TWI435730B - 延長癌症病患疾病惡化之時間或存活之方法 - Google Patents

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Description

延長癌症病患疾病惡化之時間或存活之方法
本發明係關於延長癌症病患疾病惡化之時間或存活之方法，其中該病患之癌症顯示具有HER活化情形，其係藉著以HER二聚化作用之抑制劑(諸如，波圖單抗(pertuzumab))治療該病患而進行。
 HER受體及對抗其之抗體
HER受體家族酪胺酸激酶係細胞生長、分化、及存活之重要中介子。該受體家族包括四種迥異之成員，包括，表皮生長因子受體(EGFR、ErbB1、或HER1)、HER2(ErbB2或p185n e u )、HER3(ErbB3)、及HER4(ErbB4或tyro2)。
由erbB1基因編碼之EGFR已被發現可能涉及人類惡性疾病之肇因。特定言之，已在乳癌、膀胱、肺、頭、頸、及胃癌、以及神經膠質母細胞瘤中觀察到增加之EGFR表現。增加之EGFR受體表現通常與相同腫瘤細胞增加之EGFR配位體轉化生長因子α(TGF－α)之生成相關，其藉由自分泌刺激途徑而造成受體活化。Baselga and Mendelsohn Pharmac.Ther.64：127－154(1994)。指向對抗EGFR或其配位體(TGF－α及EGF)之單株抗體已被評估做為用於此等惡性疾病治療中之療劑。參見，如，Baselga and Mendelsohn.，上述文獻；Masui et al.Cancer Research 44：1002－1007(1984)；及Wu et al.J.Clin.Invest.95：1897－1905(1995)。
HER家族之第二成員，p185n e u ，最初係被辨識為來自化學處理化大鼠神經母細胞瘤之轉化基因產物。neu原致癌基因之活化形式係來自於該編碼蛋白穿膜區域中的一個點突變(纈胺酸至麩胺酸)。在乳癌及卵巢癌中可觀察到neu人類同源物之擴增，且其與不佳之預後相關(Slamon et al.,Science,235：177－182(1987)；Slamon et al.,Science,244：707－712(1989)；及美國專利第4,968,603號)。至今，仍未在人類腫瘤中發現類似該存在於neu原致癌基因中之點突變。已在其他癌瘤中觀察到HER2之過表現(其通常但非一定係因基因擴增而產生)，包括胃、子宮內膜、唾腺、肺、腎臟、結腸、甲狀腺、胰臟、及膀胱之癌。參見，例如，King et al.,Science,229：974(1985)；Yokota et al.,Lancet：1：765－767(1986)；Fukushige et al.,Mol Cell Biol.,6：955－958(1986)；Guerin et al.,Oncogene Res.,3：21－31(1988)；Cohen et al.,Oncogene,4：81－88(1989)；Yonemura et al.,Cancer Res.,51：1034(1991)；Borst et al.,Gynecol.Oncol.,38：364(1990)；Weiner et al.,Cancer Res.,50：421－425(1990)；Kern et al.,Cancer Res.,50：5184(1990)；Park et al.,Cancer Res.,49：6605(1989)；Zhau et al.,Mol.Carcinog.,3：254－257(1990)；Aasland et al.Br.J.Cancer 57：358－363(1988)；Williams et al.Pathobiology 59：46－52(1991)；及McCann et al.,Cancer,65：88－92(1990)。在前列腺癌中，HER2可為過表現狀態(Gu et al.Cancer Lett.99：185－9(1996)；Ross et al.Hum.Pathol.28：827－33(1997)；Ross et al.Cancer 79：2162－70(1997)；及Sadasivan et al.J.Urol.150：126－31(1993))。
指向對抗大鼠p185n e u 及人類HER2蛋白產物之抗體已獲得敘述。
Drebin及其同事已培養出對抗大鼠neu基因產物p185n e u 之抗體。參見，例如，Drebin et al.,Cell 41：695－706(1985)；Myers et al.,Meth.Enzym.198：277－290(1991)；及WO94/22478。Drebin et al.Oncogene 2：273－277(1988)報告，可與p185n e u 之兩迥異區域反應之抗體混合物可造成對於移植進入裸鼠體內之neu轉形化NIH－3T3細胞之協同性抗腫瘤作用。亦參見美國專利第5,824,311號(1998年10月20日核發)。
Hudziak et al.,Mol.Cell.Biol.9(3)：1165－1172(1989)述及一組HER2抗體之生成，該等抗體經由使用人類乳癌腫瘤細胞系SK－BR－3而定性。以72小時後單層細胞之結晶紫染色’測定SK－BR－3細胞於接觸該等抗體後之相對細胞增殖。使用此分析，以稱為4D5之抗體取得最大抑制，其可抑制56%之細胞增殖。該組中之其他抗體在此分析中則以較低之程度抑低細胞增殖。進一步又發現抗體4D5可使HER2－過表現性乳癌腫瘤細胞系對於TNF－α之胞毒作用產生敏化。亦參見美國專利第5,677,171號(1997年10月14日核發)。Hudziak et al.中所討論之抗體又進一步在Fendly et al.Cancer Research 50：1550－1558(1990)；Kotts et al.In Vitro 26(3)：59A(1990)；Sarup et al.Growth Regulation 1：72－82(1991)；Shepard et al.J.Clin.Immunol.11(3)：117－127(1991)；Kumar et al.Mol.Cell.Biol.11(2)：979－986(1991)；Lewis et al.Cancer Immunol.Immunother.37：255－263(1993)；Pietras et al.Oncogene 9：1829－1838(1994)；Vitetta et al.Cancer Research 54：5301－5309(1994)；Sliwkowski et al.J.Biol.Chem.269(20)：14661－14665(1994)；Scott et al.J.Biol.Chem.266：14300－5(1991)；D'souza et al.Proc.Natl.Acad.Sci.91：7202－7206(1994)；Lewis et al.Cancer Research 56：1457－1465(1996)；及Schaefer et al.Oncogene 15：1385－1394(1997)中獲得定性。
鼠類HER2抗體4D5之一重組人類化變體(huMAb4D5－8、rhuMAb HER2、曲妥珠單抗(trastuzumab)、或HERCEPTIN7 ；美國專利第5,821,337號)在已接受大量前抗癌治療之HER2－過表現性轉移性乳癌病患體內具有臨床活性(Baselga et al.,J.Clin.Oncol.14：737－744(1996))。曲妥珠單抗(trastuzumab)已於1998年9月25日取得食品藥物管理局(Food and Drug Administration)之上市許可，用於治療其腫瘤表現HER2蛋白之轉移性乳癌病患。
其他具有各種不同特性之HER2抗體已述於Tagliabue et al.Int.J.Cancer 47：933－937(1991)；McKenzie et al.Oncogene 4：543－548(1989)；Maier et al.Cancer Res.51：5361－5369(1991)；Bacus et al.Molecular Carcinogenesis 3：350－362(1990)；Stancovski et al.PNAS(USA)88：8691－8695(1991)；Bacus et al.Cancer Research 52：2580－2589(1992)；Xu et al.Int.J.Cancer 53：401－408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk et al.Cancer Research 52：2771－2776(1992)；Hancock et al.Cancer Res.51：4575－4580(1991)；Shawver et al.Cancer Res.54：1367－1373(1994)；Arteaga et al.Cancer Res.54：3758－3765(1994)；Harwerth et al.J.Biol.Chem.267：15160－15167(1992)；美國專利第5,783,186號；及Klapper et al.Oncogene 14：2099－2109(1997)。
由同源性篩選已辨識出兩種其他之HER受體家族成員；HER3(美國專利第5,183,884及5,480,968號，以及Kraus et al.PNAS(USA)86：9193－9197(1989))及HER4(歐洲專利申請案第599,274號；Plowman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：1746－1750(1993)；及Plowman et al.,Nature,366：473－475(1993))。此兩種受體皆在至少一種乳癌細胞系中顯示具有增加之表現。
HER受體一般可以各種不同之組合而見於細胞中，且二聚化被認為可增加其對於各種HER配位體之細胞反應之多樣性(Earp et al.Breast Cancer Research and Treatment 35：115－132(1995))。EGFR係由六種不同之配位體結合；表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子α(TGF－α)、雙調蛋白、肝素結合性表皮生長因子(HB－EGF)、β細胞素、及表皮調節素(Groenen et al.Growth Factors 11：235－257(1994))。由單一基因之可變剪接所產生之一賀熱固林(heregulin)蛋白家族係HER3及HER4之配位體。該賀熱固林(heregulin)家族包括α、β、及γ賀熱固林(Holmes et al.,Science,256：1205－1210(1992)；美國專利第5,641,869號；及Schaefer et al.Oncogene 15：1385－1394(1997))；neu分化因子(NDFs)、膠質生長因子(GGFs)；乙醯膽鹼受體誘發活性(ARIA)；以及感覺及運動神經元衍生性因子(SMDF)。就其回顧評論，參見Groenen et al.Growth Factors 11：235－257(1994)；Lemke,G.Molec.& Cell.Neurosci.7：247－262(1996)；及Lee et al.Pharm.Rev.47：51－85(1995)。近來，又辨識出三種額外之HER配位體；神經調節素－2(NRG－2)，其經報導可結合HER3或HER4(Chang et al.Nature 387 509－512(1997)；及Carraway et al Nature 387：512－516(1997))；神經調節素－3，其可結合HER4(Zhang et al.PNAS(USA)94(18)：9562－7(1997))；以及神經調節素－4，其可結合HER4(Harari et al.Oncogene 18：2681－89(1999))。HB－EGF、β細胞素、及表皮調節素亦可結合HER4。
儘管EGF及TGFα並不會結合HER2，EGF卻可刺激EGFR及HER2形成異源二聚體，其可活化EGFR，並造成該異源二聚體中HER2之磷酸轉移作用。二聚化作用及/或磷酸轉移作用似乎可活化HER2酪胺酸激酶。參見，Earp et al.，上述文獻。同樣，當HER3與HER2共表現時，其形成一活性信號傳導複合物，且指向對抗HER2之抗體可破壞此複合物(Sliwkowski et al.,J.Biol.Chem.,269(20)：14661－14665(1994))。此外，在與HER2共表現時，HER3對於賀熱固林(heregulin)(HRG)之親和性可增加至較高之親和狀態。關於HER2－HER3蛋白複合物，亦參見，Levi et al.,Journal of Neuroscience 15：1329－1340(1995)；Morrissey et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1431－1435(1995)；及Lewis et al.,Cancer Res.,56：1457－1465(1996)。HER4，和HER3類似，可與HER2形成活性信號傳導複合物(Carraway and Cantley,Cell 78：5－8(1994))。
與HER抗體相關之專利公開案包括：US 5,677,171、US 5,720,937、US 5,720,954、US 5,725,856、US 5,770,195、US 5,772,997、US 6,165,464、US 6,387,371、US 6,399,063、US2002/0192211A1、US 6,015,567、US 6,333,169、US 4,968,603、US 5,821,337、US 6,054,297、US 6,407,213、US 6,719,971、US 6,800,738、US2004/0236078A1、US 5,648,237、US 6,267,958、US 6,685,940、US 6,821,515、WO98/17797、US 6,127,526、US 6,333,398、US 6,797,814、US 6,339,142、US 6,417,335、US 6,489,447、WO99/31140、US2003/0147884A1、US2003/0170234A1、US2005/0002928A1、US 6,573,043、US2003/0152987A1、WO99/48527、US2002/0141993A1、WO01/00245、US2003/0086924、US2004/0013667A1、WO00/69460、WO01/00238、WO01/15730、US 6,627,196B1、US6,632,979B1、WO01/00244、US2002/0090662A1、WO01/89566、US2002/0064785、US2003/0134344、WO 04/24866、US2004/0082047、US2003/0175845A1、WO03/087131、US2003/0228663、WO2004/008099A2、US2004/0106161、WO2004/048525、US2004/0258685A1、US 5,985,553、US 5,747,261、US 4,935,341、US 5,401,638、US 5,604,107、WO 87/07646、WO 89/10412、WO 91/05264、EP 412,116 B1、EP 494,135 B1、US 5,824,311、EP 444,181 B1、EP 1,006,194 A2、US 2002/0155527A1、WO 91/02062、US 5,571,894、US 5,939,531、EP 502,812 B1、WO 93/03741、EP 554,441 B1、EP 656,367 A1、US 5,288,477、US 5,514,554、US 5,587,458、WO 93/12220、WO 93/16185、US 5,877,305、WO 93/21319、WO 93/21232、US 5,856,089、WO 94/22478、US 5,910,486、US 6,028,059、WO 96/07321、US 5,804,396、US 5,846,749、EP 711,565、WO 96/16673、US 5,783,404、US 5,977,322、US 6,512,097、WO 97/00271、US 6,270,765、US 6,395,272、US 5,837,243、WO 96/40789、US 5,783,186、US 6,458,356、WO 97/20858、WO 97/38731、US 6,214,388、US 5,925,519、WO 98/02463、US 5,922,845、WO 98/18489、WO 98/33914、US 5,994,071、WO 98/45479、US 6,358,682 B1、US 2003/0059790、WO 99/55367、WO 01/20033、US 2002/0076695 A1、WO 00/78347、WO 01/09187、WO 01/21192、WO 01/32155、WO 01/53354、WO 01/56604、WO 01/76630、WO 02/05791、WO 02/11677、US 6,582,919、US2002/0192652A1、US 2003/0211530A1、WO 02/44413、US 2002/0142328、US 6,602,670 B2、WO 02/45653、WO 02/055106、US 2003/0152572、US 2003/0165840、WO 02/087619、WO 03/006509、WO03/012072、WO 03/028638、US 2003/0068318、WO 03/041736、EP 1,357,132、US 2003/0202973、US 2004/0138160、US 5,705,157、US 6,123,939、EP 616,812 B1、US 2003/0103973、US 2003/0108545、US 6,403,630 B1、WO 00/61145、WO 00/61185、US 6,333,348 B1、WO 01/05425、WO 01/64246、US 2003/0022918、US 2002/0051785 A1、US 6,767,541、WO 01/76586、US 2003/0144252、WO 01/87336、US 2002/0031515 A1、WO 01/87334、WO 02/05791、WO 02/09754、US 2003/0157097、US 2002/0076408、WO 02/055106、WO 02/070008、WO 02/089842、及WO 03/86467。
診斷
以HER2抗體曲妥珠單抗(trastuzumab)治療之病患係根據HER2過表現/擴增而選擇進行治療。參見，例如，WO99/31140(Paton et al.)、US2003/0170234A1(Hellmann,S.)、及US2003/0147884(Paton et al.)；以及WO01/89566、US2002/0064785、及US2003/0134344(Mass et al.)。亦參見，US2003/0152987,Cohen et al.，其係關於用以偵測HER2過表現及擴增之免疫組織化學(IHC)及螢光原位雜交(FISH)。
WO2004/053497及US2004/024815A1(Bacus et al.)，以及US 2003/0190689(Crosby and Smith)係關於判定或預測對於曲妥珠單抗治療之反應。US2004/013297A1(Bacus et al.)係關於判定或預測對於ABX0303 EGFR抗體治療之反應。WO2004/000094(Bacus et al.)係關於判定對於GW572016(一種小分子EGFR－HER2酪胺酸激酶抑制劑)之反應。WO2004/063709,Amler et al.係關於用以判定對於EGFR抑制劑埃羅替尼(erlotinib)HCl之敏感度之生物標記物及方法。US2004/0209290,Cobleigh et al.係關於用於乳癌預後之基因表現標記物。以波圖單抗(pertuzumab)治療之病患係根據HER之活化或二聚化而選擇進行治療。有關波圖單抗及選擇病患進行治療之方法之專利公開案包括：WO01/00245(Adams et al.)；US2003/0086924(Sliwkowski,M.)；US2004/0013667A1(Sliwkowski,M.)；以及WO2004/008099A2及US2004/0106161(Bossenmaier et al.)。
Cronin et al.Am.J.Path.164(1)：35－42(2004)敘述在保存之石蠟包埋組織中測量基因表現。Ma et al.Cancer Cell 5：607－616(2004)敘述使用由取自保存之初級生檢之腫瘤組織切片分離之RNA而以寡核苷酸微陣列進行基因內容分析。
波圖單抗(pertuzumab)(亦稱重組人類單株抗體2C4；OMNITARGT M ,Genentech,Inc,South San Francisco)代表一類稱為HER二聚化抑制劑(HDI)之新試劑中之第一成員，其可作用而抑制HER2與其他HER受體(諸如，EGFR/HER1、HER3、及HER4)形成活性異源二聚物能力，且其不論HER2之表現量為何皆具活性。參見，例如，Harari and Yarden Oncogene 19：6102－14(2000)；Yarden and Sliwkowski.Nat Rev Mol Cell Biol 2：127－37(2001)；Sliwkowski Nat Struct Biol 10：158－9(2003)；ChO et al.Nature 421：756－60(2003)；及Malik et al.Pro Am Soc Cancer Res 44：176－7(2003)。
波圖單抗對於細胞中HER2－HER3異源二聚物形成之阻斷已顯示可抑制重要之細胞信號傳遞，其可造成較低之腫瘤增殖及存活(Agus et al.Cancer Cell 2：127－37(2002))。
波圖單抗已以單一藥劑之形式進行臨床試驗，以末期癌症病患進行Ia期試驗，並以卵巢癌及乳癌以及肺及前列腺癌之病患進行II期試驗。在一項I期試驗中，其以每三週一次經靜脈內投藥之波圖單抗，治療具有在標準療法之過程中或之後產生蔓延之無法治癒性、局部廣闊性、復發、或轉移之實體腫瘤之病患。波圖單抗之可耐受性一般而言皆為良好。在可評估反應之20名病患中，有3名達成腫瘤退化之情形。兩名病患具有經確認之部分反應。在21名病患中，有6名觀察到持續超過個2.5月之穩定疾病狀態(Agus et al.Pro Am Soc Clin Oncol 22：192(2003))。在2.0－15毫克/公斤之劑量下，波圖單抗之藥物動力學呈線性，且其平均清除率(mean clearance)係介於自2.69至3.74毫升/天/公斤，而其平均終端消除半生期(mean terminal elimination half－life)係介於15.3至27.6天。並未偵測到對抗波圖單抗之抗體(Allison et al.Pro Am Soc Clin Oncol 22：197(2003))。
本發明提供由經HER二聚化抑制劑波圖單抗(pertuzumab)治療之人類癌症病患取得之臨床數據。其使用phospho－ELISA生物分析測定，評估病患之HER活化情形。在具有HER活化情形之病患體內，以疾病惡化之時間(TTP)及存活測量，觀察到臨床助益。
因此，本發明提供用以延長癌症病患疾病惡化之時間(TTP)及存活之方法，其包含對該病患投藥一種HER二聚化抑制劑，其量可延長該病患之疾病惡化之時間(TTP)及存活，其中該病患之癌症顯示具有HER活化情形。
本發明亦係關於用以延長罹患卵巢、腹膜、或輸卵管癌症之病患疾病惡化之時間(TTP)及存活之方法，其包含對該病患投藥波圖單抗(pertuzumab)，其量可延長該病患之TTP及存活，其中該病患之癌症顯示具有HER活化情形。
 I.定義
在本文中，"疾病惡化之時間"或"TTP"係指自起始治療(如，二聚化抑制劑，諸如，波圖單抗(pertuzumab))之時間起，直到癌症蔓延或惡化之時間，一般而言係以週或月計。此種蔓延可由熟習技藝之臨床醫師評估。就卵巢癌之情形而言，例如，蔓延可由RECIST評估(參見，例如，Therasse et al.,J.Nat.Cancer Inst.92(3)：205－216(2000))。
"延長TTP"意謂在經治療病患體內，相對於未經治療之病患(如，相對於未經二聚化抑制劑(諸如，波圖單抗)治療之病患)，或是相對於並未顯示具有HER活化情形之病患，及/或相對於經由一已獲核准之抗腫瘤劑(諸如，拓撲替康(topotecan)或阿黴素脂質體(liposomal doxorubicin)，其中該癌症係卵巢癌)治療之病患，增加其疾病惡化之時間。
"存活"意謂病患維持存活，且其包括整體之存活以及無疾病蔓延之存活。
"整體之存活"係指自診斷或治療之時起，該病患維持定義時間期之存活，諸如，1年、5年等。
"無疾病蔓延之存活"係指該病患在無癌症蔓延或惡化之情形下維持存活。
"延長存活"意謂在經治療病患體內，相對於未經治療之病患(如，相對於未經二聚化抑制劑(諸如，波圖單抗)治療之病患)，或是相對於並未顯示具有HER活化情形之病患，及/或相對於經由已獲核准之抗腫瘤劑(諸如，拓撲替康(topotecan)或阿黴素脂質體(liposomal doxorubicin)，其中該癌症係卵巢癌)治療之病患，增加其整體或無疾病蔓延之存活。
"容觀腫瘤反應"係指可測量之反應，包括完全反應(CR)或部分反應(PR)。
"完全反應"或"CR"係指癌症之所有徵兆反應治療而消失。此並不一定意謂該癌症已被治癒。
"部分反應"或"PR"係指一或多個腫瘤或病灶之大小或是體內之癌症程度反應治療而減少。
"HER受體"係一種受體蛋白酪胺酸激酶，其屬於HER受體家族，且其包括EGFR、HER2、HER3、及HER4受體。HER受體一般而言包含一胞外域，其可結合HER配位體及/或與其他HER受體分子二聚化；一親脂穿膜域；一保守性胞內蛋白酪胺酸激酶域；及一羧端信號傳導域，其具有數個可經磷酸化之酪胺酸殘基。HER受體可為"天然序列"HER受體或其"胺基酸序列變體"。較佳者，該HER受體係天然序列人類HER受體。
辭彙"ErbB1"、"HER1"、"表皮生長因子受體"、及"EGFR"在本文中係可互相交換使用者，且其係指揭示於，例如，Carpenter et al.Ann.Rev.Biochem.56：881－914(1987)中之EGFR，包括其天然存在之突變形式(例如，於Humphrey et al.PNAS(USA)87：4207－4211(1990)中之缺失突變EGFR)。erbB1係指編碼該EGFR蛋白產物之基因。
辭彙"ErbB2"及"HER2"在本文中係可互相交換使用者，且其係指述於，例如，Semba et al.,PNAS(USA)82：6497－6501(1985)及Yamamoto et al.Nature 319：230－234(1986)(Genebank登錄號X03363)中之人類HER2蛋白。辭彙"erbB2"係指編碼人類ErbB2蛋白之基因且"neu"係指編碼大鼠p185n e u 之基因。較佳之HER2係天然序列人類HER2。
在本文中，"HER2胞外域"或"HER2 ECD"係指位於細胞外之一HER2蛋白域，其可係錨接於細胞膜上，或係存在於循環中，包括其片段。在一具體實例中，HER2胞外域可包含四個蛋白域："蛋白域I"(自約1－195之胺基酸殘基；序列編號NO：19)、"蛋白域II"(自約196－319之胺基酸殘基；序列編號NO：20)、"蛋白域III"(自約320－488之胺基酸殘基；序列編號NO：21)、及"蛋白域IV"(自約489－630之胺基酸殘基；序列編號NO：22)(殘基編號不含信號肽)。參見，Garrett et al.Mol.Cell..11：495－505(2003)，Cho et al.Nature 421：756－760(2003)，Franklin et al.Cancer Cell 5：317－328(2004)，及Plowman et al.Proc.Natl.Acad.Sci.90：1746－1750(1993)，以及本文之圖1。
