CN103890010B - 抗‑人‑her3抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于分离的抗‑人‑HER3抗体或其片段。更具体地本发明提供一种分离的单克隆抗体，其特异结合至HER‑3的细胞外结构域并且与可获自作为CNCM‑I‑4486保藏的杂交瘤产生的抗体竞争结合至人HER‑3的细胞外结构域。本发明中描述的抗体本发明可用于治疗癌症。

Description

抗-人-HER3抗体及其用途
发明领域:
本发明涉及抗-人-HER3抗体及其在诊断和治疗方法中的用途。
发明背景:
受体酪氨酸激酶(RTK)的人表皮生长因子受体ErbB/HER家族包括四个成员：EGFR(ErbB1/HER1),HER2(c-Neu,HER2),HER3(HER3)和HER4(HER4)。HER受体包括由四个结构域（标记为1至4）的胞外糖基化结构域、接着是跨膜结构域和用于耦合至信号转导路径的含有激酶结构域的胞内C-末端部。除了HER3，该胞内区域含有酪氨酸激酶活性。信号转导通过通过配体诱导的受体二聚化和随后的导致细胞质信号转导路径活化的磷酸化介导。HER2没有特定配体因为它天然处于″活性”构象。其他HER受体作为无活性单体存在，其中分子以阻止二聚化的方式折叠。结合至结构域1和3的配体诱导最终暴露所述受体的结构域2中的二聚化环的主要构象变化。二聚化环的这种暴露允许受体二聚化。
HER3受体，其首次在1990年描述，是仅有的内在激酶活性的HER家族成员受体，并且下游信号转导通过异源二聚化实现。因此，HER3受体，作为单体，被称为″异物(non-self)″并且不能形成同二聚体。配体神经生长因子(Heregulin)(HRG)与HER3受体的结合触发HER3与其他HER家族受体(HER2优先)的异源二聚化。在该异源二聚体内，HER3激酶结构域充当其HER家族伴侣的变构激活剂。
HER3在各种癌症包括乳腺癌和卵巢癌的肿瘤形成中是复杂的(Lee-Hoeflich ST,Cancer Res.2008;McIntyre E,Breast Cancer Res Treat.2010;Tanner B,J ClinOncol.2006)。HER3表达与肿瘤进展和恶性黑色素瘤和转移中的患者存活减少相关联，并且与卵巢癌存活降低相关。重要地，在乳腺癌中，具有低HER2表达的肿瘤，其不适于赫赛汀(Herceptin)治疗，经常被“程序化”以强烈表达HER3(Smith et al.Br.J.Cancer2004),以及HER2+++肿瘤，其在长期治疗后变得对赫赛汀是抗性的，被“再程序化”以强烈表达HER3(Narayan,Cancer Res.2009)。西妥昔单抗(Cetuximab)抗性也与肺癌(Wheeler,Oncogene2008)和结直肠癌(Lu Cancer Res 2007)中的HER3过表达，以及EGFR内在化/降解的失调相关。最近，HER3过表达与结直肠癌中的更差的无转移存活相关(Ho-Pun-Cheung,Int JCancer 2010)。因此，HER3过表达和通过PI3K/AKT路径激活的补偿性信号转导在形成对用HER-靶向疗法(抗体和TKI)(Wheeeler 2008,Lu 2007,Narayan,2009,Sergina,2007)而且对用IGFR-靶向疗法(Desbois-Mouthon,Clin Cancer Res 2009)和用化疗剂(Kruser,ExpCell Res 2010)的治疗的抗性中是复杂的。
所有这些发现表明，HER3-靶向剂，并且尤其是抗体，可能有助于进一步理解HER3信号转导在癌症中的作用并且特别是用作有效的免疫治疗剂。
在目前，没有商业化的治疗性抗-HER3抗体，尽管特定文献强烈强调在治疗肿瘤学中靶向HER3的意义。两种人抗体目前处于Merrimack Pharmaceuticals/Sanofi Aventis(MM-121抗体;PCT WO2008/100624)和U3 PharmaAG/Daiichi Sankyo/Amgen(U3-1287或AMG-888;PCT WO2007/077028)的开发中。MM-121抗体参与在NSCLC的I期临床试验和ER+PR+HER2-乳腺癌中的I/II期试验。U3-1287抗体处于与厄洛替尼(Erlotinib)联合在NSCLC中的I期。一种EGFR/HER3双特异性抗体DL11f(Genentech;PCT WO2010/108127)仍然处于研究开发中。一种HER2/HER3双特异性抗体MM-111(Merrimack Pharmaceuticals;PCT WO2005/117973,WO2006/091209)在HER2-扩增乳腺癌中，单独或联合曲妥珠单抗或拉帕替尼，参与I/II期临床试验。
所有以上提及的抗体阻挡HER3受体的神经生长因子-结合位点，由此减少对配体-成瘾肿瘤的这些抗体疗法。用不针对HER3受体的神经生长因子-结合位点的抗体靶向HER3应使得有可能有可能在抗性HER2-扩增乳腺癌中绕过对靶向疗法或化疗法的抗性，拓宽靶向疗法对HER2低乳腺癌的应用领域，其在目前不适于这样的治疗，或者治疗三阴性乳腺癌，其表达HER3并且还没有可用的靶向疗法。
发明内容:
