose, ligado a uma ou duas cadeias leves do anticorpo, por exemplo, ligado a um ou mais resíduos de lisina), anticorpo que contém uma ou duas cadeias pesadas não-glicosilada, ou anticorpo que contenha um oligossacárido sialidatado ligado a uma ou duas cadeias pesadas deste, etc. A composição pode ser recuperada de uma linha de células geneticamente construída, por exemplo, uma linha de células de ovário de hamster chinês (CHO) que expressa o anticorpo HER2, ou pode ser preparada pela síntese de péptidos. (x) Imunoconjugados A invenção pertence também aos imunoconjugados ou a anticorpos conjugados a um agente citotóxico tal como um agente quimioterápico, fármaco, agente inibidor de crescimento, toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente activa de origem bacteriana, fúngica, 100 ΕΡ1850874Β1 vegetal ou animal, ou fragmentos destes) ou um isótopo radioactivo (isto é, um radioconjugado).

Agentes quimioterápicos úteis na geração de tais imunoconjugados foram descritos acima. Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, tais como um caliqueamicina, um maitansina (Patente U.S. N° 5.208.020), um tricoteno, e CC1065 são também contemplados no presente documento.

Numa forma de realização da presente invenção, o anticorpo é conjugado a uma ou mais moléculas de maitansina (por exemplo, cerca de 1 a cerca de 10 moléculas de maitansina por molécula de anticorpo). Maitansina pode ser convertida, por exemplo, em May-SS-Me, que pode ser reduzido em May-SH3 e reagido com anticorpo modificado (Chari et ai., Câncer Research 52: 127-131 (1992)) para gerar um conjugado de anticorpo e maitansinóide.

Outro imunoconjugado de interesse compreende um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas caliqueamicina. A família caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir rupturas de ADN de cadeia dupla em concentrações sub-picomolares. Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas não se limitam a, Yi1, OÍ21»· OÍ31, N-acetil-γι1, PSAG e θ\ (Hinman et al. ., Câncer Research 53: 3336-3342 (1993) e Lode et al., Câncer

Research 58: 2925-2928 (1998)). Veja-se, também, Patentes US N°. 5.714.586; 5.71.374; 5.264.586 e 5.773.001.

Toxinas enzimaticamente activas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem a cadeia A da difteria, fragmentos activos não-ligandos da toxina de difteria, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de rícino, cadeia A da abrina, cadeia A da modeccina, a- 101 ΕΡ1850874Β1 sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogellina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Veja-se, por exemplo, o documento WO 93/21232, publicado em 28 de Outubro de 1993. A presente invenção contempla adicionalmente um anticorpo conjugado a um composto com actividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma endonuclease de ADN, tal como uma desoxirribonuclease; DNase).

Uma série de isótopos radioactivos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu.

Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser fabricados utilizando uma série de agentes acopladores de proteínas bifuncionais, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), cicloexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCL), ésteres activos (tais como suberato de di-succinimidilo) , aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(para-azidobenzoil)- hexanodiamina), derivados bis-diazónio (tais como bis-(para-diazoniobenzoil)- etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolieno) e compostos fluorados bis-activo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Pode-se preparar, por exemplo, uma imunotoxina ricina, conforme descrito em Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). Ácido l-isotiocianatobenzil-3- 102 ΕΡ1850874Β1 metildietileno triaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é exemplo de um agente quelante para conjugação de radionucleótido ao anticorpo. Veja-se o documento WO 94/11026. O ligando pode ser um "ligando clivável" que facilita a libertação do fármaco citotóxico na célula. Pode-se utilizar, por exemplo, um ligando de ácido lábil, ligando sensível a peptidase, ligando de dimetilo ou ligando que contém dissulfeto (Chari et al. Câncer Research 52: 127-131 (1992)) .

Alternativamente, uma proteína de fusão que compreende o anticorpo e agente citotóxico pode ser elaborada, por exemplo, por meio de técnicas recombinantes ou síntese de péptidos.

Outros imunoconjugados são contemplados no presente documento. Por exemplo, o anticorpo pode estar ligado a uma variedade de polímeros não proteáceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialquilenos ou co-polímeros de polietilenoglicol e polipropilenoglicol. Os anticorpos podem também ser armazenados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas coacervação ou polimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e de poli-(metacrilato de metilo) , respectivamente, em sistemas de fornecimento de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Ditas técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

Os anticorpos descritos no presente podem também ser formulados como lipossomos. Os lipossomos que contêm o anticorpo são preparados por meio de métodos conhecidos na técnica, conforme descrito, por exemplo, em Epstein et al., 103 ΕΡ1850874Β1

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 4030 (1980); Patentes US 4.485.045 e US 4.544.545; e documento WO 97/38731 publicado em 23 de Outubro de 1997. Lipossomos com maior tempo de circulação são descritos na Patente US 5.013.556.

Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados por meio do método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeos que compreende fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Lipossomos são extraídos através de filtros com tamanho de poro definido para gerar lipossomos com o diâmetro desejado. Os fragmentos Fab' de um anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser conjugados aos lipossomos descritos em Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) por meio de reacção de intercâmbio de dissulfetos. Um agente quimioterápico é opcionalmente contido no interior do lipossomo. Veja-se Gabizon et al., J. National Câncer Inst. 81 (19) 1484 (1989). III. Selecção de Pacientes para a terapêutica O paciente no presente documento é opcionalmente submetido a um teste diagnóstico antes da terapêutica. Por exemplo, o teste de diagnóstico pode avaliar a expressão (incluindo a sobre-expressão) de HER, amplificação, e/ou activação (incluindo a fosforilação ou dimerização).

Geralmente, se um teste de diagnóstico é executado, uma amostra pode ser obtida de um paciente na necessidade da terapêutica. Quando o paciente tem cancro, a amostra é geralmente uma amostra de tumor. Numa forma de realização preferida, a amostra de tumor é de um cancro de ovário, peritónio, trompa de Falópio, cancro de mama metastático (MBC), cancro de pulmão de não pequenas células (NSCLC), 104 ΕΡ1850874Β1 cancro de próstata, ou uma amostra de tumor colo-rectal. A amostra biológica no presente pode ser uma amostra fixa, por exemplo, amostra fixada em formalina, amostra embebida em parafina (FFPE), ou uma amostra congelada. 0 paciente seleccionado para a terapêutica pode ter um tumor com activação de HER (preferivelmente HER2). Numa forma de realização, a extensão de activação de HER (ou HER2) em células de cancro excedem significativamente o nivel de activação desse receptor em células não cancerosas do mesmo tipo de tecido. Tal activação excessiva pode resultar de uma sobre-expressão de receptor HER e/ou níveis mais altos de ligando de HER disponível para activação do receptor HER nas células de cancro. Tal activação excessiva pode causar e/ou ser causada pelo estado de malignidade de uma célula de cancro. Em algumas formas de realização, o cancro é submetido a um ensaio diagnóstico ou prognóstico para determinar se a amplificação e/ou sobre-expressão do receptor HER estiver a ocorrer pela qual resulta numa activação excessiva do receptor HER. Alternativamente, ou adicionalmente, o cancro pode ser submetido a um ensaio diagnóstico ou prognóstico para determinar se a amplificação e/ou sobre-expressão de ligando de HER está ocorrendo no cancro é atribuída a uma activação excessiva do receptor HER. Num subconjunto de tais cancros, a activação excessiva do receptor pode resultar de uma via estimuladora autócrina. Os vários ensaios para determinar a activação de HER serão descritos mais pormenorizadamente a seguir. Os métodos preferidos para determinar a activação HER são: detectando a presença de dímeros ou heterodímeros de HER, avaliação da fosforilação de HER e HER2, e perfil de expressão génica. 105 ΕΡ1850874Β1

(i) Dímeros de HER

As amostras dos tumores podem ser avaliadas para a presença de dímeros de HER, como indicar a activação de HER ou HER2. Qualquer método conhecido no estado da técnica pode ser usado para detectar os dímeros de HER2, tais como EGFR-HER2, HER2-HER3, nos tumores. Diversos métodos preferidos estão descritos a seguir. Estes métodos detectam interacções não covalentes proteína-proteína ou indicam de outra maneira a proximidade entre as proteínas de interesse. Métodos baseados na imunoafinidade, tais como imunoprecipitação ou ELISA, podem ser utilizados para detectar dímeros de HER. Numa forma de realização, os anticorpos HER2 são usados para complexos de imunoprecipitado que contendo HER2 de células de tumor, e resultado imunoprecipitado é sondado então pela presença de EGFR ou HER3 por immunoblot. Numa outra realização, anticorpos EGFR ou HER3 pode ser utilizado para a etapa de imunoprecipitação e o imunoprecipitado é sondado então com anticorpos HER2. Numa forma de realização mais adicional, ligandos de HER específicos para os complexos EGFR-HER3, EGFR-HER2 ou os complexos HER2-HER3 podem ser utilizados precipitando os complexos, que são sondados então pela presença de HER2. Por exemplo, os ligandos podem ser conjugados pela avidina e os complexos purificados numa coluna de biotina.

Em outras formas de realização, tais como ELISA ou ensaios com anticorpos do tipo "sanduíche", anticorpos para HER2 imobilizados num suporte sólido, são contactados com células de tumor ou lisados de células de tumor, lavados, e então expostos ao anticorpo contra EGFR ou HER3. A ligação do último anticorpo, que pode ser detectado directamente ou 106 ΕΡ1850874Β1 por um anticorpo secundário conjugado a um marcador detectável, indica a presença dos heterodímeros. Em determinadas formas de realização, anticorpos EGFR ou HER3 imobilizados, e anticorpos HER2 é são utilizados para a etapa de detecção. Em outras formas de realização ligandos de HER podem ser utilizados no lugar, ou em combinação com anticorpos HER.

Uma reticulação química ou por UV pode também ser usado para juntar covalentemente dímeros na superfície de células vivas. Os exemplos de reticulantes químicos incluem o ditiobis(succinimidilpropionato) (DSP) e 3,3'-ditiobis (sulfosuccinimidilpropionato) (DTSSP) . Numa forma de realização, os extratos celulares de células de tumor quimicamente reticulados são analisados por SDS-PAGE e imunoblot com anticorpos EGFR e/ou HER3. Uma mobilidade de banda de umo intervalo de peso molecular apropriada mais provável representa os dímeros EGFR-HER2 ou HER2-HER3, pois HER2 é a fracção preferida para dimerização do EGFR e HER3. Este resultado pode ser confirmado por imunoblot subsequentes com os anticorpos HER2. A transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET) pode também ser utilizada para detectar dímeros de EGFR-HER2 ou HER2- HER3. A FRET detecta mudanças conformacionais da proteína e interacções proteína-proteína in vivo e in vitro baseado na transferência da energia de um fluoróforo fornecedor a um fluoróforo receptor Selvin, Nat. Struct, Biol, 7: 730-34 (2000) A transferência de energia ocorre somente se o fluoróforo fornecedor está próximo o suficiente do fluoróforo receptor. Numa experiência típica de FRET, duas proteínas ou dois locais numa única proteína são marcados com sondas fluorescentes diferentes. Uma das sondas, a sonda fornecedora, é excitada a um estado de energia mais elevada pela luz incidente num 107 ΕΡ1850874Β1 comprimento de onda específico. A sonda fornecedora transmite então sua energia à segunda sonda, a sonda receptora, tendo como resultado uma redução na intensidade da fluorescência da dadora e um aumento na emissão da fluorescência da receptora. Para medir a extensão de transferência de energia, a intensidade da dadora numa amostra marcada com sondas dadoras e aceitadoras é comparada pela sua intensidade numa amostra marcada apenas com sonda fornecedora. Opcionalmente, a intensidade da sonda receptora é comparada com dadora/receptores apenas nas amostras da receptora. As sondas apropriadas são conhecidas no estado da técnica e incluem, por exemplo, corantes permanentes da membrana, tais como fluoresceína e rodamina, corantes orgânicos, tais como os corantes cianino, e átomos de lantanida. Os métodos e a instrumentação para a detecção da transferência de energia e da medição são também conhecidos no estado da técnica.

As técnicas baseadas em FRET apropriadas para interacções de detecção e medição de proteína-proteína em células individuais são também conhecidas no estado da técnica. Por exemplo, transferência de energia por ressonância fluorescente por fotodegradação (pbFRET) e fornecedor de imagem latente de microscopia fluorescente (FLDVI) podem ser usados para detectar a dimerização dos receptores da superfície celular. Gadella & Jovin, J. Cell Biol., 129: 1543-58 (1995). Numa forma de realização, o pbFRET é usado em células ou "suspensão" ou "in situ" para detectar e medir a formação dos dímeros EGFR-HER2 ou ETER2-HER3, como descrita por Nagy et al., Cytometry, 32: 120-131 (1998). Estas técnicas medem a redução na vida da fluorescência de um dador devido a transferência de energia. Numa forma de realização particular, uma técnica de citometria de fluxo do tipo Foerster FRET (FCET) pode ser usado para investigar a dimerização de EGFR-HER2 e 108 ΕΡ1850874Β1 HER2-HER3, como descrito em Nagy et ai., supra, e Brockhoff et ai., Cytometry, 44: 338-48 (2001). O FRET é usado preferivelmente conjuntamente com técnicas de marcação imuno-histoquímica padrão Kenworthy, Methods, 24: 289-96 (2001). Por exemplo, os anticorpos conjugados a corantes fluorescentes apropriados podem ser usados como sondas marcando duas proteínas diferentes. Se as proteínas estiverem dentro de uma proximidade de outra, os corantes fluorescentes agem como dadores e receptores para o FRET. A transferência de energia é detectada por meios padrões. A transferência de energia pode ser detectada por meio da citometria de fluxo ou por sistemas de microscopia digital, tais como a microscopia confocal ou microscópio de fluorescência de amplo espectro acoplado a máquina de fotografia de dispositivo acoplado a uma carga (CCD).

