CN108778347A

CN108778347A - 放射性药物配合物

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Publication number: CN108778347A
Application number: CN201780017966.8A
Authority: CN
Inventors: L.林登; A.库斯伯特森
Original assignee: Bayer AG; Bayer Pharma AG
Current assignee: Bayer AG; Bayer Pharma AG
Priority date: 2016-03-24
Filing date: 2017-03-20
Publication date: 2018-11-09
Also published as: TWI757273B; PE20190168A1; IL261329A; JP2022173214A; CO2018010024A2; IL261329B; US20220143229A1; BR112018069485A2; WO2017162555A1; SG10202009424TA; US11260136B2; AU2017239018A1; CL2018002695A1; JP2019513699A; EP3432936A1; AR107957A1; US20190091354A1; TW201736389A; JOP20170072B1; UA125749C2

Abstract

本发明提供了用于形成组织靶向钍配合物的方法，所述方法包括：a)形成八齿螯合剂，其包含四个在N‑位被甲基取代的羟基吡啶酮(HOPO)部分、和以羧酸基团终止的偶联部分；b)将所述八齿螯合剂与至少一种靶向HER2的组织靶向部分偶联；和c)使所述组织靶向螯合剂与含有至少一种发射α粒子的钍同位素的离子的水溶液接触。还提供了治疗肿瘤或增生性疾病的方法，包括施用这种组织靶向钍配合物，以及配合物和相应的药物制剂。

Description

放射性药物配合物

发明领域

本发明涉及用于形成钍-227与某些八齿配体的配合物的方法，所述八齿配体与靶向HER2抗原的组织靶向部分缀合。本发明还涉及配合物，以及涉及疾病、特别是肿瘤疾病的治疗，所述治疗牵涉施用该配合物。

发明背景

特异性细胞杀伤对于哺乳动物对象中各种疾病的成功治疗可为必不可少的。其典型的例子是恶性疾病如肉瘤和癌的治疗。然而，某些细胞类型的选择性消除也可以在其它疾病、尤其是增生性和肿瘤疾病的治疗中起关键作用。

最常见的选择性治疗方法目前是手术、化疗和外照射。然而，靶向放射性核素治疗是有前途的和发展中的领域，具有特异性地向与疾病相关的细胞类型递送高度细胞毒性的辐射的潜力。目前授权用于人的最常见形式的放射性药物应用发射β粒子和/或发射γ粒子的放射性核素。然而，因为它们对于更特异性的细胞杀伤的潜力，对于发射α粒子的放射性核素在治疗中的应用存在一些兴趣。

典型的α发射器在生理环境中的辐射范围通常小于100微米，相当于仅几个细胞直径。这使得这些来源非常适合于治疗肿瘤、包括微转移，因为它们具有到达肿瘤内相邻细胞的范围，但如果它们被很好地靶向，那么很少的辐射能量会超过靶细胞。因此，不是每个细胞都需要被靶向，而是可最小化对周围健康组织的损害(参见Feinendegen等人, RadiatRes 148:195-201 (1997))。与之相比，β粒子在水中具有1mm或更大的范围(参见Wilbur,Antibody Immunocon Radiopharm 4: 85-96 (1991))。

与β粒子、γ射线和X射线携带的那种相比，α粒子辐射的能量高，通常为5-8 MeV，或是β粒子的能量的5至10倍和γ射线的能量的20或更多倍。因此，与γ和β辐射相比，在非常短的距离上这种大量能量的沉积给予α辐射异常高的线性能量转移(LET)、高相对生物效力(RBE)和低氧增强比(OER)。(参见Hall, "Radiobiology for the radiologist", 第5版, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia PA, USA, 2000)。这解释了发射α粒子的放射性核素的异常细胞毒性，并且对这种同位素的生物靶向以及对发射α粒子的放射性核素分配的控制和研究的水平也提出了严格的要求，这是为了避免不可接受的副作用所必需的。

到目前为止，关于在放射免疫疗法中的应用，主要注意力聚焦于²¹¹At、²¹³Bi和²²⁵Ac，并且已经在临床免疫疗法试验中探索了这三种核素。

已经提出的几种放射性核素是短寿命的，即具有小于12小时的半衰期。如此短的半衰期使得难于以商业方式基于这些放射性核素生产和分配放射性药物。短寿命核素的施用也增加在达到靶位点之前会在体内发射的辐射剂量的比例。

来自α发射的反冲能量在许多情况下会引起子体核素（daughter nuclides）从母体衰变的位置释放。这种反冲能量足以将许多子核（daughter nuclei）从可保持母体的化学环境中摆脱，例如，在母体通过配体如螯合剂配合的情况下。即使在子体与相同配体化学相容、即可通过相同配体配合的情况下，这也会发生。同样地，在子体核素是气体、特别是诸如氡的惰性气体，或者与配体化学不相容的情况下，这种释放效果将甚至更大。当子体核素具有超过几秒钟的半衰期时，它们可以扩散到血液系统中，不受保持母体的配合剂的限制。然后，这些游离放射性子体可以引起不希望的全身毒性。

几年前提出在保持控制²²³Ra子体同位素的条件下应用钍-227(T_1/2=18.7天)(参见WO 01/60417和WO 02/05859)。这是在应用载体系统的情况下，其允许子体核素被封闭环境保留。在一种情况下，放射性核素置于脂质体内，并且脂质体的实质尺寸(与反冲距离相比)有助于将子体核素保留在脂质体内。在第二种情况下，应用放射性核素的寻骨配合物（bone-seeking complexes），其掺入骨基质中并因此限制子体核素的释放。这些是潜在的非常有利的方法，但是在某些情况下不希望施用脂质体，并且存在许多软组织疾病，其中放射性核素不能被矿化基质包围以保留子体同位素。

更近来，已经确定，与从类似核（comparable nuclei）上的先前测试会预测到的相比，在²²⁷Th衰变时释放的²²³Ra子核的毒性在哺乳动物体内可以更大程度地被耐受。在没有保留上述钍-227的镭子体的具体手段的情况下，关于镭毒性的公开可得信息清楚地表明，不可能应用钍-227作为治疗剂，因为从钍-227衰变实现治疗效果所需的剂量将导致来自镭子体衰变的高毒性且可能致命的辐射剂量，即没有治疗窗。

WO 04/091668描述了预料不到的发现，即确实存在治疗处理窗，其中可以将治疗有效量的靶向钍-227放射性核素施用于对象(通常是哺乳动物)，而不产生足以引起不可接受的骨髓毒性的镭-223的量。因此，这可以用于治疗和预防骨和软组织位点处的所有类型的疾病。

鉴于上述发展，现在，在内部放射性核素治疗（endoradionuclide therapy）中应用发射α粒子的钍-227核、而没有由产生的²²³Ra引起的致死性骨髓毒性是可能的。尽管如此，治疗窗仍然相对窄，并且在所有情况下都希望向对象施用不多于绝对必要的发射α粒子的放射性同位素。因此，如果发射α粒子的钍-227核可以具有高度可靠性地被配合和靶向，则会大大增强这种新治疗窗的有用利用。

由于放射性核素不断衰变，在分离和施用给对象之间处理材料所花费的时间非常重要。如果发射α粒子的钍核可以快速和方便制备的形式配合、靶向和/或施用，优选需要很少的步骤、短的温育期和/或没有不可逆地影响靶向实体的性质的温度，这也将具有相当大的价值。此外，可以在施用前不需要除去的溶剂中进行的方法(基本上在水溶液中)具有避免溶剂蒸发或透析步骤的相当大的优点。

如果可以开发钍标记的药物产品制剂，其显示出显著增强的稳定性，这也被认为具有显著价值。这对于确保遵守稳健的产品质量标准、而同时能够允许物流途径以递送患者剂量是至关重要的。因此，优选在1-4天的时期期间具有最小辐射分解的制剂。

先前已经显示含有羟基吡啶酮基团的八齿螯合剂适于配位α发射器钍-277，用于随后附着于靶向部分(WO2011098611)。描述了八齿螯合剂，其含有通过连接体（linker）基团连接到基于胺的支架的四个3,2-羟基吡啶酮基团，具有用于与靶向分子缀合的单独的反应基团。先前发明的优选结构含有3,2-羟基吡啶酮基团，并应用异硫氰酸酯部分作为对于抗体组分的优选偶联化学，如化合物ALG-DD-NCS中所示。异硫氰酸酯广泛用于通过胺基将标记物（label）附着于蛋白。异硫氰酸酯基团与蛋白中的氨基末端和伯胺反应，并已用于标记包括抗体的许多蛋白。尽管在这些缀合物中形成的硫脲键相当稳定，但据报道，由荧光异硫氰酸酯制备的抗体缀合物随时间衰退。[Banks PR, Paquette DM., Bioconjug Chem(1995) 6:447-458]。由异硫氰酸荧光素与胺反应形成的硫脲在碱性条件下也易于转化为胍[Dubey I, Pratviel G, Meunier BJournal: Bioconjug Chem (1998) 9:627-632]。由于与长生物半衰期的单克隆抗体偶联的钍-227的长衰变半衰期(18.7天)，需要应用更稳定的连接部分以产生在体内和对于存储都更化学稳定的缀合物。

关于羟基吡啶酮配体缀合的最相关的先前工作公开在WO2013/167754中，并公开了具有包含羟烷基官能度的水溶性部分的配体。由于该螯合物类型的羟基的反应性，作为活化的酯活化是不可能的，因为随后发生多个竞争反应，通过酯化反应导致复杂的产物混合物。因此，WO2013/167754的配体必须通过替代的化学物如异硫氰酸酯与组织靶向蛋白偶联，给出如上所述的较不稳定的硫脲缀合物。此外，WO2013167755和WO2013167756公开了分别应用于CD33和CD22靶向抗体的羟烷基/异硫氰酸酯缀合物。