辭彙"ErbB3"及"HER3"在本文中係指揭示於，例如，美國專利第5,183,884及5,480,968號以及Kraus et al.PNAS(USA)86：9193－9197(1989)中之受體多肽。
辭彙"ErbB4"及"HER4"在本文中係指揭示於，例如，歐洲專利申請案第599,274號；Plowman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：1746－1750(1993)；及Plowman et al.,Nature,366：473－475(1993)中之受體多肽，包括其同種型，例如，揭示於WO99/19488(1999年4月22日公開)中者。
"HER配位體"意謂可結合及/或活化HER受體之多肽。本文中所特別關注之HER配位體係天然序列人類HER配位體，諸如，表皮生長因子(EGF)(Savage et al.,J.Biol.Chem.247：7612－7621(1972))；轉化生長因子α(TGF－α)(Marquardt et al.,Science 223：1079－1082(1984))；雙調蛋白(亦稱為神經鞘瘤或角質細胞自分泌生長因子)(Shoyab et al.Science 243：1074－1076(1989)；Kimura et al.Nature 348：257－260(1990)；及Cook et al.Mol.Cell.Biol.11：2547－2557(1991))；β細胞素(Shing et al.,Science 259：1604－1607(1993)；及Sasada et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.190：1173(1993))；肝素結合性表皮生長因子(HB－EGF)(Higashiyama et al.,Science 251：936－939(1991))；表皮調節素(Toyoda et al.,J.Biol.Chem.270：7495－7500(1995)；及Komurasaki et al.Oncogene 15：2841－2848(1997))；賀熱固林(heregulin)(參見下文)；神經調節素－2(NRG－2)(Carraway et al.,Nature 387：512－516(1997))；神經調節素－3(NRG－3)(Zhang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.94：9562－9567(1997))；神經調節素－4(NRG－4)(Harari et al.Oncogene 18：2681－89(1999))；及cripto(CR－1)(Kannan et al.J.Biol.Chem.272(6)：3330－3335(1997))。可結合EGFR之HER配位體包括EGF、TGF－α、雙調蛋白、β細胞素、HB－EGF、及表皮調節素。可結合HER3之HER配位體包括賀熱固林。可結合HER4之HER配位體包括β細胞素、表皮調節素、HB－EGF、NRG－2、NRG－3、NRG－4、及賀熱固林。
在本文中，"賀熱固林(heregulin)"(HRG)係指由賀熱固林基因產物編碼之多肽，如美國專利第5,641,869號或Marchionni et al.,Nature,362：312－318(1993)中所揭示者。賀熱固林(heregulin)之實例包括賀熱固林－α、賀熱固林－β1、賀熱固林－β2、及賀熱固林－β3(Holmes et al.,Science,256：1205－1210(1992)；及美國專利第5,641,869號)；neu分化因子(NDF)(Peles et al.Cell 69：205－216(1992)；乙醯膽鹼受體誘發活性(ARIA)(Falls et al.Cell 72：801－815(1993))；膠質生長因子(GGFs)(Marchionni et al.,Nature,362：312－318(1993))；感覺及運動神經元衍生性因子(SMDF)(Ho et al.J.Biol.Chem.270：14523－14532(1995))；γ－賀熱固林(Schaefer et al.Oncogene 15：1385－1394(1997))。
在本文中，"HER二聚物"係一非共價連結之二聚物，其包含至少兩個HER受體。此種複合物可在表現兩種或以上HER受體之細胞接觸HER配位體時形成，且其可由，例如，免疫沉澱法分離，並由SDS－PAGE進行分析，如Sliwkowski et al.,J.Biol.Chem.,269(20)：14661－14665(1994)中所述。該二聚物亦可連結其他蛋白，諸如，細胞因子受體次單元(如，gp130)。較佳者，該HER受體包含HER2。
在本文中，"HER異源二聚物"係一非共價連結之異源二聚物，其包含至少兩個不同之HER受體，諸如，EGFR－HER2、HER2－HER3、或HER2－HER4異源二聚物。
"HER抑制劑"係可干擾HER之活化或作用之試劑。HER抑制劑之實例包括HER抗體(如，EGFR、HER2、HER3、或HER4抗體)；EGFR導向性藥物；小分子HER拮抗劑；HER酪胺酸激酶抑制劑；HER2及EGFR雙酪胺酸激酶抑制劑，諸如，拉帕替尼(lapatinib)/GW572016；反義分子(參見，例如，WO2004/87207)；及/或可結合下游信號傳導分子(諸如，MAPK或Akt)或是可干擾其功能之試劑(參見圖5)。較佳者，該HER抑制劑係可結合HER受體之抗體或小分子。
"HER二聚化抑制劑"係可抑制HER二聚物或HER異源二聚物形成之試劑。較佳者，該HER二聚化抑制劑係一抗體，例如，可在其異源二聚結合位點結合HER2之抗體。最佳之HER二聚化抑制劑係波圖單抗(pertuzumab)或MAb 2C4。2C4與HER2異源二聚結合位點之結合示於圖4。其他HER二聚化抑制劑之實例包括可結合EGFR並抑制其與一或多種其他HER受體之二聚化之抗體(例如，EGFR單株抗體806，MAb 806，其可結合活化或"非栓式(untethered)"之EGFR；參見Johns et al.,J.Biol.Chem.279(29)：30375－30384(2004))；可結合HER3並抑制其與一或多種其他HER受體之二聚化之抗體；可結合HER4並抑制其與一或多種其他HER受體之二聚化之抗體；肽二聚化抑制劑(美國專利第6,417,168號)；反義二聚化抑制劑等。
"HER2二聚化抑制劑"係可抑制其中包含HER2之二聚物或HER異源二聚物形成之試劑。
"HER抗體"係可結合HER受體之抗體。選擇性者，該HER抗體可進一步干擾HER之活化或作用。較佳者，該HER抗體可結合HER2受體。本文中所特別關注之HER2抗體係波圖單抗(pertuzumab)。另一HER2抗體之實例係曲妥珠單抗(trastuzumab)。EGFR抗體之實例包括西妥昔單抗(cetuximab)及ABX0303。
"HER活化"係指一或多種HER受體中之任一者之活化或磷酸化。一般而言，HER活化可造成信號傳導(如，由HER受體或受質多肽中之HER受體磷酸化性酪胺酸殘基胞內激酶域所造成者)。HER活化可係由HER配位體與包含目標HER受體之HER二聚物之結合中介。HER配位體與HER二聚物之結合可活化該受體中一或多個HER受體之激酶域，並因而造成一或多個HER受體中酪胺酸殘基之磷酸化及/或其他受質多肽(諸如，Akt或MAPK胞內激酶)中酪胺酸殘基之磷酸化，參見，例如，圖5。
"磷酸化"係指在一蛋白，諸如，HER受體，或其受質上添加一或多個磷酸基。
可"抑制HER二聚化"之抗體係可抑制或干擾HER二聚物形成之抗體。較佳者，此種抗體係在其異源二聚結合位點結合HER2。本文中之最佳二聚化抑制性抗體係(pertuzumab)或MAb 2C4。2C4與HER2異源二聚結合位點之結合示於圖4。其他可抑制HER二聚化之抗體實例包括可結合EGFR並抑制其與一或多種其他HER受體之二聚化之抗體(例如，EGFR單株抗體806，MAb 806，其可結合活化或"非栓式(untethered)"之EGFR；參見Johns et al.,J.Biol.Chem.279(29)：30375－30384(2004))；可結合HER3並抑制其與一或多種其他HER受體之二聚化之抗體；以及可結合HER4並抑制其與一或多種其他HER受體之二聚化之抗體。
可"較曲妥珠單抗(trastuzumab)更為有效地阻斷HER受體之配位體活化"之抗體係可較曲妥珠單抗更為有效地(例如，至少約2倍有效)減少或消除HER受體或HER二聚物之HER配位體活化。較佳者，此種抗體可以至少約與鼠類單株抗體2C4或其Fab片段同樣有效之程度，或是與波圖單抗(pertuzumab)或其Fab片段同樣有效之程度，阻斷HER受體之HER配位體活化。咸可藉由直接研究HER二聚物，或是藉由評估由HER之二聚化所造之HER活化或是下游信號傳導，及/或藉由評估抗體－HER2結合位點等，評估抗體阻斷HER受體配位體活化之能力。用以篩選可較曲妥珠單抗更為有效地抑制HER受體配位體活化之抗體之分析述於Agus et al.Cancer Cell 2：127－137(2002)及WO01/00245(Adams et al.)。舉例而言，可分析：HER二聚物形成之抑制(參見，如，Agus et al.Cancer Cell 2：127－137(2002)之圖1A－B；及WO01/00245)；表現HER二聚物之細胞之HER配位體活化之減少(例如，WO01/00245及Agus et al.Cancer Cell 2：127－137(2002)之圖2A－B)；HER配位體與表現HER二聚物之細胞結合之阻斷(例如，WO01/00245及Agus et al.Cancer Cell 2：127－137(2002)之圖2E)；表現HER二聚物之癌細胞(如，MCF7、MDA－MD－134、ZR－75－1、MD－MB－175、T－47D細胞)在有(或無)HER配位體之情形下之細胞生長抑制(例如，WO01/00245及Agus et al.Cancer Cell 2：127－137(2002)之圖3A－D)；下游信號傳導之抑制(例如，HRG－依賴性AKT磷酸化作用之抑制或是HRG－或TGFα－依賴性MAPK磷酸化作用之抑制)(參見，例如，WO01/00245及Agus et al.Cancer Cell 2：127－137(2002)之圖2C－D)。亦可藉由研究抗體－HER2結合位點(例如，藉由評估連結HER2之抗體之結構模型諸如，晶體結構)，而評估該抗體是否可抑制HER二聚化作用(參見，例如，Franklin et al.Cancer Cell 5：317－328(2004))。
HER2上之"異源二聚結合位點"係指HER2胞外域中之一區域，其係在與EGFR、HER3、或HER4形成二聚物時，接觸EGFR、HER3、或HER4胞外域中之一區域或與其界面交接者。發現該區域係在HER2之蛋白域II中。Franklin et al.Cancer Cell 5：317－328(2004)。
HER2抗體可以較曲妥珠單抗更為有效(例如，至少約2倍有效)的程度，"抑制HRG－依賴性AKT磷酸化作用"及/或抑制"HRG－或TGFα－依賴性MAPK磷酸化作用"(參見，例如，Agus et al.Cancer Cell 2：127－137(2002)及WO01/00245)。
HER2抗體可為類似波圖單抗之"不抑制HER2胞外結構切割"者(Molina et al.Cancer Res.61：4744－4749(2001))。相反的，曲妥珠單抗可抑制HER2胞外結構切割。
可與HER2之"異源二聚結合位點結合"之HER2抗體可結合蛋白域II中之殘基(且其選擇性亦可結合HER2胞外域之其他蛋白域中之殘基，諸如，蛋白域I及III)，且其可(至少部分程度)立體位阻HER2－EGFR、HER2－HER3、或HER2－HER4異源二聚物之形成。Franklin et al.Cancer Cell 5：317－328(2004)定性HER2－波圖單抗之晶體結構(寄存於RCSB蛋白資料庫(RCSB Protein Data Bank)，ID碼IS78)，說明可結合HER2異源二聚結合位點之一抗體實例。
可與HER2之"蛋白域II結合"之抗體可結合蛋白域II中之殘基，且其選擇性可結合HER2其他蛋白域中之殘基，諸如，蛋白域I及III。較佳者，該可結合蛋白域II之抗體可結合HER2之蛋白域I、II、及III間之接界。
蛋白"表現"係指將編碼於基因中之資訊轉化成為信使RNA(mRNA)，接著再轉化成為蛋白。
在本文中，"表現"目標蛋白(諸如，HER受體或HER配位體)之樣本或細胞係其中編碼該蛋白之mRNA，或是該蛋白，包括其片段，經判定存在於該樣本或細胞中者。
在本文中，"聚合酶連鎖反應"或"PCR"之技術一般而言係指其中將微量之特定核酸、RNA、及/或DNA片段，如美國專利第4,683,195號(1987年7月28日核發)所述者進行擴增之流程。一般而言，必須要可取得目標區域終端或其外之序列資訊，以設計寡核苷酸引子；此等引子可具有與欲擴增樣板之相對股相同或相似之序列。該兩引子之5'端核苷酸可與該擴增材料之末端相符。PCR可用於擴增特定之RNA序列，自總體基因組DNA中擴增特定之DNA序列，以及擴增自總體細胞RNA轉錄之cDNA、噬菌體、或質體序列等。一般可參見Mullis et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.,51：263(1987)；Erlich,ed.,PCR Technology,(Stockton Press,NY,1989)。在本文中，PCR係被視為用以擴增核酸試驗樣本之核酸聚合酶反應方法之實例之一，但並非唯一實例，其包含使用已知之核酸(DNA或RNA)作為引子，並使用核酸聚合酶，以擴增或產生特定核酸片段，或是擴增或產生與特定核酸互補之特定核酸片段。
"定量性實時聚合酶連鎖反應"或"qRT－PCR"係指一種形式之PCR，其中在一PCR反應之各個步驟皆對該PCR產物之量進行測量。此種技術已被述於各種不同之出版品中，包括Cronin et al.,Am.J.Pathol.164(1)：35－42(2004)；及Ma et al.,Cancer Cell 5：607－616(2004)。
辭彙"微陣列"係指可雜交陣列元件(較佳者係核苷酸探針)在一基質上之有序排列。
辭彙"聚核苷酸"，在以單數或多數形式使用時，一般而言係指任何聚核糖核苷酸或聚去氧核糖核苷酸，其可為未經修飾之RNA或DNA或是經修飾之RNA或DNA。因此，舉例而言，本文中所定義之聚核苷酸包括，但不限於單或雙股之DNA、包括單及雙股區域之DNA、單或雙股之RNA、包括單及雙股區域之RNA、包含DNA及RNA之雜交分子，其可為單股者，或是更典型者為雙股或是包括單及雙股區域者。此外，在本文中，辭彙"聚核苷酸"係指包含RNA或DNA或是RNA及DNA兩者之三股區域。此等區域中之各股可係來自相同分子或是不同分此。該等區域可包括一或多個該等分子之全部，但更典型者僅涉及部分該等分子之某一區域。具有三螺旋區域之分子之一通常係寡核苷酸。辭彙"聚核苷酸"特定言之包括cDNAs。該辭彙包括含有一或多個經修飾鹼基之DNAs(包括cDNAs)及RNAs。因此，具有因安定性或因其他原因而修飾之骨架之DNAs或RNAs亦係本文所意指之"聚核苷酸"。同時，包含非慣常性鹼基(諸如，肌苷)或經修飾鹼基(諸如，氚化鹼基)之DNAs或RNAs亦包括於本文所定義之辭彙"聚核苷酸"中。一般而言，辭彙"聚核苷酸"涵括未經修飾聚核苷酸之所有化學、酶、及/或代謝修飾形式，以及病毒及細胞(包括簡單及複雜細胞)之特徵性DNA及RNA化學形式。
辭彙"寡核苷酸"係指相對較短之聚核苷酸，其包括，但不限於，單股去氧核糖核苷酸、單或雙股核糖核苷酸、RNA：DNA雜交物、及雙股DNAs。寡核苷酸，諸如單股DNA探針寡核苷酸，通常係由化學方法合成，例如，使用市售可得之自動化寡核苷酸合成儀。然而，寡核苷酸可以各種其他方法製備，包括體外重組DNA中介性技術以及在細胞及生物體內之DNAs表現。
辭彙"基因擴增"係指在特定細胞或細胞系中形成基因或基因片段之多重拷貝之方法。經複製之區域(一段經擴增之DNA)通常被稱為"擴增子"。通常而言，所製備信使RNA(mRNA)之量亦會隨所表現之特定基因拷貝數而比例增加。
雜交反應之"嚴格性"係可由熟習技藝者輕易判定者，且其一般而言係取決於探針長度、清洗溫度、及鹽濃度之經驗性計算。一般而言，較常之探針需要較高之溫度始可進行適當之黏連，而較短之探針則僅需較低之溫度。雜交反應一般而言取決於經變性DNA在低於其熔點之環境中存在互補股時進行再黏連之能力。探針及可雜交序列間之目標同源性程度越高，可用之相對溫度即越高。因此，較高之相對溫度即可使該反應條件較為嚴格，而較低之溫度即較不嚴格。就其他有關雜交反應嚴格性之細節及解釋，參見Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience Publishers,(1995)。
"嚴格條件"或"高嚴格性條件"，如本文所定義，一般而言係：(1)使用低離子力及高溫度進行清洗，例如，0.015 M氯化鈉/0.0015 M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉，50℃；(2)在雜交過程中使用變性劑，諸如，甲醯胺，例如，含0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/50 mM磷酸鈉緩衝液，pH 6.5，含750 mM氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉之50%(v/v)甲醯胺，42℃；或(3)使用50%甲醯胺、5×SSC(0.75 M NaCl，0.075 M檸檬酸鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5×Denhardt氏溶液、經超音波處理之鮭魚精子DNA(50 &gr；g/ml)、0.1% SDS、及10%葡聚糖硫酸酯，42℃，並於0.2×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)、42℃下以及50%甲醯胺、55℃下進行清洗，再以含EDTA之0.1×SSC，於55℃下進行高嚴格性清洗。
"中度嚴格條件"可如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,New York：Cold Spring Harbor Press,1989所述者辨識，且其包括使用較上述者較不嚴格之清洗溶液及雜交條件(如，溫度、離子力、及% SDS)。中度嚴格條件之實例之一為在37℃下，於包含：20%甲醯胺、5×SSC(150 mM NaCl、15 mM檸檬酸三鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×Denhardt氏溶液、10%葡聚糖硫酸酯、及20 mg/ml變性剪切鮭魚精子DNA之溶液中之隔夜進行共置，再以1×SSC，於約37－50℃下清洗濾器。熟習技藝者可辨知如何隨需要調整溫度、離子力等，以適應諸如探針長度等之因子。
"天然序列"多肽係具有與衍生自自然之多肽(如，HER受體或HER配位體)相同之胺基酸序列者，包括天然存在者或等位基因變體。此等天然序列多肽可由自然分離或可由重組或合成方法製備。因此，天然序列多肽可具有天然存在之人類多肽、鼠類多肽、或是取自其他哺乳動物生物種之多肽之胺基酸序列。
在本文中，辭彙"抗體"係以其最廣定義使用，且其特定言之涵括單株抗體、多株抗體、多專一性抗體(如，雙專一性抗體)、以及抗體片段，只要其具有目標生物活性即可。
在本文中，辭彙"單株抗體"係指取自一群實質勻質抗體之抗體，亦即，該族群中所包含個別抗體皆係相同及/或可結合相同抗原表位者，除外可在該單株抗體生成之過程中產生之可能變體，此等抗體一般而言係以微量存在。此種單株抗體一般而言包括一抗體，其包含可結合一目標之多肽序列，其中該目標結合性多肽序列係由包括自多種多肽序列中選擇單一目標結合性多肽序列之方法取得。舉例而言，該選擇流程可為自多種純系中(諸如，雜交瘤純系、噬菌體純系、或重組DNA純系之集合)選擇一獨特純系。應可明瞭，經選擇之目標結合性序列可經進一步之變更，例如，以改良對於該目標之親和性、人類化該目標結合序列、改良其在細胞培養物中之生成、降低其體內免疫原性、創造多專一性抗體等，且包含該經變更目標結合性序列之抗體亦係本發明之單株抗體。相對於多株抗體製備物(其一般而言包括導向對抗不同決定簇(抗原表位)之不同抗體)，一種單株抗體製備物中之各個單株抗體皆係導向對抗一抗原上之單一決定簇。除其專一性外，單株抗體製備物之優勢係其一般而言未經其他免疫球蛋白污染。修飾辭彙"單株"意指該抗體之特徵係其取自實質上勻質之抗體族群，且其並不被解釋為須要求以任何特定方法製備該抗體。舉例而言，欲根據本發明而使用之單株抗體可由各種不同之技術製備，其包括，例如，雜交瘤法(如，Kohler et al.,Nature,256：495(1975)；Harlow et al.,Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling et al.,in：Monoclonal Antibodies and T－Cell Hybridomas 563－681,(Elsevier,N.Y.,1981))，重組DNA法(參見，如，美國專利第4,816,567號)，噬菌體展示技術(參見，如，Clackson et al.,Nature,352：624－628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222：581－597(1991)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2)：299－310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5)：l073－1093(2004)；Fellouse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34)：12467－12472(2004)；及Lee et al.J.Immunol.Methods 284(1－2)：119－132(2004))，以及用於在動物體內製備人類或似人類抗體之技術，該等抗體具有部分或全部之人免疫球蛋白基因座或是編碼人類免疫球蛋白序列之基因(參見，如，WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature,362：255－258(1993)；Bruggemann et al.,Year in Immuno.,7：33(1993)；美國專利第5,545,806；5,569,825；5,591,669(全部屬於GenPharm)號；美國專利第5,545,807號；WO 1997/17852；美國專利第5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；及5,661,016號；Marks et al.,Bio/Technology,10：779－783(1992)；Lonberg et al.,Nature,368：856－859(1994)；Morrison,Nature,368：812－813(1994)；Fishwild et al.,Nature Biotechnology,14：845－851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology,14：826(1996)；及Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.,13：65－93(1995))。
本文中之單株抗體特定言之包括"鑲嵌"抗體(其中一部份之該重鏈及/或輕鏈係與衍生自特定生物種之抗體中之對應序列相同或同源，或是屬於特定之抗體種類或次類，而該(等)鏈之其餘部分係與衍生自另一生物種之抗體中之對應序列相同或同源，或是屬於另一抗體種類或次類)，以及此等抗體之片段，只要其具有目標生物活性即可(美國專利第4,816,567號；以及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851－6855(1984))。本文所關注之鑲嵌抗體包括"靈長類化"抗體(其包含衍生自非人類靈長類(如，舊大陸猴、無尾猿等)之可變域抗體結合序列以及人類恆定區域序列)以及"人類化"抗體。
非人類(如，鼠類)抗體之"人類化"形式係含有最少量之衍生自非人類免疫球蛋白序列之鑲嵌抗體。就大部分之情形而言，人類化抗體係人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中取自該受體高變區域之殘基經由具有目標專一性、親和性、及能力之取自非人類生物種(諸如，小鼠、大鼠、兔、或非人類靈長類)高變區域之殘基取代(供體抗體)。在部分情形下，該人類免疫球蛋白之框架區域(FR)殘基經由對應之非人類殘基取代。同時，人類化抗體可包含並未鑑於該受體抗體或是供體抗體中之殘基。此等修飾係用以進一步改良抗體表現。一般而言，人類化抗體會實質上包含至少一種可變域(且典型為兩種)之全部，其中所有或實質上所有之高變環皆對應於一非人類免疫球蛋白之高變環，且所有或實質上所有之FRs皆係具人類免疫球蛋白序列者。人類化抗體選擇性亦會包含至少一部分之免疫球蛋白恆定區(Fc)，一般而言係人類免疫球蛋白者。就其進一步之細節，參見Jones et al.,Nature 321：522－525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332：323－329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593－596(1992)。
人類化HER2抗體包括huMAb4D5－1、huMAb4D5－2、huMAb4D5－3、huMAb4D5－4、huMAb4D5－5、huMAb4D5－6、huMAb4D5－7、及huMAb4D5－8，或是曲妥珠單抗(trastuzumab)(HERCEPTIN7)，如美國專利第5,821,337號之表3中所述，其明白併入本文作為參考；人類化520C9(WO93/21319)；及人類化2C4抗體，諸如，波圖單抗(pertuzumab)，如本文所述。
就本文之目的而言，"曲妥珠單抗(trastuzumab)"、"HERCEPTIN7"、及"huMAb4D5－8"係指包含分別述於序列編號NOS：15及16之輕及重鏈胺基酸序列之抗體。
在本文中，"波圖單抗(pertuzumab)"及"OMNITARGJ"係指包含分別述於序列編號NOS：13及14之輕及重鏈胺基酸序列之抗體。
曲妥珠單抗及波圖單抗功能間之差異示於圖6。
在本文中，"完整抗體"係包含兩個抗原結合區域及Fc區域者。較佳者，該完整抗體具有功能性之Fc區域。
"抗體片段"包含一部分之完整抗體，較佳者係包含該抗原結合區域。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2 、及Fv片段；微型雙功能抗體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成之多專一性抗體。
"天然抗體"通常係約150,000 daltons之異源四聚性糖蛋白，其係由兩個相同之輕(L)鏈及兩個相同之重(H)鏈構成。各個輕鏈係藉由一個共價雙硫鍵而連結一個重鏈，而該雙硫連結之數目隨不同之免疫球蛋白同種型之重鏈而各有不同。各個重及輕鏈亦具有規律間隔排列之鏈內雙硫橋。各個重鏈在其一端具有可變域(VH )，其後接續數個恆定域。各個輕鏈在其一端具有可變域(VL )，並在其另一端具有一恆定域。輕鏈之恆定域係與重鏈之第一恆定區對排，而輕鏈之可變區則與重鏈之可變區對排。咸信特定之胺基酸殘基可在該輕鏈及重鏈可變區間形成一界面。