Numa forma de realização, os anticorpos HER2 e EGFR ou os anticorpos HER3 são directamente marcados com dois fluoróforos diferentes, por exemplo, como descritos em Nagy et al., supra. As células de tumor ou os lisados de célula de tumor são contactados com anticorpos diferencialmente marcados, que agem como dadores e aceitadores para FRET na presença dos dímeros EGFR-HER2 ou HER2-HER3. Alternativamente, os anticorpos não marcados contra HER2 e EGFR ou HER3 são usados junto com anticorpos secundários diferencialmente marcados que servem como dadores e aceitadores. Veja-se, por exemplo, Brockhoff et al., supra. A transferência de energia é detectada e a presença dos dímeros é determinada se as marcações forem encontradas por estarem próximas.

Em outras formas de realização, o ligando de receptores HER que são específicos para HER2 e EGFR ou HER3 109 ΕΡ1850874Β1 sao marcados fluorescentemente e usados para estudos de FRET.

Ainda em outras formas de realização, a presença dos dímeros na superfície de células de tumor é demonstrada pela co- localização de HER2 com EGFR ou HER3 usando técnicas padrão directas ou indirectas de imunofluorescência e microscopia confocal de exploração à laser. Alternativamente, a varredura de imagens a laser (LSI) é usada para detectar a ligação do anticorpo e co-localização de HER2 com EGFR ou HER3 numa forma do alto fluxo, tal como uma placa microwell, como descrito em Zuck et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA, 96: 11122-27 (1999).

Em formas de realização adicionais, a presença de EGFR-HER2 e/ou dos dímeros de HER2-HER3 são determinados identificando a actividade enzimática que é dependente da proximidade dos componentes do dímero. Um anticorpo HER2 conjugado com uma enzima e um anticorpo EGFR ou HER3 conjugado com uma segunda enzima. Um primeiro substrato para a primeira enzima é adicionada e a reacção produz um segundo substrato para uma segunda enzima. Isto conduz a uma reacção com uma outra molécula para produzir um composto detectável, tal como um corante. A presença de um outro produto químico quebra o segundo substrato, de modo que a reacção com a segunda enzima seja impedida a menos que a primeira e segunda enzima, assim como os dois anticorpos, estiverem próximos. Num tumor da realização particular as células ou lisados celulares são contactados com um anticorpo HER2 que é conjugado com uma glicose oxidase e um anticorpo de HER3 ou EGFR é conjugado com peroxidase de raiz forte (HRP). A glicose é adicionada à reacção, junto com um precursor do corante, tal como o DAB, e a catalase. A presença dos dímeros é determinada pelo desenvolvimento de coloração para o DAB. 110 ΕΡ1850874Β1

Os dímeros podem também ser detectados pela utilização de métodos baseados no sistema de ensaio por eTag™ (Aclara Bio Sciences, Mountain View, CA), Como descrito, por exemplo, no pedido de patente US 2001/0049105, publicada em 6 de Dezembro de 2001. Um eTag™, ou "Tag electroforético" compreendem de uma fracção repórter detectável, tal como um grupo fluorescente. Pode também compreender de um "modificador de mobilidade, " que consista essencialmente numa fracção que tem uma mobilidade electroforética original. Estas fracções permitem a separação e a detecção do eTag™ de uma mistura complexa sob condições electroforéticas definidas, tais como a electroforese capilar (CE). A porção do eTag™ que contém a fracção repórter e, opcionalmente, o modificador de mobilidade é ligada a uma fracção de ligação do primeiro alvo por um grupo ligando clivável para produzir um primeiro composto de ligação. A fracção de ligação do primeiro alvo reconhece especificamente um primeiro alvo particular, tal como um ácido nucleico ou uma proteína. A fracção de ligação do primeiro alvo não é limitada de nenhuma maneira, e pode ser por exemplo, um polinucleótido ou um polipéptido. Preferivelmente, a fracção de ligação do primeiro alvo é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Alternativamente, a fracção de ligação do primeiro alvo pode ser um ligando do receptor HER ou fragmento competente de ligação deste. O grupo de ligação preferivelmente compreende uma fracção clivável, tal como um substrato da enzima, ou qualquer ligação química que puder ser clivada sob circunstâncias definidas. Quando a fracção de ligação do primeiro alvo se liga a seu alvo, o agente de clivagem é introduzido e/ou activado, e o grupo de ligação é clivado, liberando assim a parcela do eTag™ que contém o modificador da mobilidade da fracção repórter. Assim, a presença de um eTag™ "livre" indica a ligação da fracção de ligação do 111 ΕΡ1850874Β1 alvo a seu alvo.

Preferivelmente, um segundo composto de ligação compreende do agente de clivagem e um segundo alvo ligado a uma fracção que reconheça especificamente um segundo alvo. A fracção de ligação do segundo alvo também não é limitada de nenhuma maneira e pode ser, por exemplo, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo ou um ligando de receptor HER fragmento do ligando competente de ligação. 0 agente de clivagem é aquele que irá clivar apenas o grupo de ligação no primeiro composto de ligação se o primeiro composto de ligação e o segundo composto de clivagem estiverem próximos.

Numa forma de realização, um primeiro composto de ligação compreende de um eTag™ em que um anticorpo HER2 serve como a primeira fracção de ligação do alvo. Um segundo composto de ligação compreende de um anticorpo EGFR ou HER3 ligado a uma agente de clivagem capaz de clivar o grupo de ligação do eTag™. Preferivelmente o agente de clivagem deve ser activado para clivar o grupo de ligação. As células de tumor ou os lisados de células de tumor são contactados com o eTag™, que se liga a HER2, e com o anticorpo EGFR ou HER3 modificado, o qual se liga ao EGFR ou HER3 na superfície da célula. 0 composto de ligação não ligado é removido, e o agente de clivagem é activado, se necessário. Se os dímeros EGFR- HER2 ou HER2-HER3 estiverem presente, o agente de clivagem cliva o grupo de ligação e liberará o eTag™ devido à proximidade do agente de clivagem do grupo de ligação. 0 eTag™ livre pode então ser detectado por qualquer método conhecido no estado da técnica, tal como a electroforese capilar.

Numa forma de realização, o agente de clivagem é uma espécie química activável que age no grupo de ligação. Por 112 ΕΡ1850874Β1 exemplo, o agente de clivagem pode ser activado expondo a amostra à luz.

Numa outra realização, o eTag™ é construído usando um anticorpo EGFR ou HER3 como a fracção de ligação do primeiro alvo, e o composto da segunda ligação são construídos de um anticorpo para HER2.

Ainda numa outra realização, o dímero de HER é detectado usando um anticorpo ou outro reagente que se liga especificamente ou preferencialmente ao dímero em quando em comparação com ligação deste para ambos receptores HER no dímero.

(ii) Fosforilação de HER A fosforilação do receptor HER pode ser avaliada por imunoprecipitação de um ou mais receptores HER, tal como o receptor HER2, e a análise de resíduo (s) tirosina fosforilada(s) no(s) receptor(es) imunoprecipitado(s). Por exemplo, a positividade é determinada pela presença de umo intervalo fosofo-HER2 no gel, usando um anticorpo antifosfotirosina para detectar resíduos de tirosina fosforilados nos receptores HER imunoprecipitados. Os anticorpos antifosfotirosina são disponíveis comercialmente por Pan Vera (Madison, Wl), uma subsidiária de Invitrogen, Chemicon Internacional Inc. (Temecula, CA), ou Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) . A negatividade é determinada pela ausência de banda. As várias formas de ensaio para detectar proteínas fosforiladas são contempladas incluindo a análise por Western blot, imuno-histoquímica, ELISA, etc.

Numa forma de realização, a fosforilação de receptor HER2 (HER2) é avaliada por imuno-histoquímica usando um 113 ΕΡ1850874Β1 anticorpo HER2 fosfo- específico (clone PN2A; Thor et al., J. Clin. Oncol, 18 (18): 3230-3239 (2000)).

Outros métodos para detectar a fosforilação de receptores HER incluem, mas não são limitados a, KIRA ELISA (Patentes US 5.766.863; US 5.891.650; US 5.914.237; US 6.025.145; e US 6.287.784), espectrometria de massa (comparando o tamanho de HER2 fosforilada e não fosforilada), ensaio de proximidade de e-tag com anticorpo HER (por exemplo, HER2) e anticorpos fosfo-específico ou fosfo-tirosina específico (por exemplo, usando um kit de ensaio eTag™ disponível pela Aclara BioSciences (Mountain View, CA)). Os pormenores do ensaio do eTag estão descritos acima no presente documento.

Também se podem usar anticorpos fosfo-específicos no arranjo celular para detectar o status da fosforilação numa amostra celular da proteína de transdução de sinal (documento US2003/0190689). O exemplo 2 a seguir descreve um método preferido para determinar a fosforilação de HER2 por ELISA fosfo-HER2. (iii) Perfil de Expressão Génica

Numa forma de realização, o perfil da expressão do gene pode servir como um substituto para medir a fosforilação directa de HER. Isto é particularmente útil guando a amostra é uma amostra fixada (por exemplo, amostra de tumor fixada em formalina e embebida em parafina) onde a fosforilação de HER pode ser difícil de se guantificar confiantemente. Por exemplo, a expressão de dois ou mais receptores HER e um ou mais ligando de HER numa amostra é avaliada, em que a expressão de os dois ou mais receptores HER e um ou mais ligandos de HER indica a activação de HER 114 ΕΡ1850874Β1 positiva na amostra. Alternativamente ou adicionalmente, a expressão da betacelulina e/ou anfiregulina na amostra podem ser mensurados, caracterizado pelo fato de que a expressão betacelulina e/ou anfiregulina indica activação de HER positiva na amostra.

De acordo com uma forma de realização preferida do perfil de expressão génica para avaliar a activação HER2, uma amostra do paciente é testada para expressão de dois ou mais receptores HER (seleccionados preferivelmente dentre EGFR, HER2, e HER3) e um ou mais ligandos de HER (seleccionados preferivelmente dentre betacelulina, anfiregulina, epiregulina e TGF-α, mais preferivelmente betacelulina ou anfiregulina). Por exemplo, dois ou mais receptores HER podem ser EGFR e HER2, ou HER2 e HER3, e um ou mais ligando de HER pode ser betacelulina ou anfiregulina. Preferivelmente, a expressão de HER2 e EGFR ou HER3, bem como da betacelulina ou anfiregulina é determinada. A amostra pode ser testada para a expressão apenas de betacelulina ou anfiregulina sozinho, ou em combinação com o teste para expressão de dois ou mais receptores HER. A expressão positiva dos genes identificados indica que o paciente é um candidato para a terapêutica com inibidor de dimerização de HER, tal como o pertuzumab. Além disso, a expressão positiva dos genes indica que o paciente é mais provável para responder favoravelmente à terapêutica com o inibidor de dimerização de HER do que um paciente que não tenha tal expressão positiva.

Os vários métodos para determinar a expressão de ARNm ou de proteína incluem, mas não são limitados a, perfil de expressão génica, reacção em cadeia da polimerase (PCR) incluindo o PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), a análise de microarranjo, análise de expressão génica em 115 ΕΡ1850874Β1 série (SAGE) , o MassARRAY, a análise da expressão do Gene por MPSS, proteómicos, imunohistoquímica (IHC), etc. Tal análise de ARNm é executada preferivelmente usando a técnica da reacção em cadeia da polimerase (PCR), ou pela análise de microarranjo. Quando o PCR é empregado, uma forma preferida é o PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) . Numa forma de realização, a expressão de um ou mais genes notáveis acima é julgada positiva se estiver na média ou acima, por exemplo, comparada a outras amostras do mesmo tipo de tumor. 0 nível médio da expressão pode ser determinado essencialmente pela medição contemporaneamente do gene, ou pode ter sido previamente determinado.

As etapas de um protocolo representativo para o perfil da expressão génica utilizando tecidos fixados, embebidos em parafina como fonte de ARN, incluindo o isolamento do ARNm, a purificação, a extensão do iniciador e a amplificação são fornecidas em vários artigos publicados em jornais (por exemplo: Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); Specht et al. Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)). Resumidamente, um processo representativo se inicia com cortes grossos de aproximadamente 10 pg das amostras de tecido do tumor embebidas em parafina. O ARN é então extraído, e a proteína e o ADN são removidos. Após a análise da concentração do ARN, o reparo do ARN e/ou as etapas de amplificação podem ser incluídas, se necessário, e a transcrição reversa do ARN é realizada usando promotores específicos do gene seguido pelo PCR. Finalmente, os dados são analisados para identificar a(s) melhor(es) opção (ões) de tratamento(s) disponível(eis) ao paciente com base no teste característico de expressão génica identificada na amostra de tumor examinada. O exemplo 3 no presente documento descreve métodos preferidos para determinar a activação HER2 pelo perfil de 116 ΕΡ1850874Β1 expressão do gene.

(iv) Expressão e Amplificação de HER

Para determinar a expressão ou amplificação de HER no cancro, vários ensaios diagnósticos/prognósticos estão disponíveis. Numa forma de realização, a sobre-expressão de HER pode ser analisada por IHC, por exemplo, usando o HERCEPTEST® (Dako). Os cortes de tecido de uma biópsia de tumor do bloco de parafina podem ser submetidos ao ensaio de IHC e conceder um critério de intensidade de coloração da proteína HER2 como se segue: Contagem 0: não é observada nenhuma coloração ou a coloração na membrana é menor gue 10% das células de tumor. Contagem 1+: coloração da membrana fracamente perceptível é detectada em mais de 10% das células de tumor. As células estão coradas somente em parte de sua membrana. Contagem 2+: é observada uma coloração de fraco a moderada na membrana inteira em de 10% das células de tumor.

Contagem 3+: é observada uma coloração de moderada à forte em mais de 10% das células de tumor.