HER受体酪氨酸激酶家族是细胞生长、分化和存活的重要介质。该受体家族包括四个不同的成员，包括表皮生长因子受体(EGFR，ErbB1或HER1)、HER2(ErbB2或p185^neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。

在癌中观察到HER2的过量表达(通常但由于基因扩增而不均匀)，所述癌包括胃、子宫内膜、唾液腺、肺(Jung)、肾、结肠、甲状腺、胰腺和膀胱的癌。

HER2是单克隆抗体曲妥珠单抗的靶。曲妥珠单抗于1998年9月25日获得美国食品和药物管理局的上市批准，用于治疗其肿瘤过量表达HER2蛋白的具有转移性乳腺癌的患者。用于制备曲妥珠单抗的方法公开在WO92/22653中。

本发明人现在已经确定，在温和条件下和借助对于配合物的储存和施用保持更稳定的连接部分，通过将特异性螯合剂与作为靶向部分的针对HER2的单克隆抗体偶联、然后加入发射α粒子的钍离子而形成组织靶向配合物，可以快速产生配合物。

发明概述

在第一方面，本发明因此提供了用于形成组织靶向钍配合物的方法，所述方法包括：

a)形成式(I)或(II)的八齿螯合剂：

其中R_C是以羧酸部分终止的连接体部分，例如

[-CH₂-Ph-N(H)-C(=O)-CH₂-CH₂-C(=O)OH],

[-CH₂-CH₂-N(H)-C(=O)-(CH₂-CH₂-O)_1-3-CH₂-CH₂-C(=O)OH]或

[-(CH₂)_1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH₂)_1-5-C(=O)OH]，其中Ph是亚苯基，优选对亚苯基；

b) 将所述八齿螯合剂偶联至组织靶向部分，所述组织靶向部分包含与序列1具有序列同一性的肽链：

轻链

和与下列序列2至6中的任一个具有序列相似性或同一性的肽链：

重链

由此产生组织靶向螯合剂；和

c)使所述组织靶向螯合剂与包含发射α粒子的钍同位素²²⁷Th的4⁺离子的水溶液接触。

在这种配合物中(并且优选在本发明的所有方面)，钍离子将通常通过八齿含羟基吡啶酮配体配合，该配体进而将经由酰胺键附着于组织靶向部分。

通常，该方法将是用于合成基于3,2-羟基吡啶酮的八齿螯合物的方法，所述螯合物包含反应性羧酸酯功能，其可以经由原位活化或通过合成和分离活性酯本身而以活性酯的形式(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯))活化。

得到的NHS酯可以用于简单的缀合步骤，以产生宽范围的螯合物修饰的蛋白形式。此外，高度稳定的抗体缀合物易于用钍-227标记。这可在环境温度或接近环境温度，通常是以高放射化学产量和纯度。

本发明的方法将优选在水溶液中进行，并且在一个实施方式中，可在不存在或基本不存在(按体积计小于1%)任何有机溶剂的情况下进行。

本发明的组织靶向配合物可配制成适于施用给人或非人动物对象的药物。

在第二方面，本发明因此提供了用于产生药物制剂的方法，包括形成如本文所述的组织靶向配合物，然后加入至少一种药物载体和/或赋形剂。合适的载体和赋形剂包括缓冲剂、螯合剂、稳定剂以及本领域已知的和本文任何方面中描述的其它合适的组分。

在另一方面，本发明另外提供了组织靶向钍配合物。这种配合物将具有贯穿本文所述的特征，特别是本文所述的优选特征。配合物可通过本文所述的方法中的任一种形成、或是通过本文所述的方法中的任一种可形成的。因此，这些方法可产生至少一种如本文任何方面或实施方式中所述的组织靶向钍配合物。

在又一方面，本发明提供了包含本文所述的配合物中的任一种的药物制剂。制剂可通过本文所述的方法中的任一种形成、或是通过本文所述的方法中的任一种可形成的，并且可含有至少一种缓冲剂、稳定剂和/或赋形剂。缓冲剂和稳定剂的选择可使得它们一起有助于保护组织靶向配合物免于辐射分解。在一个实施方式中，即使在制剂制造后的数天之后，制剂中配合物的辐射分解也是最小的。这是一个重要的优势，因为它解决了与产品质量和药物供应物流相关的潜在问题，所述问题是该技术的实现和实际应用的关键。

发明的详细描述

在本发明的上下文中，“组织靶向”在本文中用于指示所讨论的物质(特别是当以如本文所述的组织靶向配合物的形式时)用于优先将自身局限(并且特别是用于将任何缀合的钍配合物局限)在希望其存在(例如，以递送放射性衰变)的至少一个组织位点。因此，与不具有靶向部分的等价配合物的浓度相比，组织靶向基团或部分用于在施用于对象后、对该对象体内的至少一个希望位点提供更大的局限化。

本案中的靶向部分对HER2具有特异性。

如本文所述的本发明的各个方面涉及疾病的治疗，特别是用于选择性靶向患病组织，以及涉及可用于这些方法的配合物、缀合物、药物、制剂、试剂盒等。在所有方面，患病组织可驻留在体内的单个位点(例如，在局限实体瘤的情况下)，或可驻留在多个位点(例如，在关节炎中几个关节受影响的情况下、或在散布或转移性癌症疾病的情况下)。

待靶向的患病组织可在软组织位点、在钙化组织位点或多个位点，所述多个位点可全部在软组织中、全部在钙化组织中或者可包括至少一个软组织位点和/或至少一个钙化组织位点。在一个实施方式中，靶向至少一个软组织位点。靶向的位点和疾病起源位点可为相同的，但可选地可为不同的(例如，在转移位点被特异性靶向的情况下)。在牵涉多于一个位点的情况下，这可包括起源位点或者可为多个继发位点。

术语“软组织”在本文中用于指示不具有“硬”矿化基质的组织。特别地，如本文所用的软组织可为不是骨骼组织的任何组织。相应地，如本文所用的“软组织疾病”指示如在本文所用的“软组织”中发生的疾病。本发明特别适于治疗癌症和“软组织疾病”，因此包括在任何“软”(即非矿化)组织中发生的癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和混合型癌症，以及这种组织的其它非癌性疾病。癌性“软组织疾病”包括在软组织中发生的实体瘤以及转移性和微转移性肿瘤。实际上，软组织疾病可包括同一患者中的软组织的原发性实体瘤和软组织的至少一个转移性肿瘤。可选地，“软组织疾病”可仅由原发性肿瘤组成，或仅由原发性肿瘤为骨骼疾病的转移组成。

适于应用本发明的人表皮生长因子受体-2(HER2)靶向剂治疗的肿瘤的实例包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和子宫癌。

对于本发明成功的关键贡献是，抗体缀合物对于可接受的储存时间段是稳定的。因此，非放射性抗体缀合物和最终的钍标记的药物产品二者的稳定性必须满足制造和分配放射性药物产品所要求的严格标准。令人惊讶的发现是，本文所述的包含组织靶向配合物的制剂在储存中证明优异的稳定性。这甚至在通常用于加速稳定性研究的升高的温度下适用。

在可应用于本发明所有相容方面的一个实施方式中，组织靶向配合物可溶解在合适的缓冲液中。特别地，已发现应用柠檬酸盐缓冲液提供令人惊讶地稳定的制剂。这优选范围为1-100mM(pH4-7)、特别是范围为10-50mM的柠檬酸盐缓冲液，但最优选20-40mM柠檬酸盐缓冲液。

在可应用于本发明所有相容方面的另一实施方式中，组织靶向配合物可溶解在含有对氨基丁酸(PABA)的合适缓冲液中。优选的组合是柠檬酸盐缓冲液(优选在本文所述的浓度下)与PABA组合。用于本发明任一方面的PABA的优选浓度(包括与其它试剂组合)为约0.005至5mg/ml，优选0.01至1mg/ml，且更优选0.01至1mg/ml。最优选0.1至0.5mg/ml的浓度。

在可应用于本发明所有相容方面的另一实施方式中，组织靶向配合物可溶解在含有乙二胺四乙酸(EDTA)的合适缓冲液中。优选的组合是EDTA和柠檬酸盐缓冲液的应用。特别优选的组合是在PABA存在下EDTA和柠檬酸盐缓冲液的应用。在这种组合中，优选适当的柠檬酸盐、PABA和EDTA将以本文所示浓度范围和优选浓度范围存在。用于本发明任一方面的EDTA的优选浓度(包括与其它试剂组合)为约0.02至200mM，优选0.2至20mM，且最优选0.05至8mM。

在可应用于本发明所有相容方面的另一实施方式中，组织靶向配合物可溶解在含有至少一种聚山梨醇酯(PEG接枝的脱水山梨糖醇脂肪酸酯)的合适缓冲液中。优选的聚山梨醇酯包括聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)、聚山梨醇酯60(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、聚山梨醇酯40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)及其混合物。聚山梨醇酯80(P80)是最优选的聚山梨醇酯。用于本发明任一方面的聚山梨醇酯(尤其是如本文所示的优选的聚山梨醇酯)的优选浓度(包括与其它试剂组合)为约0.001至10%w/v，优选0.01至1%w/v，且最优选0.02至0.5 w/v。