辭彙"可變"係指該等可變域中某些部分隨抗體之不同而有大量序列差異，且其係用於各特定抗體對其特定抗原之結合及專一性中之事實。然而，該可變性並非平均分布於該等抗體之可變域中。其係集中於輕鏈及重鏈兩者之可變域中三個稱為高變區域之區段中。可變域中較為高度保守之部分稱為框架區域(FRs)。天然重及輕鏈之可變域各包含四個FRs，其大部分係β折疊構形，由三個高變區域連結，其形成連結該β折疊結構之環，且在部分情形下形成該β折疊結構之部分。各鏈中之該等高變區域由該等FRs維持在極相近之位置，且其與來自另一鏈之該等高變區域一同貢獻形成抗體之抗原結合位點(參見，Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恆定域並不直接涉及抗體與抗原之結合，但其具有各種不同之效應子功能，諸如，使該抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
在本文中，辭彙"高變區域"係指負責抗原結合之抗體胺基酸殘基。高變區域一般而言包含取自"互補決定區域"或"CDR"之胺基酸殘基(如輕鏈可變域中之殘基24－34(L1)、50－56(L2)、及89－97(L3)，以及重鏈可變域中之31－35(Hl)、50－65(H2)、及95－102(H3)；Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))及/或取自"高變環"之諸等殘基(如輕鏈可變域中之殘基26－32(L1)、50－52(L2)、及91－96(L3)，以及重鏈可變域中之26－32(H1)、53－55(H2)、及96－101(H3)；Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196：901－917(1987))。"框架區域"或"FR"殘基係非本文所定義之高變區域之該等可變域殘基。
抗體之木瓜蛋白酶酶切消化可產生兩種相同之抗原結合片段，稱為"Fab"片段，其各具有單一之抗原結合位點，以及一殘餘之"Fc"片段，其名稱反應其可輕易結晶之能力。胃蛋白酶之處理可產生F(ab')2 片段，其具有兩個抗原結合位點，且其仍可交聯抗原。
"Fv"係最小之抗體片段，其包含完整之抗原辨識及抗原結合位點。此種區域係由緊密、非共價連結之一個重鏈可變域及一個輕鏈可變域之二聚物構成。其構形使各可變域中之三段高變區域可互相作用而在該VH －VL 二聚物之表面定義出抗原結合位點。然而，即使是單一之可變域(或是僅含有三段對於抗原具有專一性之高變區域之半個Fv)仍具有辨識及結合抗原之能力，但其親和力較該完整之結合位點為低。
Fab片段亦含有輕鏈恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。Fab＝片段與Fab片段之差異在於其在該重鏈CH1域之羧端增加了數個殘基，包括取自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。Fab'－SH係本文用以指明其中該(等)恆定域之半胱胺酸殘基帶有至少一個自由硫醇基之Fab'之符號。F(ab')2 抗體片段原始係以一對Fab'片段之形式製備，其在兩者之間具有鉸鏈半胱胺酸。亦已知其他抗體片段之化學偶合物。
取自任何脊椎動物生物種之抗體"輕鏈"可根據其恆定域之胺基酸序列而被指定為屬於兩種明確迥異之類型之一，稱為卡帊型()及朗達型(λ)。
在本文中，辭彙"Fc區域"係用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區域，包括天然序列Fc區域及變體Fc區域。儘管免疫球蛋白重鏈Fc區域之邊界可各為不同，人類IgG重鏈Fc區域一般而言係定義為自位置Cys226或自Pro230之胺基酸殘基起始而延伸至其羧端。可在抗體之製備或純化過程中，或是藉由重組工程處理編碼抗體重鏈之核酸，舉例而言，而除去Fc區域C端之離胺酸(根據EU編號系統之殘基447)。因此，完整抗體之組合物可包含其全部之K447殘基皆已移除之抗體族群、未有任何K447殘基經移除之抗體族群、以及具有含或不含K447殘基之抗體混合物之抗體族群。
除非另外指明，在本文中，免疫球蛋白重鏈中之殘基編號皆係如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中之EU索引編號，其明白併入本文作為參考。"Kabat中之EU索引編號"係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。
"功能性之Fc區域"具有天然序列Fc區域之"效應子功能"。"效應子功能"之實例包括C1q結合；補體依賴性胞毒性；Fc受體結合；抗原依賴性細胞中介性胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(如，B細胞受體；BCR)之負調節等。此等效應子功能一般而言需要使該Fc區域與一結合域(如，抗體可變域)結合，且可使用本文所揭示之各種分析進行評估，舉例而言。
"天然序列Fc區域"包含與可見於自然中之Fc區域胺基酸序列相同之胺基酸序列。天然序列人類Fc區域包括天然序列人類IgG1 Fc區域(非A及A同種異型)；天然序列人類IgG2 Fc區域；天然序列人類IgG3 Fc區域；及天然序列人類IgG4 Fc區域，以及其天然存在之變體。
"變體Fc區域"包含與天然序列Fc區域具有因至少一個胺基酸修飾(較佳者係一或多個胺基酸取代)而造成之差異之胺基酸序列。較佳者，相較於天然序列Fc區域，或是相較於母體多肽之Fc區域，該變體Fc區域具有至少一個胺基酸取代，如，在天然序列Fc區域或是在母體多肽Fc區域中具有自約一個至約十個之胺基酸取代，且較佳者係自約一個至約五個之胺基酸取代。本文中之變體Fc區域與天然序列Fc區域及/或母體多肽Fc區域較佳具有至少約80%之同源性，且最佳者係與其具有至少約90%之同源性，更佳者係與其具有至少約95%之同源性。
根據其重鏈恆定域之胺基酸序列，完整抗體可被指明為不同之"類型"。共有五大類型之完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，且其中之數者又可進一步劃分為"次類型"(同種型)，如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、及IgA2。對應於不同抗體類型之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ、及μ。不同類型免疫球蛋白之次單元結構及三維構形皆已為熟知。
"抗體依賴性細胞中介性胞毒性"及"ADCC"係指一種細胞中介性反應，其中表現Fc受體(FcRs)之非專一性胞毒性細胞(如，天然滅殺(NK)細胞、嗜中性白細胞、及巨噬細胞)可辨識目標細胞上所連結之抗體，並因而造成目標細胞之裂解。中介ADCC之主要細胞，NK細胞，僅表現FcγRIII，而單核細胞則表現FcγRI、FcγRII、及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現摘述於Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457－92(1991)第464頁之表3。為評估目標分子之ADCC活性，可進行一體外ADCC分析，諸如述於美國專利第5,500,362或5,821,337號中者。可用於此等分析中之效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及天然滅殺(NK)細胞。或者，或此外，目標分子之ADCC活性可在體內進行評估，如，在動物模型中，諸如述於Clynes et al.PNAS(USA)95：652－656(1998)中者。
"人類效應細胞"係白細胞，其表現一或多種FcRs，且可展現效應子功能。較佳者，該等細胞至少表現FcγRIII，且可展現ADCC效應子功能。可中介ADCC之人類白細胞實例包括外周血單核細胞(PBMC)、天然滅殺(NK)細胞、單核細胞、胞毒性T細胞、及嗜中性細胞；其中PBMCs及NK細胞係較佳者。效應細胞可自其天然來源分離，如，自血液或PBMCs中，如本文所述。
辭彙"Fc受體"或"FcR"係用以敘述可結合抗體Fc區域之受體。較佳之FcR係天然序列人類FcR。同時，較佳之FcR係可結合IgG抗體者(γ受體)，且其包括FcγRI、FcγRII、及Fcγ RIII次類型之受體，包括此等受體之等位基因變體，及其他剪切形式。FcγRII受體包括FcγRIIA("活化性受體")及FcγRIIB("抑制性受體")，其具有類似之胺基酸序列，兩者之差異主要在於其胞質域。活化性受體FcγRIIA在其胞質域含有免疫受體酪胺酸基礎性活化基序(ITAM)。抑制性受體FcγRIIB在其胞質域含有免疫受體酪胺酸基礎性抑制基序(ITIM)(參見回顧評論M.in Daron,Annu.Rev.Immunol.15：203－234(1997))。FcRs之回顧評論見於Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457－92(1991)；Capel et al.,Immunomethods 4：25－34(1994)：及de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126：330－41(1995)。其他FcRs，包括可能於未來獲得辨識者，皆涵括無本文之辭彙"FcR"。該辭彙亦包括新生兒受體FcRn，其係負責將母體之IgGs轉移至胎兒(Guyer et al.,J.Immunol.117：587(1976)and Kim et al.,J.Immunol.24：249(1994))，並可調控免疫球蛋白之體內穩態。
"補體依賴性胞毒性"或"CDC"係指一分子在補體存在之情形下裂解目標之能力。補體活化途徑係由補體系統之第一組成分(C1q)與複合關聯抗原之分子(如，抗體)結合而起始。為評估補體活化作用，可進行一CDC分析，例如，如述於Gazzano－Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202：163(1996)中者。
"單鍵Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體之VH 及VL 域，其中此等蛋白域係以單一多肽鏈之形式存在。較佳者，該Fv多肽於該VH 及VL 域間尚包含一多肽連接子，其可使該scFv形成目標結構以進行抗原結合。有關scFv之回顧評論，參見Plckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer－Verlag,New York,pp.269－315(1994)。HER2抗體之scFv片段述於WO93/16185；美國專利第5,571,894號；以及美國專利第5,587,458號。
辭彙"微型雙功能抗體(diabody)"係指具有兩個抗原結合位點之小型抗體片段，該片段包含在相同多肽鏈中連結一可變輕鏈域(VL )之可變重鏈域(VH )(VH －VL )。藉由使用一過短而無法容許相同鏈中之兩蛋白域進行配對之連接子，該等蛋白域被迫與另一鏈之互補蛋白域進行配對，並產生兩個抗原結合位點。微型雙功能抗體更完整述於，例如，EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444－6448(1993)。
"裸抗體"係未綴合異源分子(諸如，胞毒性部分或放射標記)之抗體。
"分離"之抗體係已經辨識並自其天然環境之一種組成份中分離及/或回收者。其天然環境之污染組成份係可干擾該抗體之診斷或治療用途之物質，且其可包括酶、激素、及其他蛋白或非蛋白性溶質。在較佳之具體實例中，抗體將被純化至(1)由Lowry法判定高於以重量計95%之抗體，且最佳者係高於以重量計99%；(2)足以使用轉杯式定序儀取得至少15個殘基之N端或內部胺基酸序列之程度；或(3)使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳者使用銀染，在還原或非還原性條件下，以SDS－PAGE測得為勻質。分離之抗體包括重組細胞中之原位抗體，因其中將不會存在該抗體天然環境中之至少一種組成份。然而，一般而言，分離之抗體將會由至少一種純化步驟製備。
"親和力熟化"之抗體係在其一或多個高變區域中具有一或多個變更者，相較於並不具有此等變更之母抗體，此等變更可造成該抗體對抗原親和力之改良。較佳之親和力熟化抗體對於目標抗原將具有納莫耳濃度(nanomolar)甚至是皮莫耳濃度(picomolar)之親和力。親和力熟化抗體係以技藝中所熟知之流程製備。Marks et al.Bio/Technology 10：779－783(1992)述及由VH及VL域之改組而進行之親和力熟化作用。CDR及/或框架殘基之隨機誘變述於：Barbas et al.Proc Nat.Acad.Sci,USA 91：3809－3813(1994)；Schier et al.Gene 169：147－155(1995)；Yelton et al.J.Immunol.155：1994－2004(1995)：Jackson et al.,J.Immunol.154(7)：3310－9(1995)；及Hawkins et al,J.Mol.Biol.226：889－896(1992)。
在本文中，辭彙"主要種類抗體"係指在一組合物中為該組合物中量性優勢抗體分子之抗體結構。在一具體實例中，該主要種類抗體係一種HER2抗體，諸如，可結合HER2蛋白域II之抗體、可較曲妥珠單抗(trastuzumab)更為有效地抑制HER二聚化作用之抗體、及/或可結合HER2之異源二聚結合位點之抗體。在本文中，主要種類抗體之較佳具體實例係包含序列編號Nos.3及4中之可變輕鏈及可變重鏈胺基酸序列者，且最佳者係包含序列編號Nos.13及14中之輕鏈及重鏈胺基酸序列者(波圖單抗(pertuzumab))。
在本文中，"胺基酸序列變體"抗體係具有不同於主要種類抗體之胺基酸序列之抗體。一般而言，胺基酸序列變體將具有與該主要種類抗體至少約70%之同源性，且較佳者，其將係與該主要種類抗體至少約80%同源者，更加者係至少約90%同源者。該等胺基酸序列變體在該主要種類抗體之胺基酸序列中或其毗鄰處，於部分位置具有取代、缺失、及/或添加。本文中胺基酸序列變體之實例包括酸性變體(如，去醯胺化抗體變體)、鹼性變體、在其輕鏈之一或二者上具胺端前導序列延伸(如，VHS－)之抗體、在其重鏈之一或二者上具C端離胺酸殘基之抗體等，且其包括重鏈及/或輕鏈胺基酸序列變化之組合。本文所特別關注之抗體變體係在其輕鏈之一或二者上具胺端前導序列延伸之抗體，其選擇性尚包含相對於該主要種類抗之其他胺基酸序列及/或糖基化之差異。
在本文中，"糖基化變體"抗體係其上連結一或多個糖類分子部分之抗體，該等部分不同於連結在主要種類抗體上之一或多個糖類分子部份。本文糖基化變體之實例包括其Fc區域上連結G1或G2寡糖結構(取代G0寡糖結構)之抗體、其一或二條輕鏈上連結一或二個糖類分子部分之抗體、該抗體之一或兩條重鏈上未連結糖類之抗體等，以及糖基化變化之組合。
在該抗體具有Fc區域時，在該抗體之一或兩條重鏈上可能連結一寡糖結構，如，於殘基299(298，Eu殘基編號)上。就波圖單抗(pertuzumab)而言，G0係主要之寡糖結構，而其他之寡糖結構，諸如，G0－F、G－1、Man5、Man6、G1－1、G1(1－6)、G1(1－3)、及G2，則以較少之量見於波圖單抗組合物中。
除非另外指明，在本文中，"G1寡糖結構"包括G－1、G1－1、G1(1－6)、及G1(1－3)結構。
在本文中，"胺端前導序列延伸"係指胺端前導序列之一或多個胺基酸殘基，其存在於一抗體之任何一或多條重鏈或輕鏈之胺端。一種例示性之胺端前導序列延伸包含三個胺基酸殘基，VHS，或係由其構成，其存在於一抗體變體之一或兩條輕鏈上。
"去醯胺化"抗體係其中其一或多個天冬醯胺殘基已為衍化者，例如，成為天冬胺酸、琥珀醯亞胺、或異天冬胺酸。
辭彙"癌"及"癌性"係指稱或敘述哺乳動物體內典型特徵為不受控之細胞生長之生理狀態。癌之實例包括，但不限於，癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤(包括髓母細胞瘤及視網膜母細胞瘤)、肉瘤(包括脂肉瘤及滑液細胞肉瘤)、神經內分泌腫瘤(包括類癌、胃泌素瘤、及胰島細胞瘤)、間皮瘤、神經鞘瘤(包括聽神經瘤)、腦膜瘤、腺癌、黑素瘤、及白血病或淋巴癌。此等癌之更特定實例包括鱗狀細胞癌(如，上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺之腺癌、及肺之鱗狀細胞癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰臟癌、神經母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌(包括轉移性乳癌)、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、睪丸癌、食道癌、膽道腫瘤、以及頭及頸癌。
"末期"癌症係已擴散至該起源位點或器官之外者，可能係由局部侵犯或轉移造成。
"頑固性"癌症係即使在對該癌症病患投藥抗腫瘤劑(諸如，化療劑)之情形下仍持續蔓延者。頑固性癌症之實例之一係鉑頑固性癌。
"復發"癌症係在對起始治療產生反應之後於該初始位置或是一遠距位置再次生長者。
在本文中，"病患"係人類病患。該病患可為"癌症病患"，亦即，罹患一或多種癌症症狀或有其罹患風險者。
在本文中，"腫瘤樣本"係衍生自病患腫瘤之樣本或是包含衍生自病患腫瘤之腫瘤細胞者。本文中腫瘤樣本之實例包括，但不限於，腫瘤生檢、循環腫瘤細胞、循環血漿蛋白、腹水、衍生自腫瘤或是具有似腫瘤特徵之原代細胞培養物或細胞系，以及保存之腫瘤樣本，諸如，福馬林固定化、石蠟包埋性腫瘤樣本、或冷凍腫瘤樣本。
"固定性"腫瘤樣本係已使用固定劑而進行組織保存者。
"福馬林固定性"腫瘤樣本係已使用甲醛作為固定劑而保存者。
"包理性"腫瘤樣本係由堅固且一般而言為堅硬之基質包圍者，諸如，石蠟、蠟、賽璐啶(celloidin)、或樹脂。包埋可容許進行薄切片，以進行顯微鏡檢驗或製備組織微陣列(TMAs)。
"石蠟包理性"腫瘤樣本係由衍生自石油之固體烴純化混合物圍繞者。
在本文中，"冷凍"腫瘤樣本係指冷凍狀態或已為冷凍之腫瘤樣本。
"顯示HER表現、擴增、或活化"之癌症或生物樣本係在一診斷性試驗中表現(包括過表現)HER受體，具有擴增之HER基因，及/或以其他方式顯示HER受體活化或磷酸化者。
"顯示HER活化"之癌症或生物樣本係在一診斷性試驗中顯示HER受體活化或磷酸化者。此種活化情形可直接(如，藉著以ELISA測量HER之磷酸化)或間接(如，藉由基因表現內容分析或是藉由偵測HER異源二聚物，如本文所述)進行測定。
在本文中，"基因表現內容分析"係指一或多種基因之表現評估，其可作為直接測定HER磷酸化之替代法。
在本文中，"磷酸－ELISA分析"係一種分析，其中，其在一酶連性免疫吸收分析(ELISA)中，使用一反應劑，通常係一抗體，偵測磷酸化HER受體、受質、或下游信號傳導分子，以評估一或多種HER受體之磷酸化作用，特別係HER2。較佳者，其係使用可偵測磷酸化HER2之抗體。該分析可對細胞裂解物進行，較佳者係取自新鮮或冷凍之生物樣本者。
具有"HER受體過表現或擴增"之癌細胞係相較於相同組織類型之非癌性細胞而具有顯著較高量之HER受體蛋白或基因者。此種過表現可係由基因擴增或是係由增加之轉錄或轉譯造成。可在診斷或是預後分析中，藉由評估存在於細胞表面之增量HER蛋白(如，經由免疫組織化學分析；IHC)，因而判定HER受體之過表現或擴增。或者，或此外，亦可測量細胞中HER編碼性核酸之含量，如，經由螢光原位雜交(FISH；參見WO98/45479，1998年10月分開)、南方印跡、或是聚合酶連鎖反應(PCR)技術(諸如，定量性實時PCR(qRT－PCR))。亦可藉由測量生物液體(諸如，血清)中之剝落抗原(如，HER胞外域)而研究HER受體之過表現或擴增(參見，如，美國專利第4,933,294號，1990年6月12日核發；WO91/05264，1991年4月18日公開；美國專利第5,401,638號，1995年3月28日核發；及Sias et al.J.Immunol.Methods 132：73－80(1990))。除上述之分析外，亦有各種不同之體內分析可供熟習技藝者使用。舉例而言，其可使病患體內之細胞接觸抗體，該抗體選擇性經可偵測性之標記(如，放射同位素)標記，再可評估該抗體與病患體內細胞之結合，如，藉由放射活性之外部掃描，或是藉由分析取自先前已接觸該抗體之病患之生檢。
相反的，"未過表現或擴增HER受體"之癌症則係相較於相同組織類型之非癌性細胞而不具有高於正常量之HER受體蛋白或基因者。可抑制HER二聚化作用之抗體，諸如，波圖單抗(pertuzumab)，可用於治療並未過表現或擴增HER2受體之癌症。
在本文中，"抗腫瘤劑"係指用於治療癌症之藥物。本文抗腫瘤劑之非限制性實例包括化療劑、HER二聚化抑制劑、HER抗體、導向對抗腫瘤相關性抗原之抗體、抗激素化合物、細胞因子、EGFR－導向性藥物、抗血管新生劑、酪胺酸激酶抑制劑、生長抑制劑及抗體、細胞毒性劑、可誘發脫噬作用之抗體、COX抑制劑、法尼基轉移酶抑制劑、可結合癌胚蛋白CA 125之抗體、HER2疫苗、Raf或ras抑制劑、阿黴素脂質體(liposomal doxorubicin)、拓撲替康(topotecan)、紫杉醇、雙重酪胺酸激酶抑制劑、TLK286、EMD－7200、波圖單抗(pertuzumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、埃羅替尼(erlotinib)、及貝伐單抗(bevacizumab)。
"已獲核准之抗腫瘤劑"係已由規範機關，諸如，美國食品及藥物管理局(Food and Drug Administration(FDA))或其國外之對應機關同意取得上市許可之用於治療癌症之藥物。
當HER二聚化抑制劑係以"單一抗腫瘤劑"之形式投藥時，其係唯一投藥用以治療該癌症之抗腫瘤劑，亦即，其並未與另一抗腫瘤劑(諸如，化療)結合投藥。
在本文中，"標準照護"係指該或該等抗腫瘤劑係慣常使用以治療特定形式之癌症者。舉例而言，就鉑抗性卵巢癌而言，其標準照護係拓撲替康(topotecan)或阿黴素脂質體(liposomal doxorubicin)。
在本文中，"生長抑制劑"係指可在體外或體內抑制細胞生長之化合物或組合物，特別係HER表現性癌細胞。因此，該生長抑制劑可為能夠顯著減少S相中HER表現性細胞之百分比者。生長抑制劑之實例包括可阻斷細胞循環進展(於一非S相之位置)之試劑，諸如，可誘發G1停滯及M相停滯之試劑。典型之M相阻斷劑包括長春花生物鹼類(長春新鹼及長春花鹼)、紫杉醇類、及拓撲異構酶II抑制劑(諸如，阿黴素(doxorubicin)、表阿黴素(epirubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)、及博來黴素(bleomycin)。可停滯G1之諸等試劑亦可造成S相停滯，例如，DNA烷化劑，諸如，他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達卡巴嗪(dacarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、順鉑(cisplatin)、氨甲喋呤、5－氟尿嘧啶、及ara－C。其他資料可見於The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn and Israel,eds.,Chapter 1,entitled"Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs"by Murakami et al.(WB Saunders：Philadelphia,1995)，特別係第13頁。
"生長抑制性"抗體之實例係可結合HER2並抑制過表現HER2之癌細胞生長者。較佳之生長抑制性HER2抗體可以約0.5至30微克/毫升之抗體濃度，抑制細胞培養物中SK－BR－3乳癌腫瘤細胞之生長達超過20%，且較佳係超過50%(如，自約50%至約100%)，其中該生長抑制係在使該SK－BR－3細胞接觸該抗體六天後測定(參見，美國專利第5,677,171號，1997年10月14日核發)。該SK－BR－3細胞生長抑制分析於該專利及下文中進一步詳述。較佳之生長抑制抗體係鼠類單株抗體4D5之人類化變體，如，曲妥珠單抗(trastuzumab)。
可"誘發脫噬作用"之抗體係可誘發編程性細胞凋亡者，如由膜聯蛋白V(annexin V)之結合、DNA裂解、細胞縮小、內質網膨脹、細胞裂解、及/或膜小泡之形成(稱為脫噬體)測定。該細胞通常係過表現HER2受體者。較佳者，該細胞係腫瘤細胞，如，乳房、卵巢、胃、子宮內膜、唾腺、肺、腎、結腸、甲狀腺、胰臟、或膀胱細胞。在體外者，該細胞可為SK－BR－3、BT474、Calu 3細胞、MDA－MB－453、MDA－MB－361、或SKOV3細胞。已有各種不同之方法可用以評估與脫噬作用相關之細胞事件。舉例而言，膜聯蛋白之結合可由磷脂醯絲胺酸(PS)轉位測量；DNA之裂解可經由DNA之梯化評估；且隨DNA裂解而產生之核/染色質濃縮可由亞二倍評估。較佳者，可誘發脫噬作用之抗體係在使用BT474細胞之膜聯蛋白結合分析中(參見下文)，可造成約2至50倍相較於未經處理細胞之膜聯蛋白結合誘發情形者，較佳係約5至50倍，且最佳係約10至50倍。可誘發脫噬作用之HER2抗體實例包括7C2及7F3。
"抗原表位2C4"係HER2胞外域中之抗體2C4所結合之區域。為篩選可結合該2C4抗原表位之抗體，可進行一慣常之交叉阻斷分析，諸如述於Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中者。較佳者，該抗體可阻斷2C4與HER2之結合達約50%或以上。或者，可進行抗原表位作圖，以評估該抗體是否可結合HER2之2C4抗原表位。抗原表位2C4包含取自HER2胞外域中蛋白域II之殘基。2C4及波圖單抗(pertuzumab)可結合HER2胞外域中蛋白域I、II、及III間之接界位置。Franklin et al.Cancer Cell 5：317－328(2004)。
"抗原表位4D5"係HER2胞外域中之抗體4D5(ATCC CRL 10463)及曲妥珠單抗(trastuzumab)所結合之區域。此一抗原表位接近HER2之穿膜域，且係位於HER2之蛋白域IV中。為篩選可結合該4D5抗原表位之抗體，可進行一慣常之交叉阻斷分析，諸如，述於Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中者。或者，可進行抗原表位作圖，以評估該抗體是否可結合HER2之4D5抗原表位(如，在自約殘基529至約殘基625之區域中之任何一或多個殘基，包括HER2 ECD，殘基編號包括信號肽)。
"抗原表位7C2/7F3"係位於HER2胞外域N端、蛋白域I中，7C2及/或7F3抗體(各寄存於ATCC，參見下文)所結合之區域。為篩選可結合該7C2/7F3抗原表位之抗體，可進行一慣常之交叉阻斷分析，諸如，述於Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中者。或者，可進行抗原表位作圖，以評估該抗體是否可結合HER2之7C2/7F3抗原表位(如，在HER2ECD之自約殘基22至約殘基53之區域中之任何一或多個殘基，殘基編號包括信號肽)。
"治療"係指治療性之處理以及預防性之處理。需要治療者包括已罹患癌症者，以及欲預防癌症發生者。因此，本文中之欲治療病患可為已經診斷出罹患癌症者，或是可為有罹患癌症之傾向或容易罹患癌症者。
辭彙"有效量"係指可在病患體內有效治療癌症之藥物。藥物之有效量可減少癌細胞之數目；減少腫瘤大小；抑制(亦即，減緩至某一程度或較佳者為中止)癌細胞滲入其周圍之器官；抑制(亦即，減緩至某一程度或較佳者為中止)腫瘤轉移；抑制某一程度之腫瘤生長；及/或減輕某一程度之一或多種癌症相關性症狀。依該藥物可預防既存癌細胞生長及/或滅殺既存癌細胞之程度，其可為細胞靜止性及/或細胞毒性者。該有效量可延長無疾病蔓延之存活時間(例如，如以實體腫瘤反應評估標準(Response Evaluation Criteriafor Solid Tumors,RECIST)所測量者，或由CA－125之變化測量者)，造成客觀反應(包括部分反應(PR)或完全反應(CR))，增加整體存活時間，及/或改善一或多種癌症之症狀(例如，如以FOSI評估者)。