Aqueles tumores com contagem 0 ou 1+ para a avaliação da sobre-expressão de HER2 podem ser caracterizados como não sobre-expressão de HER2, visto que os tumores com contagens 2+ ou 3+ podem ser caracterizados como sobre-expressantes de HER2.

Tumores que sobre-expressam HER2 podem ser avaliados pela contagem imuno-histoquímica que corresponde ao número de cópias de moléculas HER2 expressadas por uma célula, e pode ser determinada bioquímicamente: 117 ΕΡ1850874Β1 Ο = 0-10.000 cópias/célula, 1+ = pelo menos cerca de 200.000 cópias/célula, 2+ = pelo menos cerca de 500.000 cópias/célula, 3+ = pelo menos cerca de 2.000.000 cópias/célula. A sobre-expressão de HER2 no nível 3+, que conduz à activação da tirosina quinase independente de ligando (Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84: 7159-7163 (1987)), ocorre em aproximadamente 30% dos cancros de mama, e nestes pacientes, a sobrevivência livre de recaída e a sobrevivência total estão diminuídas (Slamon et al., Science, 244: 707-712 (1989); Slamon et al., Science, 235: 177-182 (1987)).

Alternativamente, ou adicionalmente, os ensaios FISH, tais como INFORM™ (vendido por Ventana, Arizona) ou PATHVISION™ (Vysis, Illinois) podem ser realizados em tecido de tumor fixados em formalina, embebidos em parafina para determinar a extensão (se alguma) da amplificação de HER2 no tumor.

Numa forma de realização, o cancro é aquele que expressa (e pode sobre-expressar) EGFR, tal expressão pode ser avaliada como para os métodos de avaliar a expressão de HER2 como notável acima. A sobre-expressão ou amplificação do receptor HER ou ligando de HER podem também ser avaliados utilizando um ensaio diagnóstico in vivo, por exemplo, administrando uma molécula (tal como um anticorpo) que se liga a molécula a ser detectada e são marcadas com um marcador detectável (por exemplo, um isótopo radioactivo) e realizar um varredura externa no paciente para a localização do marcador. 118 ΕΡ1850874Β1 IV. Formulações Farmacêuticas

As formulações farmacêuticas dos inibidores da dimerização de HER são preparadas para armazenagem através da mistura do anticorpo, polipéptido, oligopéptido ou pequenas moléculas orgânicas/inorgânicas que possuem o grau de pureza desejado com veículos, excipiente ou estabilizantes farmaceuticamente opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a Ed, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Cristais de anticorpos também são contemplados (veja-se, pedido de patente 2002/0136719). Os veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são atóxicos aos recipientes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tais como acetato, Tris, fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservante (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, butil ou benzil álcool; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m- cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacáridos, dissacáridos, e outros hidratos de carbono que incluem glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; tonificantes tais como trehalose e cloreto de sódio; açucares tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; tensoativos tais como polisorbato; contra-iões formadores de sal tal como sódio; complexos metálicos (tal como, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não-iónicos tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG). 119 ΕΡ1850874Β1

Por exemplo, as formulações liofilizadas do anticorpo anti-ErbB2 estão descritas na WO 97/04801. A formulação preferida de pertuzumab para a utilização terapêutico compreende do pertuzumab 30 mg/ml em acetato do histidina 20 mM, 120 mM de sacarose, 0,02% polisorbato 20 em pH 6,0. Uma formulação alternativa do pertuzumab compreende de 25 mg/ml de pertuzumab, 10 mM de tampão histidina-HCl, 240 mM de sacarose, 0,02% de polisorbato 20, pH 6,0. A formulação no presente pode também conter mais do que um composto activo conforme necessário para a indicação particular que está a ser tratada, preferivelmente aquelas com actividades complementares que não se afectam adversamente. Os vários fármacos que podem ser combinadas com inibidor de dimerização de HER são descritas na seção de método a seguir. Tais moléculas estão apropriadamente presentes na combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida.

Os ingredientes activos podem também ser armazenados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de conservação ou através de polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Ditas técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

Preparações de libertação sustentada podem ser preparadas. Exemplos apropriados de preparações de 120 ΕΡ1850874Β1 libertação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contém o anticorpo, sendo que ditas matrizes estão presentes na forma de artigos moldados, tais como, filmes, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2- hidroxietil-metacrilato), ou poli(vinilálcool)), poliláctidos (patente U. S. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico e γ etil-L-glutamato, etileno-vinil acetato não-degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis tais como LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto pode ser facilmente realizado através de filtração por membranas de filtração estéreis.

V. Tratamento com Inibidores de Dimerização de HER

Revela-se no presente documento a utilização de um inibidor de dimerização de HER para estender o TAP ou a sobrevivência de um paciente com cancro, cujo cancro apresenta a activação de HER, em que o inibidor de dimerização de HER é administrado ao paciente numa quantidade que estende o TAP ou sobrevivência do paciente. Preferivelmente, o inibidor de dimerização de HER é um inibidor de dimerização de HER2 e/ou inibe a heterodimerização de HER. 0 cancro do paciente pode apresentar a activação de HER2, incluindo a fosforilação de HER2. Preferentemente, a fosforilação de HER2 é avaliada usando um ensaio de fosfo-ELISA. Alternativamente, a activação de HER2 pode ser 121 ΕΡ1850874Β1 avaliada pelo perfil de expressão génica ou por meio da detecção de dímeros de HER ou heterodímeros.

Exemplos de vários cancros que podem ser tratados com um inibidor de dimerização de HER estão listados na seção da definição acima. As indicações preferidas do cancro incluem cancro de ovário, peritónio, trompa de Falópio, cancro de mama metastático (MBC), cancro de pulmão de não pequenas células (NSCLC), cancro de próstata, ou uma amostra de tumor colo-rectal. Numa forma de realização, o cancro que é tratado é avançado, refractário, recorrente, resistente aos quimioterápicos e/ou resistente a platina. A terapêutica com o inibidor de dimerização de HER estende a TAP e/ou a sobrevivência. Numa forma de realização, a terapêutica com inibidor de dimerização de HER estende o TAP ou a sobrevivência em pelo menos aproximadamente 20% a mais do que TAP ou sobrevivência obtida administrando apenas um agente anti-tumoral aprovado, ou padrão de cuidado para o cancro que está a ser tratado.

Revela-se no presente documento a utilização de pertuzumab para estender o tempo até a progressão da doença (TAP) ou sobrevivência de um paciente com o cancro de ovário, peritónio, trompa de Falópio, e cujo cancro indica activação de HER2, em que o pertuzumab é administrado ao paciente numa quantidade que estenda o TAP ou a sobrevivência do paciente. O paciente pode ter cancro avançado, refractário, recorrente, resistente aos quimioterápicos e/ou resistente a platina. A administração do pertuzumab ao paciente pode, por exemplo, estender o TAP ou a sobrevivência em pelo menos aproximadamente 20% mais do que o TAP ou a sobrevivência conseguida pela administração de topotecano ou doxorrubicina lipossomal a 122 ΕΡ1850874Β1 tal paciente. 0 inibidor de dimerização de HER é administrado a um paciente humano de acordo com métodos conhecidos, tais como a administração intravenosa, por exemplo, como um bolus ou através de infusão continua durante um período de tempo, através das vias intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinhal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, ou inalação. A administração intravenosa ou subcutânea do anticorpo é preferida.

Para a prevenção ou o tratamento do cancro, a dose de inibidor de dimerização de HER dependerá do tipo de cancro a ser tratado, como definido acima, a severidade e o curso do cancro, se o anticorpo será administrado para finalidades preventivas ou terapêuticas, terapêutica precedente, a história clínica do paciente e a resposta ao anticorpo, e o critério do médico.

Numa forma de realização, uma dose fixa de inibidor de dimerização de HER é administrada. A dose fixa pode ser apropriadamente administrada ao paciente por uma vez ou numa série de tratamento. Quando uma dose fixa é administrada, preferivelmente está na escala de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 2000 mg de inibidor de dimerização de HER. Por exemplo, a dose fixa pode ser de aproximadamente 420 mg, aproximadamente 525 mg, aproximadamente 840 mg, ou aproximadamente 1050 mg de inibidor de dimerização de HER, tal como o pertuzumab.

Quando uma série de doses é administrada, estas podem, por exemplo, ser administradas a cada semana, aproximadamente a cada 2 semanas, aproximadamente a cada 3 semanas ou aproximadamente a cada 4 semanas, mas 123 ΕΡ1850874Β1 preferivelmente aproximadamente a cada 3 semanas. As doses fixas podem, por exemplo, continuar a ser administradas até a progressão da doença, evento adverso ou a qualquer momento como determinado pelo médico. Por exemplo, aproximadamente duas, três, quatro até aproximadamente 17 ou mais doses fixas podem ser administradas.

Numa forma de realização, uma ou mais doses de ataque do anticorpo é administrado, seguido por uma ou mais doses de manutenção do anticorpo. Numa outra realização, um maior número da mesma dose é administrada ao paciente.

De acordo com uma forma de realização preferida, uma dose fixa de inibidor da dimerização de HER (por exemplo, pertuzumab) de 840 mg (dose de ataque) é administrada, seguida por uma ou mais doses de aproximadamente 420 mg (dose de manutenção) de anticorpo. As doses da manutenção são administradas preferivelmente a cada 3 semanas, por um total de pelo menos duas doses, até 17 doses ou mais.

De acordo com uma outra realização preferida, uma ou mais dose fixas de 1050 mg do inibidor de dimerização de HER (por exemplo, pertzumab) são administradas, por exemplo, a cada 3 semanas. De acordo com esta realização, uma, duas ou mais doses fixas são administradas, por exemplo, por até um ano (17 ciclos) e por muito mais tempo como for desejado.

Numa outra realização, uma dose fixa de 1050 mg de inibidor de dimerização de HER (por exemplo, pertuzumab) é administrada a aproximadamente uma dose de ataque, seguido por uma ou mais doses de manutenção de aproximadamente 525 mg. Aproximadamente uma, duas ou mais doses de manutenção podem ser administradas ao paciente a cada 3 semanas de acordo com esta realização. 124 ΕΡ1850874Β1

Enquanto inibidor de dimerização de HER puder ser administrado como um único agente anti-tumoral, o paciente é opcionalmente tratado com uma combinação de inibidor de dimerização de HER, e um ou mais agentes quimioterápicos. Preferivelmente pelo menos um dos agentes quimioterápicos é um agente quimioterápico antimetabólito, tal como a gencitabina. A administração combinada inclui a co-administração ou administração concomitante, utilizando formulação separadas ou uma única formulação farmacêutica, e administração consecutiva numa ou outra ordem, em que preferivelmente há um período de tempo quando ambos (ou todos) agentes activos exercerem simultaneamente suas actividades biológicas. Assim, o agente quimioterápico antimetabólito pode ser administrado antes, ou depois, da administração do inibidor de dimerização de HER. Nesta realização, o sincronismo entre, pelo menos uma administração do agente quimioterápico antimetabólito e pelo menos uma administração do inibidor de dimerização de HER, é preferivelmente de aproximadamente 1 mês ou menos, e mais preferivelmente de aproximadamente 2 semanas ou menos. Alternativamente, o agente quimioterápico antimetabólito e o inibidor de dimerização de HER são administrados simultaneamente ao paciente, numa única formulação ou formulação separada. 0 tratamento com a combinação do agente quimioterápico (por exemplo, agente quimioterápico antimetabólito tal como a gencitabina) e do inibidor de dimerização de HER (por exemplo, pertuzumab) pode resultar em benefício terapêutico sinergístico, ou mais do que aditivo ao paciente.

Um agente quimioterápico antimetabólito, se administrado, é administrado geralmente nas dosagens conhecida deste, ou opcionalmente menores devido à acção combinada dos fármacos ou dos efeitos colaterais negativos atribuídos à administração do agente quimioterápico 125 ΕΡ1850874Β1 antimetabólito. A preparação e as programações de dosagens para tais agentes quimioterápicos podem ser usadas de acordo com as instruções dos fabricantes ou como determinadas pelo médico hábil. Quando o agente quimioterápico antimetabólito é a gencitabina, preferivelmente, é administrado numa dose entre aproximadamente 600 mg/m2 a 1250 mg/m2 (por exemplo, aproximadamente 1000 mg/m2) , por exemplo, nos dias 1 e 8 de um ciclo de 3 semanas.

Com excepção do inibidor de dimerização de HER e do agente quimioterápico antimetabólito, outros regimes terapêuticos podem ser combinados com este. Por exemplo, um segundo (terceiro, quarto, etc.) agente quimioterápico pode ser administrado, quando o segundo agente quimioterápico é outro, diferente do agente quimioterápico antimetabólito, ou um agente quimioterápico que não seja antimetabólito. Por exemplo, o segundo agente quimioterápico pode ser um taxano (tal como o paclitaxel ou o docetaxel), capecitabina, ou um agente quimioterápico baseado em platina (tal como a carboplatina, cisplatina, ou oxaliplatina), antraciclina (tal como a doxorrubicina, incluindo, a doxorrubicina lipossomal), topotecano, pemetrexed, alcaloide da vinca (tal como vinorelbina), e TLK 286. "Coquetéis" de agente quimioterápico diferentes podem ser administrados.