本发明提供用于分离的抗-人-HER3抗体或其片段。
本发明的一方面提供一种分离的单克隆抗体，其特异地结合至HER-3的细胞外结构域和与可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤产生的抗体竞争结合至人HER-3的细胞外结构域。
本发明的另一方面涉及一种单克隆抗体，其包含可变轻链(VL)和可变重链(VH)，所述可变轻链(VL)包括可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤的抗体的VL链的CDR，并且所述可变重链(VH)包含可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤的抗体的VH链的CDR。
本发明的另一方面涉及一种单克隆抗体，其包含可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤的抗体的VL链和可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤的抗体的VH链。
本发明的另一方面涉及一种单克隆嵌合抗体，其包含可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤的抗体的可变结构域。
本发明的另一方面涉及一种单克隆人源化抗体，其包含可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤的抗体的CDR。
本发明的另一方面因此涉及一种可获自以CNCM保藏号I-4486可得的鼠类单克隆抗体(16D3-C1)。
本发明还提供提供所述抗体的抗体片段，其包括但不限于Fv,Fab,F(ab’)2,Fab’,dsFv,scFv,sc(Fv)2和双特异抗体。
发明详述：
本发明的发明人已表征了一种鼠类抗-人-HER3抗体。尤其是，本发明的发明人已在2011年5月17日依据布达佩斯条约保藏了一种产生在法国国家培养物和微生物保藏中心(CNCM,Institut Pasteur,25 rue du Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15,France)的鼠类抗-人-HER3抗体（murine anti-human-HER3 antibody）(16D3-C1)。所保藏的杂交瘤（hybriddoma）具有CNCM保藏号I-4486。本发明的发明人尤其已证实，这种抗体是异源二聚体HER2-HER3复合物形成的有效抑制剂，以及抑制与配体神经生长因子无关。
定义:
术语“HER3”是指如在Plowman等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:4905-4909(1990);还参见Kani等,Biochemistry44:15842-857(2005),Cho and Leahy,Science297:1330-1333(2002))中描述的人HER3受体。HER3也称为″HER3”。
术语“抗-人-HER3抗体”是指一种针对人HER3的抗体。
根据本发明，“抗体”或“免疫球蛋白”具有相同含义，并且将同等地用于本发明中。如本文中使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性蛋白质，即，含有免疫特异地结合抗原的抗原结合位点的分子。同样，术语抗体不仅涵盖完全抗体分子，而且抗体片段以及抗体和抗体片段的变体(包括衍生物)。在天然抗体中，两个重链彼此通过二硫键连接并且每个重链通过二硫键连接至轻链。有两种类型的轻链λ(l)和κ(k)。有有个主要重链类(或同种型)，其决定抗体分子的功能活性：IgM,IgD,IgG,IgA和IgE。每个链含有不同的序列结构域。轻链包括两个结构域，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1,CH2和CH3,集中地称为CH)。两个轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定对抗原的结合识别和特异性。轻链(VL)和重链(VH)的恒定区结构域赋予重要的生物学性质如抗体链缔合、分泌、经胎盘流动性、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-末端部并且由一个轻链和一个重链的可变部分组成。所述抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变或互补决定区(CDR)的残基组成。有时，来自肺高变或读框区(FR)的残基影响总体结构域结构并因此结合位点。互补决定区或CDR是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区域的结合亲和性和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别命名为L-CDR1,L-CDR2,L-CDR3以及H-CDR1,H-CDR2,H-CDR3。因此，抗原结合位点包括六个CDR，包含来自重链和轻链V区域每一个的CDR组。框架区域(FR)是指插入在CDR之间的氨基酸序列。