在本文中，辭彙"細胞毒性劑"係指可抑制或防止細胞之功能及/或造成細胞破壞之物質。該辭彙意欲包括放射性同位素(如，At2 1 1 、I1 3 1 、I1 2 5 、Y9 0 、Re1 8 6 、Re1 8 8 、Sm1 5 3 、Bi2 1 2 、P3 2 ，以及Lu之放射性同位素)、化療劑、及毒素(諸如，細菌、真菌、或動物來源之小分子毒素或酶活毒素，包括其片段及/或變體)。
"化療劑"係可用於治療癌症之化學化合物。化療劑之實例包括烷化劑，諸如，噻替派(thiotepa)及CYTOXAN7環磷醯胺；烷基磺酸酯，諸如，白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、及哌泊舒凡(piposulfan)；吖丙啶，諸如，苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、麥尤力多巴(meturedopa)、及尤力多巴(uredopa)；乙烯亞胺及甲基艾敏胺(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺、及三甲基歐洛美胺(trimethylolomelamine)；TLK 286(TELCYTAJ)；乙醯生合成物(acetogenins)(特別係布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ －9－四氫大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL7)；β －拉帕酮(lapachone)；黃鐘花醌(lapachol)；秋水仙素；白樺脂酸；喜樹鹼(包括合成性之類似物拓撲替康(topotecan)(HYCAMTIN7)、CPT－11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR7)、乙醯基喜樹鹼、斯克普利克汀(scopolectin)、及9－胺基喜樹鹼)；苔蘚蟲素(bryostatin)；凱利斯坦汀(callystatin)；CC－1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)、及比折來新(bizelesin)合成性類似物)；鬼臼毒素；足葉草酸；替尼泊苷(teniposide)；隱藻素(cryptophycins)(特別係隱藻素1及隱藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；度卡黴素(duocarmycin)(包括其合成性類似物KW－2189及CB1－TM1)；艾利絲洛濱(eleutherobin)；派克地斯坦汀(pancratistatin)；沙克地泰因(sarcodictyin)；海綿素(spongistatin)；氮芥，諸如，苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧化氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法崙(melphalan)、諾凡濱奇(noVembichin)、芬斯特靈(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝脲，諸如，卡氮芥(carmustine)、葡糖氯乙亞硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、及拉尼莫司汀(ranimnustine)；雙磷酸鹽類，諸如，氯屈膦酸二鈉(clodronate)；抗生素，諸如，烯二炔類抗生素，如，卡奇黴素(calicheamicin)，特別係卡奇黴素γ1I及卡奇黴素Ω I1(參見，如，Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33：183－186(1994))及蒽環類抗生素，諸如，蒽環黴素(annamycin)、AD 32、阿卡紅黴素(alcarubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、右雷佐生(dexrazoxane)、DX－52－1、表阿黴素(epirubicin)、GPX－100、伊達比星(idarubicin)、KRN5500、美諾立爾(menogaril)、達奈菌素(dynemicin)(包括dynemicin A)、艾斯普菌素(esperamicin)、新制癌菌素(neocarzinostatin)發色團及相關之色蛋白烯二炔類抗生素發色團、艾克雷辛諾菌素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、奧斯洛菌素(authramycin)、重氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉賓辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素D(dactinomycin)、地托比星(detorubicin)、6－二吖－5－氧代－L－正白胺酸、ADRIAMYCIN7多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉基－多柔比星、氰基嗎啉基－多柔比星、2－吡咯啉基－多柔比星、脂質體多柔比星、及去氧多柔比星)、伊索比星(esorubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(諸如，絲裂黴素C)、黴酚酸、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、匹萊黴素(peplomycin)、普托服洛菌素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、及佐柔比星(zorubicin)；葉酸類似物，諸如，丹諾呤(denopterin)、蝶羅呤(pteropterin)、及三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類四物，諸如，氟達拉濱(fludarabine)、6－巰基嘌呤、塞艾嘌呤(thiamiprine)、及硫代鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如，安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6－氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、及氟尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如，卡譜睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、及睾內酯(testolactone)；抗腎上腺素，諸如，胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、及曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如，亞葉酸(亞葉酸鈣(leucovorin))；醋葡醛內酯(aceglatone)；抗葉酸抗腫瘤新生劑，諸如，ALIMTA7、LY231514培美曲唑；二氫葉酸還原酶抑制劑，諸如，胺甲喋呤；抗代謝物，諸如，5－氟尿嘧啶(5－FU)及其前藥，諸如，UFT、S－1、及卡培他濱(capecitabine)；以及胸苷酸合成酶抑制劑及甘胺醯胺核糖核苷酸甲醯基轉移酶抑制劑，諸如，雷替曲塞(raltitrexed)(TOMUDEXR M ,TDX)；二氫嘧啶脫氫酶抑制劑，諸如，乙炔尿嘧啶(eniluracil)；醛磷醯胺糖苷；胺基酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；貝斯托普希(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾德托斯(edatraxate)；迪弗法胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗奈辛(elfornithine)；依利醋胺(elliptinium acetate)；埃坡黴素(epothilone)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣(lentinan)；洛尼戴尼(lonidainine)；美登素類(maytansinoids)，諸如，美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocins)；米托胍(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比丹莫(mopidanmol)；奈托靈(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；芬那美(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2－乙基肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK7多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐糖(sizofiran)；螺鍺；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"－三氯三乙胺；梭黴菌毒素(trichothecenes)(特別是T－2毒素、非拉可菌素A(verracurin A)、漆斑菌素A(roridin A)、及蛇形菌毒素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(ELDISINE7,FILDESIN7)；達卡巴仁(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；葛西投辛(gacytosine)；阿糖胞苷("Ara－C")；環磷醯胺；噻替派(thiotepa)；紫杉醇及紫杉烷，如，TAXOL7太平洋紫杉醇(Bristol－Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANET M 太平洋紫杉醇之無氫化蓖麻油聚氧乙烯、白蛋白工程處理之奈米顆粒調配物(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)、及TAXOTERE7多烯紫杉醇(Rhne－Poulenc Rorer,Antony,France)；克洛雷布希(chloranbucil)；吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR7)；6－硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；鉑；鉑類似物或鉑基礎性類似物，諸如，順鉑、奧沙利鉑(oxaliplatin)、及卡鉑(carboplatin)；長春花鹼(VELBAN7)；依托泊苷(etoposide)(VP－16)；異環磷醯胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(ONCOVIN7)；長春花生物鹼；去甲長春花鹼(NAVELBINE7)；諾凡特龍(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；截瘤達(xeloda)；依班膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；維生素A，諸如，微A酸；任何上述者之醫藥可接受性鹽、酸、或衍生物；以及二或多個上述者之結合，諸如，CHOP，其係環磷醯胺、多柔比星(doxorubicin)、長春新鹼、及潑尼松龍(prednisolone)之結合療法之縮寫，以及FOLFOX，其係以奧沙利鉑(oxaliplatin)(ELOXATINT M )結合5－FU及亞葉酸鈣(leucovorin)之療程之縮寫。
此定義中亦包括作用以調控或抑制激素對於腫瘤之作用之抗激素劑，諸如，抗雌激素以及雌激素受體調控劑(SERMs)，包括，例如，泰莫西芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX7泰莫西芬)、雷洛西芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4－羥基泰莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、克西服芬(keoxifene)、LY117018、奧納司酮(onapristone)、及FARESTON7托瑞米芬(toremifene)；可抑制芳環轉化酶之芳環轉化酶抑制劑，其可調控腎上腺中之雌激素生成，諸如，舉例而言，4(5)－咪唑、胺魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE7醋酸甲地孕酮、AROMASIN7依西美坦(exemestane)、弗馬斯坦尼(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR7伏氯唑(vorozole)、FEMARA7來曲唑(letrozole)、及ARIMIDEX7阿那曲唑(anastrozole)；以及抗雄激素，諸如，氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、必卡他胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、及戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(一種1,3－二戊環核苷胞嘧啶類似戊)；反義寡核苷酸，特別係可抑制與異常細胞增殖相關之信號傳導途徑中之基因表現者，諸如，舉例而言，PKC－α、Raf、H－Ras、及表皮生長因子受體(EGF－R)；疫苗，諸如基因治療疫苗，例如，ALLOVECTIN7疫苗、LEUVECTIN7疫苗、及VAXID7疫苗；PROLEUKIN7 rIL－2；LURTOTECAN7拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX7 rmRH；以及任何上述者之醫藥可接受性鹽、酸、或衍生物。"抗代謝物化療劑"係一試劑，其在結構上類似一代謝物，但不可由身體以生成性之方式使用。許多抗代謝物化療劑皆可干擾核酸、RNA、及DNA之生成。抗代謝物化療劑之實例包括吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR7)、5－氟尿嘧啶(5－FU)、卡培他濱(capecitabine)(XELODAJ)、6－巰基嘌呤、胺甲喋呤、6－硫鳥嘌呤、培美曲唑(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed)、阿糖胞苷ARA－C賽達拉敏(cytarabine)(CYTOSAR－U7)、達卡巴仁(daCarbaZine)(DTIC－DOME7)、偶氮胞嘧啶、去氧胞嘧啶、吡咯德嘧啶(pyridmidene)、氟達拉濱(fludarabine)(FLUDARA7)、凱德洛濱(cladrabine)、2－去氧－D－葡糖等。較佳之抗代謝物化療劑係吉西他濱(gemcitabine)。
"吉西他濱(gemcitabine)"或"2'－去氧－2',2'－二氟胞苷單鹽酸鹽(b－異構物)"係一種具有抗腫瘤活性之核苷類似物。吉西他濱HCl之實驗式係C9H11F2N3O4 A HCl。吉西他濱HCl係由Eli Lilly公司以商標名稱GEMZAR7出售。
"鉑基礎性化療劑"包含一有機化合物，其含有鉑作為該分子之整體部分。鉑基礎性化療劑之實例包括碳鉑、順鉑、及奧沙利鉑(oxaliplatin)。
"鉑基礎性化療"意指以一或多種鉑基礎性化療劑進行之治療，選擇性結合一或多種其他化療劑。
"化療抗性"之癌症意謂該癌症病患在接受化療療程之同時仍產生惡化(意即，該病患係"化療頑固性"者)，或是該病患在完成一化療療程後之12個月內(例如，6個月內)仍產生惡化。
"鉑抗性"之癌症意謂該癌症病患在接受鉑基礎性化療療程之同時仍產生惡化(意即，該病患係"鉑頑固性"者)，或是該病患在完成一鉑基礎性化療療程後之12個月內(例如，6個月內)仍產生惡化。
"抗血管新生劑"係指一化合物，其可阻斷，或是干擾某種程度之血管發展。抗血管新生因子可為，例如，一小分子或抗體，其可結合涉及促進血管新生之生長因子或生長因子受體。本文之較佳抗血管新生因子係一抗體，其可結合血管內皮生長因子(VEGF)，諸如，貝伐單抗(bevacizumab)(AVASTIN7)。
辭彙"細胞因子"係類別辭彙，用以敘述由一類群之細胞釋出之蛋白，其可作用於另一細胞上作為胞間中介子。此種細胞因子之實例包括淋巴因子、單核因子、及傳統之多肽激素、N－甲硫胺醯基人類生長激素、及牛生長激素；副甲狀腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；鬆他素；鬆他素原；糖蛋白激素，諸如，促濾泡激素(FSH)、促甲狀腺素(TSH)、及黃體化激素(LH)；肝細胞生長因子；纖維母細胞生長因子；泌乳激素；胎盤泌乳素；腫瘤壞死因子－α 及－β ；慕勒氏(mullerian)抑制物；小鼠促性腺素相關肽；抑制素；激活素；血管內皮生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經生長因子，諸如，NGF－β；血小板生長因子；轉化生長因子(TGFs)，諸.如，TGF－α及TGF－β；類胰島素生長因子－I及－II；紅血球生成素(EPO)；骨誘導因子；干擾素，諸如，干擾素－α、－β、及－γ；集落刺激因子(CSFs)，諸如，巨噬細胞－CSF(M－CSF)、粒狀細胞－巨噬細胞－CSF(GM－CSF)、及粒狀細胞－CSF(G－CSF)；間白素(ILs)，諸如，IL－1、IL－1α、IL－2、IL－3、IL－4、IL－5、IL－6、IL－7、IL－8、IL－9、IL－10、IL－11、IL－12；腫瘤壞死因子，諸如，TNF－α或TNF－β；以及其他多肽因此，包括LIF及kit配位體(KL)。在本文中，辭彙細胞因子包括取自天然來源或是取自重組細胞培養物之蛋白，以及天然序列細胞因子之生物活性當量物。
在本文中，辭彙"EGFR－導向性藥物"係指一治療劑，其可結合EGFR，並選擇性可抑制EGFR活化。此等試劑之實例包括可結合EGFR之抗體及小分子。可結合EGFR之抗體實例包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)、MAb 455(ATCC CRL HB8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(參見，美國專利第4,943,533號，Mendelsohn et al.)，以及其變體，諸如，鑲嵌化之225(C225或西妥昔單抗(cetuximab)；ERBUTIX7)以及重塑之人類225(H225)(參見，WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；IMC－11F8，一種完全人類之EGFR－導向性抗體(Imclone)；可結合第II類突變EGFR之抗體(美國專利第5,212,290號)；可結合EGFR之人類化及鑲嵌抗體，如述於美國專利第5,891,996號中者；以及可結合EGFR之人類抗體，諸如，ABX－EGF(參見，WO98/50433，Abgenix)；EMD 55900(Stragliotto et al.Eur.J.Cancer 32A：636－640(1996))；EMD7200(matuzumab)，一種導向對抗EGFR之人類化EGFR抗體，其可與EGF及TGF－α兩者競爭EGFR結合；以及mAb 806或人類化之mAb 806(Johnsetal.,J.BiOl.Chem.279(29)：30375－30384(2004))。該抗－EGFR抗體可與一胞毒劑綴合，因而產生一免疫綴合物(參見，如，EP659,439A2,Merck Patent GmbH)。可結合EGFR之小分子實例包括ZD1839或吉非替尼(Gefitinib)(IRESSAJ；Astra Zeneca)；CP－358774或埃羅替尼(Erlotinib)(TARCEVAJ；Genentech/OSI)；以及AG1478，AG1571(SU5271；Sugen)；EMD－7200。
"酪胺酸激酶抑制劑"係可抑制酪胺酸激酶(諸如，HER受體)之酪胺酸激酶活性之分子。此等抑制劑之實例包括述於前文之EGFR－導向性藥物；小分子HER2酪胺酸激酶抑制劑，諸如，TAK165(可自Takeda取得)；CP－724,714，一種口服之ErbB2酪胺酸激酶選擇性抑制劑(Pfizer及OSI)；雙重HER抑制劑，諸如，EKB－569(可自Wyeth取得)，其偏好結合EGFR，但可抑制HER2及EGFR過表現性細胞兩者；GW572016(可自Glaxo取得)，一種口服之HER2及EGFR酪胺酸激酶抑制劑；PKI－166(可自Novartis取得)；泛HER抑制劑，諸如，卡諾泰尼濱(canertinib)(CI－1033；Pharmacia)；Raf－1抑制劑，諸如，反義劑ISIS－5132(可自ISIS Pharmaceuticals取得，其可抑制Raf－1信號傳導)；非HER導向性TK抑制劑，諸如，甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate)(GleevacJ)(可自Glaxo取得)；MAPK胞外調控性激酶I抑制劑CI－1040(可自Pharmacia取得)；喹唑啉，諸如，PD 153035、4－(3－氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶；嘧啶并嘧啶；吡咯并嘧啶，諸如，CGP 59326、CGP 60261、及CGP 62706；吡唑并嘧啶；4－(苯基胺基)－7H－吡咯并[2,3－d]嘧啶；薑黃素(二阿魏醯基甲烷，4,5－雙(氟苯胺基)鄰苯二甲醯亞胺)；含泰封斯汀(tyrphostines)之硝基噻嗯分子部分；PD－0183805(Warner－Lamber)；反義分子(如，可結合HER編碼性核酸者)；喹喔啉(美國專利第5,804,396號)；泰封斯汀(tryphostins)(美國專利第5,804,396號)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK－787(Novartis/Schering AG)；泛HER抑制劑，諸如，CI－1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate)(Gleevac；Novartis)；PKI 166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；CI－1033(Pfizer)；EKB－569(Wyeth)；Semaxinib(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK－787(Novartis/Schering AG)；INC－1C11(Imclone)；或如下列專利公開案之任一者中所述：美國專利第5,804,396號；WO99/09016(American Cyanimid)；WO98/43960(American Cyanamid)；WO97/38983(Warner Lambert)；WO99/06378(Warner Lambert)；WO99/06396(Warner Lambert)；WO96/30347(Pfizer,Inc)；WO96/33978(Zeneca)；WO96/3397(Zeneca)；及WO96/33980(Zeneca)。
在本文中，療劑之"固定"或"平坦"劑量係指不考慮病患之體重(WT)或體表面積(BSA)而對人類病患投藥之劑量。因此，該固定或平坦劑量並不已毫/公斤劑量或是毫克/平方公尺劑量之形式提供，而係以該療劑之絕對量形式指明。
在本文中，"加樣"劑量一般而言包含對病患投藥之療劑起始劑量，其後會再接續一或多份之其維持劑量。一般而言，其係投藥單一之加樣劑量，但多重之加樣劑量亦涵括於本文中。通常，該(等)投藥之加樣劑量之量係超過該(等)投藥之維持劑量之量，及/或該(等)加樣劑量係以較該(等)維持劑量更高的頻率投藥，以在使用該(等)維持劑量達成所欲之療劑穩定狀態濃度之前，先達成該濃度。
在本文中，"維持"劑量係指在一段治療期間內，對該病患投藥之一或多份療劑劑量。通常，該等維持劑量係以分隔之治療時間間隔進行投藥，諸如，約每週一次、約每2週一次、約每3週一次、或是約每4週一次。
II.抗體之製備
由於，在該較佳具體實例中，該HER二聚化抑制劑係抗體，下文敘述以為製備根據本發明使用之HER抗體之例示性技術。用於製備抗體之HER抗原可為，如，可溶形式之HER受體胞外域可溶形式之或其部分，其含有所欲之抗原表位。或者，可使用在其細胞表面表現HER之細胞(如，經轉形以過表現HER2之NIH－3T3細胞；或是一癌細胞系，諸如，SK－BR－3細胞，參見，Stancovski et al.PNAS(USA)88：8691－8695(1991))而製備抗體。其他可用於產生抗體之HER受體形式將係熟習技藝者明顯可知者。
(i)多株抗體多株抗體較佳係在動物體內，由多重之皮下(sc)或腹膜內(ip)之相關抗原及佐劑注射而培養。可能可使用雙官能劑或衍化劑，例如，馬來醯亞胺基苯甲醯基磺琥珀醯亞胺酯(經由半胱胺酸殘基之綴合)、N－羥基號珀醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2 、或R1 N＝C＝NR(其中R及R1 係不同之烷基)，使該相關抗原與一在該欲免疫之生物種體內具有免疫原性之蛋白綴合，如，匙孔嘁血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制劑。
藉由結合，如，100微克或5微克之蛋白或綴合物(分別就兔或小鼠而言)與3倍體積之弗氏(Freund)完全佐劑，並在多個位點由皮內注射該溶液，以使動物對抗該抗原、免疫原性綴合物、或衍生物免疫。一個月之後，以1/5至1/10原始量之置於弗氏完全佐劑中之肽或綴合物在多個位點之皮下注射，對該等動物進行加強免疫。7至14天後，對該等動物進行取血，並分析血清中之抗體效價。對該等動物繼續進行加強免疫，直到達成效價平台為止。較佳者，其係以相同抗原、但係綴合不同之蛋白及/或係經由不同之交聯劑綴合之綴合物對該動物進行加強免疫。亦可在重組細胞培養物中，以蛋白融合物之形式製備綴合物。同時，聚集劑(諸如，明礬)可適當用於增強免疫反應。
(ii)單株抗體技藝中有諸多可用於製備本文單株抗體之方法。舉例而言，可使用雜交瘤法(最初由Kohler et al.,Nature,256：495(1975)所述)、由重組DNA法(美國專利第4,816,567號)而製備該等單株抗體。
在雜交瘤法中，其如上文所述免疫小鼠或其他適當之宿主動物，諸如，倉鼠，以激發製備抗體或是具有製備抗體能力之淋巴細胞，該等抗體可專一結合該用以進行免疫之蛋白。或者，可在體外免疫淋巴細胞。接著，使用適當之融合劑，諸如，聚乙二醇，使該等淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,pp.59－103(Academic Press,1986))。