Outros agentes terapêuticos que podem ser combinados com inibidor de dimerização de HER incluem qualquer um ou mais de: um segundo, inibidor de dimerização de Her diferente (por exemplo, um anticorpo HER2 inibidor de crescimento, tal como o trastuzumab, ou anticorpo HER2 que induz a apoptose de células que sobre-expressam HER2, tal como 7C2, 7F3 ou variantes humanizadas deste); um anticorpo direccionado contra um antigénio diferente associado ao 126 ΕΡ1850874Β1 tumor, tal como EGFR, HER3, HER4; compostos anti-hormonais, por exemplo, um composto antiestrogénio, tal como tamoxifeno, ou um inibidor da aromatase; um cardioprotector (para previnir ou reduzir a qualquer disfunção no miocárdio associada com a terapêutica); uma citocina; um fármaco contra EGFR (tal como TARCEVA®, IRESSA® ou cetuximab); um agente anti-angiogénico (especialmente o bevacizumab vendido pela Genentech sob a marca registada AVASTIN™) ; um inibidor da tirosina quinase; um inibidor de COX (por exemplo, um inibidor de COX-1 ou COX-2) ; um anti-inflamatório não esteróide, celecoxib (CELEBREX®); inibidor de farnesil transferase (por exemplo, Tipifarnib/ZARNESTRA® RI 15777 disponível pela Johnson ou Lonafarnib SCH66336 disponível pela Schering-Plough); anticorpo que se liga a proteína oncofetal CA 125, tal como Oregovomab (MoAb B43.13); vacina HER2 (tal como HER2 AutoVac da Pharmexia, ou vacina APC8024 da Dendreon, du vacina péptido HER2 da GSK/Corixa); uma outra terapêutica contra HER (por 3xemplo, trastuzumab, cetuximab, ABX-EGF, EMD7200, gefitinib, erlotinib, 3P724714, Cl 1033, GW572016, JMC-11F8, TAK165, etc); inibidores de Raf e/ou ras (veja-se, por exemplo, documento WO 2003/86467); injecção lipossomal de doxorrubicina HC1 (DOXJJL®) ; inibidores da topoisomerase I, tal como topotecano; taxano; HER2 e inibidor duplo de EGFR e tirosina quinase, tal como lapatinib/GW572016; TLK286 (TELCYTA®); EMD-7200; um medicamento que trata a náusea, tal como um antagonista, um esteróide, ou uma benzodiazepina de serotonina; um medicamento que impeça ou trate o eritema na pele ou terapias de acne padrão, incluindo antibiótico tópico ou oral; um medicamento que trate ou impeça a diarreia; um medicamento que reduza a temperatura do corpo como o acetaminofen, difenidramina, meperidina; factor de crescimento hematopoiético e etc.

As dosagens apropriadas para qualquer um dos agentes 127 ΕΡ1850874Β1 acima co-administrado são aquelas usadas presentemente e podem ser diminuídas devido à acção combinada (sinérgica) do agente e do inibidor de dimerização de HER.

Além dos regimes terapêuticos acima, o paciente pode ser submetido à remoção cirúrgica de células de cancro e/ou terapêutica de radiação.

Quando o inibidor é um anticorpo, preferivelmente o anticorpo administrado é um anticorpo nu. Entretanto, o inibidor administrado pode ser conjugado com um agente citotóxico. Preferivelmente, o inibidor e/ou o antigénio conjugado ao qual está ligado é internalizado pela célula, tendo por resultado a eficácia terapêutica do conjugado em matar a célula de cancro ao qual se liga aumentada. Numa forma de realização preferida, o agente citotóxico se combina ou interfere com o ácido nucleico em células cancerosas. Exemplos de ditos agentes citotóxicos são descritos e incluem maitansinóides, caliquiamicinas, ribonucleases e endonucleases de ADN. 0 presente pedido contempla a administração do inibidor de dimerização de HER pela terapêutica génica. Veja-se, por exemplo, o documento WO 96/07321 publicado em 14 de Março de 1996 a respeito da utilização da terapêutica génica em gerar anticorpos intracelulares.

Existem duas principais abordagens para a obtenção do ácido nucleico (opcionalmente contido num vector) nas células dos paciente; in vivo e ex vivo. Para a administração in vivo o ácido nucleico é injectado directamente no paciente, normalmente no local em que o anticorpo é requerido. Para o tratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucleico é introduzido em ditas células isoladas e células modificadas 128 ΕΡ1850874Β1 são administradas ao paciente tanto directamente ou, por exemplo, encapsuladas em membranas porosas que são implantadas nos pacientes (veja-se, por exemplo, patente US 4.892.538 e US 5.283.187). Existe uma serie de técnicas disponíveis para a introdução de ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo de se o ácido nucleico é transferido em células cultivadas in vitro, ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. Técnicas apropriadas para a transferência de ácido nucleico em células de mamíferos in vitro incluem a utilização de lipossomos, electroporação, microinjecção, fusão celular, DEAE- dextrano, o método de precipitação em fosfato de cálcio, etc. Um vector comumente utilizado para administração ex vivo do gene é um vector retroviral.

As técnicas de transferência de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluem a transfecção com vectores virais (tal como adenovírus, vírus I da Herpes simplex, ou vírus adeno-associado) e sistemas baseados em lipídeos (lipídeos úteis para transferência mediada por lipídeos do gene são: DOTMA, DOPE e DC-Chol, por exemplo) . Em algumas situações, é desejável fornecer a fonte de ácido nucleico com um agente que dirija as células alvo, tal como um anticorpo específico para uma proteína de membrana da superfície celular ou a célula alvo, um ligando para um receptor sobre a célula alvo etc. Ao empregar-se lipossomos, as proteínas que se ligam a uma proteína de membrana da superfície celular associada a endocitose podem ser utilizadas para dirigir e/ou facilitar a absorção, por exemplo, de proteínas capsídicas ou seus fragmentos trópicos para um tipo celular específico, anticorpos para proteínas que sofrem internalização na ciclização e proteínas que dirigem localização intracelular e aumentam a semivida intracelular. 0 método de endocitose mediada por receptor é descrito, por exemplo, por Wu et al., J. Biol. 129 ΕΡ1850874Β1

Chem. 262: 4429-4432 (1987); e Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 3410-3414 (1990). Para análise dos protocolos de terapêutica génica e marcação génica atualmente conhecidos, veja-se Anderson et ai.,. Science 256: 808-813 (1992). Veja-se também o documento WO 93/25673 e as referências nele mencionadas. VI. Depósito de Materiais

As seguintes linhas de células de hibridomas foram depositados na Colecção Americana de Culturas Tipo, 10801 University Blvd., Manassas VA 20110-2209, Estados Unidos (ATCC).

Designação do N° do ATCC Data de Depósito Anticorpo 7C2 ATCC HB-12215 17 de Outubro de 1996 7F3 ATCC HB-12216 17 de Outubro de 1996 4D5 ATCC CRL 10463 24 de Maio de 1990 2C4 ATCC HB-12697 8 de Abril de 1999

Pormenores adicionais da invenção sao ilustrados pelos seguintes exemplos não limitativos. EXEMPLO 1 ACTIVIDADE CLÍNICA DE PERTUZUMAB EM CANCRO DE OVÁRIO AVANÇADO, REFRACTÁRIO OU RECORRENTE E O PAPEL DO STATUS DA ACTIVAÇÃO DE HER2 O presente exemplo refere-se a testes clínicos de multicêntrico de fase II, de marca aberta, de braço simples, de paciente com cancro de ovário. Pacientes com cancro de ovário avançado, refractário ou recorrente foram tratados com pertuzumab, um anticorpo de HER2 humanizado. Pertuzumab representa uma nova classe de agentes 130 ΕΡ1850874Β1 direccionados, denominada inibidores da dimerização de HER (HDIs) que inibem a dimerização de HER2 com EGFR, HER3 e HER4, e inibe a sinalização através de MAP e quinase P13. 65 pacientes com cancro de ovário em estado agravado foram registados, com 61 recebendo terapêutica com "baixa dosagem" de agente isolado pertuzumab; pertuzumab foi administrado por via intravenosa (IV) com uma concentração de 840 mg seguido durante 420 mg a cada três semanas.

Um segundo grupo de pacientes foi tratado com "alta dosagem" de pertuzumab; 1050 mg cada 3 semanas, administrados como agente isolado. Neste grupo, 64 pacientes foram registados, com 62 pacientes sendo tratados.

Avaliações do tumor foram obtidas após 2, 4, 6, 8, 12 e 16 ciclos. A razão de resposta (RR) por RECIST foi o ponto final principal. Biópsias de tumor fresco foram obrigatórias a fim de testar o status da fosforilação de HER2 (pHER2) utilizando um ensaio imunoabsorvente ligado por enzima de pHER2 conforme descrito no Exemplo 2 a seguir. pHER2 para os pacientes do grupo 1 foi testada. A segurança e tolerância foram adicionalmente avaliadas.

Os segundos pontos finais foram TAP, duração da resposta, duração da sobrevivência, farmacocinética (PK), e FOSI (grupo 2).

Resultados

Os valores demográficos basais dos pacientes são fornecidas no Quadro 2 a seguir. A idade média era 57 anos 131 ΕΡ1850874Β1 (faixa de 35-83) e ECOG PS médio foi 2. 0 número médio de regimes de quimioterapia foi 5.

As Figs. 10-14 representam quaisquer eventos adversos nos pacientes tratados. Pertuzumab foi bem tolerado. Diarreia (classe 1-3) foi relatada em 61% dos pacientes. 5% dos pacientes apresentaram uma queda na fracção de ejecção de menos de 50%.

Os resultados de eficácia são sumarizados na Fig. 15. 4% dos pacientes apresentaram uma resposta parcial (RP) . 39% dos pacientes apresentaram doença estável (SD) . Conforme ilustrado na figura 16, o TAP médio para pacientes tratados com 420 mg de pertuzumab foi de 7 semanas, e, para pacientes tratados com 1050 mg de pertuzumab foi de 6, 6 semanas. A figura 17 proporciona a sobrevivência geral para os pacientes tratados com baixa dosagem ou alta dosagem de pertuzumab. A sobrevivência média foi de 40 semanas. Respostas de CA-125 para os pacientes com cancro de ovário tratados com 420 mg ou 1050 mg de pertuzumab são fornecidas na Fig. 18. Pertuzumab foi eficaz na redução de níveis de CA-125. Cada redução é um indício de que a terapêutica é eficaz no cancro de ovário. O status da activação de HER2 de pacientes do grupo 1, tratados com 420 mg de pertuzumab, foi avaliado. Os resultados são exibidos nas Figs. 19 a 23. Aproximadamente 30% dos pacientes com cancro do ovário foram pHER2 positivos (mais do que 30% de tumor, ELISA realizado conforme descrito no Exemplo 2) . Dos pacientes avaliados para eficácia e dados de pHER2, 26% foram pHER2 positivos. Veja-se Fig. 19. O TAP médio para pacientes pHER2+ foi de 21 semanas, comparado com 6 semanas em pacientes pHER2-, e 9 semanas em 132 ΕΡ1850874Β1 pacientes com status de pHER2 desconhecido (Figs. 20 e 22) . 14 de 61 pacientes do grupo 1 exibiram evidência da actividade de pertuzumab. O único paciente com uma resposta parcial (RP) foi fosfo-HER2 positivo. Veja-se Fig. 21 A sobrevivência geral dos pacientes também foi avaliada. Conforme exibido na Fig. 23, a sobrevivência geral de pacientes pHER2 positivos tratados com pertuzumab aparece superior para a sobrevivência alcançada com topotecano (sobrevivência média de 43 semanas) ou doxorrubicina lipossomal (36 semanas).

Conclusões

Como um agente isolado, pertuzumab é bem tolerado. A toxicidade de pertuzumab e eficácia não parece ser relacionada a dosagem. Pertuzumab possui uma actividade em cancro de ovário avançado, refractário ou recorrente. Indivíduos com status de pHER2 positivo exibiram TAP e sobrevivência aprimorados em comparação a indivíduos com status de pHER2 negativo. A eficácia, conforme medida por TAP ou sobrevivência, de pertuzumab em pacientes que exibem activação de HER2 pareceu superior à sobrevivência alcançada utilizando topotecano ou doxorrubicina lipossomal, agentes atualmente utilizados para tratar pacientes com cancro de ovário avançado, recorrente ou refractário. EXEMPLO 2 ELISA DE FOSFO-HER2 PARA A DETERMINAÇÃO DA ACTIVAÇÃO DE HER2 O exemplo 1 acima descreve o teste clínico que avalia 133 ΕΡ1850874Β1 a eficácia de pertuzumab em indivíduos com cancro de ovário avançado, refractário ou recorrente. 0 presente exemplo descreve o desenvolvimento do teste utilizado para determinar a activação de HER2 em pacientes tratados no exemplo 1. 0 ELISA fosfo—HER2 foi desenvolvido para medir a concentração de fosforilação de tirosina associada a HER2 (HER2/pTyr) em lisatos de tecido de tumor do ovário humanos. 0 teste utiliza placas de microtítulo COSTAR™ 96 cavidades, meia área, devido ao volume de amostra limitado. 0 anticorpo de revestimento é um anti-HER2 ECD de cabra purificado por afinidade e o segundo anticorpo é um monoclonal murino biotinilado (clone 4G10) específico para fosfotirosina. A referência padrão é um lisato de células SK-BR-3 com umo intervalo de teste de 132 U/ml. Uma unidade iguala a quantidade de tirosina fosforilada medida num lisato de célula SK-BR-3 contendo 277 pg de HER2 total, conforme determinado pelo ELISA HER2 total (Total HER2 ELISA). ELISA utiliza AMDEX™ estreptavidina-HRP para detecção e TMB como o substrato.