尽管先前已将PABA描述为放射稳定剂(参见US4880615A)，但在储存中的非放射性缀合物上观察到在本发明中PABA的积极作用。在不存在辐射分解的情况下的这种稳定作用构成了特别令人惊讶的优点，因为组织靶向螯合剂的合成将通常在与钍离子接触之前显著地发生。因此，组织靶向螯合剂可在与钍离子接触之前1小时至3年产生，并且将优选在该时期的至少一部分期间与PABA接触储存。也就是说，本发明的步骤a)和b)可在步骤c)之前1小时至3年并且在步骤b)和c)之间发生，组织靶向螯合剂可与PABA接触储存，特别是在缓冲液中，例如柠檬酸盐缓冲液和任选具有EDTA和/或聚山梨醇酯。所有材料优选为本文所示的类型和浓度。因此，PABA是本发明制剂的高度优选的组分，并且对于组织靶向螯合剂和/或对于组织靶向钍配合物可以导致长期稳定性。

就本发明制剂中的组织靶向钍配合物的稳定性而言，如本文所述的柠檬酸盐缓冲液的应用提供了进一步令人惊讶的优点。本发明人进行了关于缓冲溶液对过氧化氢产生的影响的辐射研究，其具有意料不到的结果。已知过氧化氢由于水辐射分解而形成，并有助于溶液中蛋白缀合物的化学修饰。因此，过氧化氢产生对产物的纯度和稳定性具有不希望的作用。图2显示了令人惊讶的观察结果，即与所有其它测试的缓冲液相比，在柠檬酸盐缓冲液中辐射以Co-60(10kGy)的本发明的抗体HOPO缀合物溶液中，测量到较低水平的过氧化氢。因此，本发明的制剂将优选包含如本文所述的柠檬酸盐缓冲液。

本发明人另外确定了关于本发明制剂中某些组分的联合作用的进一步令人惊讶的发现。这再次涉及放射性标记的缀合物的稳定性。已经发现柠檬酸盐是最有效的缓冲液，令人惊讶地发现通过添加PABA更进一步改善了这种效果。

本发明的方法、配合物和制剂的关键组分是八齿螯合剂部分。关于钍离子与羟基吡啶酮配体配合的最相关的先前工作公开为WO2011/098611，并公开了与八齿含HOPO配体配合的钍离子的相对容易生成。

先前已知的用于钍的螯合剂还包括多氨基多酸螯合剂，其包含直链、环状或支链的多氮杂烷骨架，具有附着于骨架氮的酸性(例如羧基烷基)基团。这种螯合剂的实例包括DOTA衍生物例如对异硫氰酸根合苄基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(p-SCN-Bz-DOTA)，和DTPA衍生物例如对异硫氰酸根合苄基-二亚乙基三胺五乙酸(p-SCN-Bz-DTPA)，前者是环状螯合剂，后者是直链螯合剂。

先前已经举例说明了1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸的衍生物，但是标准方法不能容易地用于用DOTA衍生物螯合钍。加热DOTA衍生物与金属有效地提供螯合物，但通常以低产量。在该过程中存在至少一部分配体不可逆地变性的趋势。此外，由于其对不可逆变性的相对高的敏感性，通常需要避免靶向部分的附着，直到所有加热步骤完成。这加入了额外的化学步骤(具有所有必要的后处理(work-up)和分离)，其必须在发射α粒子的钍同位素的衰变寿命期间进行。显然，优选不以这种方式处理发射α粒子的材料或者不以比必要更大的程度产生相应的浪费。此外，制备缀合物花费的所有时间浪费一定比例的钍，其在该预备期间将衰变。

在所有方面中，本发明的一个关键方面是式(I)或(II)的八齿螯合剂的应用：

其中R_C是以羧酸部分终止的连接体部分，例如

[-CH₂-Ph-N(H)-C(=O)-CH₂-CH₂-C(=O)OH],

[-CH₂-CH₂-N(H)-C(=O)-(CH₂-CH₂-O)_1-3-CH₂-CH₂-C(=O)OH]或

[-(CH₂)_1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH₂)_1-5-C(=O)OH]，其中Ph是亚苯基，优选对亚苯基。

在某些先前的公开内容例如WO2013/167756、WO2013/167755和WO2013/167754中，附着于3,2-HOPO部分的N-原子的甲基主要是增溶基团，例如羟基或羟烷基(例如CH₂OH、-CH₂-CH₂OH、-CH₂-CH₂-CH₂OH等)。这在较高的溶解度方面具有某些优点，但是这种螯合剂难以应用酰胺键与靶向部分连接。

螯合部分可通过本领域已知的方法形成，包括US 5,624,901(例如实施例1和2)和WO2008/063721中描述的方法(均通过引用并入本文)。

R_C代表偶联部分。合适的部分包括烃基，例如烷基或烯基，其以羧酸基团终止。本发明人已经确定，例如通过本发明的方法，应用羧酸连接部分形成酰胺，在螯合剂和组织靶向部分之间提供更稳定的缀合。

在本发明最优选的实施方式中，将八齿配体与靶向部分连接的偶联部分(R_C)选择为：

[-CH₂-Ph-N(H)-C(=O)-CH₂-CH₂-C(=O)OH],

[-CH₂-CH₂-N(H)-C(=O)-(CH₂-CH₂-O)_1-3-CH₂-CH₂-C(=O)OH]或

[-(CH₂)_1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH₂)_1-5-C(=O)OH]，

其中Ph是亚苯基，优选对亚苯基。

在一个优选的实施方式中，R_C是[-(CH₂)_1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH₂)_1-5-C(=O)OH]。在一个更优选的实施方式中，R_C是[-(CH₂)-对亚苯基-N(H)-C(=O)-(CH₂)₂-C(=O)OH]。

高度优选的八齿螯合剂包括下文式(III)和(IV)的那些：

化合物(III)的合成在下文中描述，并遵循下文所述的合成路线。

本发明方法的步骤a)可通过任何合适的合成途径进行。下文在以下实施例中给出了合成方法的一些具体实例。这些方法提供了具体的实例，但是其中所说明的合成方法也将可以由本领域技术人员在一般上下文中应用。因此，实施例中说明的方法也意图作为一般公开内容，其在上下文允许的情况下适于本发明的所有方面和实施方式。

优选本发明所有方面中的发射α粒子的钍和八齿配体的配合物在不加热到60℃以上的情况下形成或可形成(例如，不加热到50℃以上)，优选不加热到38℃以上和最优选不加热到25℃以上(例如在20至38℃的范围内)。典型的范围可为例如15至50℃或20至40℃。本发明方法中的配合反应(部分c)可进行任何合理的时期，但这将优选为1至120分钟，优选1至60分钟，且更优选5至30分钟。

另外优选在加入发射α粒子的钍同位素²²⁷Th⁴⁺离子之前制备靶向部分和八齿配体的缀合物。因此，本发明的产物优选通过下列形成或可形成：通过八齿配体和组织靶向部分的缀合物(组织靶向螯合剂)配合发射α粒子的钍同位素(²²⁷Th⁴⁺离子)。

各种类型的靶向化合物可经由八齿螯合剂(包含如本文所述的偶联部分)与钍(例如钍-227)连接。

通常地，如本文所用，组织靶向部分将是“肽”或“蛋白”，它是主要由氨基酸组分之间的酰胺骨架形成的结构，具有或不具有二级和三级结构特征。

根据本发明，可通过靶向配合剂配合²²⁷Th，所述靶向配合剂通过酰胺键连接或可连接于如本文所述的组织靶向部分。

通常，靶向部分将具有100g/mol至数百万g/mol(特别是100g/mol至1百万g/mol)的分子量，并且将优选直接地对疾病相关受体具有亲和力，和/或将包含合适的预施用的结合剂(例如生物素或抗生物素蛋白)，其与在施用²²⁷Th之前已经靶向疾病的分子结合。

选择本发明的特异性结合剂(组织靶向部分)以靶向HER2抗原。

本发明的组织靶向部分包含与序列1具有序列同一性的肽链：

轻链

重链

在一个优选的实施方式中，组织靶向部分包含与序列1具有序列同一性的肽链：

轻链

和与序列2具有序列相似性或同一性的肽链：

重链

。

实质序列同一性/相似性可被认为与完整序列具有至少80%的序列相似性/同一性、和/或与特定结合区域(上述序列中以粗体显示的那些区域和任选地下划线的那些部分)具有至少90%的序列相似性/同一性。对于粗体区域并且优选地也对于完整序列，优选的序列相似性或更优选地同一性可为至少92%、95%、97%、98%或99%。序列相似性和/或同一性可应用来自威斯康星大学的Genetics Computer Group Version 10软件包的“BestFit”程序来确定。该程序应用Smith和Waterman的局部had算法(local had algorithm)，默认值为：空位产生罚分=8，空位延伸罚分=2，平均匹配=2.912，平均错配2.003。

在一个优选的实施方式中，组织靶向部分包含与序列1具有序列同一性的肽链、和与序列2至6中任一个具有98%或更高的序列相似性或具有同一性的肽链。

在一个更优选的实施方式中，组织靶向部分包含与序列1具有序列同一性的肽链、和与序列2至6中任一个具有99%或更高的序列相似性或具有同一性的肽链。

在另一个优选的实施方式中，组织靶向部分包含与序列1具有序列同一性的肽链、和与序列2具有98%或更高的序列相似性或具有同一性的肽链。

在一个更优选的实施方式中，组织靶向部分包含与序列1具有序列同一性的肽链、和与序列2具有99%或更高的序列相似性或具有同一性的肽链。

本发明的组织靶向部分代表曲妥珠单抗的变体：

SEQ ID NO. 1和2：曲妥珠单抗，没有C-末端赖氨酸

SEQ ID NO. 1和3：曲妥珠单抗，没有C-末端赖氨酸和具有重链突变E359D、M361L

SEQ ID NO. 1和4：曲妥珠单抗，没有C末端赖氨酸和具有重链突变N300A、E359D、M361L

SEQ ID NO. 1和5：曲妥珠单抗，没有C-末端赖氨酸和具有重链突变N300Q、E359D、M361L

SEQ ID NO. 1和6：曲妥珠单抗，没有C末端赖氨酸和具有重链突变Q298N、N300Q、E359D、M361L。

本发明的针对HER2的抗体可以通过在宿主细胞中重组表达编码轻链和重链或其部分的核酸序列来制备。为了重组表达抗体、抗原结合部分或其变体，可以用一种或多种携带编码轻链和/或重链或其部分的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，使得轻链和重链在宿主细胞中表达。标准的重组DNA方法学用于制备和/或获得编码重链和轻链的核酸、将这些核酸掺入重组表达载体中并将载体导入宿主细胞，例如描述于Sambrook, Fritschand Maniatis (eds.), Molecular Cloning；A Laboratory Manual, 第2版, ColdSpring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M.等人(eds.) Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)和Boss等人的美国专利号4,816,397的那些。