使該等如此製備之雜交瘤細胞在適當之培養基中播種並生長，該培養基較佳含有一或多種可抑制未經融合之母體骨髓瘤細胞生長或存活之物質。舉例而言，如該母體骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則該等融合瘤之培養基一般而言將會包含次黃嘌呤、胺基喋呤(aminopterin)、及胸苷(HAT培養基)，該等物質可防止HGPRT缺失性細胞之生長。
較佳之骨髓瘤細胞係可有效融合、可支持所選抗體生成細胞之穩定高含量抗體生成、且對於培養基(諸如，HAT培養基)具敏感性者。在此等之中，較佳之骨髓瘤細胞系係小鼠骨髓瘤細胞系，諸如，衍生自MOPC－21及MPC－11小鼠腫瘤者(可自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA取得)，以及SP－2或X63－Ag8－653細胞(可自American Type Culture Collection,Rockville,Maryland USA取得)。人類骨髓瘤及小鼠－人類骨髓瘤細胞系亦已被敘述用於製備人類單株抗體(Kozbor,J.Immunol.,133：3001(1984)；及Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51－63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
分析雜交瘤細胞所生長之培養基中導向對抗該抗原之單株抗體生成。較佳者，以免疫沈澱或是藉由體外結合分析(諸如，放射免疫分析(RIA)或酶連免疫吸收分析(ELISA))，測定由該等雜交瘤細胞所生成單株抗體之結合專一性。
該單株抗體之結合專一性可，例如，由Munson et al.,Anal.Biochem.,107：220(1980)之Scatchard分析進行測定。
在辨識出可生產具有所欲專一性、親和力、及/或活性之抗體之融合瘤細胞後，可以限制稀釋流程對該等純系進行次選殖，再以標準方法進行生長(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,pp.59－103(Academic Press,1986))。可用於此目的之適當培養基包括，例如，D－MEM或RPMI－1640培養基。此外，可以腹水瘤之形式，在動物體內，使該等離交瘤細胞於活體內生長。
可以習知之抗體純化流程，諸如，舉例而言，A蛋白－瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、或是親和層析，使由該等次純系所分泌之單株抗體自該培養基、腹水、或血清中適當分離。
可使用習知流程(如，使用可專一結合編碼小鼠抗體重及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)，輕易分離並定序編碼該等單株抗體之DNA。融合瘤細胞可作為此種DNA之較佳來源。一旦獲得分離，即可將該DNA置入表現載體中，其接著可轉染進入宿主細胞中，諸如，在其他情形下並不生產抗體蛋白之大腸桿菌(E.coli)細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓瘤細胞，已在該等重組宿主細胞中取得單株抗體之合成。關於編碼抗體之DNA於細菌中之重組表現之回顧評論包括Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.,5：256－262(1993)及Plckthun,Immunol.Revs.,130：151－188(1992)。
在另一具體實例中，可自使用述於McCafferty et al.,Nature,348：552－554(1990)之技術產生之抗體噬菌體庫中，分離出單株抗體或抗體片段。Clackson etal.,Nature,352：624－628(1991)及Marks et al.,J.Mol.Biol.,222：581－597(1991)分別敘述使用噬菌體庫分離小鼠及人類抗體。後續之出版品中敘述了由鏈改組而製備高親和性(nM範圍)之人類抗體(Marks et al.,Bio/Technology,10：779－783(1992))，以及使用結合感染及體內重組作為建構極大噬菌體庫之策略(Waterhouse et al.,Nuc.Acids.Res.,21：2265－2266(1993))。因此，此等技術係用以分離單株抗體時傳統單株抗體雜交瘤技術之可行替代選擇。
該DNA亦可進行修飾，例如，藉著以人類重鏈及輕鏈恆定區之編碼序列取代該同源之小鼠序列(美國專利第4,816,567號；及Morrison,et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA,81：6851(1984))，或是藉著將一非免疫球蛋白多肽之全部或部分編碼序列共價連結至該免疫球蛋白編碼序列上。
一般而言，此等非免疫球蛋白多肽係用以取代抗體之恆定域，或者，其係取代抗體一抗原結合位點之可變域，以創造一鑲嵌雙價抗體，其包含一個對於某一抗原具有專一性之抗原結合位點，以及另一個對一不同抗原具有專一性之抗原結合位點。
(iii)人類化抗體可用於使非人類抗體人類化之方法已述於技藝之中。較佳者，人類化抗體具有一或多個由非人類來源引入其中之胺基酸殘基。此等非人類之胺基酸殘基通常被稱為"進口"殘基，其一般而言係由一"進口"可變域取得。人類化作用在本質上可根據Winter及其同事之方法進行(Jones et al.,Nature,321：522－525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332：323－327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239：1534－1536(1988))，以高變區域序列取代一人類抗體之對應序列。因此，此等"人類化"之抗體係鑲嵌抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上少於一完整之人類可變域已為取自非人類生物種之對應序列取代。在實務上，人類化抗體一般而言係人類抗體，其中部分之高變區域殘基以及可能尚有部分之FR殘基係由取自鼠類抗體類似位點之殘基取代。
用於製備人類化抗體之人類可變域(輕鏈及重鏈兩者)之選擇對於降低抗原性而言係相當重要者。根據所謂之"最適"方法，對抗整個已知人類可變域之序列庫，篩選鼠類抗體可變域之序列。接著，接受與鼠類序列最接近之人類序列作為該人類化抗體之人類框架區域(FR)(Sims et al.,J.Immunol.,151：2296(1993)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.,196；901(1987))。另一方法係使用衍生自所有人類抗體特定輕鏈或重鏈次群之共有序列之特定框架區域。可就多種不同之人類化抗體使用該相同之框架(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；Presta et al.,J.Immunol.,151：2623(1993))。
咸更重要者係使該等抗體在進行人類化之時仍可維持對於抗原之高親和性以及其他有利之生物特性。為達成此一目標，根據一較佳之方法，其係藉由使用母體及人類化序列之三級模型分析母體序列及各種概念上之人類化產物之方法而製備人類化抗體。三級之免疫球蛋白模型係一般可取得者，且係熟習技藝者所熟知。亦可取得電腦程式，其可免疫球蛋白序列之可能三級構形結構。此等顯示結果之檢驗可容許針對諸等殘基在該候選免疫球蛋白序列之功能中之可能角色進行分析，亦即，分析可影響該候選免疫球蛋白結合其抗原能力之殘基。據此，其可選擇FR殘基，並將其與受體及進口序列結合，以達成所欲之抗體特性，諸如，對於目標抗原之較高親和力。一般而言，高變區域之殘基係直接且最實質涉及影響抗原結合者。
WO01/00245敘述例示性人類化HER2抗體之製備，該抗體可結合HER2，並阻斷HER受體之配位體活化。本文所特別關注之人類化抗體可以基本上和小鼠單株抗體2C4(或其Fab片段)同樣有效之程度，阻斷MAPK之EGF、TGF－α、及/或HRG中介性活化作用。本文中之人類化抗體可，舉例而言，包含納入人類可變重鏈域之非人類高變區域殘基，且可在選自包含69H、71H、及73H之位置(使用述於Kabat et al.,SequenceS of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)之可變域編號系統)，進一步包含框架區域(FR)取代。在一具體實例中，該人類化抗體在包含69H、71H、及73H中之兩個或全部位置包含FR取代。
本文所關注人類化抗體之一實例包含重鏈可變域互補決定殘基GFTFTDYTMX，其中X較佳係D或S(序列編號NO：7)；DVNPNSGGSIYNQRFKG(序列編號NO：8)；及/或NLGPSFYFDY(序列編號NO：9)，並選擇性包含此等CDR殘基之胺基酸修飾，如，其中該等修飾可實質上維持或改良該抗體之親和性時。舉例而言，該所關注之抗體變體在上述之可變重鏈CDR序列中可具有自約1至約7個或是約5個胺基酸取代。此等抗體變體可由親和力熟化作用製備，如，參見下文。最佳之人類化抗體包含序列編號NO：4中之重鏈可變域胺基酸序列。
該人類化抗體可，如，在前段所述之該等重鏈可變域CDR殘基之外，包含輕鏈可變域互補決定殘基KASQDVSIGVA(序列編號NO：10)；SASYX1 X2 X3 ，其中X1 較佳係R或L，X2 較佳係Y或E，且X3 較佳係T或S(序列編號NO：11)，及/或QQYYIYPYT(序列編號NO：12)。此等人類化抗體可選擇性包含上述CDR殘基之胺基酸修飾，如，其中該等修飾可實質上維持或改良該抗體之親和性時。舉例而言，該所關注之抗體變體在上述之可變輕鏈CDR序列中可具有自約1至約7個或是約5個胺基酸取代。此等抗體變體可由親和力熟化作用製備，如，如下文所述。最佳之人類化抗體包含序列編號NO：3中之輕鏈可變域胺基酸序列。
本申請案亦涵括親和力熟化抗體，該抗體可結合HER2，並阻斷HER受體之配位體活化。該母抗體可為人類抗體或人類化抗體，如，包含分別述於序列編號Nos.3及4中之可變輕鏈及/或可變重鏈序列者(亦即，包含波圖單抗(pertuzumab)之VL及/或VH)。該親和力熟化抗體較佳可以優於小鼠2C4或波圖單抗之親和力結合HER2受體(如，自約2或約4倍，至約100倍或約1000倍之改良親和力，如，如使用HER2胞外域(ECD)ELISA所評估者)。可用以進行取代之重鏈可變CDR殘基之實例包括H28、H30、H34、H35、H64、H96、H99，或是二或多者之結合(如，此等殘基中之二、三、四、五、六、或七個)。可用以進行變更之輕鏈可變CDR殘基之實例包括L28、L50、L53、L56、L91、L92、L93、L94、L96、L97，或是二或多者之結合(如，此等殘基中之二至三、四、五、或是直到十個)。
本發明涵括各種不同形式之人類化抗體或親和力熟化抗體。舉例而言，該人類化抗體或親和力熟化抗體可為抗體片段，諸如，Fab，其選擇性與一或多個胞毒劑綴合以產生免疫綴合物。或者，該人類化抗體或親和力熟化抗體可為完整抗體，諸如，完整之IgG1抗體。較佳之完整IgG1抗體包含序列編號NO：13中之輕鏈序列以及序列編號NO：14中之重鏈序列。
(iv)人類抗體作為人類化作用之另一替代選擇，可製備人類抗體。舉例而言，現今已可能產生轉基因動物(如，小鼠)，其在進行免疫之後，可在無內源免疫球蛋白生產之情形下，產生完整之人類抗體集合庫。舉例而言，咸已獲得敘述，鑲嵌及種系突變小鼠體內抗體重鏈連接區(JH )基因之同合子缺失可造成內源性抗體生成之競爭抑制。將人類之種系免疫球蛋白基因陣列轉移至此等種系突變小鼠之體內將會造成抗體挑戰時之人類抗體生產。參見，如，Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature,362：255－258(1993)；Bruggermann et al.,Year in Immuno.,7：33(1993)；以及美國專利第5,591,669、5,589,369、及5,545,807號。或者，可使用噬菌體展示技術(McCafferty et al.,Nature 348：552－553(1990))，由取自未經免疫之供者之免疫球蛋白可變(V)域基因集合庫，於體外製備人類抗體及抗體片段。根據此種技術，其將抗體V域基因以符合框構之方式選殖進入絲狀噬菌體(諸如，M13或fd)之主要或次要外殼蛋白基因中，再在該噬菌體顆粒之表面將其以功能性之抗體片段形式展現。由於該絲狀顆粒含有該噬菌體基因組之單股DNA拷貝，根據抗體功能特性所進行之選擇亦可造成編碼具有此等特性抗體之基因之選擇。因此，該噬菌體可模擬部分之B細胞特性。噬菌體展示法可以各種不同之形式進行；就其回顧評論，參見，如，Johnson,Kevin S.and Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3：564－571(1993)。可使用數種V基因節段之來源以進行噬菌體展示。Clackson et al.,Nature,352：624－628(1991)由衍生自經免疫小鼠脾臟之V基因小型隨機組合庫，分離出一多變之抗唑酮抗體陣列。可實質上根據Marks et al.,J.Mol.Biol.222：581－597(1991)或是Griffith et al.,EMBO J.12：725－734(1993)所述之技術，建構取自未經免疫人類供者之V基因集合庫，再分離出對於多變抗原陣列之抗體。亦參見，美國專利第5,565,332及5,573,905號。
如上所討論，亦可由體外活化之B細胞生產人類抗體(參見，美國專利第5,573,905及5,229,275號)。
(v)抗體片段咸已發展出各種不同之技術以製備包含一或多個抗原結合區域之抗體片段。在傳統上，此等片段係經由完整抗體之蛋白酶解性酶切消化而衍生(參見，如，Morimoto et al.,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107－117(1992)；以及Brennan et al.,Science,229：81(1985))。然而，此等片段現今可由重組宿主細胞直接製備。舉例而言，可自上文所論及之抗體噬菌體庫分離此等抗體片段。或者，可自大腸桿菌中直接回收Fab'－SH片段，再進行化學偶合以形成F(ab')2 片段(Carter et al.,Bio/Technology 10：163－167(1992))。根據另一方法，可自重組宿主細胞培養物中直接分離F(ab')2 片段。其他可用於製備抗體片段之技術將係熟習技藝者明顯可知者。在另一具體實例中，其所選之抗體係單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利第5,571,894號；以及美國專利第5,587,458號。抗體片段亦可為一"線性抗體"，如，舉例而言，如美國專利第5,641,870號中所述。此等線性之抗體片段可為單專一性或雙專一性者。
(vi)雙專一性抗體雙專一性抗體係具有對於至少兩個不同抗原表位之結合專一性之抗體。例示性之雙專一性抗體可結合HER2蛋白之兩個不同抗原表位。其他此等抗體可結合HER2之結合位點與EGFR、HER3、及/或HER4之結合位點。或者，可使HER2臂與可結合白細胞上啟動分子之臂結合，諸如，T細胞受體分子(如，CD2或CD3)，或是IgG之Fc受體(FcγR)者(諸如，FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、及FcγRIII(CD16))以使細胞防禦機制集中於HER2表現性細胞。亦可使用雙專一性抗體，將胞毒劑集中至表現HER2之細胞。此等抗體具有一HER2結合臂，以及一可結合胞毒劑之臂(如，皂草素、抗干擾素－α 、長春花生物鹼、蓖麻毒蛋白A鏈、胺甲喋呤、或放射性同位素半抗原)。雙專一性抗體可以全長抗體或抗體片段(如，F(ab')2 雙專一性抗體)之形式製備。
WO 96/16673述及一種HER2/FcγRIII雙專一性抗體，而美國專利第5,837,234號則揭示一種雙專一性HER2/FcγRI抗體IDM1(Osidem)。一種雙專一性HER2/Fcα抗體示於WO98/02463中。美國專利第5,821,337號教示一種雙專一性HER2/CD3抗體。MDX－210係一種雙專一性HER2－FcγRIII抗體。
用以製備雙專一性抗體之方法係技藝中已知者。全長雙專一性抗體之傳統製備係根據兩種免疫球蛋白重鏈－輕鏈配對之共表現，其中該兩鏈具有不同之專一性(Millstein et al.,Nature,305：537－539(1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機選型，此等雜交瘤(四交瘤(quadromas))可產生10種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅有一種具有正確之雙專一性結構。此種正確分子之純化(其通常係以親和層析進行)相當麻煩，且其產率極低。類似之流程揭示於WO 93/08829以及Traunecker et al.,EMBO J.,10：3655－3659(1991)中。
根據一種不同方法，其使具有所欲結合專一性之抗體可變域(抗體－抗原結合位點)與免疫球蛋白之恆定域序列融合。該融合較佳係與一免疫球蛋白重鏈恆定域之融合，該蛋白域包含至少部分之鉸鏈、CH2、及CH3區域。較佳係使至少一種該等融合物中存在含有進行輕鏈結合所需位點之第一重鏈恆定區(CH1)。將編碼該等免疫球蛋白重鏈融合物以及，如需要，該免疫球蛋白輕鏈之DNAs插入不同之表現載體中，再將其共轉染進入適當之宿主生物體內。如此可提供極大之彈性，在其中於建構中使用不等比例之該三種多肽可提供最佳產率之具體實例中，調整該三種多肽片段之相互比例。然而，亦可能在以等比例表現其中至少兩種多肽鏈可造成高產率時，或是在該比例並不具有特別重要性時，將其中兩種或全部三種該多肽鏈之編碼序列插入同一個表現載體中。
在此方法之一較佳具體實例中，該雙專一性抗體之構成係在其一臂為具有第一結合專一性之雜交免疫球蛋白，並在其另一臂為雜交免疫球蛋白重鏈－輕鏈配對(提供第二結合專一性)。咸已發現此種不對稱性之結構可有助於分離所欲之雙專一性化合物與非所欲之免疫球蛋白鏈組合，因僅有一半之該雙專一性分子中存在免疫球蛋白輕鏈之情形可提供一種簡易之分離方式。此種方法揭示於WO 94/04690中。關於產生雙專一性抗體之進一步細節，參見，例如，Suresh et al.,Methods in Enzymology,121：210(1986)。
根據揭示於美國專利第5,731,168號之另一方法，可對抗體分子對間之界面進行工程處理，以使可自重組細胞培養物中回收之異源二聚物百分比最大化。較佳之界面包含至少一部份抗體恆定域之CH 3域。在此方法中，其將取自該第一抗體分子界面之一或多個小胺基酸側鏈以較大之側鏈(如，酪胺酸或色胺酸)取代。藉著以較小之側鏈(如，丙胺酸或羥丁胺酸)取代較大之胺基酸側鏈，在該第二抗體分子之界面上，製造大小與該(等)大型側鏈相同或類似之補償性"空腔"。如此可提供一種機制，提高異源二聚物之產率，使其優於其他非所欲之終產物(如，同源二聚物)。
雙專一性抗體包括交聯性或"異源綴合物"抗體。舉例而言，該異源綴合物中之一種抗體可與生物素偶合，而另一抗體則可與親和素偶合。此等抗體已被，舉例而言，建議用於將免疫系統之細胞導向至非所欲之細胞(美國專利第4,676,980號)，以及用於治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373、及EP 03089)。異源綴合物抗以可使用任何習知之交聯方法方法製備。適當之交聯劑係技藝中所熟知者，且其與諸多之交聯技術一同揭示於美國專利第4,676,980號中。
可用於自抗體片段產生雙專一性抗體之技術亦已被述於文獻之中。舉例而言，可使用化學連結而製備雙專一性抗體。Brennan et al.,Science,229：81(1985)述及一種流程，其中對完整之抗體進行蛋白酶解性之切割，以產生F(ab')2 片段。在雙硫醇複合劑亞砷酸鈉之存在下還原此等片段，以穩定鄰近之雙硫醇，並預防分子間二硫化物之形成。接著將該等所生成之Fab'片段轉化成為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。接著以巰基乙胺進行還原，將其中一種Fab'－TNB衍生物轉化成為Fab'－硫醇，再使其與等莫耳濃度量之其他Fab'－TNB衍生物混合，以形成雙專一性抗體。可使用該所製備之雙專一性抗體作為試劑進行酶之選擇性固定。
近來之進步已有助於由大腸桿菌直接回收Fab'－SH片段，其可再經化學偶合而形成雙專一性抗體。Shalaby et al.,J.Exp.Med.,175：217－225(1992)述及一種完全人類化雙專一性抗體F(ab')2 分子之製備。其自大腸桿菌分別分泌各個Fab'片段，再對其進行體外之導向性化學偶合，以形成該雙專一性抗體。如此形成之該雙專一性抗體可結合表現HER2受體之細胞及正常之人類T細胞，同時並可啟動人類胞毒性淋巴細胞對抗人類乳癌目標之裂解活性。
可用於直接自重組細胞培養物中製備並分離雙專一性抗體片段之各種技術皆已為敘述。舉例而言，已有使用白胺酸拉鍊而製備雙專一性抗體者。Kostelny et al.,J.Immunol.,148(5)：1547－1553(1992)。其以基因融合，使取自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鍊肽連結兩種不同抗體之Fab'部分。在鉸鏈區域還原該等抗體同源二聚物以形成單體，接著再次氧化以形成抗體異源二聚物。亦可使用此種方法以製備抗體同源二聚物。由Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444－6448(1993)所述之"微型雙功能抗體(diabody)"技術已提供另一種製備雙專一性抗體片段之替代機制。該等片段包含連結一可變輕鏈域(VL )之可變重鏈域(VH )，該連結係藉由使用一過短而無法容許相同鏈中之兩蛋白域進行配對之連接子而進行。因此，一片段中之VH 及VL 域被迫與另一片段中之互補VH 及VL 域進行配對，因而形成兩個抗原結合位點。藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚物而製備雙專一性抗體片段之另一策略亦已獲得報導。參見，Gruber et al.,J.Immunol.,152：5368(1994)。
(vi)其他胺基酸序列修飾物本文所述抗體之胺基酸序列修飾物亦為涵括。舉例而言，咸可能會想要改變抗體之結合親和性及/或其他生物特性。抗體之胺基酸序列變體可藉著將適當之核苷酸變化引入該抗體之核酸而製備，或是藉由肽合成而製備。此等修飾包括，例如，該抗體胺酸序列中之殘基缺失、及/或插入、及/或取代。可進行缺失、插入、及取代之任何組合以達成終建構物，只要該終建構物具有所欲之特性即可。胺基酸之變化亦可改變該抗體之後轉譯性加工，諸如，改變糖基化位點之數目或位置。
其中一種可用於辨識屬於較佳誘變位置之某些抗體殘基或區域之有用方法係稱為"丙胺酸掃描誘變(alanine scanning mutagenesis)"，如Cunningham and Wells Science,244：1081－1085(1989)所述。在此，其先辨識出一個殘基或是一群目標殘基(如，荷電性殘基，諸如，arg、asp、his、lys、及glu)，再以中性或負電性胺基酸取代(最佳者為丙胺酸或聚丙胺酸)，以影響該等胺基酸與抗原間之交互作用。接著再藉著在該等取代位點引入進一步或是其他之變體，以精練顯示對於此等取代具有功能敏感性之該等胺基酸位置。因此，在預定了欲引入胺基酸序列變化之位點的情形下，其並不需要預定該突變本身之性質。舉例而言，為分析一突變在一指定位點上之表現，可在該目標密碼子或區域處進行掃描或隨機誘變，再對該等表現之抗體變體篩選所欲之活性。
胺基酸序列之插入包括胺端及/或羧端之融合，其長度自一個殘基至包含一百或以上個殘基之多肽不等，亦包括單一或多重胺基酸殘基之序列內插入。終端插入之實例包括具有N端甲硫胺酸殘基之抗體，或是融合胞毒性多肽之抗體。其他抗體分子之插入性變體包括在該抗體之N端或C端融合一酶(如，對ADEPT者)，或是融合可增加該抗體血液半生期之多肽。
另一類型之變體係胺基酸取代變體。此等變體在該抗體分子中具有至少一個由一不同殘基取代之胺基酸殘基。用以進行取代性誘變之最受關注位點包括高變區域，但其亦涵括FR之變化。保守性之取代示於表1中之"較佳取代"標題之下。如此等取代可造成生物活性之變化，則可再引入更為實質之變化(其在表1中指名為"例示性取代"，並在下文參照胺基酸分類之內容中進一步敘述)並篩選該產物。
抗體生物特性之實質性修飾可藉由選擇其在維持(a)取代區域之多肽骨架結構(例如，片層或螺旋構形)、(b)目標位點處之分子電荷或疏水性、或(c)側鏈之體積之作用顯著不同之取代而達成。胺基酸可根據其側鏈特性之相似度而進行分類(於A.L.Lehninger,in Biochemistry,second ed.,pp.73－75,Worth Publishers,New York(1975)中)：(1)非極性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)(2)未荷電之極性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)(4)鹼性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者，天然存在之殘基可根據其共有之側鏈特性而進行分類：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)可影響鏈排列方向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性之取代將會造成其中一種此等類型之成員與另一類型之成員間的交換。
亦可取代並未涉及維持抗體適當構形之任何半胱胺酸，一般而言係以絲胺酸取代，以改良該分子之氧化安定性，並預防異常之交聯情形。相反的，可在該抗體中加入半胱胺酸鍵結，以改良其安定性(特別係在該抗體係抗體片段，諸如，Fv片段時)。
其中一種特別較佳之取代變體類型係涉及取代一或多個之母體抗體(如，人類化或人類抗體)高變區域殘基。一般而言，該(等)獲得選擇以進行進一步發展之所得變體將會具有相對於其產生來源母體抗體之改良生物特性。可用以產生此等取代性變體之一種便利方式係涉及使用噬菌體展示之親和力熟化作用。簡言之，其使數個高變區域位點(如，6－7個位點)產生突變，以在各個位點產生所有可能之胺基酸取代。將如此產生之抗體變體以取自絲狀噬菌體顆粒之單價之形式展示，如，在以和包含於各個顆粒中之M13基因III產物之融合物形式展示。接著如本文所揭示者篩選該等噬菌體展示性變體之生物活性(如，結合親和力)。為辨識可用以進行修飾之候選高變區域位點，可進行丙胺酸掃描誘變，以辨識對於抗原結合具有顯著貢獻之高變區域殘基。或者，或是此外，分析抗原－抗體複合物之晶體結構以辨識該抗體與人類HER2間之接觸點可能亦係有益者。此等接觸殘基以及其毗鄰殘基皆係可根據本文所述之技術進行取代之候選者。一旦產生此等變體，即可如本文所述對該等變體組進行篩選，並選擇在一或多項相關分析中顯示具有較佳特性之抗體進行進一步之發展。
另一類型之抗體胺基酸變體係改變該抗體之原始糖基化模式。改變意謂剔除之一或多個可見於該抗體中之糖類分子部分，及/或加入一或多個並不存在於該抗體中之糖基化位點。
抗體之糖基化作用一般而言係N－連結性或O－連結性。N－連結性係指糖類分子部分與天冬醯胺殘基側鏈之連結。天冬醯胺－X－絲胺酸及天冬醯胺－X－羥丁胺酸(其中X係任何除外脯胺酸之胺基酸)之三肽序列係糖類分子部分與天冬醯胺殘基側鏈之酶連結的辨識序列。因此，在一多肽中任一此等三肽序列之存在即產生一個潛在之糖基化位點。O－連結性糖基化作用係指N－乙醯半乳糖胺(GlcNAc)、半乳糖、或木糖中之一個糖與羥基胺基酸(最常見係絲胺酸或羥丁胺酸，但5－羥基脯胺酸或5－羥基離胺酸亦可使用)之連結。
抗體之糖基化位點添加可藉由改變胺基酸之序列使其含有一或多個上述之三肽序列而便利完成(針對N－連結性糖基化位點)。該改變亦可藉著在該原始抗體序列中添加一或多個絲胺酸或羥丁胺酸或以其進行取代而進行(對O－連結性糖基化位點)。