Materiais 1. Material padrão, lisato de células SK-BR-3 1.056 U/ml HER2/pTyr 2. Fonte de controlo, lisato de células SK-BR-3 1.056 U/ml 3. Anticorpo de revestimento, anti-HER2 ECD de cabra 9,6 mg/ml 4. Anticorpo secundário, murino biotinilado antifosfotirosina, clone 4G10, 971 ug/ml (Upstate 134 ΕΡ1850874Β1

Biotech Cat #16-103) 5. AMDEX™ estreptavidina conjugada a HRP (SA-HRP) (Amersham Biosciences Catalog No. RPN4401) 6. Substrato, Substrato de peroxidase de tetrametil Benzidina (TMB) (Kirkegaard & Perry Labs [KPL] Catalog

No. 50-76-01) 7. Tampão de revestimento, 0,05 M de tampão de carbonato de sódio, pH 9,6 8. Diluente do teste, PBS/0,5% BSA/0,05% Polisorbato 20/0,05% PROCLIN 300™, pH 7,4 9. Tampão de lise: tampão de lise base (50 mM Tris- HC1/150 mM NaCl/5 mM EDTA/1% TRITON X-100™)/1: 10 coquetel inibidor de protease /1: 100 coquetel de inibidor de fosfatase 1/1: 100 coquetel de inibidor de fosfatase 11/ 50 mM fluoreto de sódio/2 mM de orto- vanadato de sódio, pH 8,1 10. Amostra, padrão e diluente controlo: tampão de lise 11. MDA-468 (ATCC# HTB-132). Nível de expressão de HER2: nenhum. Tecido: glândula mamária humana, mama, adenocarcinoma 12. MCF-7 (ATCC# HTB-22). Nível de expressão de HER2: 0 (níveis de expressão normais de HER2). Tecido: glândula mamária humana; mama; epitelial; local metastático: adenocarcinoma de fusão pleural 13. SK-BR-3 (ATCC# HTB-30, Manassas, VA). Nível de 135 ΕΡ1850874Β1 expressão de HER2: 3 (nível elevado de sobre-expressão de HER2). Tecido: glândula mamária humana; mama; local metatársico: adenocarcinoma de efusão pleural 14. BT-474 (ATCC# HTB-20, Manassas, VA). Nível de expressão de HER2: 3 (nível elevado de sobre-expressão de HER2) Tecido: glândula mamária humana; mama; dueto; carcinoma ductal 15. Lisatos de tumor BT-474. Ratinhos foram inoculados com BT-474. Após 2 semanas tumores foram colhidos. Tumores colhidos foram homogeneizados para a produção de lisatos tumorais

Preparação de Materiais

Material padrão/comum: o padrão comum de ELISA fosfo HER2 é material padrão limpo. 0 material padrão foi preparado através da colheita de lisatos de 3 placas de cultura de células 245x245 mm contendo células SK-BR- 3 (SKBR3), que foram confluentes de 80% a 90%. Lisatos celulares foram clarificados através de centrifugação e o sobrenadante foi colhido. O sobrenadante é utilizado como material padrão. O material padrão foi determinado a uma concentração de 1.056 U/ml de forma que o calibrador baixo no intervalo de informação do teste seja 1 U/ml. Uma unidade é definida como a quantidade de tirosina fosforilada mensurada num lisato de células SK-BR-3 que contém 277 pg de HER2 total como determinado por ELISA de HER2 total.

Controlos de lisato celular: controlos de lisato celular foram preparados a partir do material padrão. Material padrão foi diluído em tampão de lise de forma a 136 ΕΡ1850874Β1 obter níveis de HER2/pTyr que representam as faixas menores, medianas e altas da curva de teste padrão.

Controlos de lisato de tecido: controlos de lisato de tecido foram preparados a partir de lisatos tumorais BT474. Lisatos tumorais BT474 foram diluídos em tampão de lise para obter níveis de HER2/pTyr que representam o intervalo alta da curva padrão do ensaio.

Fonte de revestimento: estoque I de anti-HER2 ECD de cabra que foi preparado através da diluição do material de fonte (9,6 mq/ml) para 100 pg/ml em PBS.

Conjugado biotinilado: o anticorpo antifosfotirosina murino biotinilado (1 pg/ml) foi obtido de Upstate Biotech. O anticorpo é um IgG2b-capa monoclonal purificado por proteína A, biotinilado desenvolvido contra fosfotiramina acoplada a KLH. O anticorpo anti-fosfotirosina monoclonal biotinilado (clone 4G10, Cat #05-321) é específico para fosfotirosina e não reage de forma cruzada a fosfoserina ou fosfotreonina.

Especificidade de anti-HER2 ECD de cabra: activação de receptor de HER2 inicia quando a dimerização do receptor ocorre com outros membros da família. A menos que a sinalização seja estritamente devido a homodimerização de HER2, EGFR, HER3, e/ou HER4 devem ser expressos no tumor activo. Cada um dos mencionados receptores pode estar presente em amostras de lisatos de tecido de ovário e podem interferir na mensuração exata da fosforilação de tirosina associada a HER2 (HER2/pTyr) se os mencionados receptores reagirem de forma cruzada com o anticorpo de revestimento. A especificidade do anticorpo anti-HER2 ECD de cabra foi determinada pela análise de ressonância de plasmon de 137 ΕΡ1850874Β1 superfície (BIACORE 3000®, BIACORE® International AB, Neuchatel, Suíça). O anticorpo anti-HER2 ECD de cabra foi imobilizado num sensor de chip CM5 utilizando a química de acoplamento de amina. O sensor de chip foi bloqueado com 1 M de etanolamina-HCl, pH 8,5, e condicionado com 10 mM HC1. A especificidade foi determinada através de injecção de EGFR recombinante solúvel (sEGFR) (Research Diagnostics, Inc., Flanders, NJ) e HER2 ECD humano recombinante /proteínas de fusão de IgGl Fc humanas sobre o anticorpo anti-HER2 de cabra imobilizado. As proteínas de fusão consistiam de ECD de HER2, HER3, ou FTER4 fusionadas a região FC do carboxi-terminal marcada durante 6X histidina de IgGl humana através de ligando peptídico (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Respostas relativas subtraídas de referências para sEGFR, HER3-FC, e HER4-Fc foram, respectivamente, -41 RU, 0,3 RU, e 2,5 RU. A resposta relativa negativa obtida para sEGFR foi devido a alterações no refractivo entre a fase móvel (HBS-EP) e o excipiente da amostra. A resposta relativa para HER2-FC foi 374 RU. Métodos O teste ELISA de fosfo HER2 utiliza placas COSTAR™ de meia- área (A/2) revestidas com anti-HER2 ECD de cabra a 4 pg/ml em 0,5 M de tampão de carbonato de sódio, pH 9,6, e incubado durante 18-72 horas a 2°C-8°C. As cavidades são bloqueadas com aproximadamente 150 pL/cavidade de diluente de ensaio durante 1-2 horas e então 50 pL/cavidade de padrões, controlos, e amostras são adicionadas. A diluição mínima para lisatos de tecido de tumor de ovário é 1/40 em tampão de lise. Os padrões, controlos e amostras são incubados durante 2 horas a temperatura ambiente com agitação. As cavidades são lavadas com PBS/0,05 TWEEN 20™ e 138 ΕΡ1850874Β1 250 ng/ml de antifosfotirosina biotinilado é adicionado. Após 2 horas, as cavidades são lavadas e AMDEX™ estreptavidina-HRP é adicionada. AMDEX™ estreptavidina-HRP (SA-HRP) é um conjugado polimérico com múltiplas marcas de enzima ligadas a estreptavidina. Após 15 minutos, as cavidades são lavadas e um substrato tetrametil-benzidina (TMB) é adicionado, e deixado desenvolver durante 15 minutos antes de ser parado com 1 M de ácido fosfórico. A absorvância é mensurada através da utilização de um leitor de placa SPECTRAMAX™ (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) com um filtro de 450 nm e um filtro referência de 650 nm. As concentrações da amostra são calculadas com relação a um ajuste logístico de 4 parâmetros, não-lineares a uma curva padrão de sete pontos (Marquardt, D. J. Soe. Indust. Appl. Math. 431-441 (1963)). O intervalo de teste de ELISA é 1 a 32 U/ml. As unidades são unidades arbitrárias, onde 1 U iguala a quantidade de tirosina fosforilada mensurada num lisato de células SK-BR-3 contendo 277 pg de HER2 total. O limite inferior do ensaio foi ajustado para 1 U/ml e foi definido pelo limite inferior de detecção. A precisão do ELISA de fosfo HER2 foi novamente avaliada após a concentração do material padrão ser novamente determinada. As precisões de intra- e inter-ensaio foram avaliadas através da determinação do coeficiente de variação (CV) de HER2/pTyr num lisato de células SKBR3 em três diferentes níveis. 0 lisato de células SKBR3 foi diluído para a obtenção de níveis de HER2 que representem as faixas menores, médias e superiores da curva de ensaio padrão. Após a concentração de material padrão ter sido novamente determinada, o controlo superior não estava dentro do intervalo superior da curva padrão de ensaio. Portanto, um lisato de tecido BT474 controlo foi diluído de forma a estar no intervalo superior. Os lisatos, que foram corridos como ensaios controlo, foram analisados 139 ΕΡ1850874Β1 em duplicata após 5 dias. Os dados controlo foram importados em STATVTEW para análise ANOVA™ para determinar o desvio padrão do intra- e inter-ensaio.

As CVs foram calculadas como se segue: 100 x (desvio padrão) / (valor do controlo médio).

As precisões do intra-ensaio de CVs foram 4%, 4%, 3%, e 11% para controlos de BT474, superiores, médios, e inferiores, respectivamente. As precisões do inter-ensaio de CVs foram 5%, 6%, 5%, e 14% para controlos de BT474, superiores, médios, e inferiores, respectivamente.

Durante o desenvolvimento de ELISA de fosfo HER2, um lisato de células SKBR3 foi diluído a 22, 9, 6,39, e 1,71 U/ml em lisato de células MDA468 puro. As amostras foram diluídas em tampão de lise contendo SKBR3 HER2/pTyr para manter um nível constante de HER2/pTyr durante toda a série de diluição, enquanto os efeitos da matriz são diluídos. As séries de diluição foram analisadas por ELISA de fosfo HER2 e comparadas a SKBR3 HER2/pTyr sem MDA468 para determinar a recuperação. A percentagem de recuperação foi calculada como se segue: 100 x SKBR3 HER2/pTyr diluídos em MDA468 SKBR3 HER2/pTyr diluídos em tampão de lise.

Os resultados para a recuperação de SKBR3 HER2/pTyr nos três níveis na presença de lisato de células MDA468, revelaram que a matriz aumenta significativamente a recuperação em diluições de amostra entre pura e 1/16 ao nível de 1,71 U/ml, com recuperação de HER2/pTyr entre 120% e 127%. A interferência da matriz não foi observada em 140 ΕΡ1850874Β1 qualquer outro nível. A recuperação entre 80% e 120% é demonstrada em cada nível de partida a uma diluição de amostra de 1/16 em tampão de lise.

Lisatos de tumor de ovário e BT474 foram diluídos em série por suas vezes em tampão de lise e analisados em ELISA de fosfo HER2. A diluição de partida para as amostras BT474, que foram analisadas durante o desenvolvimento, foi 1/20. Os lisatos de ovário foram analisados após a concentração do material padrão ter sido novamente determinada. A diluição de partida para os lisatos de ovário variou de acordo com as concentrações de HER2/pTyr esperadas. A diferença percentual para as séries de diluição, que é um indicador de linearidade de diluição da amostra, foi calculada como se segue: 100 x (v&lor de resultado correto mais alto — valor de resultado correto mais baixo) (média dos valores de resultado correto mais baixo e mais alto)

Diferenças percentuais para lisato de tecido de ovário HF8198 foram calculadas a partir de uma diluição de 1/80, 1/160, ou mesmo 1/320. Diferenças percentuais para lisato de tecido de ovário HF7945 foram calculadas a partir de uma diluição de 1/320, 1/640, ou mesmo 1/1280. Diferenças percentuais para os lisatos de tecido de ovário restantes foram calculadas a partir de uma diluição de 1/20, ou mesmo 1/40, para determinar a diluição mínima, bem como determinar a linearidade da diluição.

As diferenças para as séries de diluição de BT474 variaram de - 9% a 12%. As diferenças para as séries de diluição de HF7930 e HF7934 a partir de uma diluição de 1/10 foram 43% e 38%, respectivamente. As diferenças para 141 ΕΡ1850874Β1 HF8197 foram 2%, 8%, e 5% para séries de diluição a partir de 1/320, 1/160, 1/1280, respectivamente. As diferenças para HF8198 foram 72%, 34%, e 3%, para séries de diluição a partir de 1/80, 1/160, e 1/320, respectivamente. 18 lisatos de tecido de ovário diferentes foram analisados por ELISA fosfo-HER2 após a concentração de material padrão ter sido alterada. Amostras foram diluídas duas vezes a partir de 1/20 e 1/160. Uma amostra foi LTR a uma diluição de 1/20; 10 amostras foram LTR a uma diluição de 1/40. 7 amostras tiveram níveis mensuráveis de HER2/pTyr a diluições de 1/20 e 1/40 e uma amostra apresentou níveis mensuráveis de HER2/pTyr a uma diluição de até 1/80. As diferenças para amostras que tiveram níveis mensuráveis de HER2/pTyr a diluições de 1/20 e 1/40 variaram de 16% a 34%, com 3 das 7 amostras apresentando diferenças de menos de 20%. A única amostra que apresentou níveis mensuráveis de HER2/pTyr a uma diluição de até 1/80, amostra HF7931, apresentava diferenças de 16% e 4% para séries de diluição a partir de 1/20 e 1/40, respectivamente.

Pertuzimab e trastuzumab foram analisados em ELISA fosf0-HER2 para determinar se estes terapêuticos interferem. Os anticorpos foram diluídos a concentrações que variavam de 1,5 a 10.000 ng/ml em lisatos de células MCF7 (MCF7+) estimulados por heregulina, contendo 98,48 U/ml de HER2/pTyr.