另外，编码重链和/或轻链的可变区的核酸序列可以转化为例如编码全长抗体链、Fab片段的核酸序列或scFv。编码VL或VH的DNA片段可以与编码例如抗体恒定区或柔性连接体的另一DNA片段可操作地连接(使得两个DNA片段编码的氨基酸序列符合读框)。人重链和轻链恒定区的序列是本领域已知的(参见例如Kabat, E. A., el al. (1991) Sequencesof Proteins of Immunological Interest, 第5版, U.S. Department of Health andHuman Services, NIH Publication No. 91-3242)，并且包含这些区域的DNA片段可以通过标准的PCR扩增获得。

为了建立编码scFv的多核苷酸序列，编码VH和VL的核酸可以与编码柔性连接体的另一个片段可操作地连接，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白，具有通过柔性连接体连接的VL和VH区域(参见例如Bird等人 (1988) Science 242:423-426；Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty等人, Nature (1990)348:552-554)。

为了表达抗体、其抗原结合片段或其变体，可以应用标准的重组DNA表达方法(参见，例如，Goeddel；Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego, Calif. (1990))。例如，可以将编码所需多肽的DNA插入表达载体中，然后将其转染到合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞是原核细胞和真核细胞。原核宿主细胞的实例是例如细菌，真核宿主细胞的实例是酵母、昆虫和昆虫细胞、植物和植物细胞、转基因动物或哺乳动物细胞。在一些实施方式中，将编码重链和轻链的DNA插入分开的载体中。在其它实施方式中，将编码重链和轻链的DNA插入相同的载体中。应当理解，表达载体的设计、包括调节序列的选择受下列因素影响，所述因素诸如宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平以及表达是组成型还是诱导型的。

通过插入与功能性启动子处于可操作读取阶段的、编码所需蛋白的DNA序列连同合适的翻译起始和终止信号，构建对于细菌应用的有用表达载体。载体将包含一种或多种表型选择标记和复制起点，以确保载体的维持，并且如果需要，提供宿主内的扩增。用于转化的合适的原核宿主包括但不限于大肠杆菌(E. coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，和假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的各种物种。

细菌载体可为例如基于噬菌体、质粒或噬菌粒的。这些载体可以含有选择标记和细菌复制起点，其来自市售质粒，所述质粒通常含有公知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的元件。在转化合适的宿主菌株并使宿主菌株生长至合适的细胞密度后，通过适当的手段(例如，温度变换或化学诱导)使选择的启动子去抑制/诱导，并将细胞培养另外的时期。通常通过离心收获细胞，通过物理或化学手段破碎细胞，并保留所得粗提取物用于进一步纯化。

在细菌系统中，取决于对于所表达的蛋白意图的应用，可有利地选择许多表达载体。例如，当要产生大量这样的蛋白时，例如，为了产生抗体或筛选肽文库，可能需要指导易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。

本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体包括天然纯化的产物、化学合成过程的产物、和通过重组技术从原核宿主产生的产物，所述原核宿主包括例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属中的各种物种，优选地，从大肠杆菌细胞产生的产物。

用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，例如源自下列的启动子和/或增强子：巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。抗体的表达可为组成型的或调节型的(例如，通过添加或除去小分子诱导物如结合Tet系统的四环素而可诱导)。关于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如Stinski的U.S.5,168,062，Bell等的U.S.4,510,245和Schaffner等人的U.S.4,968,615。重组表达载体还可以包括复制起点和选择标记(参见例如U.S.4,399,216、4,634,665和U.S.5,179,017)。合适的选择标记包括赋予药物抗性的基因，例如G418、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素、zeocin/博来霉素或甲氨蝶呤、或在已引入载体的宿主细胞上利用营养缺陷型的选择标记，例如谷氨酰胺合成酶(Bebbington等人, Biotechnology (N Y).1992 Feb;10(2):169-75)。例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因赋予对甲氨蝶呤的抗性，neo基因赋予对G418的抗性，来自土曲霉(Aspergillus terreus)的bsd基因赋予对杀稻瘟素的抗性，嘌呤霉素N-乙酰转移酶赋予对嘌呤霉素的抗性，Sh ble基因产物赋予对zeocin的抗性，并且对潮霉素的抗性由大肠杆菌潮霉素抗性基因(hyg或hph)赋予。选择标记如DHFR或谷氨酰胺合成酶也可用于与MTX和MSX结合的扩增技术。

表达载体向宿主细胞中的转染可以应用标准技术进行，例如电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、脂质转染、基于聚阳离子的转染例如基于聚乙烯亚胺(polyethlylenimine，PEI)的转染和DEAE-葡聚糖转染。

用于表达本文提供的抗体、其抗原结合片段或其变体的合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO细胞)，例如CHO-K1、CHO-S、CHO-K1SV[包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220和Urlaub等人, Cell. 1983 Jun;33(2):405-12，与DHFR选择标记一起应用，例如，如描述于R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621；和Fan等人,Biotechnol Bioeng. 2012 Apr;109(4):1007-15中举例说明的其它敲除细胞]、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞、HEK293细胞、HKB11细胞、BHK21细胞、CAP细胞、EB66细胞和SP2细胞。

在表达系统例如HEK293、HEK293T、HEK293-EBNA、HEK293E、HEK293-6E、HEK293-Freestyle、HKB11、Expi293F、293EBNALT75、CHO Freestyle、CHO-S、CHO-K1、CHO-K1SV、CHOEBNALT85、CHOS-XE、CHO-3E7或CAP-T细胞中，表达也可能是瞬时或半稳定的(例如Durocher等人, Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E9)。

在一些实施方式中，设计表达载体使得表达的蛋白分泌到宿主细胞生长的培养基中。可以应用标准蛋白纯化方法从培养基中回收抗体、其抗原结合片段或其变体。

可以通过公知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体，包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、蛋白A色谱、蛋白G色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱、混合模式色谱和凝集素色谱。高效液相色谱(“HPLC”)也可以用于纯化。参见，例如，Colligan,Current Protocols in Immunology, 或Current Protocols in Protein Science, JohnWiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)，例如，第1、4、6、8、9、10章，其各自完全通过引用并入本文。

本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体包括天然纯化的产物、化学合成过程的产物、和通过重组技术从真核宿主产生的产物，所述真核宿主包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。取决于重组生产过程中应用的宿主，本发明的抗体可以是糖基化的或可以是非糖基化的。许多标准实验室手册中描述了这些方法，例如Sambrook，同上，第17.37-17.42节；Ausubel，同上，第10、12、13、16、18和20章。

在优选的实施方式中，将抗体纯化：(1)至大于95%重量的抗体，例如通过Lowry方法、UV-Vis光谱法或通过SDS-毛细管凝胶电泳(例如在Caliper LabChip GXII，GX 90或Biorad Bioanalyzer装置上)确定的，和在进一步优选的实施方式中，大于99重量%，(2)至足以获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)在应用考马斯蓝或优选银染色的还原或非还原条件下通过SDS-PAGE至同质性。分离的天然存在的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，将通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。

关于发射α粒子的钍组分，一个关键的最近发现是，²²⁷Th可以既治疗有效又不产生不可耐受的骨髓毒性的量施用。如本文所用，术语“可接受地非骨髓毒性的”用于指示，最重要的是，由施用的钍-227放射性同位素的衰变产生的镭-223的量通常不足以对于对象直接致死。然而，技术人员将清楚的是，将是这种治疗的可接受的副作用的骨髓损伤的量(和致死反应的可能性)将随着所治疗疾病的类型、治疗方案的目标和对于对象的预后而显著变化。尽管本发明的优选对象是人，但是其它哺乳动物，特别是伴侣动物如狗，将受益于本发明的应用，并且可接受的骨髓损伤水平也可反映对象的物种。在恶性疾病的治疗中，可接受的骨髓损伤水平将通常大于非恶性疾病。一种公知的骨髓毒性水平的测量是嗜中性粒细胞计数，并且在本发明中，²²³Ra的可接受地非骨髓毒性的量将通常是受控的量，使得处于其最低的点(最低点(nadir))的嗜中性粒细胞分数不低于治疗前计数的10%。优选地，²²³Ra的可接受地非骨髓毒性的量将是使得嗜中性粒细胞分数在最低点为至少20%、并且更优选至少30%的量。最优选至少40%的最低点嗜中性粒细胞分数。

另外，当包括干细胞支持或类似的恢复方法时，含放射性²²⁷Th的化合物可以高剂量方案应用，在该方案的情况下，所产生的²²³Ra的骨髓毒性将通常是不可耐受的。在这种情况下，嗜中性粒细胞计数可在最低点降至低于10%，并且异常地将降至5%或如果必要低于5%，条件是采取适当的预防措施并给予随后的干细胞支持。这些技术在本领域中是公知的。