在該抗體包含Fc區域時，可改變與其連結之糖類。舉例而言，在該抗體之Fc區域上連結缺乏岩藻糖之成熟糖類結構之抗體已述於美國專利申請案No US 2003/0157108 A1(Presta,L.)。亦參見US 2004/0093621 A1(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。在該抗體之Fc區域上連結具有等分性N－乙醯葡糖胺(GlcNAc)之糖類之抗體可參照於WO03/011878(Jean－Mairet et al.)及美國專利第6,602,684號(Umana et al.)中。在該抗體之Fc區域上連結具有至少一個半乳糖殘基於該寡糖中之抗體則報導於WO97/30087(Patel et al.)中。亦參見WO98/58964(Raju,S.)及WO99/22764(Raju,S.)有關具有改變之糖類連結於其Fc區域上之抗體。
咸可能會想要修飾本發明抗體之效應功能，如，以增進該抗體之抗原依賴性細胞中介性胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性胞毒性(CDC)。此可藉著在該抗體之Fc區域中引入一或多個胺基酸取代而達成。或者，或是此外，可在該Fc區域中引入半胱胺酸殘基，因而容許在此區域中形成鏈間之雙硫鍵。如此產生之同源二聚物可具有改良之內化能力及/或增加之補體中介性細胞滅殺及抗以依賴性細胞毒性(ADCC)。參見，Caron et al.,J.Exp Med.176：1191－1195(1992)及Shopes,B.J.Immuno1.148：2918－2922(1992)。具有增強抗腫瘤活性之同源二聚抗體亦可使用異源雙官能性交聯劑而製備，如述於Wolff et al.Cancer Research 53：2560－2565(1993)中者。或者，可對抗體進行工程處理，以使其具有雙Fc區域，並可因而具有增強之補體裂解及ADCC能力。參見Stevenson et al.Anti－Cancer Drug Design 3：219－230(1989)。
WO00/42072(Presta,L.)述及在人類效應細胞之存在下具有改良ADCC功能之抗體，其中該等抗體在其Fc區域中包含胺基酸取代。較佳者，該具有改良ADCC之抗體在該Fc區域之298、333、及/或334位置(Eu殘基編號)包含胺基酸取代。較佳者，該經改變之Fc區域係人類IgG1 Fc區域，其包含一、二、或三個此等位置之取代或係由其構成。此等取代可選擇性結合可增進C1q結合及/或CDC之取代。
具有改變之C1q結合及/或補體依賴性胞毒性(CDC)之抗體述於WO99/51642、美國專利第6,194,551B1號、美國專利第6,242,195B1號、美國專利第6,242,195B1號、及美國專利第6,538,124號(Idusogie et al.)。該等抗體包含於其Fc區域之270、322、326、327、329、313、333、及/或334胺基酸位置(Eu殘基編號)中之一或多者包含胺基酸取代。
為增加抗體之血清半生期，舉例而言，可在該抗體(特別係抗體片段)中納入補救受體結合性抗原表位，如美國專利第5,739,277號所述。在本文中，辭彙"補救受體結合性抗原表位"係指IgG分子(如，IgG1 、IgG2 、IgG3 、或IgG4 )Fc區域之一個抗原表位，其係負責增加IgG分子肢體內血清半生期。
具有改良之新生兒Fc受體(FcRn)結合以及增長半生期之抗體述於WO00/42072(Presta,L.)及US2005/0014934A1(Hinton et al.)。此等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區域，其可改良該Fc區域與FcRn之結合。舉例而言，該Fc區域可在238、250、256、265、272、286、303、305、307、311、312、314、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428、或434位置(Eu殘基編號)中之一或多者包含胺基酸取代。具有改良FcRn結合之較佳含Fc區域抗體包含在其Fc區域之307、380、及434位置(Eu殘基編號)中之一、二、或三者包含胺基酸取代。
具有三個或以上(較佳者係四個)功能性抗原結合位點之工程處理性抗體亦為涵括(美國專利申請案US2002/0004587 A1，Miller et al.)。
編碼抗體變體胺基酸序列之核酸分子可以技藝中已知之各種不同方法製備。此等方法包括，但不限於，自天然來源分離(就天然存在之胺基酸序列變體而言)，或是以該抗體較早製備之變體或非變體版本之寡核苷酸中介性(或定位性)誘變、PCR誘變、以及盒式誘變製備。
(viii)具有所欲特性抗體之篩選用以產生抗體之技術已於上文敘述。如需要，可再進一步選擇具有特定生物特性之抗體。
為辨識可阻斷HER受體配位體活化作用之抗體，可判定該抗體阻斷HER配位體結合表現HER受體細胞之能力(如，綴合另一HER受體，其與目標HER受體可形成HER異源寡聚體)。舉例而言，可使天然表現該HER異源寡聚體之HER受體，或是經轉染而表現其之細胞與該抗體進行共置培養，接著再使其接觸經標記之HER配位體。然後，針對該抗體阻斷配位體結合該HER異源寡聚體中HER受體之能力進行評估。
舉例而言，HER2抗體對於HRG與MCF7乳癌細胞系結合之抑制可使用單層之MCF7培養物，於冰上，以24孔試驗盤之形式，基本上如WO01/00245中所述者而進行。可在各孔中加入HER2單株抗體，並進行30分鐘之恆溫培養。接著可加入1 2 5 I－標記性rHRGβ11 7 7 － 2 2 4 (25 pm)，再繼續進行恆溫培養4至16小時。可製備劑量反應曲線，並計算目標抗體之IC5 0 值。在一具體實例中，可阻斷HER受體配位體活化之抗體將會在此分析中具有約50 nM或以下之IC5 0 值以抑制HRG對MCF7細胞之結合，更佳係10 nM或以下。在該抗體係抗體片段，諸如，Fab片段時，在此分析中抑制HRG對MCF7細胞結合之IC5 0 值可為，例如，約100 nM或以下，更佳者係50 nM或以下。
或者，或是此外，可評估抗體阻斷存在於HER異源寡聚體中HER受體之HER配位體激發性酪胺酸磷酸化作用之能力。舉例而言，可使內源表現該等HER受體，或是經轉染而表現其之細胞與該抗體進行恆溫培養，接著再使用抗磷酸酪胺酸單株抗體(其可選擇性綴合可偵測之標記)，分析HER配位體依賴性酪胺酸磷酸化活性。亦可使用美國專利第5,766,863號所所述之激酶受體活化分析，判斷HER受體之活化作用以及抗體對於該活性之阻斷。
在一具體實例中，可在基本上如WO01/00245中所述，篩選可抑制MCF7細胞中p180酪胺酸磷酸化作用之HRG激發之抗體。舉例而言，可在24孔試驗盤中平板培養MCF7細胞，再在各孔中加入對抗HER2之單株抗體，並在室溫下進行恆溫培養30分鐘；接著可在各孔中加入終濃度0.2 nM之rHRGβ11 7 7 － 2 4 4 ，再繼續進行恆溫培養8分鐘。可自各孔中吸出培養基，再藉著加入100微升之SDS樣本緩衝液(5% SDS，25 mM DTT，及25 mM Tris－HCl，pH 6.8)而中止反應。可在一4－12%梯度凝膠(Novex)上，對各樣本(25微升)進行電泳，接著再電泳轉移至聚亞二氟乙烯膜上。可發展磷酸酪胺酸(於1微克/毫升濃度)之免疫印跡，並以反射密度計定量Mr －180,000處預定反應條帶之密度。所選之抗體較佳可在此分析中以約0－35%控制組之量顯著抑制p180酪胺酸磷酸化作用之HRG激發。可由反射密度計所測定者，針對p180酪胺酸磷酸化作用HRG激發之抑制，製備劑量反應曲線，並計算目標抗體之IC5 0 值。在一具體實例中，可阻斷HER受體配位體活化之抗體將會在此分析中具有約50 nM或以下之IC5 0 值以抑制p180酪胺酸磷酸化作用之HRG激發，更佳係10 nM或以下。在該抗體係抗體片段，諸如，Fab片段時，在此分析中抑制p180酪胺酸磷酸化作用之HRG激發之IC5 0 值可為，例如，約100 nM或以下，更佳者係50 nM或以下。
咸亦可評估抗體對於MDA－MB－175細胞之生長抑制作用，如，基本上如Schaefer et al.Oncogene 15：1385－1394(1997)中所述。根據此一分析，可以HER2單株抗體(10微克/毫升)處理MDA－MB－175細胞4天，再以結晶紫進行染色。與HER2抗體所進行之共置恆溫培養可顯示出其對於此細胞系具有類似單株抗體2C4所顯示出之生長抑制作用。在另一具體實例中，外源性之HRG將不會顯著逆轉此種抑制作用。較佳者，該抗體將可以大於單株抗體4D5之程度(且選擇性為大於單株抗體7F3之程度)，抑制MDA－MB－175細胞之細胞增殖，不論在有或無外源HRG存在之情形下皆然。
在一具體實例中，該目標HER2抗體可阻斷在MCF7及SK－BR－3兩者細胞中HER2與HER3之賀熱固林(heregulin)依賴性連結，如在一共免疫實驗中所測得者，諸如，述於WO01/00245中者，該阻斷作用較單株抗體4D5顯著更為有效，且較佳者較單株抗體7F3顯著更為有效。
為辨識生長抑制性之HER2抗體，可針對能夠抑制過表現HER2之癌症細胞生長之抗體進行篩選。在一具體實例中，所選之生長抑制性抗體可以約0.5至30微克/毫升之抗體濃度，抑制細胞培養物中SK－BR－3細胞約20－100%之生長，且較佳係約50－100%。為辨識此等抗體，可進行述於美國專利第5,677,171號之SK－BR－3分析。根據此一分析，其在F12及DMEM培養基之1：1混合物中(添加10%胎牛血清、麩胺醯胺、及青黴素鏈黴素)培養SK－BR－3細胞。接著以20,000個細胞之量，在一35 mm之細胞培養皿中(2毫升/35 mm皿)，對該等SK－BR－3細胞進行平板培養。在各皿中加入0.5至30微克/毫升之HER2抗體。6天後，使用電子式COULTERJ細胞計數器，相較於未經處理之細胞而計算細胞數目。選擇可抑制SK－BR－3細胞約20－100%或約50－100%之生長之抗體作為生長抑制性抗體。參見美國專利第5,677,171號有關篩選生長抑制性抗體(諸如，4D5及3E8)之分析。
為選擇可誘發脫噬作用之抗體，可利用一種使用BT474細胞之膜聯蛋白結合分析。如前段所論，培養該等BT474細胞並播種於培養皿中。接著除去該培養基，再以單獨之新鮮培養基或是含有10微克/毫升該單株抗體之培養基取代。在3天之恆溫培養期後，以PBS清洗單層細胞，再以胰蛋白酶消化進行脫附。接著離心細胞，再次懸浮於Ca2 ＋ 結合緩衝液中，並如上所論分為小份置入管中，以進行細胞死亡分析。接著在管中置入經標記之膜聯蛋白(如，膜聯蛋白V－FTIC)(1微克/毫升)。可使用FACSCANJ流式細胞計數器及FACSCONVERTJ CellQuest軟體(Becton Dickinson)分析樣本。選擇可誘發滿意顯著程度相較於控制組之膜聯蛋白結合之該等抗體作為脫噬誘發性抗體。除該膜聯蛋白結合分析外，尚有一種使用BT474細胞之DNA染色分析。為進行此一分析，其使已如前兩段落所述而以目標抗體進行處理之BT474細胞與9微克/毫升之HOECHST 33342J，在37℃下，進行共置恆溫培養2小時，接著再在EPICS ELITEJ流式細胞計數器上(Coulter Corporation)，使用MODFIT LTJ軟體(Verity Software House)進行分析。使用此一分析，可選擇能夠誘發脫噬性細胞百分比之變化至未經處理細胞之2倍或以上(且較佳係3倍或以上)(至100%之脫噬性細胞)之抗體作為促脫噬性抗體。參見WO98/17797有關篩選可誘發脫噬作用抗體(諸如，7C2及7F3)之分析。
為篩選可連結由目標抗體所連結HER2上之抗原表位之抗體，可進行一慣常之交叉阻斷分析，諸如，述於Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中者，以評估該抗體是否可交叉阻斷抗體(諸如，2C4或波圖單抗(pertuzumab))與HER2之結合。或者，或是此外，可以技藝中已知之方法行抗原表位作圖，及/或可研究該抗體－HER2結構(Franklin et al.Cancer Cell5：317－328(2004))，以得知何者(何等)HER2蛋白域係由該抗體連結。
(ix)波圖單抗(pertuzumab)組合物在一HER2抗體組合物之具體實例中，該組合物包含主要種類波圖單抗與一或多種其變體之混合物。本文波圖單抗主要種類抗體之較佳具體實例係包含序列編號Nos.3及4中之可變輕鏈及可變重鏈胺基酸序列者，且最佳者係包含選自序列編號Nos.13及17之輕鏈胺基酸序列以及選自序列編號Nos.14及18之重鏈胺基酸序列者(包括此等序列之去醯胺化及/或氧化變體)。在一具體實例中，該組合物包含該主要種類波圖單抗抗體與其包含胺端引導序列延伸之胺基酸序列變體之混合物。較佳者，該胺端引導序列延伸係位於該抗體變體之輕鏈上(如，位於該抗體變體之一或二條輕鏈上)。該主要種類HER2抗體或該抗體變體可為全長抗體或抗體片段(如，F(ab＝)2片段之Fab)，但其較佳為兩者皆係全長抗體。本文之抗體變體可在其一或多條重鏈或輕鏈上包含胺端引導序列延伸。較佳者，該胺端引導序列延伸係位於該抗體之一或二條輕鏈上。該胺端引導序列延伸較佳包含VHS－或係由其構成。該組合物中胺瑞引導序列延伸之存在可由各種不同之分析技術偵測，其包括，但不限於，N－端序列分析、電荷異質性之分析(例如，陽離子交換層析或毛細管區帶電泳)、質譜分析等。該組合物中之抗體變體量一般而言係自構成用以偵測該變體之任何分析(較佳係N－端序列分析)之偵測限度之量至低於該主要種類抗體量之量不等。一般而言，該組合物中約20%或以下(如，自約1%至約15%，例如，自約5%至約15%)之抗體分子係包含胺端引導序列延伸者。此等百分比之量較佳係使用定量性N－端序列分析或是陽離子交換分析(較佳係使用高解析度之弱陽離子交換管柱，諸如，PROPAC WCX－10J陽離子交換管柱)而測定。除胺端引導序列延伸變體之外，其亦涵括該主要種類抗體之其他胺基酸序列變化及/或變體，包括，但不限於，在其一或兩條重鏈上包含C－端離胺酸殘基之抗體、去醯胺化抗體變體等。
同時，該主要種類抗體或變體可進一步包含糖基化之變化，其非限制性之實例包括包含G1或G2寡糖結構連結於其Fc區域上之抗體、包含一糖類分子部分連結於其輕鏈上之抗體(如，一或兩個糖類分子部分，諸如，葡萄糖或半乳糖，連結於該抗體之一或兩條輕鏈上，例如，連結於一或多個離胺酸殘基上)、包含一或兩條未糖基化重鏈之抗體、或是包含一唾酸化寡糖連結於其一或兩條重鏈上之抗體等。
該組合物可自經基因工程處理之細胞系回收，如，表現HER2抗體之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，或是可由肽合成而製備。
(x)免疫綴合物本發明亦係關於免疫綴合物，其包含綴合胞毒劑之抗體，諸如，綴合化療劑、毒素(如，細菌、真菌、植物、或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段及/或變體)、或放射性同位素(亦即，放射性綴合物)者。
可用於產生此等免疫綴合物之化療劑已述於上文。抗體與一或多種小分子毒素之綴合物，諸如，綴合卡奇黴素(calicheamicin)、美登素(maytansine)(美國專利第5,208,020號)、三克斯尼(trichothene)、及CC1065者，亦涵括於本文中。
在本發明之一較佳具體實例中，該抗體係與一或多個美登素(maytansine)分子綴合(如，每個抗體分子對約1至約10個美登素分子)。美登素可，例如，轉化成為May－SS－Me，其可再還原為May－SH3並與經修飾之抗體反應(Chari et al.Cancer Research 52：127－131(1992))，以產生類美登素－抗體免疫綴合物。
另一種值得關注之免疫綴合物係與一或多個卡奇黴素(calicheamicin)綴合之抗體。抗生素卡奇黴素家族係可以次皮莫耳濃度(sub－picomolar)之濃度製造雙股DNA斷裂。可用之卡奇黴素結構類似物包括，但不限於，γ1 I 、α2 I 、α3 I 、N－乙醯基－γ1 I 、PSAG、及θI 1 (Hinman et al.Cancer Research 53：3336－3342(1993)及Lode et al.Cancer Research 58：2925－2928(1998))。 亦參見美國專利第5,714,586；5,712,374；5,264,586；及5,773,001號，其明白納入本文作為參考。
可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合性活性片段、外毒素A鏈(取自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、藥蓮毒素A鏈、α－sarcin、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII、及PAP－S)、苷瓜(momordica charantia)抑制劑、痲瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制劑、白樹素、麥托葛林(mitogellin)、瑞斯克菌素(restrictocin)、酚黴素、艾諾菌素(neomycin)、及梭黴菌毒素(trichothecenes)。參見，例如，WO 93/21232(1993年10月28日公開)。
本發明且涵括由一抗體及一具有溶核活性之化合物(如，核糖核酸酶或DNA內功核酸酶，諸如，去氧核糖核酸酶；DNase)所形成之免疫綴合物。
可取得各種不同之放射性同位素以製備放射綴合性HER2抗體。其實例包括At2 1 1 、I1 3 1 、I1 2 5 、Y9 0 、Re1 8 6 、Re1 8 8 、Sm1 5 3 、Bi2 1 2 、P3 2 ，以及Lu之放射性同位素。
抗體及胞毒劑之綴合物可使用各種不同之雙官能性蛋白偶合繼而製備，諸如，N－琥珀醯亞胺基－3－(2－吡啶基二硫醇)丙酸(SPDP)、琥珀醯亞胺基－4－(N－馬來醯亞胺基甲基)環己烷－1－羧酸酯、巰醇亞胺(IT)、亞胺酸酯之雙官能性衍生物(諸如，己二醯亞胺酸二甲酯HcL)、活性酯(諸如，二琥珀醯亞胺基辛二酸酯)、醛(諸如，戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如，雙(對－疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙－重氮衍生物(諸如，雙(對－重氮苯甲醯基)－乙二胺)、二異氰酸酯(諸如，亞苄基2,6－二異氰酸酯)、及雙活性氟化合物(諸如，1,5－二氟－2,4－二硝基苯)。舉例而言，可如Vitetta et al.Science 238：1098(1987)中所述製備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14標記性1－異氰硫基苄基－3－甲基二乙烯三胺五乙酸(MX－DTPA)係可用以使放射性核苷酸綴合抗體之例示性螯合劑。參見WO94/l1026。該連接子可為一種"可切割性連接子"，因而有助於該胞毒性藥物在細胞中之釋放。舉例而言，可使用酸不安定性連接子、肽酶敏感性連接子、二甲基連接子、或含雙硫化物之連接子(Chari et al.Cancer Research 52：127－131(1992))。
或者，可製備包含抗體及胞毒劑之融合蛋白，如，藉由重組技術或肽合成。
本文亦涵括其他之免疫綴合物。舉例而言，可使抗體連結各種不同非蛋白聚合物中之一者，如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或是聚乙二醇及聚丙二醇之共聚物。亦可將該抗體截留於微膠囊中(其可藉由，例如，凝聚技術或藉由界面間之聚合作用而製備(例如，分別可用於羥甲基纖維素或凝膠微膠囊以及聚(甲基甲酸酯)微膠囊))，於膠態藥物傳遞系統中(如，脂質體、白蛋白微球體、微滴乳液、奈米分子、及奈米膠囊)，或是於粗滴乳液中。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Oslo,A.,Ed.,(1980)。
本文所揭示之抗體亦可被調配為免疫脂質體。含有該抗體之脂質體可以技藝中已知之方法製備，諸如，述於Epstein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：3688(1985)；Hwang et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA,77：4030(1980)；美國專利第4,485,045及4,544,545號；以及WO97/38731(1997年10月23日公開)中者。具有增長循環時間之脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。
特別有用之脂質體可由逆相蒸發法，使用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇、及PEG－衍化性磷脂醯基乙醇胺(PEG－PE)之脂質組合物而產生。使脂質體通過具有預定孔大小之濾器擠出，以產生具有所欲直徑之脂質體。可如Martin et al.J.Biol.chem.257：286－288(1982)中所述者，經由二硫化物交換反應，使本發明抗體之Fab'片段綴合該等脂質體。該等脂質體中選擇性包含化療劑。參見Gabizon et al.J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
III.選擇病患進行治療
本文中之病患在進行治療之前可選擇性接受診斷試驗。舉例而言，該診斷試驗可評估HER(如，HER2或EGFR)之表現(包括過表現)、擴增、及/或活化(包括磷酸化或二聚化)。
一般而言，如其進行診斷試驗，可自該需求治療之病患取得樣本。在該對象具有癌症時，該樣本一般而言係腫瘤樣本。在較佳具體實例中，該腫瘤樣本係取自卵巢癌、腹膜癌、輸卵管癌、轉移性乳癌(MBC)、非小細胞性肺癌(NSCLC)、前列腺癌、或是結腸直腸癌腫瘤樣本。
本文中之生物樣本可為固定性樣本，如，福馬林固定化、石蠟包埋性樣本(FFPE)，或是冷凍樣本。
根據本文中本發明之一具體實例，選擇進行治療之病患具有顯示HER(且較佳係HER2)活化情形之腫瘤。在一具體實例中，癌細胞中HER(或HER2)活化程度之顯著超過該受體於相同組織類型非癌細胞中之活化程度。此等過量之活化情形可能來自於癌細胞中該HER受體之過表現及/或其中具有高於正常量之HER配位體可用於活化該HER受體。此種過量之活化情形可能造成癌細胞之惡性狀態及/或可能係由癌細胞之惡性狀態造成。在部分具體實例中，其將會對該癌症進行診斷性或預後性之分析，以判定是否存在造成此種HER受體過量活化情形之HER受體擴增及/或過表現。或者，或是此外，可對該癌症進行診斷性或預後性之分析，以判定該癌症中是否存在造成該受體過量活化情形之HER配位體擴增及/或過表現。在此等癌症之一次群中，受體之過量活化可能係來自於自分泌激發途徑。用以測定HER活化情形之各種不同分析將於下文進一步詳述。用以測定HER活化情形之較佳方法係：偵測HER二聚物或異源二聚物之存在，評估HER或HER2之磷酸化情形，以及基因表現內容分析。
(i)HER二聚物可評估腫瘤樣本中HER二聚物之存在，以作為HER或HER2活化之指標。可使用技藝中已知之任何方法以偵測腫瘤中之HER二聚物，諸如，EGFR－HER2、HER2－HER3。下文敘述數種較佳之方法。此等方法係偵測非共價性之蛋白－蛋白作用，或是其他可指出目標蛋白間之接近情形者。
可使用根據免疫親和性之方法(諸如，免疫沈澱或ELISA)而偵測HER二聚物。在一具體實例中，其係使用HER2抗體以免疫沈澱含有取自腫瘤之HER2之複合物，接著再以免疫印跡法探測該所得免疫沈澱物中EGFR或HER3之存在。在另一具體實例中，可使用EGFR或HER3進行該免疫沈澱步驟，接著再以HER2抗體探測該免疫沈澱物。在另一具體實例中，可使用對於EGFR、HER3、EGFR－HER2複合物、或HER2－HER3複合物具有專一性之HER配位體沈澱複合物，接著再對其探測HER2之存在。舉例而言，可使配位體綴合親和素，再在生物素管柱上純化複合物。
在其他具體實例中，諸如，ELISA或抗體"夾層"類型之分析中，其係將對抗HER2之抗體固定於一固體支持物上，使其接觸腫瘤細胞或腫瘤細胞裂解物，清洗，接著再使其接觸對抗EGFR或HER3之抗體。與該後述抗體之結合(其可直接進行偵測或是藉由綴合可偵測性標記之第二抗體而偵測)即指出異源二聚物之存在。在部分具體實例中，其係固定EGFR或HER3抗體，再使用HER2抗體進行偵測步驟。在其他具體實例中，可使用HER配位體取代或結合HER抗體。
亦可使用化學或UV交聯而共價連結活細胞表面之二聚物。化學交聯子之實例包括二硫雙(琥珀醯亞胺基)丙酸酯(DSP)及3,3－二硫雙(磺基琥珀醯亞胺基)丙酸酯(DTSSP)。在一具體實例中，其以SDS－PAGE以及使用EGFR及/或HER3抗體之免疫印跡，分析取自化學交聯性腫瘤細胞之細胞萃取物。具有適當分子量之超級遷移率變動條帶(supershifted band)最可能係代表EGFR－HER2或HER2－HER3二聚物，因HER2係EGFR及HER3之較佳二聚化配對物。此種結果可由後續使用HER2抗體進行之免疫印跡而確認。
亦可使用螢光共振能量轉移(FRET)偵測EGFR－HER2或HER2－HER3二聚物。FRET可根據能量自供者螢光團至受者螢光團之轉移而偵測體內及體外之蛋白構形變化以及蛋白－蛋白交互作用。Selvin,Nat.Struct.Biol.,7：730－34(2000)。能量轉移僅可在該供者螢光團與該受者螢光團之位置足夠接近時發生。在一典型之FRET實驗中，其以不同之螢光探針標記兩個蛋白或是單一蛋白中之兩個位點。將其中一個探針，供者探針，由具有指定波長之入射光激發至高能態。接著該供著探針會將其能量傳遞至該第二探針，受體探針，因而造成該供者螢光強度之減低以及該受者螢光放射之增加。為測量能量轉移之程度，比較經供者及受者探針標記之樣本中之供者強度與僅以供者探針標記之樣本中之供者強度。選擇性者，亦比較供者/受者以及僅標記受者之樣本中之受者強度。適當之探針係技藝中所已知者，且其包括，例如，膜滲透性染劑(諸如，螢光素及若丹明)、有機染劑(諸如，花青染劑)、以及鑭原子。用以偵測及測量能量轉移之方法及手段亦係技藝中所已知者。
適用於在個別細胞中偵測及測量蛋白－蛋白交互作用之FRET基礎性技術亦係技藝中所已知者。舉例而言，可使用供者光漂白螢光共振能量轉移(pbFRET)顯微術以及螢光生命期造影顯微術(FLIM)，以偵測細胞表面受體之二聚化作用。Gadella & Jovin,J.Cell Biol.,129：1543－58(1995)。在一具體實例中，其係以"於懸浮液中"或是"原位"之方式，對細胞使用pbFRET，以偵測及測量EGFR－HER2或HER2－HER3二聚物之形成，如Nagy et al.,Cytometry,32：120－131(1998)所述。此等技術可測量供者螢光生命期因能量轉移而造成之減少。在一特定具體實例中，可使用流式細胞計數性Foerster類型FRET技術(FCET)而探究EGFR－HER2及HER2－HER3二聚化作用，如Nagy et al.,上述文獻以及Brockhoff et al.,Cytometry,44：338－48(2001)所述。
FRET較佳係結合標準之免疫組織化學標記技術而使用。Kenworthy,Methods,24：289－96(2001)。舉例而言，可使用綴合適當螢光染劑之抗體作為探針以標記兩種不同之蛋白。如該蛋白之位置接近另一蛋白，則該等螢光染劑即可作為FRET之供者及受者。能量轉移係以標準方式偵測。能量轉移可以流式細胞計數方式或是由數位顯微術系統而進行偵測，諸如，共軛焦顯微術或是寬場螢光顯微術，結合電荷偶合元件(CCD)相機。
在本發明之一具體實例中，其係以兩種不同之螢光團直接標記HER2抗體以及EGFR或HER3抗體，例如，如Nagy et al.,上述文獻所述。使腫瘤細胞或腫瘤細胞裂解物接觸該等經差異標記之抗體，其可在EGFR－HER2或HER2－HER3二聚物之存在下作為FRET之供者及受者。或者，可使用對抗HER2以及EGFR或HER3之抗體，結合作為供者及受者之差異標記性二級抗體。參見，例如，Brockhoff et al.,上述文獻。如發現該等標記彼此極為接近時，偵測能量轉移並判定二聚物之存在。