Durante o desenvolvimento, lisatos de células e tecidos foram submetidos a 4 ciclos de congelamento e degelo para a determinação dos efeitos do ciclo de temperatura. Lisato de células SKBR3 e lisatos de tumor BT474 congelados foram degelados a temperatura ambiente. A partir de cada lisato, foram removidos 10 pL e diluídos num diluente de ensaio. Os lisatos restantes foram rapidamente 142 ΕΡ1850874Β1 congelados numa mistura de gelo seco e metanol, e degelados novamente. Amostras de teste foram removidas mais uma vez e diluídas em diluente de ensaio (primeiro ciclo congelamento/degelo, x) . 0 congelamento rápido, degelo e procedimento de colheita da amostra foram "repetidos duas vezes para a obtenção de amostras a partir dos segundo e terceiro ciclo de congelamento/degelo (2x e 3x, respectivamente).

Amostras diluídas foram testadas em ELISA fosfo-HER2 para determinar a recuperação de HER2/pTyr com relação à amostra "fresca". A amostra "fresca" é a amostra obtida a partir do degelo inicial.

As recuperações de SKBR3 HER2/pTyr para amostras de lx, 2x, e 3x foram 104%, 109%, e 113%, respectivamente. As recuperações de BT474 HER2/pTyr em amostra 314A foram 99%, 103%, e 99%, para amostras de lx, 2x, e 3x, respectivamente. As recuperações de BT474 HER2/pTyr em amostra 365 foram 111%, 96%, e 99%, para amostras lx, 2x, e 3x, respectivamente. O limite inferior de quantificação (LLOQ) foi determinado como a concentração média do controlo inferior, 1,35 U/ml. Uma vez que o controlo inferior é incluído dentro de cada experimento, ele é um indicador confiável do limite inferior para qual amostras podem ser mensuradas de forma exata. Portanto, a concentração quantificável mínima em ELISA de fosfo HER2 é o LLOQ multiplicado pela diluição mínima da amostra (1/40), ou 54 U/ml.

Conclusões

Um ensaio ELISA sensível e exacto foi desenvolvido para mensurar a fosforilação de tirosina associada a HER2 143 ΕΡ1850874Β1 (HER2/pTyr) em lisatos de tecido tumoral. ELISA fosfo-HER2 se demonstrou sensível a seguir de 1,35 U/ml com uma concentração quantificável mínima de 54 U/ml, onde 1 U é igual à quantidade de tirosina fosforilada mensurada em lisato de células SK- BR-3 contendo 277 pg de HER2 total. 0 ELISA de fosfo-HER2 demonstrou boa precisão em 4 níveis. As precisões intra-ensaio de CVs foram 4%, 3%, 3%, e 11%, para o lisato de tecido BT474 controlo e os controlos superiores, médios, e inferiores de lisato de célula SKBR3, respectivamente. As precisões inter- ensaio de CVs foram 5%, 6%, 5%, e 14%, para o controlo de lisato de tecido BT474 e os controlos superiores, médios e inferiores de lisato de células SKBR3, respectivamente. 0 ELISA de fosfo-HER2 demonstrou boa recuperação de HER2/pTyr na presença de lisato de célula MDA468. A partir de uma diluição de 1/16, recuperações variando de 88% a 120%. ELISA demonstrou alta especificidade como EGFR, HER3-IgG Fc, e HER4-IgG Fc não reagem de forma cruzada com o revestimento do ensaio.

Lisatos de tecido de tumor de ovário humano e tumor de xenoenxerto de ratinho BT474 foram utilizados para analisar a linearidade da diluição e a diluição de amostra mínima. As diferenças de valores corrigidos de diluição para os lisatos de tumor de BT474 variaram de - 9% a 12%. Fora os 7 lisatos de ovário que tiveram níveis mensuráveis de HER2/pTyr a diluições de 1/20 e 1/40, apenas 3 apresentaram diferenças de menos de 20%, enquanto 6 dos 7 tiveram diferenças menores ou iguais a 23%. A única amostra que apresentou níveis mensuráveis de HER2/pTyr a uma diluição de até 1/80, a amostra HF7931, apresentou uma diferença de 4% para séries de diluição a partir de 1/40. Todas das amostras acima não encontraram o critério de ^20% a uma diluição mínima de 1/20, portanto, a diluição de amostra 144 ΕΡ1850874Β1 mínima será 1/40.

As amostras de lisatos de tecido BT474 e lisato de tecido de ovário humano HF8197 e HF8198 tiveram níveis mensuráveis altos de HER2/pTyr e necessitaram de diluições entre 1/80 e 1/320 para atingirem o intervalo quantitativo do ensaio. As amostras BT474 e amostra HF8197, que tiveram a concentração de HER2/pTyr mensurada mais alta dentro do subconjunto de tecido de tumor de ovário humano, diluídos de forma linear até o intervalo de ensaio total. Em contraste, a amostra HF8198 diluída de forma não linear como o correto para concentrações de HER2/pTyr de diluição monotonicamente aumentadas através do intervalo de ensaio e aparece para estabilização a uma diluição de 1/320.

Lisatos de células SKBR3 submetidos a 3 ciclos de congelamento/degelo demonstraram uma recuperação muito boa. A recuperação de HER2/pTyr variou de 104% a 113% em relação a mesma amostra fresca por degelo. 2 lisatos de tumor BT474 também foram submetidos a 3 ciclos de congelamento/degelo. A recuperação de BT474 fosfo-HER2 variou de 99% a 103%. A recuperação de HER2/pTyr de BT474 variou de 96% a 111%. Portanto, o ciclo de temperatura parece não afectar a actividade de fosfo-HER2. O ensaio ELISA de fosfo-HER2 não demonstrou qualquer interferência a partir de pertuzimab ou mesmo trastuzumab. EXEMPLO 3 PERFIL DE EXPRESSÃO GENICA PARA DETERMINAÇÃO DA ACTIVAÇÃO DE HER2 O presente exemplo exibe como a activação de HER2 pode 145 ΕΡ1850874Β1 ser avaliada através da determinação de perfis de expressão génica como uma alternativa para determinar directamente a fosforilação de HER2. 0 mencionado perfil pode ser realizado em espécimes de tumor de ovário embebidas em parafina, fixadas em formalina, congeladas ou frescas, mas preferencialmente embebidas em parafina.

Espécimes de cancro de ovário tratados com pertuzumab foram determinados para a expressão génica utilizando análises de microarranjo AFFYMETRIX® realizadas de acordo com instruções do fabricante. Os dados de expressão do microarranjo foram analisados para identificar padrões génicos que seriam associados com status de fosforilação de HER2. De forma considerável, um padrão foi emerso onde tumores com niveis de expressão de EGFR, HER2, HER3, e ligando HER de betacelulina relativamente altos também foram positivos para fosforilação de HER2. A correlação foi positiva em 6 dos 6 casos positivos de fosforilação de HER2, e nenhum dos casos negativos de fosforilação de HER2 foi positivo utilizando dados de expressão de microarranjo como a base para o algoritmo.

Numa segunda análise, a predição do status de fosforilação de HER2 foi alcançada através da utilização de um único gene isolado, denominado betacelulina. Todos os 6 tumores positivos para a fosforilação de HER2 tiveram uma expressão de betacelulina acima do médio, utilizando os dados de expressão de microarranjo.

Um segundo método para quantificar a expressão génica, reacção em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR), foi utilizado para validar, e foi comparado com, os dados do microarranjo. qRT-PCT seria um método preferido para a mensuração de expressão génica em amostras de pacientes típicas disponíveis num conjunto clínico. 146 ΕΡ1850874Β1

Plataformas da tecnologia de diagnóstico já foram estabelecidas para este método. qRT-PCR foi realizada conforme descrito em Cronin et al., Am. J. Pathol. 164(1): 35 - 42 (2004); e Ma et al., Câncer Cell 5: 607-616 (2004) . O ARN foi extraído de tumores de ovário congelados utilizando reagentes comercialmente disponíveis de Qiagen, Valência, Califórnia. Primers e sondas para análise TAQMAN™ qRT-PCR foram designadas para darem comprimentos de amplicão de cerca de 100 bases ou menos. Transcritos foram quantificados por qRT- PCR utilizando um instrumento TAQMAN™ (Applied BioSystems), com níveis de expressão dos genes de teste normalizados par aqueles genes de referência. O gene constitutivo (house keeping) GUS foi seleccionado como o gene controlo devido a sua baixa variação e alta expressão.

Com base nos experimentos notados acima, um algoritmo foi desenvolvido com base nos dados de perfil de expressão génica de tumores com status de fosforilação de HER2 conhecidos por ELISA. Um tumor é considerado positivo para um perfil de expressão génica associado com a fosforilação de HER2 que possui betacelulina ou anfiregulina e expressão de HER2 mediana ou acima, e/ou expressão de EGFR e/ou HER3 mediana ou acima. Alternativamente, a expressão isolada de betacelulina ou anfiregulina pode ser mensurada através de qRT-PCR para identificar tumores com fosforilação de HER2 prevista.

Lista De Sequências <110> GENENTECH, INC. DERYNCK, MIKA K. KELSEY, STEPHEN M.

<120> EXTENSÃO DE TEMPO ATÉ A PROGRESSÃO DA DOENÇA OU SOBREVIVÊNCIA EM PACIENTES COM CANCRO DE OVÁRIO USANDO PERTUZUMAB 147 ΕΡ1850874Β1 < 13 0 > Ρ22 0 6R1 <150> US 60/655.277 <151> 23- 02-2005 < 16 0 > 22 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 1 ASP 1 Thr Vai Met Thr Gin 5 Ser His Lys Ile 10 Met Ser Thr Ser Val 15 Gly Asp Arg vai Ser Ile 20 Thr Cys Lys Ala 25 Ser Gin Asp Val Ser 30 Ile Gly vai Ala Trp Tyr 35 Gin Gin Arg pro 40 Gly Gin Ser pro Lys 45 Leu Leu ile Tyr Ser Ala 50 ser Tyr Arg Thr Gly val Pro ASp 60 Arg Phe Thr Gly Ser Gly 65 Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Phe Thr ile 75 Ser ser vai Gin Ala Glu 80 Asp Leu Ala val 85 Tyr Tyr cys Gin Gin 90 Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 95 Thr Phe Gly Gly 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105

<210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 148 ΕΡ1850874Β1

Glu 1 vãl Gin Leu Gin 5 Gin Ser Gly pro Glu 10 Leu Vai Lys Pro Gly 15 Thr Ser Vai Lys ile 20 ser cys Lys Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Thr 30 Asp Tyr Thr Met ASp 35 Trp vai Lys Gin Ser 40 HÍS Gly Lys Ser Leu 45 Glu Trp Ile Gly ASp 50 vai Asn Pro Asn Ser 55 Gly Gly Ser Ile Tyr 60 Asn Gin Arg phe Lys 65 Gly Lys Ala Ser Leu 70 Thr vai Asp Arg Ser 75 Ser Arg Ile vai Tyr 80 Met Glu Leu Arg ser 85 Leu Thr Phe Glu Asp 90 Thr Ala Vai Tyr Tyr 95 cys Ala Arg Asn Leu 100 Gly pro ser Phe Tyr 105 Phe Asp Tyr Trp Gly HO Gin Gly Thr Thr Leu 115 Thr vai ser ser <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência art ificial <220> <223> a sequênci .a é sintet izada <400> 3 ASp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser ser 10 Leu Ser Ala ser vai 15 Gly Asp Arg vai Thr 20 Ile Thr cys Lys Ala 25 ser Gin ASP vai Ser 30 ile Gly vai Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu ile Tyr ser 50 Ala ser Tyr Arg Tyr 55 Thr Gly vai Pro ser 60 Arg phe ser Gly Ser 65 Gly ser Gly Thr ASP 70 phe Thr Leu Thr Ile 75 ser ser Leu Gin pro 80 Glu ASp phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90 Tyr Tyr ile Tyr Pro 95 Tyr Thr phe Gly Gin 100 Gly Thr Lys val Glu 105 Ile Lys 149 ΕΡ1850874Β1

<210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> a sequência é sintetizada <400> 4

Glu 1 Val Gin Leu val 5 Glu ser Gly Gly Gly 10 Leu val Gin pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser cys Ala Ala ser 25 Gly Phe Thr Phe Thr 30 Asp Tyr Thr Met ASP 35 Trp val Arg Gin Ala 40 pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp val Ala Asp 50 val Asn pro Asn Ser 55 Gly Gly ser ile Tyr 60 Asn Gin Arg Phe Lys Gly Arg phe Thr Leu Ser val Asp Arg Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala val Tyr Tyr cys Ala Arg Asn Leu Gly pro Ser Phe Tyr 95 100 ios Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val ser Ser 110 US

<210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> a sequência é sintetizada <400> 5 150 ΕΡ1850874Β1 ASp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser ser 10 Leu Ser Ala Ser val 15 Gly Asp Arg val Thr 20 ile Thr cys Arg Ala 25 Ser Gin ser Ile ser 30 Asn Tyr Leu Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys pro 40 Gly Lys Ala pro Lys 45 Leu Leu ile Tyr Ala 50 Ala Ser Ser Leu Glu 55 Ser Gly val pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly Ser 65 Gly ser Gly Thr ASP 70 Phe Thr Leu Thr lie 75 ser ser Leu Gin Pro 80 Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr cys Gin Gin 90 Tyr Asn ser Leu Pro 95 Trp Thr Phe Gly Gin 100 Gly Thr Lys val Glu 105 Ile Lys <210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> a sequência é sintetizada <4 0 0> Glu 1 6 val Gin Leu Val 5 Glu ser Gly Gly Gly 10 Leu val Gin pro Gly 15 Gly ser Leu Arg Leu 20 ser cys Ala Ala ser 25 Gly phe Thr Phe ser 30 Ser Tyr Ala Met Ser 35 Trp val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp val Ala Val 50 Ile ser Gly Asp Gly 55 Gly Ser Thr Tyr Tyr 60 Ala Asp ser val Lys 65 Gly Arg phe Thr Ile 70 ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg val Gly Tyr Ser Leu 95 100 105 Tyr Asp Tyr Trp Gly 110 Gin Gly Thr Leu val 115 Thr val ser ser 151 ΕΡ1850874Β1 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> A sequência é sintetizada. <220> <221> xaa <222> 10 <223> xaa é preferivelmente D ou S <400> 7 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met xaa 5 10 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> A sequência é sintetizada. <4 0 0> 8