钍-227相对容易生产并且可以间接地从中子辐射的²²⁶Ra制备，其将包含²²⁷Th的母体核素，即²²⁷Ac(T_1/2=22年)。锕-227可以非常容易地与²²⁶Ra靶分离并用作用于²²⁷Th的发生器。如果需要，该过程可以按比例调节到工业规模，并且因此可以避免用大多数其它α-发射器所见的供应问题，所述其它α-发射器被认为是用于分子靶向放射疗法的候选者。

钍-227可以足以提供所需治疗效果、而不产生如此多的镭-223以引起不可耐受的骨髓抑制的量施用。期望将子同位素（daughter isotopes）保持在靶向区域中，以便可从它们的衰变中得到进一步的治疗效果。然而，为了具有有用的治疗效果而不引起不可接受的骨髓毒性，没有必要保持钍衰变产物的控制。

假设肿瘤细胞杀伤效应将主要来自钍-227而不是来自其子体，可以通过与其它α发射器比较来确定该同位素的可能治疗剂量。例如，对于砹-211，动物中的治疗剂量通常为2-10MBq/kg。通过针对半衰期和能量校正，用于钍-227的相应剂量将至少为每公斤体重36-200kBq。这将设定²²⁷Th量的下限，其可预期治疗效果而有用地施用。该计算假定砹和钍的类似的保留。然而，显然钍的18.7天半衰期将最可能导致在其衰变之前这一同位素的更多消除。因此，该计算的剂量通常应被认为是最小有效量。以完全保留的²²⁷Th表示的治疗剂量(即，未从身体消除的²²⁷Th)将通常为至少18或25kBq/kg，优选至少36kBq/kg，并且更优选至少75kBq/kg，例如100kBq/kg或更高。预期更大量的钍会具有更大的治疗效果，但如果会导致不可耐受的副作用则不能施用。同样地，如果钍以具有短生物半衰期的形式(即从仍然携带钍的身体消除之前的半衰期)施用，那么对治疗效果将需要更大量的放射性同位素，因为大部分钍将在其衰变之前消除。然而，产生的镭-223的量将相应减少。当同位素被完全保留时，待施用的钍-227的上述量可容易与具有较短生物半衰期的等效剂量相关。这种计算在本领域中是公知的并且在WO 04/091668中给出(例如在实施例1和2的文本中)。

如果放射性标记的化合物释放子体核素，重要的是知道任何放射性子体核素(一种或多种)的命运(如果适用)。对于²²⁷Th，主要子产物是²²³Ra，由于其寻骨性质，其正在临床评估中。镭-223非常快速地从血液清除并且在骨骼中浓缩或经由肠和肾脏途径排泄(参见Larsen, J Nucl Med 43(5, Supplement): 160P (2002))。因此，在体内从²²⁷Th释放的镭-223可在很大程度上不影响健康的软组织。在Müller在Int. J. Radiat. Biol. 20:233-243 (1971)中对²²⁷Th作为溶解的柠檬酸盐的分配的研究中，发现由软组织中的²²⁷Th产生的²²³Ra容易重新分配到骨或被排泄。因此，发射α粒子的镭的已知毒性，特别是对骨髓的毒性，是伴随钍剂量的一个问题。

在WO 04/091668中首次确定，实际上，可以在人对象中施用和耐受至少200kBq/kg的剂量的²²³Ra。这些数据在该出版物中呈现。因此，现在可以看出，非常出乎意料地，确实存在治疗窗，其中可以向哺乳动物对象施用治疗有效量的²²⁷Th(例如大于36kBq/kg)，而不期望这样的对象将遭受严重或甚至致命的骨髓毒性的不可接受的风险。尽管如此，进行这种治疗窗的最佳应用是极度重要的，并且因此必需的是，放射性钍快速且有效地配合，并以非常高的亲和力保持，以将最大可能比例的剂量递送到靶位点。

由²²⁷Th药物产生的²²³Ra的量将取决于放射性标记的化合物的生物半衰期。理想的情况将是应用配合物，其具有快速的肿瘤摄取、包括内化到肿瘤细胞中，强的肿瘤保留，和在正常组织中的短生物半衰期。然而，具有低于理想的生物半衰期的配合物可以是有用的，只要将²²³Ra的剂量保持在可耐受水平内。体内产生的镭-223的量将是施用的钍的量和钍配合物的生物保留时间的因子。在任何特定情况下产生的镭-223的量可以由普通技术人员容易地计算。²²⁷Th的最大可施用量将由体内产生的镭的量确定，并且必须小于将产生不可耐受的副作用水平、特别是骨髓毒性的量。该量将通常小于300kBq/kg，特别是小于200kBq/kg，并且更优选小于170kBq/kg(例如小于130kBq/kg)。最小有效剂量将通过下列确定：钍的细胞毒性，患病组织对产生的α辐射的敏感性，以及钍被靶向配合物(在这种情况下是配体和靶向部分的组合)有效组合、保持和递送的程度。

在本发明的方法中，钍配合物理想地以18至400kBq/kg体重、优选36至200kBq/kg(例如50至200kBq/kg)、更优选75至170kBq/kg、特别是100至130 kBq/kg的钍-227剂量施用。相应地，单次剂量直至可包括这些范围中的大约任一乘以合适的体重，例如30至150Kg，优选40至100Kg(例如每剂量540kBq至4000KBq的范围等)。此外，钍剂量、配合剂和施用途径将希望是如此的，使体内产生的镭-223剂量小于300kBq/kg，更优选小于200kBq/kg，再更优选小于150kBq/kg，尤其是小于100 kBq/kg。同样，这将提供通过将这些范围乘以所指示的体重中的任一而指示的对²²³Ra的暴露。上述剂量水平优选是²²⁷Th的完全保留剂量，但考虑到在其衰变之前一些²²⁷Th将从身体清除，可为施用剂量。

在²²⁷Th配合物的生物半衰期与物理半衰期相比短(例如小于7天，尤其是小于3天)的情况下，可能需要显著更大的施用剂量以提供等效的保留剂量。因此，例如，150kBq/kg的完全保留剂量等效于以711kBq/kg的剂量施用的具有5天半衰期的配合物。可应用本领域公知的方法，从配合物的生物清除率计算对于任何适当的保留剂量的等效施用剂量。

由于一个²²⁷Th核的衰变提供一个²²³Ra原子，²²⁷Th的保留和治疗活性将直接与患者遭受的²²³Ra剂量相关。可以应用公知的方法计算在任何特定情况下产生的²²³Ra的量。

在一个优选的实施方式中，本发明因此提供了用于治疗哺乳动物对象中的疾病的方法(如本文所述)，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的至少一种如本文所述的组织靶向钍配合物。

显然希望使对象对²²³Ra子同位素的暴露最小化，除非有用地应用这一性质。特别地，体内产生的镭-223的量将通常大于40kBq/kg，例如，大于60 kBq/Kg。在某些情况下，需要体内产生的²²³Ra大于80kBq/kg，例如，大于100或115 kBq/kg。

在适当的载体溶液中的钍-227标记的缀合物可作为单次应用或在分次应用（fractionated application）方案中静脉内、腔内(例如腹膜内)、皮下、口服或局部施用。优选地，与靶向部分缀合的配合物将通过胃肠外(例如经皮)途径、尤其是静脉内或通过腔内途径作为溶液施用。优选地，本发明的组合物将被配制在无菌溶液中用于胃肠外施用。

本发明的方法和产品中的钍-227可以单独应用或与其它治疗方式组合应用，所述其它治疗方式包括手术、外放射疗法、化学疗法、其它放射性核素或组织温度调节等。这形成了本发明方法的另一个优选实施方式，并且制剂/药物可相应地包含至少一种另外的治疗活性剂，例如另一种放射性试剂或化学治疗剂。

在一个特别优选的实施方式中，还使对象接受干细胞治疗和/或其它支持性治疗，以减少镭-223诱导的骨髓毒性的作用。

本发明的钍(例如钍-227)标记的分子可通过靶向疾病相关受体用于治疗癌性或非癌性疾病。通常，²²⁷Th的这种医学应用将通过放射免疫疗法，其基于通过螯合剂将²²⁷Th与抗体、抗体片段、或抗体或抗体片段的构建体连接，用于治疗癌性或非癌性疾病。在根据本发明的方法和制剂中²²⁷Th的应用特别适于治疗乳腺癌、胃癌、卵巢癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和子宫癌。

在本发明的另一个实施方式中，具有软组织和骨骼疾病二者的患者可通过²²⁷Th和通过施用的钍在体内产生的²²³Ra二者治疗。在该特别有利的方面，对于治疗的额外治疗组分来自通过靶向骨骼疾病的可接受地非骨髓毒性量的²²³Ra。在该治疗方法中，通常利用²²⁷Th通过适当靶向它们来治疗软组织的原发性和/或转移性癌症，并且利用由²²⁷Th衰变产生的²²³Ra来治疗相同对象中的相关的骨骼疾病。这种骨骼疾病可为由原发性软组织癌引起的对于骨骼的转移，或者可为软组织治疗要对抗转移性癌症情况下的原发性疾病。有时，软组织和骨骼疾病可为不相关的(例如，具有风湿病软组织疾病的患者中的骨骼疾病的另外治疗)。

下面提供了一些示例合成。这些合成中所示的步骤将适于本发明的许多实施方式。例如，在本文所述的许多或所有实施方式中，步骤a)可经由下文所示的中间体AGC0021进行。