在其他具體實例中，其對HER2以及EGFR或HER3專一性之HER受體配位體進行螢光標記，並用於進行FRET實驗。
又在其他之本發明具體實例中，腫瘤細胞表面二聚物之存在係由使用標準之直接或間接式免疫螢光技術以及共軛焦雷射掃描顯微術而進行HER2以及EGFR或HER3之共定位而顯示。或者，可使用雷射掃描顯影術(LSI)，以高效能之形式(諸如，微試驗盤)，偵測HER2與EGFR或HER3之抗體結合及共定位，如Zuck et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96：11122－27(1999)所述。
在其他具體實例中，EGFR－HER2及/或HER2－HER3二聚物之存在可藉由辨識取決於二聚物組成份位置相近程度之酶活性而判定。使HER2抗體綴合一酶，並使EGFR或HER3抗體綴合第二種酶。加入該第一酶之第一受質，而該反應產生該第二酶之第二受質。如此可導致與另一分子之反應以產生一可偵測之化合物，諸如，染劑。該另一化學物之存在可分解該第二受質，因而防止其與該第二酶之反應，除非該第一及第二酶(並因而該兩抗體亦然)之位置極為接近。在一特定具體實例中，其使腫瘤細胞或細胞裂解物接觸綴合葡糖氧化酶之HER2抗體以及綴合辣根過氧化物酶之EGFR或HER3抗體。在該反應中加入葡萄糖，以及一染劑前體分子(諸如，DAB)及過氧化氫酶。二聚物之存在係由染色DAB時之發色而判定。
二聚物亦可使用根據eTagT M 分析系統(Aclara Bio Sciences,Mountain View,CA)之方法，如美國專利申請案2001/0049105(2001年12月6日公開)所述(此兩者皆明白整體納入本文作為參考)而進行偵測。eTagT M 或"電泳標記"包含一可偵測之報導基團分子部分，諸如，螢光基團。其亦可包含"移動性修飾子"，其基本上係由具有獨特電泳移動性之分子部分構成。此等分子部分可容許在特定之電泳條件下，諸如，毛細管電泳(CE)，自一複雜之混合物中分離並偵測該eTagT M 。該eTagT M 部分含有報導基團分子部分，且選擇性者，該移動性修飾子係由一可切割性之連結基團連結於該第一目標結合分子部分，以產生第一結合化合物。該第一目標結合分子部分可專一辨識特定之第一目標，諸如，核酸或蛋白。該第一目標結合分子部分並不以任何方式受限，且其可包含，例如，聚核苷酸或多肽。較佳者，該第一目標結合分子部分係抗體或抗體片段。或者，該第一目標結合分子部分可為HER受體配位體或其具結合能力之片段。
該連結基團較佳包含一可切割性之分子部分，諸如，酶之受質，或是任何可在特定條件下切割之化學鍵。當該第一目標結合分子部分結合其目標時，可引入及/或活化切割劑，之後該連結基團即可獲得切割，因而釋出含該報導基團分子部分及移動性修飾子之eTagT M 部分。因此，自由eTagT M 之存在即可指出該目標結合分子部分與其目標之結合。
較佳者，該第二結合化合物包含該切割劑以及可專一辨識第二目標之第二目標結合分子部分。該第二目標結合分子部分亦不以任何方式受限，且其可為，例如，抗體或抗體片段，或是HER受體配位體或其具結合能力之片段。該切割劑係僅在該第一結合化合物與該第二結合化合物之位置極為接近時始可切割該連結基團者。
在本發明之一具體實例中，該第一結合化合物包含一eTagT M ，其中係以一對於HER2之抗體作為該第一目標結合分子部分。該第二結合化合物包含對於EGFR或HER3之抗體，連結可切割該eTagT M 連結基團之切割劑。較佳者，該切割劑必須經由活化始可切割該連接基團。使腫瘤細胞或腫瘤細胞裂解物接觸該eTagT M ，其可結合HER2，並接觸經修飾之EGFR或HER3抗體，其可結合細胞表面之EGFR或HER3。較佳可移除未連結之結合化合物，且如需要，再活化該切割劑。如其中存在EGFR－HER2或HER2－HER3二聚物，該切割劑將會因該切割寄與該連結基團位置之相近而切割該連結基團，並釋出該eTagT M 。接著可以技藝中之任何已知方法偵測自由之eTagT M ，諸如毛細管電泳。
在一具體實例中，該切割劑係可活化之化學物，其可作用於該連結基團。舉例而言，該切割既可藉由暴露該樣本於光下而活化。
在另一具體實例中，該eTagT M係使用對於EGFR或HER3之抗體作為該第一目標結合分子部分而建構，且該第二結合化合物係自對於HER2之抗體建構。
在又另一具體實例中，該HER二聚物係使用一抗體或其他試劑而進行偵測，相較於該物與該二聚物中任一HER受體之結合，該物可專一或偏好結合該二聚物。
(ii)HER2磷酸化作用HER受體之磷酸化作用可藉由進行一或多個HER受體(諸如，HER2受體)之免疫沈澱，再分析該(等)經免疫沈澱受體中之磷酸化酪胺酸殘基而評估，舉例而言，可以凝膠上磷酸－HER2條帶之存在判定為陽性，使用抗磷酸酪胺酸抗體以偵測該(等)經免疫沈澱HER受體中之磷酸化酪胺酸殘基。抗磷酸酪胺酸抗體可自PanVera(Madison,WI)、Invitrogen之一子公司Chemicon International Inc.(Temecula,CA)、或是Upstate Biotechnology(Lake Placid,NY)而購得。以該條帶之不存在判定為陰性。各種可用以偵測磷酸化蛋白之分析形式皆為涵括，諸如，西方點漬分析、免疫組織化學、ELISA等。
在一具體實例中，HER2(HER2)受體之磷酸化作用係以免疫組織化學，使用一種磷酸專一性HER2抗體而評估(純系PN2A；Thor et al.,J.Clin.Oncol,18(18)：3230－3239(2000))。
可用於偵測HER受體磷酸化作用之其他方法包括，但不限於，KIRA ELISA(美國專利第5,766,863；5,891,650；5,914,237；6,025,145；及6,287,784號)、質譜(比較磷酸化及未磷酸化HER2之大小)、以及使用一HER(如，HER2)抗體以及磷酸專一性或磷酸酪胺酸專一性抗體之e－tag接近性分析(如，使用可自Aclara BioSciences(Mountain View,CA)取得之eTagT M 分析套組)。eTag分析之細節述於前文。
亦可在細胞陣列中使用磷酸專一性抗體偵測信號傳導蛋白細胞樣本中之磷酸化狀態(US2003/0190689)。
下文之實例2敘述以磷酸－HER2 ELISA判定HER2磷酸化作用之一較佳方法。
(iii)基因表現內容分析在一具體實例中，其使用基因表現內容分析作為直接測量HER磷酸化作用之代替品。此在該樣本係固定性樣本時特別有用(如，石蠟包埋性福馬林固定性腫瘤樣本)，其中HER之磷酸化作用可能難以可靠定量。舉例而言，其可評估樣本中二或多種之HER受體以及一或多種之HER配位體，其中該二或多種HER受體以及一或多種HER配位體之表現指出該樣本中之陽性HER活化作用。或者，或是此外，可測量該樣本中之β細胞素及/或雙調蛋白表現，其中該β細胞素及/或雙調蛋白之表現指出該樣本中之陽性HER活化作用。
根據用以評估HER活化作用之基因表現內容分析之較佳具體實例，其對取自病患之樣本試驗二或多種之HER受體(較佳者係選自EGFR、HER2、及HER3)以及一或多種之HER配位體(較佳者係選自β細胞素、雙調蛋白、表皮調節素、及TGF－α，最佳者係β細胞素或雙調蛋白)之表現。舉例而言，該二或多種之HER受體可為EGFR及HER2，或是HER2及HER3，且該一或多種之HER配位體可為β細胞素或雙調蛋白)。較佳者，其判定HER2以及EGFR或HER3，以及β細胞素或雙調蛋白之表現。可僅試驗該樣本之β細胞素或雙調蛋白表現，或是結合試驗二或多種HER受體之表現。經指明基因之陽性表現即指出該病患係以HER受體抑制劑(諸如，波圖單抗(pertuzumab))進行治療之候選者。同時，該(等)基因之陽性表現可指出，對於HER受體抑制劑所進行之治療，該病患可能會有較並未具有此種陽性表現之病患優越之有利反應。
可用以測定mRNA或蛋白表現之各種方法包括，但不限於，基因表現內容分析、聚合酶連鎖反應(PCR)(包括定量性實時PCR(qRT－PCR))、微陣列分析、基因表現系列分析(SAGE)、MassARRAY、由大規模平行信號定序(MPSS)所進行之基因表現分析、蛋白體學研究、免疫組織化學(IHC)等。較佳者，其係對mRNA進行定量。此等mRNA之分析較佳係使用聚合酶連鎖反應(PCR)技術或由微陣列分析而進行。在使用PCR時，其中一種較佳之PCR形式係定量性實時PCR(qRT－PCR)。在一具體實例中，一或多個上述基因之表現如於為其中位值或以上，如，相較於相同腫瘤類型之其他樣本，其即被視為陽性表現。該中位值表現量基本上可與基因表現之測量同時測定，或可於先前進行測定。
使用固定性、石蠟包埋性組織作為RNA來源而進行之基因表現內容分析之代表性流程步驟(包括mRNA分離、純化、引子延伸、及擴增)已提供於各種已公開之期刊文章之中(例如，Godfrey et al.J.Molec.Diagnostics 2：84－91(2000)；Specht et al.,Am.J.Pathol.158：419－29(2001))。簡言之，其中一種代表性之流程係以切割約10微克之厚切片石蠟包埋性腫瘤或組織樣本而起始。接著萃取RNA，並除去蛋白及DNA。在分析該RNA濃度後，需要，可包含RNA修復及/或擴增之步驟，再使用基因專一性啟動子接續PCR而對RNA進行逆轉錄。最後，分析該等數據，以根據於該檢驗腫瘤樣本中所辨識之特徵基因表現模式，判定可用於該病患之最佳治療選擇。
本文之實例3敘述以基因表現內容分析判定HER2活化作用之一較佳方法。
(iv)HER表現及擴增未測定癌症中之HER表現或擴增，使用各種不同之診斷/預後分析。在一具體實例中，HER之過表現可由IHC分析，如，使用HERCEPTEST(Dako)。可對取自腫瘤生檢之石蠟包埋性組織切片進行分析，並配合一如下之HER2蛋白染色強度標準：評分0未觀察到任何染色，或是在少於10%之腫瘤細胞中觀察到膜染色。
評分1＋在超過10%之腫瘤細胞中觀察到微弱/勉強可見之膜染色。該等細胞僅在其部分之膜獲得染色。
評分2＋在超過10%之腫瘤細胞中觀察到弱至中度之完整膜染色。
評分3＋在超過10%之腫瘤細胞中觀察到中度至強之完整膜染色。
具有0或1＋評分HER2過表現評估之該等腫瘤可被定性為未過表現HER2，而具有2＋或3＋評分之該等腫瘤則可被定性為過表現HER2。
過表現HER2之腫瘤可以對應於每個細胞中HER2分子拷貝數之免疫組織化學評分進行評估，且其可以生物化學方式判定：0＝0－10,000拷貝/細胞，1＋＝至少約200,000拷貝/細胞，2＋＝至少約500,000拷貝/細胞，3＋＝至少約2,000,000拷貝/細胞。
3＋層級之過表現(其可造成酪胺酸激酶之配位體依賴性活化作用(Hudziak et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84：7159－7163(1987)))存在於約30%之乳癌中，且在此等病患體內，無復發性存活及整體存活皆縮減(Slamon et al.,Science,244：707－712(1989)；Slamon et al.,Science,235：177－182(1987))。
或者，或是此外，可對福馬林固定性、石蠟包埋性腫瘤組織進行FISH分析，諸如INFORMT M (Ventana,Arizona所售)或PATHVISIONT M (Vysis,IllinoiS)，以測定腫瘤中HER2擴增之程度(如有任何此等情形)。
在一具體實例中，該癌症將係表現(且可為過表現)EGFR者，此種表現可如用以評估表現之方法如上所述而進行評估。
HER受體或HER配位體之過表現或擴增亦可使用體內診斷分析而進行評估，如，藉由投藥一分子(諸如一抗體)，其可結合該欲偵測之分子，且其係標記一可偵測性之標記(如，放射同位素)，再對該病患進行外部偵測以定位該標記。
IV.醫藥調配物
根據本發明所使用之HER二聚化抑制劑治療性調配物可藉由混合具有所欲純度之抗體與選擇性之醫藥可接受性載體、賦形劑、或安定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))而製備貯存，一般而言係為凍乾性調配物或水溶液之形式。抗體晶體亦為涵括(參見美國專利申請案2002/01367l9)。可接受之載體、賦形劑、或安定劑在所用之劑量及濃度下對該受者係無毒性者，且其包括緩衝液，諸如，磷酸、檸檬酸、及其他有機酸；抗氧化劑，包括，抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如，十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六烴季胺；氯化苯二甲羥銨；氯化苯銨松寧；酚，丁基或苄基醇；對羥基苯甲酸酯，諸如，對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3－戊醇；及間－甲酚)；低分子量(低於約10個殘基)多肽；蛋白，諸如，血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如，聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸、或離胺酸；單醣、雙糖、或其他之糖類，包括，葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑，諸如，EDTA；糖類，諸如，蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、或山梨糖醇；鹽形成性反荷離子，諸如，鈉；金屬複合物(如，Zn－蛋白複合物)；及/或非離子界面活性季，諸如，TWEENJ、PLURONICSJ、或聚乙二醇(PEG)。凍乾性抗體調配物係述於WO 97/04801，其明白納入本文作為參考。
較佳之治療用途波圖單抗(pertuzumab)調配物包含30毫克/毫升之波圖單抗於20 mM之醋酸組胺酸、120 mM之蔗糖、0.02%之聚抗壞血酸酯20(pH 6.0)中。另一波圖單抗調配物則包含25毫克/毫升之波圖單抗、10 mM之組胺酸－HCl緩衝液、240 mM之蔗糖、0.02%之聚抗壞血酸酯20(pH 6.0)。
本文之該調配物亦可含有欲治療特定病症所需之一種以上活性化合物，較佳係具有不會彼此反向影響之互補活性者。各種可結合該二聚化抑制劑之藥物述於下文之方法章節。此等分子係以可有效產生所欲目的之量適當結合存在。
該等活性成分亦可被截留於微膠囊中(其可藉由，例如，凝聚技術或藉由界面間之聚合作用而製備(例如，分別可用於羥甲基纖維素或凝膠微膠囊以及聚(甲基甲酸酯)微膠囊))，於膠態藥物傳遞系統中(如，脂質體、白蛋白微球體、微滴乳液、奈米分子、及奈米膠囊)，或是於粗滴乳液中。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Oslo,A.,Ed.,(1980)。
可製備持釋型製備物。持釋型製備物之適當實例包括含有該抗體之固體疏水性聚合物半滲透性基質，該基質係為塑形物件之形式，如，薄膜或微膠囊。持釋型基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2－羥乙基－異丁烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利第3,773,919號)、L－麩胺酸及γ－乙基－L－麩胺酸之共聚物、非可降解性乙烯－乙酸乙烯酯、可降解性乳酸－乙醇酸共聚物(諸如，LUPRONDEPOTJ(由乳酸－乙醇酸共聚物及醋酸亮丙瑞林(leuprolide)構成之可注射性微球體))、及聚－D－(－)－3－羥基丁酸。
欲用於進行體內投藥之調配物須為無菌。此可藉由過濾通過無菌過濾膜而輕易完成。
V.以HER二聚化抑制劑進行治療
本文之發明提供一種延長癌症病患之TTP或存活之方法(該病患之癌症顯示HER活化作用)，其包含對該病患投藥HER二聚化抑制劑，其量可延長該病患之TTP或存活。較佳者，該HER二聚化抑制劑係HER2二聚化抑制劑及/或可抑制HER二聚化作用。
在一具體實例中，該病患之癌症顯示HER2活化情形，包括HER2磷酸化。較佳者，HER2磷酸化作用係使用磷酸－ELISA分析而評估。或者，HER2磷酸化作用可使用基因表現內容分析或藉由偵測HER之二聚物或異源二聚物而評估。
可以HER二聚化抑制劑治療之各種癌症實例已列於上文之定義章節。較佳之癌症包括卵巢癌；腹膜癌；輸卵管癌；乳癌，包括轉移性乳癌(MBC)；肺癌，包括非小細胞肺癌(NSCLC)；前列腺癌；及結腸直腸癌。在一具體實例中，該經治療之癌症係末期、頑固性、復發性、化療抗性、及/或鉑抗性癌症。
以HER二聚化抑制劑進行之治療可延長TTP及/或存活。在一具體實例中，以HER二聚化抑制劑進行之治療可延長TTP及/或存活達至少20%高於以可用於該欲治療癌症之已核准上市抗腫瘤劑或標準照護投藥時所能達成之TTP及/或存活。
在較佳具體實例中，本發明提供一種延長罹患卵巢、腹膜、或輸卵管癌之病患(其癌症顯示HER2活化作用)疾病惡化之時間(TTP)及存活之方法，其包含對該病患投藥波圖單抗(pertuzumab)，其量可延長該病患之TTP或存活。該病患可具有末期、頑固性、復發性、化療抗性、及/或鉑抗性之卵巢、腹膜、或輸卵管癌。對於該病患之波圖單抗投藥可，例如，延長TTP及/或存活達至少20%高於以拓撲替康或阿黴素脂質體對此種病患投藥時所能達成之TTP及/或存活。
該HER二聚化抑制劑係根據已知之方法而對人類病患投藥，諸如，靜脈內之投藥(如，以單次給藥劑量形式，或是以一段時間內之持續灌流)、肌內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑囊內、胸內、口服、局部、或吸入途徑。抗體之靜脈內投藥係較佳者。
就本發明或癌症之治療而言，HER二聚化抑制劑之劑量將取決於欲治療之癌症類型(如上所定義)、該癌症之嚴重性及進程、該抗體係因預防或治療目的而投藥、先前之治療、該病患之臨床病史及對該抗體之反應、以及主治醫師之判斷。
在一具實例中，其係投藥固定量之HER二聚化抑制劑。可以一次或是一系列治療之方式，將該固定劑量適當投藥至該病患體內。在投藥固定劑量時，較佳者，其係介於約20毫克至約2000毫克之HER二聚化抑制劑。舉例而言，該固定劑量可為約420毫克、約525毫克、約840毫克、或是約1050毫克之HER二聚化抑制劑，諸如，波圖單抗(pertuzumab)。
在進行一系列之投劑時，其可，例如，約每週一次、約每2週一次、約每3週一次、或約每4週一次進行投藥，但較佳者係約每3週一次。該固定劑量可，例如，繼續投藥直到疾病惡化、發生有害狀況、或其他由醫師判定之時間為止。舉例而言，可投藥自約2、3、或4，至約17次或以上之固定劑量。
在一具體實例中，其係投藥一或多次加樣劑量之抗體，再接續投藥一或多次維持劑量之抗體。在另一具體實例中，其係對該病患投藥複數次之相同劑量。
根據本發明之一較佳具體實例，其係投藥約840毫克(加樣劑量)之固定劑量HER二聚化抑制劑(如，波圖單抗)，再接續投藥約420毫克(維持劑量)之一或多劑該抗體。較佳者，該等維持劑量係以約每3週一次之方式投藥，共投藥至少2劑，至多達17次或以上之投劑。
根據本發明之另一較佳具體實例，其係，例如，每3週一次，投藥一或多劑約1050毫克之固定劑量HER二聚化抑制劑(如，波圖單抗)。根據此一具體實例，其係投藥1劑、2劑、或以上之固定劑量，如，進行一年(17循環)或視需要進行更長時間。
在另一具體實例中，其係投藥約1050毫克之固定劑量HER二聚化抑制劑(如，波圖單抗)作為加樣劑量，再接續投藥約525毫克之一或多劑維持劑量。根據此一具體實例，可每3週一次對該病患投藥約1劑、2劑、或以上之維持劑量。
儘管該HER二聚化抑制劑可以單一抗腫瘤劑之形式進行投藥，該病患可選擇性以HER二聚化抑制劑與一或多種化療劑之結合進行治療。較佳者，至少一種該等化療劑係抗代謝物化療劑，諸如，吉西他濱(gemcitabine)。該結合投藥包括共投藥或是同時之投藥(使用分離之調配物或單一醫藥調配物)，以及任一順序之連續投藥，其中較佳具有一段時期為該兩種(或全部)之活性劑皆同時展現其生物活性者。因此，該抗代謝物化療劑可在投藥該HER二聚化抑制劑之前或之後進行投藥。在此具體實例中，至少一次該抗代謝物化療劑投藥與至少一次該HER二聚化抑制劑投藥間之時間較佳係約1個月或以下，且最佳係2週或以下。或者，該抗代謝物化療劑及該HER二聚化抑制劑係同時對該病患投藥，以單一調配物或分離調配物之形式進行。以該化療劑(如，抗代謝物化療劑，諸如，吉西他濱)與該HER二聚化抑制劑(如，波圖單抗)所進行之結合治療可對該病患造成協同性，或是大於累加性之治療助益。
如進行投藥，抗代謝物化療劑通常係以其已知之劑量，或是選擇性之較低量(因藥物作用之結合或是由於投藥抗代謝物化療劑之負面副作用)而進行投藥。此等化療劑之製備及投劑流程可根據製造商之指示進行或是由熟習技藝之醫師以經驗判定。在該抗代謝物化療劑係吉西他濱時，較佳者，其係以介於約600 mg/m2 至約1250 mg/m2 間之劑量(例如，約1000mg/m2 )，例如，在一3週循環之第1及8天投藥。
除外該HER二聚化抑制劑及該抗代謝物化療劑，尚可結合其他療程。例如，可投藥第二(第三、第四等)化療劑，其中該第二化療劑可係另一不同之抗代謝物化療劑，或係並非抗代謝物之化療劑。例如，該第二化療劑可為紫杉烷(諸如，大平洋紫杉醇或多烯紫杉醇)、卡培他濱(capecitabine)、或鉑基礎性化療劑(諸如，卡鉑(carboplatin)、順鉑、或奧沙利鉑(oxaliplatin))、蒽環黴素(諸如，阿黴素(doxorubicin)，包括，阿黴素脂質體)、拓撲替康(topotecan)、培美曲唑(pemetrexed)、長春花生物鹼(諸如，去甲長春花鹼)、及TLK 286。可投藥不同化療劑之"雞尾酒"。
可與HER二聚化抑制劑結合之其他療劑包括下列任何一或多者：一種不同之第二HER二聚化抑制劑(例如，HER2抗體之生長抑制劑，諸如，曲妥珠單抗(trastuzumab)，或是可誘發HER2過表現細胞之脫噬作用之HER2抗體，諸如，7C2、7F3、或其人類化變體)；導向對抗不同腫瘤相關性抗原(諸如，EGFR、HER3、HER4)之抗體；抗激素化合物，如，抗雌激素化合物，諸如，他莫昔芬(tamoxifen)，或是芳環轉化酶抑制劑；心臟保護劑(以預防或降低與該治療相關之任何心肌官能障礙)；細胞因子；EGFR導向性藥物(諸如，TARCEVA7、IRESSA7、或西妥昔單抗(cetuximab))；抗血管新生劑(特別係貝伐單抗(bevacizumab)(由Genentech以商標AVASTINJ出售)；酪胺酸激酶抑制劑；COX抑制劑(例如，COX－1或COX－2抑制劑)；非類固醇性抗炎藥物塞洛克斯泊(celecoxib)(CELEBREX7)；法尼基轉移酶抑制劑(例如，可自Johnson and Johnson取得之Tipifarnib/ZARNESTRA7 R115777以及可自Schering－Plough取得之Lonafarnib SCH66336)；可結合癌胚蛋白CA 125之抗體(諸如，Oregovomab(MoAb B43.13))、HER2疫苗(諸如，取自Pharmexia之HER2 AutoVac疫苗、取自Dendreon之APC8024蛋白疫苗、或取自GSK/Corixa之HER2肽疫苗)；另一HER導向性治療(如，曲妥珠單抗、西妥昔單抗、ABX－EGF、EMD7200、吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、CP724714、CI1033、GW572016、IMC－11F8、TAK165等)；Raf及/或ras抑制劑(參見，例如，WO 2003/86467)；阿黴素HCl脂質體注射(DOXIL)；拓撲異構酶I抑制劑(諸如，拓撲替康)；紫杉烷；HER2及EGFR雙重酪胺酸激酶抑制劑(諸如，拉帕替尼(lapatinib)/GW572016)；TLK286(TELCYTA)；EMD－7200；治療噁心之藥物(諸如，血清緊張素拮抗劑、類固醇、或苯并二吖庚因)；可預防或治療皮膚發疹或標準痤瘡治療之藥物(包括局部或口服抗生素)；可預防或治療痢疾之藥物；降體溫藥物(諸如，乙醯基胺基苯、苯海拉明(diphenhydramine)、或哌替啶(meperidine))；造血生長因子等。
任何上述共投藥試劑之適當劑量皆係目前所用者，且可因該試劑與HER二聚化抑制劑之結合作用(協同性)而為較低。
除上述療程之外，可對該病患進行癌細胞之手術移除及/或放射治療。
在該抑制劑係抗體時，較佳者，該經投藥之抗體係裸抗體。然而，可使該投藥之抑制劑綴合胞毒劑。較佳者，該經綴合之抑制劑及/或其所連結之抗原係由該細胞內化，因而造成該綴合物滅殺其所結合癌細胞之治療作用增加。在一較佳具體實例中，該胞毒劑可導向或干擾該癌細胞中之核酸。此等胞毒劑之實例包括美登素類(maytansinoids)、卡奇黴素(calicheamicin)、核糖核酸酶、及DNA內切核酸酶。
本發明涵括以基因治療進行之HER二聚化抑制劑投藥。參見，例如，WO96/07321(1996年3月14日公開)有關使用基因治療而產生胞內抗體。
共有兩種主要之方法可將核酸(其選擇性含於載體中)置入病患之細胞；包括體內及體外方式。就體內之傳遞而言，可將該核酸直接注射進入該病患體內，通常係位於需求該抗體之位點。就體外之治療而言，其移除該病患之細胞，將該核酸引入此等經分離之細胞中，再以直接或是，例如，包納於植入該病患體內之孔狀膜中(參見，如，美國專利第4,892,538及5,283,187號)之方式，將該等經修飾之細胞投藥至該病患體內。各種不同之技術皆可用於將核酸引入活細胞中。該等技術根據欲以體外或體內之方式將該核酸轉移進入目標宿主之細胞中而各有不同。適用於在體外將核酸轉移進入哺乳動物細胞中之技術包括使用脂質體、電穿孔、微注射、細胞融合、DEAE－葡聚糖、磷酸鈣沉澱法等。常用於進行體外基因傳遞之載體系逆轉錄病毒。
目前較佳之體內核酸轉移技術包括使用病毒載體(諸如，腺病毒、簡單疱疹I病毒、或腺相關性病毒)及脂質體基礎性系統(可用以進行脂質中介性基因轉移之脂質係，例如，DOTMA、DOPE、及DC－Chol)之轉染。在部分情形下，其可為該核酸來源提供可導向該目標細胞之試劑，諸如，對於細胞表面之膜蛋白或對於該係目標細胞具有專一性之抗體、該目標細胞上受體之配位體等。在使用脂質體時，可使用可結合與胞吞作用相關之細胞表面膜蛋白之蛋白，以進行導向及/或協助攝入，如，對於特定細胞類型具有向性之衣殼蛋白或其片段、對抗在循環中可進行內化之蛋白之抗體、以及可導向胞內定位作用並增進胞內半生期之蛋白。受體中介性胞吞作用之技術述於，例如，Wu et al.,J.Biol.Chem.262：4429－4432(1987)；及Wagner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3410－3414(1990)。有關目前已知基因製備及基因治療流程之回顧評論，參見Anderson et al.,Science 256：808－813(1992)。亦參見WO 93/25673及其中所引述之參考文獻。
VI. 材料之寄存
下列之融合瘤細胞系已被寄存於美國形態培養物保藏中心(American Type Culture Collection,10801 University Boulevard,Manassas,VA20110－2209,USA)(ATCC)：
本發明之進一步細節茲由下列之非限制性實例說明。說明書中所有引述文獻之揭示內容皆明白納入本文作為參考。
實例1 波圖單抗於末期、頑固性、或復發性卵巢癌中之臨床活性以及HER2活化狀態之角色
此一實例係關於卵巢癌病患之一單臂、開放標記、多中心之第II期臨床試驗。以波圖單抗，一種人類化之HER2抗體，治療具有末期、頑固性、或復發性卵巢癌之病患。波圖單抗代表一類新的導向試劑，稱為HER二聚物抑制劑(HDIs)，其可抑制與EGFR、HER3、及HER4之二聚化作用，並抑制經由MAP及P13激酶之信號傳導。
招募65位具有復發卵巢癌之病患，其中61位接受"低劑量"單一藥劑波圖單抗之治療；波圖單抗係以靜脈內(IV)之方式，以840毫克之加樣接續每3週一次之420毫克劑量進行投藥。
以"高劑量"之波圖單抗治療第二群之病患；每3週一次之1050毫克劑量，以單一藥劑之方式投藥。在此群中，共招募64位病患，其中對62位對象進行治療。