Asp vai Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser lie Tyr Asn Gin Arg Phe 15 10 15

Lys Gly

<210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 152 ΕΡ1850874Β1 <223> A sequência é sintetizada. <400> 9

Asn Leu Gly Pro ser Phe Tyr Phe Asp Tyr 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> A sequência é sintet <400> 10

Lys Ala ser Gin Asp vai ser ile Gly vai Ala 5 10

<210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> a sequência é sintetizada <220> <221> xaa <222> 5

<223> xaa é preferivelmente R ou L <220> <221> Xaa <222> 6

<223> xaa é preferivelmente Y ou E 153 ΕΡ1850874Β1 <220> <221> Xaa <222> 7 <223> xaa é preferivelmente T ou S < 4 0 0 > 11 Ser Ala ser Tyr xaa 5 xaa Xaa <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> A sequência é sintetizada. <400> 12 Gin Gin Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr <210> 13 <211> 214 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> A sequência é sintetizada. <400> 13 154 ΕΡ1850874Β1 ASp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin ser Pro Ser ser 10 Leu Ser Ala ser vai 15 Gly Asp Arg vai Thr 20 ile Thr cys Lys Ala 25 ser Gin Asp Vai ser 30 ile Gly vai Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu ile Tyr ser 50 Ala ser Tyr Arg Tyr 55 Thr Gly vai Pro ser 60 Arg Phe Ser Gly Ser 65 Gly Ser Gly Thr A5p 70 phe Thr Leu Thr ile 75 ser Ser Leu Gin Pro 80 Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr cys Gin Gin 90 Tyr Tyr Ile Tyr Pro 95 Tyr Thr Phe Gly Gin 100 Gly Thr Lys vai Glu 105 Ile Lys Arg Thr vai 110 Ala Ala Pro Ser Vai 115 phe lie phe Pro Pro 120 ser Asp Glu Gin Leu 125 Lys Ser Gly Thr Ala 130 ser vai vai cys Leu 135 Leu Asn Asn Phe Tyr 140 Pro Arg Glu Ala Lys íh5 vai Gin Trp Lys val 150 Asp Asn Ala Leu Gin 155 Ser Gly Asn ser Gin 160 Glu ser vai Thr Glu 165 Gin Asp ser Lys Asp 170 Ser Thr Tyr Ser Leu 175 Ser ser Thr Leu Thr 180 Leu ser Lys Ala Ásp 185 Tyr Glu Lys His Lys 190 vai Tyr Ala cys Glu 195 Vai Thr His Gin Gly 200 Leu ser Ser Pro Vai 205 Thr Lys ser Phe Asn 210 Arg Gly Glu cys <210> 14 <211> 448 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> A sequência é sintetizada. <400> 14 155 ΕΡ1850874Β1

GlÚ 1 vai Gin Leu vai 5 Glu ser Gly Gly Gly 10 Leu val Gin pro Gl? Gly ser Leu Arg Leu 20 Ser cys Ala Ala ser 25 Gly phe Thr phe Thr 30 Asp Tyr Thr Met ΊΙ Trp vai Arg Gin Ala 40 pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp vai Ala Asp vai Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser lie Tyr 60 50 55 Asn Gin Arg Phe Lys 65 Gly Arg Phe Thr Leu 70 ser val ASP Arg Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn ser 85 Leu Arg Ala Glu ASp 90 Thr Ala vai Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Asn Leu 100 Gly pro Ser Phe Tyr 105 phe ASp Tyr Trp Gly 110 Gin Gly Thr Leu val 115 Thr val ser Ser Ala 120 ser Thr Lys Gly Pro ser Val Phe Pro Leu Ala pro ser ser Lys 125 130 135 ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu val Lys Asp 140 145 150 Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr Val Ser Trp Asn ser Gly Ala Leu 155 160 165 Thr Ser Gly vai His Thr phe Pro Ala val Leu Gin ser ser Gly 170 175 180 Leu Tyr Ser Leu Ser ser val Val Thr val pro ser Ser Ser Leu 185 190 195 Gly Thr Gin Thr Tyr ile cys Asn val Asn His Lys Pro Ser Asn 200 205 210 156 ΕΡ1850874Β1

Thr Lys vai Asp Lys 21S Lys val Glu Pro Lys 220 Ser Cys Asp Lys Thr 225 His Thr cys Pro Pro Cys 230 Pro Ala Pro Glu 235 Leu Leu Gly Gly pro 240 ser Vai phe Leu Phe 245 Pro pro Lys Pro Wo Asp Thr Leu Met He 255 Ser Arg Thr Pro Glu 260 Val Thr Cys val val 265 val Asp val ser HÍS 270 Glu Asp pro Glu Val 275 Lys Phe Asn Trp Tyr 280 val Asp Gly val Glu 285 vai His Asn Ala Lys 290 Thr Lys Pro Arg Glu 295 Glu Gin Tyr Asn ser 300 Thr Tyr Arg val Val 305 Ser val Leu Thr val 310 Leu His Gin Asp Trp 315 Leu Asn Gly Lys Glu 320 Tyr Lys cys Lys val 325 Ser Asn Lys Ala Leu 330 Pro Ala pro ile Glu 335 Lys Thr He ser Lys 340 Ala Lys Gly Gin Pro 345 Arg Glu pro Gin Val 350 Tyr Thr Leu pro Pro 355 Ser Arg Glu Glu Met 360 Thr Lys Asn Gin val 365 Ser Leu Thr cys Leu 370 val Lys Gly phe Tyr 375 pro ser Asp Ile Ala 380 val Glu Trp Glu ser 385 Asn Gly Gin pro Glu 390 Asn Asn Tyr Lys Thr 395 Thr Pro pro val Leu 400 ASp ser Asp Gly Ser 405 Phe phe Leu Tyr Ser 410 Lys Leu Thr val Asp 415 Lys ser Arg Trp Gin 420 Gin Gly Asn val Phe 425 Ser cys ser val Met 430 His Glu Ala Leu His 435 Asn His Tyr Thr Gin 440 Lys Ser Leu ser Leu 445 Ser Pro Gly

<210> 15 <211> 214 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> A sequência é sintetizada. <4 Ο 0> 15 157 ΕΡ1850874Β1 ASÇ ile Gin Met Thr 5 Gin Ser pro ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser val 15 Gly Asp Arg vai Thr 20 11 e Thr cys Arg Ala 25 Ser Gin Asp val Asn 30 Thr Ala vai Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu ile Tyr Ser 50 Ala ser phe Leu Tyr 55 ser Gly val pro Ser 60 Arg Phe ser Gly Ser 65 Arg ser Gly Thr ASp 70 Phe Thr Leu Thr lie 75 ser Ser Leu Gin pro 80 Glu ASP phe Ala Thr 85 Tyr Tyr cys Gin Gin 90 His Tyr Thr Thr Pro 95 Pro Thr phe Gly Gin 100 Gly Thr Lys val Glu 105 ile Lys Arg Thr Vai 110 Ala Ala pro ser val 115 Phe lie Phe Pro Pro 120 Ser Asp Glu Gin Leu 125 Lys ser Gly Thr Ala 130 Ser val val Cys Leu 135 Leu Asn Asn Phe Tyr 140 Pro Arg Glu Ala Lys 145 val Gin Trp Lys Val ISO Asp Asn Ala Leu Gin 155 Ser Gly Asn ser Gin 160 Glu Ser val Thr Glu 165 Gin Asp Ser Lys ASp 170 Ser Thr Tyr ser Leu 175 Ser Ser Thr Leu Thr 180 Leu Ser Lys Ala ASp 185 Tyr Glu Lys His Lys 190 val Tyr Ala cys Glu 195 vai Thr HÍS Gin Gly 200 Leu Ser Ser Pro val 205 Thr Lys Ser phe Asn 210 Arg Gly Glu Cys

<210> 16 <211> 449 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> a sequência é sintetizada <400> 16 158 ΕΡ1850874Β1

Glu val Gin Leu 1

Gly Ser Leu Arg Asp Thr Tyr He Glu Trp vai Ala Ala Asp Ser vai Lys Asn Thr Ala Thr Ala vai Tyr Ala Met Asp Tyr val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu val Gin pro 61? Leu 20 Ser cys Ala Ala ser 25 Gly Phe Asn Ile Lío His 35 Trp val Arg Gin Ala 40 pro Gly Lys Gly Leu 45 Arg 50 Ile Tyr pro Thr Asn 55 Gly Tyr Thr Arg Tyr 60 Lys Gly Arg Phe Thr ile ser Al a Asp Thr ser 65 70 75 Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Tyr cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly phe Tyr 95 100 105 Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val ser Ser 110 115 120 159 ΕΡ1850874Β1

Ala Ser Thr Lys Gly 12S Pro ser val Phe pro 130 Leu Ala Pro ser Ser 135 Lys ser Thr Ser Gly 140 Gly Thr Ala Ala Leu 145 Gly cys Leu val Lys 150 Asp Tyr Phe pro Glu 155 pro val Thr val ser 160 Trp Asn Ser Gly Ala 165 Leu Thr Ser Gly val 170 His Thr phe Pro Ala 175 val Leu Gin ser Ser 180 Gly Leu Tyr ser Leu 185 ser Ser val val Thr 190 val Pro ser ser ser 195 Leu Gly Thr Gin Thr 200 Tyr ll e cys Asn val 205 Asn His Lys pro Ser 210 Asn Thr Lys val Asp 215 Lys Lys val Glu Pro 220 Lys Ser cys Asp Lys 225 Thr His Thr cys Pro 230 Pro Cys pro Ala Pro 235 GlU Leu Leu Gly Gly 240 Pro Ser val Phe Leu 245 phe Pro Pro Lys Pro 250 Lys Asp Thr Leu Met 255 lie Ser Arg Thr Pro 260 Glu val Thr cys val 265 val val Asp val Ser 270 His Glu Asp Pro Glu 275 val Lys Phe Asn Trp 280 Tyr val Asp Gly val 285 Glu vai His Asn Ala 290 Lys Thr Lys Pro Arg 295 Glu Glu Gin Tyr Asn 300 ser Thr Tyr Arg val 305 Val Ser val Leu Thr 310 val Leu His Gin ASp 315 Trp Leu Asn Gly Lys 320 Glu Tyr Lys Cys Lys 325 val Ser Asn Lys Ala 330 Leu Pro Ala Pro He 335 Glu Lys Thr Ile Ser 340 Lys Ala Lys Gly Gin 345 Pro Arg Glu Pro Gin 350 val Tyr Thr Leu Pro 355 Pro Ser Arg Glu Glu 360 Met Thr Lys Asn Gin 365 val Ser Leu Thr cys 370 Leu val Lys Gly Phe 375 Tyr Pro Ser Asp lie 380 Ala val Glu Trp Glu 385 Ser Asn Gly Gin pro 390 Glu Asn Asn Tyr Lys 395 Thr Thr Pro Pro val 400 Leu Asp ser ASp Gly 405 Ser Phe Phe Leu Tyr 410 ser Lys Leu Thr val 415 Asp Lys Ser Arg Trp 420 Gin Gin Gly Asn val 425 Phe Ser cys ser val 430 Met His Glu Ala Leu 435 His Asn HiS Tyr Thr 440 Gin Lys Ser Leu Ser 445 Leu Ser Pro Gly 160 ΕΡ1850874Β1

<210> 17 <211> 217 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> A sequência é sintetizada. <400> 17 vai 1 His Ser Asp lie 5 Gin Met Thr Gin Ser 10 pro ser Ser Leu Ser 15 Ala ser vai Gly Asp Arg 20 vai Thr He Thr 25 cys Lys Ala Ser Gin 30 ASp vai Ser lie Glí vai Ala Trp Tyr Gin 40 Gin Lys pro Gly Lys 45 Ala Pro Lys Leu Leu 50 He Tyr ser Ala Ser 55 Tyr Arg Tyr Thr Gly 60 vai Pro Ser Arg Phe 65 ser Gly ser Gly Ser 70 Gly Thr ASp Phe Thr 75 Leu Thr He Ser ser 80 Leu Gin Pro Glu ASP 85 phe Ala Thr Tyr Tyr 90 cys Gin Gin Tyr Tyr 95 He Tyr pro Tyr Thr 100 phe Gly Gin Gly Thr 105 Lys vai Glu 11 e Lys Arg 110 Thr vai Ala Ala 115 pro ser vai Phe lie 120 phe Pro Pro ser Asp 125 Glu Gin Leu Lys ser 130 Gly Thr Ala ser vai 135 vai Cys Leu Leu Asn 140 Asn Phe Tyr Pro Arg 145 Glu Ala Lys vai Gin 150 Trp Lys vai ASp Asn 155 Ala Leu Gin ser Gly 160 Asn Ser Gin Glu ser 165 vai Thr Glu Gin Asp ser 170 Lys ASP Ser Thr 175 Tyr Ser Leu Ser ser 180 Thr Leu Thr Leu ser 185 Lys Ala ASP Tyr Glu 190 Lys His Lys val Tyr 195 Ala cys Glu vai Thr 200 His Gin Gly Leu Ser 205 ser pro vai Thr Lys 210 Ser Phe Asn Arg Gly Glu 215 cys <210> 18 161 ΕΡ1850874Β1

<211> 449 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> A sequência é sintetizada. <400> 18

Glu 1 vai Gin Leu vai S Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu vai Gin Pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala ser Gly phe Thr Phe Thr 20 25 30 Asp Tyr Thr Met ASp Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 162 ΕΡ1850874Β1 35 40 45