AGC0020关键中间体的合成

N,N,N',N'-四(2-氨基乙基)-2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二胺

a)丙二酸二甲酯，氢化钠，THF，b)DIBAL-H，THF，c)MsCl，NEt₃，CH₂Cl₂，d)咪唑，Boc₂O，CH₂Cl₂，甲苯，e)DIPEA，乙腈，f)MeOH，水，AcCl。

AGC0021关键中间体的合成

3-(苄氧基)-1-甲基-4-[(2-硫代-1,3-噻唑烷-3-基)羰基]吡啶-2(1H)-1-酮

a)草酸二乙酯，乙醇钾，甲苯，EtOH，b)Pd/C，对二甲苯，c)Mel，K₂CO₃，DMSO，丙酮，d) i)BBr₃，DCM，ii)BnBr，K₂CO₃，Kl，丙酮，e)NaOH，水，MeOH，f)，DCC，DMAP，DCM。

式(VIII)的化合物的螯合物的合成

4-{[4-(3-[双(2-{[(3-羟基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)羰基]氨基}乙基)氨基]-2-{[双(2-{[(3-羟基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)羰基]氨基}乙基)氨基]甲基}丙基)苯基]氨基}-4-氧代丁酸

在形成本发明配合物的方法中，优选的是，八齿螯合剂和组织靶向部分之间的偶联反应在水溶液中进行。这有几个优点。首先，它除去制造商将所有溶剂除去到低于可接受水平并证明该除去的负担。其次，它减少浪费，并且最重要的是，它通过避免分离或除去步骤来加速生产。在本发明的放射性药物的背景下，重要的是尽可能快地进行合成，因为放射性同位素将一直衰变，并且在制备中花费的时间浪费有价值的材料并引入污染的子同位素。

合适的水溶液包括净化水和缓冲液，例如本领域公知的许多缓冲液中的任一种。乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐(例如PBS)和磺酸盐缓冲液(例如MES)是公知的水性缓冲液的典型实例。

在一个实施方式中，该方法包括形成八齿含羟基吡啶酮配体的第一水溶液(如贯穿本文所述)和组织靶向部分的第二水溶液(如贯穿本文所述)，并使所述第一和所述第二水溶液接触。

合适的偶联部分在上文详细讨论，并且本文中作为偶联和/或连接基团讨论的所有基团和部分可适当地用于将靶向部分偶联到配体。一些优选的偶联基团包括酰胺、酯、醚和胺偶联基团。通过从羧酸产生活化的酯基团的方式，可方便地形成酯和酰胺。这种羧酸可存在于靶向部分上、偶联部分上和/或配体部分上，并且将通常与醇或胺反应形成酯或酰胺。这些方法在本领域中是公知的，并且可利用公知的活化试剂，包括N-羟基马来酰亚胺、碳二亚胺和/或偶氮二甲酸酯活化试剂例如DCC、DIC、EDC、DEAD、DIAD等。

在一个优选的实施方式中，可应用至少一种偶联试剂(例如本文所述的那些中的任一)和活化剂来活化八齿螯合剂，所述八齿螯合剂包含：四个在N-位被甲基烷基取代的羟基吡啶酮部分、和以羧酸基团终止的偶联部分，所述活化剂如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，由此形成八齿螯合剂的NHS酯。这一活化的(例如NHS)酯可分离或无需分离应用，用于偶联至具有游离胺基团(例如在赖氨酸侧链上)的任何组织靶向部分。其它活化的酯是本领域公知的，并且可为有效离去基团例如氟化基团、甲苯磺酸酯基（tosylates）、甲磺酸酯基（mesylates）、碘（iodide）等的任何酯。然而，NHS酯是优选的。

偶联反应优选在相对短的时期期间和在约环境温度进行。用于1步或2步偶联反应的典型时期为约1至240分钟，优选5至120分钟，更优选10至60分钟。用于偶联反应的典型温度将为0至90℃，优选15至50℃，更优选20至40℃。约25℃或约38℃是合适的。

八齿螯合剂与靶向部分的偶联将通常在没有不利地(或至少并非不可逆地)影响靶向部分的结合能力的条件下进行。由于结合剂通常是基于肽或蛋白的部分，这需要相对温和的条件以避免变性或二级/三级结构的丧失。水性条件(如本文在所有上下文中所讨论的)将是优选的，并且将期望避免pH的极端和/或氧化还原。因此，步骤b)可在3至10之间、优选4至9之间、和更优选4.5至8之间的pH进行。可期望在氧化还原方面是中性的、或非常温和地还原以避免在空气中氧化的条件。

适于本发明所有方面的优选组织靶向螯合剂是如本文所述的AGC0018。AGC0018与²²⁷Th的离子的配合物形成本发明配合物和相应制剂、用途、方法等的一个优选实施方式。可用于本发明所有这些方面的其它优选实施方式包括与组织靶向部分(如本文所述)缀合的AGC0019的²²⁷Th配合物，所述组织靶向部分包括对HER2具有结合亲和力的单克隆抗体。

现在将通过以下非限制性实施例说明本发明。实施例中列举的所有化合物形成本发明的优选实施方式(包括优选的中间体和前体)，并且可在上下文允许情况下在任何方面中个别应用或以任何组合应用。

实施例1

式(III)的化合物的合成

实施例1.1

2-(4-硝基苄基)丙二酸二甲酯的合成

在0℃，将氢化钠(60%分散体，11.55g，289mmol)悬浮在450mL四氢呋喃(THF)中。在约30分钟期间滴加丙二酸二甲酯(40.0mL，350mmol)。将反应混合物在0℃搅拌30分钟。在0℃在约30分钟期间滴加溶解在150mL THF中的4-硝基苄基溴(50.0g，231mmol)，然后在环境温度2小时。

加入500 mL乙酸乙酯(EtOAc)和250mL NH₄Cl(饱和水溶液)，然后过滤溶液。对相进行分离。用2*250mL EtOAc萃取水相。合并有机相，用250mL盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并减压除去溶剂。将300mL庚烷和300mL甲基叔丁基醚(MTBE)加入到残余物中并加热至60℃。过滤溶液。将滤液置于冰箱中过夜并过滤。将滤饼用200mL庚烷洗涤并减压干燥，得到标题化合物，为灰白色固体。

产量：42.03g，157.3mmol，68%。

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 3.30(d, 2H, 7.8 Hz), 3.68(t, 1H, 7.8 Hz),3.70(s, 6H), 7.36(d, 2H, 8.7 Hz), 8.13(d, 2H, 8.7 Hz)。

实施例1.2

2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二醇的合成

在0℃，将2-(4-硝基苄基)丙二酸二甲酯(28.0g，104.8mmol)溶解在560mL THF中。在0℃在约30分钟期间滴加二异丁基氢化铝(DIBAL-H)(1M，在己烷中，420mL，420mmol)。将反应混合物在0℃搅拌2小时。

在0℃将20 mL水滴加到反应混合物中。在0℃向反应混合物中滴加20mL NaOH(水溶液，15%)，然后向反应混合物中滴加20mL水。将混合物在0℃搅拌20分钟，然后加入约150gMgSO4。将混合物在室温搅拌30分钟，然后在布氏漏斗上过滤。将滤饼用500mL EtOAc洗涤。除去滤饼并用800mL EtOAc和200mL MeOH搅拌约30分钟，然后过滤溶液。合并滤液并减压干燥。

应用EtOAc在庚烷中的梯度、然后MeOH在EtOAc中的梯度在二氧化硅上进行DFC，得到标题化合物，为浅黄色固体。

产量：15.38g，72.8mmol，69%。

1H-NMR (400MHz, CDCl3): 1.97-2.13(m, 3H), 2.79(d, 2H, 7.6 Hz), 3.60-3.73(m, 2H), 3.76-3.83 (m, 2H), 7.36(d, 2H, 8.4 Hz), 8.14(d, 2H, 8.4 Hz)。

实施例1.3

2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基二甲磺酸酯的合成

在0℃，将2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二醇(15.3g，72.4mmol)溶解在150mL CH₂Cl₂中。加入三乙胺(23mL，165mmol)，然后在约15分钟期间滴加甲磺酰氯(12mL，155mmol)，然后在环境温度搅拌1小时。

加入500 mL CH₂Cl₂，并将混合物用2*250mL NaHCO₃(饱和水溶液)、125mL HCl(水溶液，0.1M)和250mL盐水洗涤。将有机相经Na₂SO₄干燥、过滤并减压干燥，得到标题化合物，为橙色固体。

产量：25.80g，70.2mmol，97%。

1H-NMR (400MHz, CDCl3): 2.44-2.58(m, 1H), 2.87(d, 2H, 7.7 Hz), 3.03(s, 6H), 4.17(dd, 2H, 10.3, 6.0 Hz), 4.26(dd, 2H, 10.3, 4.4 Hz), 7.38(d, 2H,8.6 Hz), 8.19(d, 2H, 8.6 Hz)。

实施例1.4

(氮烷二基双(乙烷-2,1-二基))二氨基甲酸二叔丁酯的合成

在室温将咪唑(78.3g，1.15mol)悬浮在500mL CH₂Cl₂中。分批加入二碳酸二叔丁酯(Boc₂O)(262.0g，1.2mol)。将反应混合物在室温搅拌1小时。将反应混合物用3*750mL水洗涤，经Na₂SO₄干燥、过滤并减压除去挥发物。

将残余物溶解在250mL甲苯中，并加入二亚乙基三胺(59.5mL，550mmol)。将反应混合物在60℃搅拌2小时。

加入1L CH₂Cl₂，并用2*250mL水洗涤有机相。将有机相经Na₂SO₄干燥、过滤并减压还原。应用具有三乙胺的甲醇(MeOH)在CH₂Cl₂中的梯度在二氧化硅上进行DFC，得到标题化合物，为无色固体。