在2、4、6、8、12、及16循環之後取得腫瘤評估。
由RECIST取得之反應率(RR)係第一終點。強制進行新鮮之腫瘤生檢，以使用如下文實例2所述之pHER2酶連免疫吸附分析，分析HER2磷酸化(pHER2)狀態。評估第1群對象之pHER2。額外並評估安全性及耐受性。
第二終點係TTP、反應持續期、存活持續期、藥物動力學(PK)、及FOSI(第2群)。
結果
圖9提供該等病患之基線人口統計。年齡中位值為57歲(35－83範圍)，且ECOG PS中位值係2。先前化療療程數目之中位值係5。
圖10－14敘述經治療病患體內之任何有害事件。波圖單抗係具有良好耐受性者。61%之病患具有腹瀉(第1－3級)情形。5%病患之射血分數降低至低於50%。
功效結果摘述於圖15。4%之病患具有部分反應(PR)。39%之病患具有穩定之疾病(SD)。如圖16所述，以420毫克波圖單抗治療病患之TTP中位值係7週，且以1050毫克波圖單抗治療病患之TTP中位值係6.6週。圖17提供經低劑量或高劑量波圖單抗治療病患之整體存活。存活之中位值係40週。圖18提供CA－125反應。波圖單抗可有效降低CA－125含量。此種抑低作用係卵巢癌病患體內治療有效性之指標。
評估第1群病患(經420毫克波圖單抗治療)之HER2活化狀態。該等結果示於圖19－23。約30%之卵巢癌病患係pHER2陽性(高於30%之腫瘤，ELISA如實例2所述進行)。再可進行功效及pHER2數據評估之病患中，26%係pHER2陽性。參見圖19。
pHER2＋病患之TTP中位值係21週，相對於pHER2－病患之6週，以及具有未知pHER2狀態病患之9週(圖20及22)。
在第1群之61位病患中，14位顯示波圖單抗活性之證據。唯一一位具有部分反應(PR)之病患係磷酸－HER2陽性考。參見圖21。
評估病患之整體存活。如圖23所示，以波圖單抗治療之pHER2陽性病患顯示具有優於使用拓撲替康(存活中位值為43週)或阿黴素脂質體(36週)所可達成之存活。
結論
作為單一藥劑，波圖單抗具有良好之耐受性。波圖單抗之毒性及功效似乎不為劑量相關性者。波圖單抗在末期、頑固性、或復發性之卵巢癌中皆具活性。相較於具有陰性pHER2狀態之對象，具有陽性pHER2狀態之對象顯示具有較高之TTP及存活功效。波圖單抗於顯示HER2活化之病患體內之功效(如以TTP或存活測量者)顯示為優於使用拓撲替康或阿黴素脂質體所可達成者，該等藥劑係目前用於治療具有末期、頑固性、或復發性卵巢癌病患之藥劑。
實例2 用以測定HER2活化之磷酸－HER2 ELISA
上文之實例1敘述評估波圖單抗在具有末期、頑固性、或復發性卵巢癌病患體內功效之臨床試驗。此一實例則描述用於測定實例1中治療病患HER2活化情形之分析發展。
咸發展磷酸－HER2 ELISA以測量人類卵巢癌組織裂解物中HER2－相關性酪胺酸磷酸化作用(HER2/pTyr)之濃度。該分析因有限之樣本體積而使用COSTART M 之96孔半區域性微滴定盤。該塗覆抗體係親和純化之山羊抗HER2 ECD，而該第二抗體係對於磷酸酪胺酸具有專一性之生物素化小鼠單株抗體(純系4G10)。參考標準值係SK－BR－3細胞裂解物，其分析範圍為132單位/毫升。一單位等於可在含277 pg總體HER2(以總體HER2 ELISA(Total HER2 ELISA)所測得)之SK－BR－3細胞裂解物中所測得之磷酸化酪胺酸含量。該ELISA係使用AMDEXT M 鏈黴親和素－HRP進行偵測並使用TMB作為受質。
材料
1.標準物材料，SK－BR－3細胞裂解物，1,056 U/mL HER2/pTyr 2.控制組來源，SK－BR－3細胞裂解物，1,056 U/mL 3.塗覆抗體，山羊抗HER2 ECD 9.6 mg/mL 4.次級抗體，生物素化小鼠抗磷酸酪胺酸，純系4G10，971 μg/mL(Upstate Biotech Cat #16－103)5.綴合HRP之AMDEXT M 鏈黴親和素(SA－HRP)(Amersham Biosciences Catalog No.RPN4401)6.受質，四甲基聯苯胺(TMB)過氧化物酶受質(Kirkegaard & Perry Labs[KPL]Catalog No.50－76－01)7.塗覆緩衝液，0.05 M碳酸鈉緩衝液，pH 9.6 8.分析稀釋劑，PBS/0.5% BSA/0.05% PolySorbate 20/0.05% PROCLIN 300T M ，pH 7.4 9.裂解緩衝液：鹼性裂解緩衝液(50 mM Tris－HCl/150 mM NaCl/5 mM EDTA/1% TRITON X－100T M )/1：10蛋白酶抑制劑雞尾酒混合物/1：100磷酸酶抑制劑雞尾酒混合物I/1：100磷酸酶抑制劑雞尾酒混合物II/50 mM氟化鈉/2 mM原釩酸鈉，pH 8.1 10.樣本、標準物、及控制組稀釋劑：裂解緩衝液11. MDA－468(ATCC# HTB－132)。HER2表現量：無。組織：人類乳腺，乳房，腺癌。12. MCF－7(ATCC# HTB－22)。HER2表現量：0(正常量之HER2表現)。組織：人類乳腺；乳房；表皮；轉移位點：胸腔積液腺癌。13. SK－BR－3(ATCC# HTB－30,Manassas,VA)。HER2表現量：3(高量之HER2表現)。組織：人類乳腺；乳房；轉移位點：胸腔積液腺癌。14. BT－474(ATCC# HTB－20,Manassas,VA)。HER2表現量：3(高量之HER2表現量)。組織：人類乳腺；乳房；乳管；乳管癌。15. BT－474腫瘤裂解物。對小鼠接種BT－474。2週後收取腫瘤。對取得之腫瘤進行勻質化處理，以產生腫瘤裂解物。
材料之製備
標準材料/貯物：該磷酸HER2 ELISA標準貯物係淨標準材料。藉由收集取自三個含SK－BR－3(SKBR3)細胞之245×245 mm細胞培養皿(其係80%至90%鋪滿)之裂解物而製備標準材料。離心以純化細胞裂解物，再收集上清液。使用該上清液作為標準材料。
指定該標準材料之濃度為1,056單位/毫升，以使該分析報導範圍內之最低刻度可為1單位/毫升。一單位係定義為在含277 pg總體HER2(以總體HER2 ELISA(Total HER2 ELISA)所測得)之SK－BR－3細胞裂解物中所測得之磷酸化酪胺酸含量。
細胞裂解物控制組：細胞裂解物控制組係自該標準材料製備。以裂解緩衝液稀釋該標準材料，以取得代表該分析標準曲線之低、中、及高範圍之HER2/pTyr含量。
組織裂解物控制組：組織裂解物控制組係自該BT474腫瘤裂解物製備。以裂解緩衝液稀釋該BT474腫瘤裂解物，以取得代表該分析標準曲線之高範圍之HER2/pTyr含量。
塗覆來源：以PBS將該來源物質稀釋至100微克/毫升而製備山羊抗HER2 ECD貯物I。
生物素化綴合物：自Upstate Biotech購得該生物素化小鼠抗磷酸酪胺酸抗體(1微克/毫升)。該抗體係一種對抗偶合KLH之磷酸酪胺培養之生物素化、A蛋白純化性單株IgG2b－。該生物素化單株抗磷酸酪胺酸抗體(純系4G10，Cat #05－321)對於磷酸酪胺酸具有專一性，且其不會與磷酸絲胺酸或磷酸羥丁胺酸交叉反應。
山羊抗HER2 ECD之專一性：當與其他家族成員之受體二聚化作用發生時即起始HER2受體活化作用。除非信號傳導係嚴格因HER2之同源二聚化作用造成，該活性腫瘤中必有EGFR、HER3、及/或HER4之表現。各個此等受體皆可存在於卵巢組織裂解物樣本中，且如此等受體可與該山羊抗體交叉反應，其可干擾HER2－相關性酪胺酸磷酸化作用(HER2/pTyr)之精確測量。
以表面電漿共振分析(BIACORE 3000,BIACOREInternational AB,Neuchtel,Switzerland)測定該山羊抗HER2 ECD之專一性。使用胺偶合化學，將山羊抗HER2 ECD抗體固定於CM5感應晶片上。以1 M之乙醇胺－HCl(pH 8.5)阻斷該感應晶片，再以10 mM HCl進行調節。藉將可溶性之重組EGFR(sEGFR)(Research Diagnostics,Inc.,Flanders,NJ)及重組人類HER2 ECD/人類IgG1 Fc融合蛋白注射於該經固定之山羊抗HER2抗體上而測定專一性。該等融合蛋白係由經由一肽連接子而融合至6X組胺酸標記性人類IgG1 Fc區域羧端之HER2、HER3、或HER4之ECD構成(R&D Systems,Minneapolis,MN)。
對於sEGFR、HER3－Fc、及HER4－Fc之參考值減去性相對反應分別係－41 RU、0.3 RU、及2.5 RU。由sEGFR取得之負值相對反應係因該移動相(HBS－EP)與該樣本賦形劑間之折射率變化。HER2－Fc之相對反應係374 RU。
方法
磷酸HER2 ELISA係使用COSTART M 半區域性微滴定盤，其塗覆4 μg/mL於0.5 M碳酸鈉緩衝液(pH 9.6)中之山羊抗HER2 ECD，並在2℃－8℃下進行恆溫共置18－72小時。以約150 μL/孔之分析稀釋劑對該等試驗孔進行1－2小時之阻斷，接著再加入50 μL/孔之標準物、控制組、及樣本。該卵巢癌組織裂解物之最低稀釋度係1/40於裂解緩衝液中。在室溫下，對該等標準物、控制組、及樣本進行2小時之恆溫共置，同時予以攪拌。以PBS/0.05 TWEEN 20T M 清洗該等試驗孔，在加入250 ng/mL之生物素化抗磷酸酪胺酸。2小時後，請洗該等試驗孔，再加入AMDEXT M 鏈黴親和素－HRP。AMDEXT M 鏈黴親和素－HRP(SA－HRP)係一種聚合性之綴合物，其具有多個酶標記連結於該鏈黴親和素上。15分鐘後，請洗該等試驗孔，再加入四甲基聯苯胺受質(TMB)，使其發展15分鐘，再以1 M磷酸中止反應。使用SPECTRAMAXT M 盤視讀器(Molecular Devices Corp.,Sunnyvale,CA)，以450 nm之濾鏡及650 nm之參考濾鏡測量吸收值。相對於七點標準曲線之非線性四參數邏輯適應而計算該等樣本濃度(Marquardt,D.J.Soc.Indust.Appl.Math.431－441(1963))。該ELISA之分析範圍係1至32單位/毫升。該等單位係獨斷性之單位，其中1單位等於含277 pg總體HER2之SK－BR－3細胞裂解物中所測得之磷酸化酪胺酸含量。該分析之下限設定為1單位/毫升，且其係由偵測之下限定義。
在重新指定該標準物質之濃度後，再次評估該磷酸HER2 ELISA之精確度。藉由判定SKBR3細胞裂解物中三種不同含量HER2/pTyr之偏離係數(CV)，評估分析內及分析間之精確度。對該SKBR3細胞裂解物進行稀釋，以取得代表該分析標準曲線之低、中、及高範圍之HER2含量。在重新指定該標準物質之濃度後，該高控制組即不再位於該分析標準曲線之高範圍中。因此，將一BT474組織裂解物控制組稀釋至落於該高範圍中。以5天之時間，由雙重試驗形式分析該等裂解物(其係作為分析控制組)。將該控制組數據引入STATVIEW中進行ANOVAT M 分析，以測定分析內及分析間之標準差。
如下計算CV值：100×(標準差)/(平均控制組值)
該BT474、高、中、及低控制組之分析內精確度CV分別係4%、4%、3%、及11%。該BT474、高、中、及低控制組之分析間精確度CV分別係5%、6%、5%、及14%。
在發展該磷酸HER2 ELISA時，以淨MDA468細胞裂解物將SKBR3細胞裂解物稀釋至22.9、6.39、及1.71 U/mL。以含有SKBR3 HER2/pTyr之裂解緩衝液稀釋該等樣本，以在基質作用被稀釋淡化之同時，在整個稀釋系列中維持恆定量之HER2/pTyr。在該磷酸HER2 ELISA中分析該稀釋系列，並與無MDA468之SKBR3 HER2/pTyr進行比較，以判定回收率。
如下計算回收百分比：
在MDA468細胞裂解物存在下於三種含量之SKBR3 HER2/pTyr回收結果顯示，該基質可在介於淨及1/16(1.71 U/mL含量)間之樣本稀釋度中顯著增進回收，其HER2/pTyr回收率介於120%及127%間。並未在任何其他含量下觀察到基質干擾。在始於裂解緩衝液之1/16樣本稀釋度之各個含量下，顯示出介於80%及120%之回收。
以裂解緩衝液對卵巢及BT474腫瘤裂解物進行兩倍之系列稀釋，並在該磷酸HER2 ELISA中分析。在研發過程中分析之BT474起始稀釋度係1/20。在重新指定該標準物質濃度後分析該等卵巢裂解物。該等卵巢裂解物之起始稀釋物隨所預期之濃度而各有不同。
如下計算稀釋系列之差異百分比，其係樣本稀釋物線性之指標：
自1/80、1/160、或1/320之稀釋度起始，計算卵巢組織裂解物HF8198之差異百分比。自1/320、1/640、或1/1280之稀釋度起始，計算卵巢組織裂解物HF7945之差異百分比。自1/20或1/40之稀釋度起始，計算其餘卵巢組織裂解物之差異百分比，以判定該最低稀釋度並評估稀釋之線性。
BT474稀釋系列之差異係由－9%至12%。自1/10稀釋起始之HF7930及HF7934稀釋系列之差異分別係43%及38%。自1/320、1/160、及1/1280起始之HF8197系列稀釋之差異分別係2%、8%、及5%。自1/80、1/160、及1/320起始之HF8198系列稀釋之差異分別係72%、34%、及3%。
在變更該標準物質濃度後，在該磷酸HER2 ELISA中，分析18種不同之卵巢組織裂解物。自1/20至1/60，對樣本進行兩倍之稀釋。其中一個樣本係1/20稀釋之LTR；10個樣本係1/40稀釋之LTR。共有7個樣本在1/20及1/40之稀釋下具有可測量含量之HER2/pTyr，且有1個樣本在高達1/80之稀釋下仍具有可測量含量之HER2/pTyr。對於在1/20及1/40之稀釋下具有可測量含量HER2/pTyr之樣本，其差異度介於自16%至34%不等，而該7個樣本中之三者具有低於20%之差異度。該在高達1/80之稀釋下仍具有可測量含量HER2/pTyr之樣本，樣本HF7931，在其以1/20及1/40起始之系列稀釋分別具有16%及4%之差異。
在該磷酸HER2 ELISA中分析波圖單抗(pertuzumab)及曲妥珠單抗(trastuzumab)，以判定此等療劑是否會產生干擾。以含98.48 U/mL HER2/pTyr之賀熱固林(heregulin)激發性MCF7(MCF7＋)細胞裂解物，將該等抗體稀釋至介於自1.5至10,000 ng/mL之濃度。
在研發過程中，對細胞及組織裂解物進行四循環之冷凍及解凍，以測定溫度循環之作用。在室溫下解凍冷凍之SKBR3細胞裂解物及BT474腫瘤裂解物。自各裂解物中取出10 μL，並以分析稀釋劑進行稀釋。在乾冰及假脣脂混合物中，急速冷凍剩餘之裂解物，接著再次解凍。再次取出試驗樣本，並以分析稀釋劑進行稀釋(第一冷凍/解凍樣本，1x)。重複兩次該急速冷凍、解凍、及收集樣本之流程，以自該第二及第三冷凍循環中取得樣本(分別為2x及3x)。
在該磷酸HER2 ELISA中分析該等經稀釋之樣本，以判定相對於"新鮮"樣本之HER2/pTyr回收。該"新鮮"樣本係取自該最初解凍步驟之樣本。
1x、2x、及3x樣本之SKBR3 HER2/pTyr回收分別係104%、109%、及113%。樣本314A之1x、2x、及3x樣本BT474 HER2/pTyr回收分別係99%、103%、及99%。樣本365之1x、2x、及3x樣本BT474 HER2/pTyr回收分別係111%、96%、及99%。
設定該定量下限(LLOQ)為低控制組之平均濃度1.35 U/mL。由於該低控制組包含於各個實驗中，其係可精確測量樣本下限之可靠指標。因此，該磷酸HER2 ELISA之最低可定量濃度係該LLOQ乘以該最低樣本稀釋度(1/40)，或54 U/mL。
結論
咸發展出一種敏感且精確之ELISA，以測量腫瘤組織裂解物中之HER2相關性酪胺酸磷酸化作用(HER2/pTyr)。該磷酸HER2 ELISA顯示具有低達1.35 U/mL之敏感度，且其最低可定量濃度係54 U/mL，其中1 U係等於含277 pg總體HER2之SK－BR－3細胞裂解物中所測得之磷酸化酪胺酸含量。該磷酸HER2 ELISA顯示在四種含量層級具有優良之精確度。該BT474組織裂解物控制組以及該高、中、及低SKBR3組織裂解物控制組之分析內精確度CV分別係4%、3%、3%、及11%。該BT474組織裂解物控制組以及該高、中、及低SKBR3組織裂解物控制組之分析間精確度CV分別係5%、6%、5%、及14%。
該磷酸HER2 ELISA顯示在MDA468細胞裂解物存在下之優良HER2/pTyr回收。自1/16之稀釋起始，回收係介於自88%至120%。該ELISA顯示高專一性，因EGFR、HER3－IgG Fc、及HER4－IgG Fc不會與該分析塗覆物交叉反應。
使用人類卵巢腫瘤及BT474小鼠異種移植腫瘤組織裂解物分析稀釋之線性以及最低樣本稀釋度。BT474腫瘤裂解物之稀釋差異校正值係介於自－9%至12%。於該7個在1/20及1/40之稀釋下具有可測量含量HER2/pTyr之樣本中，僅有三者具有低於20%之差異度，而該七者中之六者具有低於或等於23%之差異度。該在高達1/80之稀釋下仍具有可測量含量HER2/pTyr之樣本，樣本HF7931，在其以1/40起始之系列稀釋具有4%之差異。所有之上述樣本在1/20之最低稀釋度皆不符合20%之標準，因此，該最低樣本稀釋度應係1/40。
BT474組織裂解物以及人類卵巢組織裂解物樣本HF8197及HF8198具有高可測量含量之HER2/pTyr，且其需要介於1/80至1/320之稀釋以落於該分析之定量範圍內。該等BT474樣本及樣本HF8197(其具有在該人類卵巢癌組織次群中所測得之最高HER2/pTyr濃度)在整個分析範圍之中皆可以線性方式稀釋。相對的，樣本HF8198則係以非線性之方式稀釋，因該HER2/pTyr濃度之稀釋校正值在整個分析範圍中持續一致的增加，且在1/320之稀釋時顯示到達平台。
進行三次冷凍/解凍循環之SKBR3細胞裂解物顯示極佳之回收情形。相對於相同之新鮮解凍性樣本，其HER2/pTyr回收係介於自104%至113%。
亦對兩種BT474腫瘤裂解物進行三次之冷凍/解凍循環。BT474之磷酸HER2回收介於自99%至103%。BT474之HER2/pTyr回收介於自96%至111%。因此，溫度循環似乎並不會影響磷酸HER2活性。
該磷酸HER2 ELISA並未顯示由波圖單抗(pertuzumab)或曲妥珠單抗(trastuzumab)所產生之任何干擾。
實例3 用以測定HER2活化作用之基因表現內容分析
此一實例顯示如何可藉由測定基因表現內容作為直接測定HER2磷酸化作用之替代法而評估HER2之活化作用。此種內容分析可以新鮮、冷凍、或是福馬林固定性石蠟包埋性之卵巢癌樣本進行測定，但較佳係後者。
使用AFFYMETRIX微陣列分析，根據製造商之指示進行，對經波圖單抗處理之卵巢癌樣本進行基因表現內容分析。分析該微陣列之表現數據，以辨識可能與HER2磷酸化作用狀態相關之基因模式。值得注意者，在此分析中出現一種模式，其中相對高含量之EGFR、HER2、HER3、及HER配位體β 細胞素表現亦為HER2磷酸化作用陽性。於六個HER2磷酸化作用陽性之案例中，六者皆顯示該相關性之陽性，且在使用微陣列表現數據作為該算法之基礎時，未有任何HER2磷酸化作用陰性之案例被預測為陽性。
在第二分析中，其係僅使用單一基因(亦即，β細胞素)而達成HER2磷酸化作用之預測。在再次使用微陣列表現數據之情形下，全部該六個HER2磷酸化作用陽性腫瘤皆具有高於中位值之β 細胞素表現量。
可使用可用以定量基因表現之第二方法，定量性實時聚合酶連鎖反應(qRT－PCR)，證實該微陣列數據並與其進行比較。qRT－PCR係在可自臨床環境下取得之典型病患樣本中測量基因表現之較佳方法。可用於此方法之診斷技術平台係既已獲得建立者。qRT－PCR係如Cronin et al.,Am.J.Pathol.164(1)：35－42(2004)；及Ma et al.,Cancer Cell 5：607－616(2004)所述進行。使用取自Qiagen,Valencia,California之市售可得試劑，自冷凍卵巢癌中萃取RNA。設計用以進行TAQMANT M qRT－PCR分析之引子及探針，以產生約100個鹼基或以下長度之擴增子。使用TAQMANT M 工具(Applied BioSystems)，由qRT－PCR定量轉錄物，並以參考基因之表現量對試驗基因之表現量進行常態化處理。因其低度之差異及高度之表現而選擇"管家"基因GUS作為控制組基因。
根據上述之實驗，根據由ELISA已知其HER2磷酸化狀態之腫瘤之基因表現內容分析數據發展出一種算法。如其具有與HER2磷酸化作用相關之基因表現內容，其中具有中位值或以上之β細胞素或雙調蛋白以及HER2表現，及/或中位值或以上之EGFR及/或HER3表現，該腫瘤即視為陽性。或者，可由qRT－PCR單獨測量β細胞素或雙調蛋白之表現，以辨識具有預測HER2磷酸化作用之腫瘤。
圖1提供蛋白結構之圖示，以及其胞外域蛋白域I－IV之胺基酸序列(分別為序列編號Nos.19－22)。
圖2A及2B說明小鼠單株抗體之輕鏈可變域(VL )(圖2A)及重鏈可變域(VH )(圖2B)(分別為序列編號Nos.1及2)；變體574/波圖單抗之VL 及VH 域(分別為序列編號Nos.3及4)；以及人類VL 及VH 共有框構(hum1，輕鏈次群I；，humIII重鏈次群III)(分別為序列編號Nos.5及6)之胺基酸序列排比。星號辨識出波圖單抗與小鼠單株抗體2C4之可變域間或是波圖單抗與該人類框構可變域間之差異。互補決定區域(CDRs)示於中括號內。
圖3A及3B顯示波圖單抗之輕鏈(圖3A，序列編號No.13)及重鏈(圖3B，序列編號No.14)胺基酸序列。CDRs以粗體顯示。該輕鏈及重鏈之分子量計算值係23,526.22 Da及49,216.56 Da(半胱胺酸為還原形式)。糖類分子部分連結於該重鏈之Asn 299上。
圖4以圖示說明2C4於異源二聚結合位點之結合，因而阻止其與經活化EGFR或HER3之異源二聚化作用。
圖5說明HER2/HER3與MAPK及Akt途徑之結合。
圖6比較曲妥珠單抗(trastuzumab)與波圖單抗(pertuzumab)之各種不同活性。
圖7A及7B分別顯示曲妥珠單抗之輕鏈(圖7A，序列編號No.15)及重鏈(圖7B，序列編號No.16)胺基酸序列。
圖8A及8B分別說明一變體波圖單抗輕鏈序列(圖8A，序列編號No.17)及一變體曲妥珠單抗重鏈序列(圖8B，序列編號No.18)。
圖9提供實例1中治療病患之基線人口統計。
圖10顯示所有等級3－4之有害事件(不論其與治療之相關性)。
圖11顯示所有嚴重之有害事件(不論其與治療之相關性)。
圖12摘述經研究者判斷與試驗藥物相關之嚴重有害事件。
圖13提供所選有害事件之資訊。
圖14說明心臟之嚴重有害事件及需要正式報導之有害事件。
圖15摘述實例1中波圖單抗第II期試驗之功效結果。
圖16顯示對於經低劑量(420 mg)或高劑量(1050 mg)波圖單抗治療之可評估性卵巢癌對象之疾病惡化時間(TTP)功效。
圖17顯示對於經低劑量(420 mg)或高劑量(1050 mg)波圖單抗治療之可評估性卵巢癌對象之整體存活功效。經拓撲替康治療卵巢癌對象之存活歷史中位值為43週，且就阿黴素脂質體而言係36週。
圖18提供經420 mg或1050 mg波圖單抗治療之卵巢癌對象之CA－125反應。
圖19提供經420 mg波圖單抗治療之卵巢癌對象之磷酸－HER2(pHER2)狀態(如以ELISA所測定者)。
圖20提供經420 mg波圖單抗治療之卵巢癌對象由pHER2狀態(如以ELISA所測定者)顯示之臨床功效結果。
圖21提供經420 mg波圖單抗治療之卵巢癌病患顯示活性證據(部分反應PR，或是超過18週之穩定疾病SD)之pHER2狀態(如以ELISA所測定者)。BSLD係指最大直徑之基線總和。
圖22提供由pHER2狀態顯示之TTP功效。卵巢癌病患係經420 mg之波圖單抗治療。整體TTP係6.6週；pHER陽性對象之TTP係20.9週；pHER陰性對象之TTP係6.0週；且具未知pHER2狀態對象之TTP係9.1週。
圖23說明由pHER2狀態顯示之整體存活。卵巢癌病患係經420 mg之波圖單抗治療。經拓撲替康治療卵巢癌對象之存活歷史中位值為43週，且就阿黴素脂質體而言係36週。
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Claims (29)

  1. 一種波圖單抗(pertuzumab)之用途，其係用於製造用以延長癌症病患疾病惡化之時間(TTP)或存活之藥物，其中以一定量之波圖單抗投與病患可延長病患疾病惡化之時間(TTP)或存活，其中該癌症係選自卵巢癌、腹膜癌、輸卵管癌、乳癌、非小細胞性肺癌(NSCLC)、前列腺癌及結腸直腸癌所組成之群，且其中該藥物包含420毫克之波圖單抗。
  2. 根據請求項1之用途，其中該病患之癌症呈現HER2之活化。
  3. 根據請求項1或2之用途，其中該病患之癌症呈現HER2之磷酸化。
  4. 根據請求項3之用途，其中該病患之癌症於磷酸-ELISA分析評估呈現HER2之磷酸化。
  5. 根據請求項1或2之用途，其中該病患之癌症以基因表現內容分析評估呈現HER2之活化。
  6. 根據請求項1或2之用途，其中該藥物係裸抗體。
  7. 根據請求項1或2之用途，其中該藥物係完整抗體。
  8. 根據請求項1或2之用途，其中該藥物係包含完整波圖單抗(pertuzumab)之抗原結合區域之抗體片段。
  9. 根據請求項1或2之用途，其中該癌症係卵巢癌、腹膜癌或輸卵管癌。
  10. 根據請求項9之用途，其中該癌症係末期、頑固性或復發性卵巢癌。
  11. 根據請求項1或2之用途，其中該癌症係乳癌。
  12. 根據請求項11之用途，其中該癌症係轉移性乳癌(MBC)。
  13. 根據請求項1或2之用途，其中波圖單抗(pertuzumab)係以單一抗腫瘤劑之形式投藥。
  14. 根據請求項1或2之用途，其中波圖單抗(pertuzumab)係與第二療劑共同投與病人。
  15. 根據請求項14之用途，其中該第二療劑係選自化療劑、非波圖單抗(pertuzumab)之HER抗體、對抗腫瘤相關性抗原之抗體、抗激素化合物、心臟保護劑、細胞因子、EGFR-導向性藥物、抗血管新生劑、酪胺酸激酶抑制劑、COX抑制劑、非類固醇性抗炎藥物、法尼基轉移酶(farnesyl transferase)抑制劑、可結合癌胚蛋白CA 125之抗體、HER2疫苗、HER導向性治療、Raf或ras抑制劑、阿黴素脂質體(liposomal doxorubicin)、拓撲替康(topotecan)、紫杉烷(taxane)、雙重酪胺酸激酶抑制劑、TLK286、EMD-7200、治療噁心之藥物、可預防或治療皮膚發疹或標準痤瘡治療之藥物、可預防或治療痢疾之藥物、降體溫藥物及造血生長因子所組成之群。
  16. 根據請求項15之用途，其中該第二療劑係化療劑。
  17. 根據請求項15之用途，其中該化療劑係抗代謝物化療劑。
  18. 根據請求項17之用途，其中該抗代謝物化療劑係吉西他濱(gemcitabine)。
  19. 根據請求項14之用途，其中該第二療劑係曲妥珠單抗(trastuzumab)、埃羅替尼(erlotinib)、或貝伐單抗 (bevacizumab)。
  20. 根據請求項1或2之用途，其中TTP獲得延長。
  21. 根據請求項1或2之用途，其中存活獲得延長。
  22. 一種波圖單抗(pertuzumab)之用途，其係用於製造用以延長罹患卵巢癌、腹膜癌、輸卵管癌或乳癌之癌症病患疾病惡化之時間(TTP)或存活之藥物，其中以一定量之波圖單抗投與病患可延長病患疾病惡化之時間(TTP)或存活，其中該藥物包含420毫克之波圖單抗。
  23. 根據請求項22之用途，其中該病患具有卵巢癌。
  24. 根據請求項22或23之用途，其中該病患具有末期、頑固性或復發性之癌症。
  25. 根據請求項22之用途，其中該癌症係乳癌。
  26. 根據請求項25之用途，其中該癌症係轉移性乳癌(MBC)。
  27. 根據請求項22或23之用途，其中該藥物係與化療劑共同投與病患。
  28. 根據請求項27之用途，其中該化療劑係抗代謝物化療劑。
  29. 根據請求項28之用途，其中該抗代謝物化療劑係吉西他濱(gemcitabine)。
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