GlU Trp Vai Ala Asp SO val Asn Pro Asn Ser 55 Gly Gly Ser ile Tyr 60 Asn Gin Arg Phe Lys 65 ciy Arg Phe Thr Leu 70 Ser val Asp Arg ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn ser 85 Leu Arg Ala Glu ASp 90 Thr Ala vai Tyr Tyr 95 cys Ala Arg Asn Leu 100 Gly Pro ser phe Tyr 105 Phe Asp Tyr Trp Gly 110 Gin Gly Thr Leu val 115 Thr val ser Ser Ala 120 ser Thr Lys Gly Pro 125 Ser val Phe Pro Leu 130 Ala pro ser ser Lys 135 Ser Thr Ser Gly Gly 140 Thr Ala Ala Leu Gly 145 Cys Leu val Lys Asp 150 Tyr Phe Pro Glu Pro 155 val Thr Val Ser Trp 160 Asn Ser Gly Ala Leu 165 Thr Ser Gly Vai His 170 Thr Phe Pro Ala val 175 Leu Gin ser ser Gly 180 Leu Tyr Ser Leu Ser 185 Ser Val val Thr val 190 pro ser ser ser Leu 195 Gly Thr Gin Thr Tyr 200 He Cys Asn val Asn 205 His Lys pro Ser Asn 210 Thr Lys vai Asp Lys 215 Lys val Glu Pro Lys 220 ser cys ASp Lys Thr 225 His Thr cys Pro Pro 230 Cys Pro Ala Pro Glu 235 Leu Leu Gly Gly Pro 240 ser vai Phe Leu Phe 245 Pro pro Lys Pro » Asp Thr Leu Met ile 255 Ser Arg Thr Pro Glu 260 Val Thr cys val Val 265 val ASp val Ser His 270 Glu Asp Pro Glu val 275 Lys Phe Asn Trp Tyr 280 val Asp Gly val Glu 285 vai His Asn Ala Lys 290 Thr Lys Pro Arg Glu 295 Glu Gin Tyr Asn Ser 300 Thr Tyr Arg val val 305 Ser val Leu Thr val 310 Leu His Gin Asp Trp 315 Leu Asn Gly Lys Glu ím Tyr Lys cys Lys Val 325 Ser Asn Lys Ala Leu 330 ΡΓΟ Ala Pro Ile GlU 335 Lys Thr ile ser Lys 340 Ala Lys Gly Gin Pro 345 Arg Glu pro Gin val 350 Tyr Thr Leu pro Pro 355 Ser Arg Glu Glu Met 360 Thr Lys Asn Gin Val 365 Ser Leu Thr Cys Leu 370 val Lys Gly Phe Tyr 375 163 ΕΡ1850874Β1 ΡΓΟ Ser Asp He Ala 380 vai Glu Trp Glu Ser 385 Asn Gly Gin Pro Glu 390 Asn Asn Tyr Lys Thr 395 Thr pro Pro vai Leu 400 ASP ser Asp Gly ser 405 phe phe Leu Tyr Ser 410 Lys Leu Thr vai ASP 415 Lys ser Arg Trp Gin 420 Gin Gly Asn Vai phe 425 ser cys Ser vai Met 430 His Glu Ala Leu His 435 Asn His Tyr Thr Gin 440 Lys Ser Leu Ser Leu 445 Ser pro Gly Lys <210> 19 <211> 195 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Thr 1 Gin vai Cys Thr 5 Gly Thr Asp Met Lys 10 Leu Arg Leu pro Ala 15 ser Pro GlU Thr His 20 Leu Asp Met Leu Arg 25 His Leu Tyr Gin Gly 30 Cys Gin Vai vai Gin 35 Gly Asn Leu Glu Leu 40 Thr Tyr Leu Pro Thr 45 Asn Ala Ser Leu Ser 50 Phe Leu Gin ASP lie 55 Gin Glu vai Gin Gly 60 Tyr vai Leu ile Ala 65 His Asn Gin vai Gin Vai Pro Leu Gin 75 Arg Leu Arg He vai 80 Arg Gly Thr Gin Leu 85 Phe Glu ASp Asn Tyr 90 Ala Leu Ala vai Leu 95 Asp Asn Gly Asp pro 100 Leu Asn Asn Thr Thr 105 Pro vai Thr Gly Ala 110 ser pro Gly Gly Leu 115 Arg Glu Leu Gin Leu 120 Arg Ser Leu Thr GlU 125 lie Leu Lys Gly Gly 130 vai Leu He Gin Arg 135 Asn Pro Gin Leu Cys 140 Tyr Gin Asp Thr lie 145 Leu Trp Lys Asp lie 150 Phe His Lys Asn Asn 155 Gin Leu Ala Leu Thr 160 Leu lie ASP Thr Asn 165 Arg Ser Arg Ala Cys 170 His pro cys ser Pro 175 Met Cys Lys Gly Ser 180 Arg Cys Trp Gly Glu 185 Ser ser Glu ASp Cys 190 Gin Ser Leu Thr Arg 195 164 ΕΡ1850874Β1 <2 Λ Ο ι—I 20 <2 11> 124 <2 12> PRT <2 13> Homo sapiens <4 00> 20 Thr 1 vãl cys Ala Gly cys Ala Arg cys 10 Lys Gly pro Leu pro 15 Thr Asp Cys Cys HÍS 20 Glu Gin cys Ala Ala 25 Gly cys Thr Gly pro 30 Lys HÍS ser ASP cíl Leu Ala cys Leu HÍS 40 Phe Asn His ser Gly 45 Ile cys Glu Leu HÍS 50 cys Pro Ala Leu val 55 Thr Tyr Asn Thr ASp 60 Thr phe Glu ser Met 65 pro Asn pro Glu Gly 70 Arg Tyr Thr Phe Gly 75 Ala Ser Cys vai Thr 80 Ala cys Pro Tyr Asn 85 Tyr Leu ser Thr ASp 90 vai Gly ser cys Thr Leu vai Cys Pro Leu HÍS Asn Gin Glu val 95 100 105 Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gin Arg cys Glu Lys Cys ser Lys pro 110 115 120 Cys Ala Arg vai <2 10> 21 <2 11> 169 <2 12> PRT <2 13> Homo s; apiens <4 00> 21 165 ΕΡ1850874Β1 cys 1 Tyr Gly Leu *1 Met Glu HiS Leu Aí8 Glu val Arg Ala val 15 Thr Ser Ala Asn ile 20 Gin Glu Phe Ala cys Lys Lys ile Phe 30 Gly ser Leu Ala Phe 35 Leu pro Glu ser Phe 40 ASp Gly Asp Pro Ala 45 ser Asn Thr Ala pro 50 Leu Gin Pro Glu Gin 55 Leu Gin val Phe Glu 60 Thr Leu Glu Glu ile 65 thr Gly Tyr Leu Tyr 70 Ile Ser Ala Trp Pro 75 Asp Ser Leu Pro ASp 80 Leu Ser vai Phe Gin 85 Asn Leu Gin val Ile 90 Arg Gly Arg Ile Leu 95 HiS Asn Gly Ala Tyr 100 Ser Leu Thr Leu Gin 105 Gly Leu Gly lie Ser 110 Trp Leu Gly Leu Arg 115 ser Leu Arg Glu Leu 120 Gly ser Gly Leu Ala 125 Leu Ile HiS His Asn 130 Thr His Leu cys phe 135 vai HiS Thr vai Pro 140 Trp Asp Gin Leu Phe 145 Arg Asn Pro His Gin 150 Ala Leu Leu HiS Thr 1S5 Ala Asn Arg pro Glu 160 Asp Glu Cys val Gly 165 Glu Gly Leu Ala <2 10> 22 <2 11> 142 <2l2> PRT <2 13> Homo s. apiens <400> 22 166 ΕΡ1850874Β1 cys His Gin Leu cyf Ala Arg GlV His cys 10 Trp Gly pro Gly Pro 15 Thr Gin Cys vai Asn 20 cys Ser Gin phe Leu 25 Arg Gly Gin Glu Cys 30 vai Glu Glu Cys Arg 35 vai Leu Gin Gly Leu 40 Pro Arg Glu Tyr val 45 Asn Ala Arg HÍS cys 50 Leu Pro cys HÍS Pro 55 Glu cys Gin pro Gin 60 Asn Gly Ser Vai Thr 65 cys Phe Gly Pro Glu 70 Ala ASP Gin cys val 75 Ala cys Ala His Tyr 80 Lys Asp pro pro phe 85 cys val Ala Arg cys 90 ΡΓΟ ser Gly vai Lys 95 Pro Asp Leu ser Tyr 100 Met pro lie Trp BS phe ΡΓΟ ASp Glu Glu 110 Gly Ala cys Gin pro 115 cys Pro Ile Asn 3S Thr Mis Ser cys Vai ASp Leu Asp Asp Lys Gly cys Pro Ala GlU 125 130 135 Gin Arg Ala Ser Pro Leu Thr 140 167 ΕΡ1850874Β1

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 65527705 P [0001] US 4968603 A [0005] [0014] wo 9422478 A [0007] [0014] US 5824311 A [0007] [0014] US 5677171 A [0008] [0014] [0131] [0218] US 5821337 A [0009] [0014] [0074] [0093] wo 9400136 A [0010] US 5783186 A [0010] [0014] US 5183884 A [0011] [0039] US 5480968 A [0011] [0039] EP 599274 A [0011] [0040] US 5641869 A [0012] [0042] US 5720937 A [0014] US 5720954 A [0014] US 5725856 A [0014] US 5770195 A [0014] US 5772997 A [0014] [0178] US 6165464 A [0014] US 6387371 B [0014] US 6399063 B [0014] US 20020192211 AI [0014] US 6015567 A [0014] US 6333169 B [0014] US 6054297 A [0014] [0181] 168 ΕΡ1850874Β1 US 6407213 B [0014] US 6719971 B [0014] US 6800738 B [0014] US 20040236078 AI [0014] US 5648237 A [0014] US 6267958 B [0014] US 6685940 B [0014] US 6821515 B [0014] wo 9817797 A [0014] [0219] US 6127526 A [0014] US 6333398 B [0014] US 6797814 B [0014] US 6339142 B [0014] US 6417335 B [0014] US 6489447 B [0014] wo 9931140 A [0014] [0015] 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Lisboa, 26 de Novembro de 2013 187

Claims

ΕΡ1850874Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Pertuzumab para utilização num método para estender o tempo até a progressão da doença (TAP) ou sobrevivência de um paciente com cancro, o método compreende administrar pertuzumab ao paciente numa quantidade que estende o TAP ou sobrevivência do paciente, em que o cancro do paciente é cancro do ovário.
2. Pertuzumab para utilização de acordo com a reivindicação 1 em que o cancro é cancro do ovário avançado, refractário ou recorrente.
3. Pertuzumab para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 em que o pertuzumab é administrado no método como um único agente anti-tumoral.
4. Pertuzumab para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, o método compreende administrar um segundo agente terapêutico ao paciente.
5. Pertuzumab para utilização de acordo com a reivindicação 4 em que o segundo agente terapêutico é seleccionado a partir do grupo que consiste em agente quimioterápico, anticorpo HER, anticorpo direccionado contra um antigénio associado a tumor, composto anti-hormonal, cardioprotector, citocina, fármaco dirigido a EGFR, agente antiangiogénico, inibidor de tirosina quinase, inibidor de COX, fármaco anti-inflamatório não esteroidal, inibidor de farnesil transferase, anticorpo que se liga a proteina oncofetal CA 125, vacina de HER2, terapêutica dirigida a HER, inibidor de Raf ou ras, doxorubicina lipossomal, topotecan, taxano, inibidor duplo de tirosina quinase, TLK286, EMD- 7200, um medicamento que trata náusea, um medicamento que previne ou trata erupção cutânea ou terapêutica contra a acne padrão, 1 ΕΡ1850874Β1 um medicamento que trata ou previne diarreia, um medicamento que reduz a temperatura corporal, e um factor de crescimento hematopoiético.
6. Pertuzumab para utilização de acordo com a reivindicação 5 em que o segundo agente terapêutico é um agente quimioterápico.
7. Pertuzumab para utilização de acordo com a reivindicação 6 em que o agente quimioterápico é um agente quimioterápico antimetabólito.
8. Pertuzumab para utilização de acordo com a reivindicação 7 em que o agente quimioterápico antimetabólito é gencitabina.
9. Pertuzumab para utilização de acordo com a reivindicação 4 em que o segundo agente terapêutico é trastuzumab, erlotinib, ou bevacizumab.
10. Pertuzumab para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o TAP é estendido.
11. Pertuzumab para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a sobrevivência é estendida.
12. Pertuzumab para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que no método a administração de pertuzumab estende o TAP ou sobrevivência pelo menos 20% mais que o TAP ou sobrevivência alcançada por meio da administração de um agente anti-tumoral aprovado ao paciente com cancro.
13. Pertuzumab para utilização num método para estender o 2 ΕΡ1850874Β1 tempo até a progressão da doença (TAP) ou sobrevivência de um paciente com cancro do ovário, o método compreende administrar pertuzumab ao paciente numa quantidade que estende o TAP ou sobrevivência do paciente, em que o cancro do paciente apresenta activação de HER2.
14. Pertuzumab para utilização de acordo com a reivindicação 13 em que o paciente tem cancro avançado, refractário ou recorrente.
15. Pertuzumab para utilização de acordo com a reivindicação 13 ou reivindicação 14 em que no método a administração de pertuzumab ao paciente estende o TAP ou sobrevivência pelo menos 20% mais que o TAP ou sobrevivência alcançada por meio da administração de topotecan ou doxorubicina lipossomal ao paciente.
16. Pertuzumab para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, o método compreende ainda administrar um agente quimioterápico ao paciente.
17. Pertuzumab para utilização de acordo com a reivindicação 16 em que o agente quimioterápico é um agente quimioterápico antimetabólito.
18. Pertuzumab para utilização de acordo com a reivindicação 17 em que o agente quimioterápico antimetabólito é gencitabina. Lisboa, 26 de Novembro de 2013 3