产量：102g，336mmol，61%。

¹H-NMR (400MHz, CDCl3): 1.41(s, 18H), 1.58(bs, 1H), 2.66-2.77(m, 4H),3.13-3.26(m, 4H), 4.96(bs, 2H)。

实施例1.5

(((2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基)双(氮烷三基))四(乙烷-2,1-二基))四氨基甲酸四叔丁酯的合成

将2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基二甲磺酸酯(26.0g，71mmol)和(氮烷二基双(乙烷-2,1-二基))二氨基甲酸二叔丁酯(76.0g，250mmol)溶解在700毫升乙腈中。加入N,N-二异丙基乙胺(43mL，250mmol)。将反应混合物在回流下搅拌4天。

减压除去挥发物。

应用EtOAc在庚烷中的梯度在二氧化硅上进行DFC，得到标题化合物，为浅黄色固体泡沫。

产量：27.2g，34.8mmol，49%。

¹H-NMR (400MHz, CDCl3): 1.40(s, 36H), 1.91-2.17(m, 3H), 2.27-2.54(m,10H), 2.61-2.89(m, 2H), 2.98-3.26(m, 8H), 5.26(bs, 4H), 7.34(d, 2H, 8.5 Hz),8.11(d, 2H, 8.5 Hz)。

实施例1.6

N¹,N^1'-(2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基)双(N¹-(2-氨基乙基)乙烷-1,2-二胺)，AGC0020的合成

将(((2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基)双(氮烷三基))四(乙烷-2,1-二基))四氨基甲酸四叔丁酯(29.0g，37.1mmol)溶解在950mL MeOH和50mL水中。在30℃在约20分钟期间滴加乙酰氯(50mL，0.7mol)。将反应混合物搅拌过夜。

减压除去挥发物，并将残余物溶解在250mL水中。加入500mL CH₂Cl₂，然后加入175mL NaOH(水溶液，5M，用NaCl饱和)。对相进行分离，并且用4*250mL CH₂Cl₂萃取水相。合并有机相，经Na₂SO₄干燥、过滤并减压干燥，得到标题化合物，为粘稠的红棕色油状物。

产量：11.20g，29.3mmol，79%。纯度(HPLC图9)：99.3%。

¹H-NMR (300MHz, CDCl₃): 1.55(bs, 8H), 2.03(dt, 1H, 6.6, 13.3 Hz), 2.15(dd, 2H, 12.7, 6.6), 2.34-2.47(m, 10H), 2.64-2.77(m, 10H), 7.32(d, 2H, 8.7Hz), 8.10(d, 2H, 8.7 Hz)。

¹³C-NMR (75MHz, CDCl₃): 37.9, 38.5, 39.9, 58.0, 58.7, 123.7, 130.0,146.5, 149.5。

实施例1.7

5-羟基-6-氧代-1,2,3,6-四氢吡啶-4-甲酸乙酯的合成

在室温将2-吡咯烷酮(76mL，1mol)和草酸二乙酯(140mL，1.03mol)溶解在1L甲苯中。加入乙醇钾(EtOK)(24%，在EtOH中，415mL，1.06mol)，并将反应混合物加热至90℃。

由于反应混合物的增稠，在反应的第一小时期间分批加入200 mL EtOH。将反应混合物搅拌过夜并冷却至室温。缓慢加入210 mL HCl(5M，水溶液)同时搅拌。加入200mL盐水和200mL甲苯，并且对相进行分离。

用2×400mL CHCl₃萃取水相。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)、过滤并真空还原。将残余物从EtOAc中重结晶，得到标题化合物，为浅黄色固体。

产量：132.7g，0.72mol，72%。

实施例1.8

3-羟基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-甲酸乙酯的合成

将{5-羟基-6-氧代-1,2,3,6-四氢吡啶-4-甲酸乙酯}(23.00g，124.2mmol)溶解在150mL对二甲苯中并加入碳载钯(Palladium on carbon)(10%，5.75g)。将反应混合物在回流下搅拌过夜。冷却至室温后，将反应混合物用300mL MeOH稀释，并通过短Celite®垫过滤。将垫用300mL MeOH洗涤。真空除去溶剂，得到标题化合物，为浅红棕色固体。

产量：19.63g，107.1mmol，86%。MS (ESI, pos): 206.1[M+Na]⁺, 389.1[2M+Na]⁺。

实施例1.9

3-甲氧基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-甲酸乙酯的合成

在室温将{3-羟基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-甲酸乙酯}(119.2g，0.65mol)溶解在600mL二甲亚砜(DMSO)和1.8L丙酮中。加入K₂CO₃(179.7g，1.3mol)。在室温在约1小时期间滴加溶解在600mL丙酮中的甲基碘(MeI)(162mL，321mmol)。

将反应混合物在室温搅拌另外2小时，然后加入MeI(162mL，2.6mol)。将反应混合物在回流下搅拌过夜。减压还原反应混合物，并加入2.5L EtOAc。

过滤混合物并减压还原。应用EtOAc在庚烷中的梯度在SiO₂上通过干燥快速色谱(dry flash chromatography，DFC)进行纯化，得到标题化合物。

产量：56.1 g, 210.1 mmol, 32 %。MS (ESI, pos):234.1[M+Na]⁺, 445.1[2M+Na]⁺。

实施例1.10

3-(苄氧基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-甲酸乙酯的合成

在-78℃将{3-甲氧基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-甲酸乙酯}(5.93g，28.1mmol)溶解在80mL二氯甲烷(DCM)中，并滴加溶解在20mL DCM中的BBr₃(5.3mL，56.2mmol)。将反应混合物在-78℃搅拌1小时，然后将反应加热至0℃。通过滴加25mL叔丁基甲基醚(tert-BuOMe)和25mL MeOH来猝灭反应。真空除去挥发物。将残余物溶解在90mL DCM和10mL MeOH中，并通过短的SiO₂垫过滤。将垫用200mL的DCM中的10%MeOH洗涤。真空除去挥发物。将残余物溶解在400mL丙酮中。加入K₂CO₃(11.65g，84.3mmol)，KI(1.39g，8.4mmol)和苄基溴(BnBr)(9.2mL，84.3mmol)。将反应混合物在回流下搅拌过夜。将反应混合物用200mL EtOAc稀释，并用3×50mL水和50mL盐水洗涤。将合并的水相用2×50mL EtOAc萃取。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)、过滤，并将挥发物真空除去，并应用庚烷中的EtOAc(40-70%)作为洗脱剂在SiO₂上通过干燥快速色谱纯化，得到标题化合物。

产量：5.21 g, 18.1 mmol, 65 %。MS (ESI, pos): 310.2[M+Na]⁺, 597.4[2M+Na]⁺。

实施例1.11

3-(苄氧基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-甲酸的合成

将{3-(苄氧基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-甲酸乙酯}(27.90g，97.1mmol)溶解在250mL MeOH中，并加入60mL NaOH(5M，水溶液)。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后将反应混合物真空浓缩至约1/3。将残余物用150mL水稀释，并应用氯化氢(HCl)(5M，水溶液)酸化至pH 2。将沉淀物过滤并真空干燥，得到标题化合物，为无色固体。产量：22.52g，86.9mmol，89%。

实施例1.12

3-(苄氧基)-1-甲基-4-(2-硫代噻唑烷-3-羰基)吡啶-2(1H)-酮(AGC0021)的合成

将{3-(苄氧基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-甲酸}(3.84g，14.8mmol)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(196mg，1.6mmol)和2-噻唑啉-2-硫醇(1.94g，16.3mmol)溶解在50mL DCM中。加入N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)(3.36g，16.3mmol)。将反应混合物搅拌过夜。过滤反应，用DCM洗涤固体，并真空还原滤液。将得到的黄色固体从异丙醇/DCM中重结晶，得到AGC0021。产量：4.65g，12.9mmol，87%。MS(ESI, pos): 383[M+Na]⁺, 743[2M+Na]⁺。

实施例1.13

AGC0023的合成

将AGC0020(8.98g；23.5mmol)溶解在CH₂Cl₂(600mL)中。加入AGC0021(37.43g；103.8mmol)。将反应在室温搅拌20小时。减压浓缩反应混合物。

应用甲醇在EtOAc和CH₂Cl₂的1：1混合物中的梯度在SiO₂上进行DFC，得到AGC0023，为固体泡沫。

平均产量：26.95g，20.0mmol，85%。

实施例1.14

AGC0024的合成

将AGC0023(26.95g；20.0mmol)溶解在乙醇(EtOH)(675mL)中。加入铁(20.76g；0.37mol)和NH₄Cl(26.99g；0.50mol)，然后加入水(67mL)。将反应混合物在70℃搅拌2小时。加入更多的铁(6.75g；121mmol)，并将反应混合物在74℃搅拌1小时。加入更多的铁(6.76g；121mmol)，并将反应混合物在74℃搅拌1小时。冷却反应混合物，然后减压还原反应混合物。

应用甲醇在CH₂Cl₂中的梯度在SiO₂上进行DFC，得到AGC0024，为固体泡沫。产量18.64g，14.2mmol，71%。

实施例1.15

AGC0025的合成

将AGC0024(18.64g；14.2mmol)溶解在CH₂Cl₂(750mL)中并冷却至0℃。加入BBr₃(50g；0.20mol)并将反应混合物搅拌75分钟。通过小心加入甲醇(MeOH)(130mL)同时在0℃搅拌来猝灭反应。减压除去挥发物。将HCl(1.25M，在EtOH中，320mL)加入到残余物中。然后应用旋转蒸发器在大气压和环境温度旋转烧瓶15分钟，然后减压除去挥发物。

应用乙腈(ACN)在水中的梯度在非封端的C₁₈二氧化硅上进行DFC，得到AGC0025，为浅橙色玻璃状固体。

产量13.27g，13.9mmol，98%。

实施例1.16

AGC0019的合成

在室温将AGC0025(10.63g；11.1mmol)溶解在ACN(204mL)和水(61mL)中。加入琥珀酸酐(2.17g；21.7mmol)并将反应混合物搅拌2小时。减压还原反应混合物。应用ACN在水中的梯度在非封端的C₁₈二氧化硅上进行DFC，产生浅绿色玻璃状固体。

在40℃将固体溶解在MeOH(62mL)和水(10.6mL)中。在超声处理下将溶液滴加至EtOAc(750mL)中。过滤沉淀物，用EtOAc洗涤并减压干燥，得到AGC0019，为具有浅绿色调的灰白色固体。

产量：9.20g，8.7mmol，78%。H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆), ¹³C-NMR (100 MHz,DMSO-d₆)。

实施例2

纯钍-227的分离

从锕-227发生器中分离钍-227。通过镭-226的热中子照射、随后镭-227(t1/2=42.2m)衰变至锕-227，产生锕-227。通过阴离子交换色谱，从8M HNO₃溶液中的锕-227衰变混合物中选择性地保留钍-227。应用2mm内径、长度30mm的柱，其含有70mg AG^®1-X8树脂(200-400目，硝酸盐形式)。在锕-227、镭-223和子体从柱中洗脱后，用12M HCl从柱中提取钍-227。将含有钍-227的洗脱液蒸发至干燥，并在标记步骤之前将残余物重悬于0.01M HCl中。

实施例3

实施例3.1

针对HER2的单克隆抗体(AGC1100)的产生

在Geneart/Life Technologies(Regensburg，Germany)合成含有用于本发明IgG的氨基酸序列的DNA序列，并将其克隆到合适的表达载体中。所有基因都被密码子优化用于CHO表达。应用NRC Canada的表达系统(Durocher等人, Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E9)，在HEK293 6E细胞中瞬时表达IgG，或在稳定转染CHO-K1细胞后表达IgG。如前所述(Hristodorov等人, Mol Biotechnol (2013) 53:326–335)，经由蛋白A亲和色谱和随后的尺寸排阻色谱纯化抗体。

实施例3.2 mAb AGC1100与螯合剂AGC0019(式(VIII)的化合物)偶联，以得到缀合物AGC1118

在缀合之前，将磷酸盐缓冲液pH 7.5加入到抗体溶液(AGC1100)中以增加溶液的缓冲能力。确定容器中AGC1100(mAb)的量。

向PBS中的曲妥珠单抗加入11%1M磷酸盐缓冲液pH 7.4。

将螯合剂AGC0019溶解在1：1的DMA：0.1M MES缓冲液pH 5.4中。将NHS和EDC溶解在0.1M MES缓冲液pH 5.4中。

制备螯合剂/ N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)/1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的1/1/3摩尔当量溶液，以活化螯合剂。

为了与抗体缀合，将摩尔比8/8/25/1(螯合剂/NHS/EDC/mAb)的活化的螯合剂加载至mAb。20-40分钟后，用12%v/v 0.3M柠檬酸将pH调节至5.5来猝灭缀合反应。

通过在与ÄKTA系统(GE Healthcare)连接的Superdex 200(GE Healthcare)柱上凝胶过滤，实施AGC0118缀合物的纯化和缓冲液交换到30mM柠檬酸盐pH5.5、154mM NaCl中。测量Abs 280nm处的蛋白浓度，然后用缓冲液配制产物(以获得在30mM柠檬酸盐、154mMNaCl、2mM EDTA、2mg/ml pABA、pH 5.5中的2.5mg/mL AGC0118)。最后，在储存之前，将溶液通过0.2μm过滤器过滤到无菌瓶中。

实施例3.3

制备²²⁷Th-AGC0118注射时的剂量

如前所述进行标记：

将一小瓶20MBq钍-227氯化物薄膜溶解在2ml 8M HNO3溶液中并放置15分钟，然后取出溶液用于应用到阴离子交换柱，用于除去随时间生长的镭-223。用3ml 8M HNO3和1ml水洗涤柱，然后用3ml 3M HCl洗脱钍-227。测量钍-227的洗脱活性，并将10MBq的剂量转移到空的10ml玻璃小瓶中。然后应用真空泵并使小瓶在加热块(设为120℃)中30-60分钟而蒸发酸。达到室温后，加入6ml的2.5mg/ml的AGC0118缀合物用于放射性标记。将小瓶轻轻混合并在室温放置15分钟。然后将溶液无菌过滤到无菌小瓶中，并取出样品用于iTLC分析，以在应用前测定RCP。

实施例3.4

具有不同总活性的²²⁷Th-AGC0118对SKOV-3的细胞毒性

在4小时温育时间期间通过改变加入孔中的总活性，对各种剂量的²²⁷ Th-AGC0118测试细胞的细胞毒性。在实验前一天，在96孔板中每孔接种10000个SKOV-3细胞。在第1天向细胞中加入一系列总活性5、10、20和40 kBq/ml的螯合的²²⁷ Th-AGC0118，比活性为20kBq/μg。温育期结束后，通过多阵列移液管，然后是用培养基的一次另外洗涤和随后的新鲜培养基洗涤，除去剩余的未结合的²²⁷Th-AGC0118。SKOV-3细胞在具有10%FBS和1%青霉素/链霉素的Mc-Coy培养基中培养。在与²²⁷Th-AGC0118温育期间，无血清培养基取代培养基。在第四天，用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)测量细胞活力。见图6。

实施例4

酰胺和异硫氰酸酯连接的缀合物的稳定性的比较

将AGC1118和具有异硫氰酸酯偶联部分的相应缀合物(AGC1115)在40℃、在水溶液中储存11天。定期采集样品。

从中可以看出，对于酰胺偶联的缀合物，没有见到缀合物浓度的可测量的减少。与之相比，异硫氰酸酯缀合物减少。

序列表

<110> Bayer Pharma AG

<120> 放射性药物配合物

<130> BHC163022 EP

<160> 6

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 2

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 Seq 2

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

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Gly

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<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 Seq 3

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<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 Seq 4

<400> 4

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435 440 445

Gly

<210> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 Seq 4

<400> 5

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

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325 330 335

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435 440 445

Gly

<210> 6

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 Seq 6

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

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275 280 285

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290 295 300

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

Claims

1.用于形成组织靶向钍配合物的方法，所述方法包括：

a)形成式(I)或(II)的八齿螯合剂：

其中R_C是以羧酸部分终止的连接体部分，例如

[-CH₂-Ph-N(H)-C(=O)-CH₂-CH₂-C(=O)OH],

[-CH₂-CH₂-N(H)-C(=O)-(CH₂-CH₂-O)_1-3-CH₂-CH₂-C(=O)OH]或

轻链

重链

从而产生组织靶向螯合剂；和

2.权利要求1的方法，其中步骤b)在水溶液中进行。

3.任一前述权利要求的方法，其中所述酰胺偶联试剂是碳二亚胺偶联试剂，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)。

4.任一前述权利要求的方法，其中步骤b)在pH为4至9的水溶液中进行。

5.任一前述权利要求的方法，其中步骤b)在15至50℃进行5至120分钟。

6.任一前述权利要求的方法，其中步骤c)在15至50℃进行1至60分钟。

7.任一前述权利要求的方法，

其中R_C是

[-(CH₂)_1-3-对-亚苯基-N(H)-C(=O)-(CH₂)_1-5-C(=O)OH]，

优选地[-(CH₂)-对-亚苯基-N(H)-C(=O)-(CH₂)₂-C(=O)OH]。

8.任一前述权利要求的方法，其中所述组织靶向部分包含与序列1具有序列同一性的肽链：

轻链

和与序列2具有98%或更多的序列相似性或具有同一性的肽链：

重链

。

9.组织靶向钍配合物，其通过权利要求1至8中任一项的方法形成、或可通过权利要求1至8中任一项的方法形成。

10.药物制剂，其包含如权利要求1至9中任一项所定义的至少一种组织靶向钍配合物。

11.权利要求10的药物制剂，其还包含柠檬酸盐缓冲液。

12.权利要求10或权利要求11的药物制剂，其还包含对氨基丁酸(PABA)、和任选地EDTA和/或至少一种聚山梨醇酯。

13.如权利要求1至9中任一项所定义的组织靶向钍配合物、或如权利要求10至12中任一项所请求保护的药物制剂在制备用于治疗增生性或肿瘤疾病的药物中的用途。

14.如权利要求13请求保护的用途，其中所述疾病选自：胃癌、卵巢癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和子宫癌。

15.治疗人或非人动物(特别是需要所述治疗的人或非人动物)的方法，包括施用如权利要求1至9中任一项所定义的至少一种组织靶向钍配合物、或如权利要求10至12中任一项所请求保护的至少一种药物制剂。

16.权利要求15的方法，其用于治疗胃癌、卵巢癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和子宫癌。

17.如权利要求1至9中任一项所定义的组织靶向钍配合物、或如权利要求10至12中任一项所请求保护的药物制剂，其用于治疗胃癌、卵巢癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和子宫癌。

18.试剂盒，其包含：

i)如权利要求1或7所定义的八齿螯合剂；

ii)如权利要求1或8所定义的至少一种组织靶向部分；

iii)至少一种酰胺偶联试剂；和

iv)任选地且优选地，发射α粒子的钍放射性核素，例如²²⁷Th。