术语″嵌合抗体″是指这样一种抗体，其包含来源于16D3-C1抗体的抗体的VH结构域和VL结构域，以及人抗体的CH结构域和CL结构域。
根据本发明，术语″人源化抗体″是指这样一种抗体，其具有来自人抗体的可变区域框架和恒定区域但保留16D3-C1抗体的CDR。
术语“Fab”是指具有约50,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中在通过用蛋白酶（木瓜蛋白酶）处理IgG获得的片段中，H链和整个L链的N-末端侧的约一半通过二硫键结合在一起。
术语“F(ab′)2”是指具有约100,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，在通过用蛋白酶(胃蛋白酶)处理IgG获得的片段中，其稍大于经由铰链区域的二硫键结合的Fab。
术语“Fab′“是指具有约50,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其是通过切割F(ab′)2的铰链区域的二硫键获得的。
单个链Fv(“scFv”)多肽是共价连接的VH::VL异源二聚体，其通常表达自包括编码通过肽编码连接物连接的基因的VH和VL的基因融合体。“dsFv”是通过二硫键稳定化的VH::VL异源二聚体。二价和多价抗体片段可以通过单价scFv结合而自发地形成，或者可以通过肽连接物偶联单价scFV产生，如二价sc(Fv)2。
术语″双特异抗体″是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含连接至同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对的连接物，所述结构域被迫与另一个链的互补结构域配对并且生成两个抗原结合位点。
当提及根据本发明的抗体或核苷酸序列时，″纯化的″和″分离的″是指指定的分子以实质上没有相同类型的其他生物学大分子存在。如本文使用的，术语″纯化的″是指存在至少75重量%,更优选至少85重量%,仍更优选至少95重量%,并且最优选至少98重量%的同类型的生物学大分子。编码特定多肽的“分离的”核酸分子是指这样的核酸分子，其基本上没有不编码该多肽的其他核酸分子；然而该分子可以包括一些不会有害地影响所述组合物的基本特性的额外碱基或部分。
本发明的抗体:
本发明提供用于分离的抗-人-HER3抗体或其片段.特别是，本发明的发明人已于2011年5月17日依据布达佩斯条约在法国国家培养物和微生物保藏中心(CNCM,InstitutPasteur,25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15,France)保藏了产生杂交瘤的鼠类抗-人-HER3抗体(16D3-C1)。所保藏的杂交瘤具有CNCM保藏号I-4486。
本发明的一方面提供一种分离的单克隆抗体，其特异地结合至HER-3的细胞外结构域并且与可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤产生的抗体竞争结合至人HER-3的细胞外结构域。
在一个特定实施方式中，所述抗体选自由以下各项组成的组：鼠抗体,嵌合抗体,人源化抗体和人抗体。
本发明的另一方面涉及一种包含可变轻链(VL)和可变重链(VH)的单克隆抗体，所述可变轻链(VL)包含可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤的抗体的VL链的CDR，所述可变重链(VH)包含可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤的抗体的VH链的CDR。
本发明的另一方面涉及一种单克隆抗体，其包含可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤的抗体的VL链和可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤的抗体的VH链。
本发明的另一方面涉及一种单克隆嵌合抗体，其包含可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤的抗体的可变结构域。
本发明的另一方面涉及一种单克隆人源化抗体，其包含可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤的抗体的CDR。
因此本发明的另一方面涉及一种鼠类单克隆抗体(16D3-C1)，其可获自以CNCM保藏号I-4486可得的杂交瘤。
本发明还提供所述抗体的抗体片段，其包括但不限于Fv,Fab,F(ab’)2,Fab’,dsFv,scFv,sc(Fv)2和双特异抗体。
竞争性结合测定:
因此本发明涉及一种分离的单克隆抗体，其特异地结合至HER-3的细胞外结构域并且与可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤产生的抗体竞争结合至人HER-3的细胞外结构域。
表位框并可以用来鉴别落入所要求保护的发明的范围的抗体。表位框并是指使用竞争性结合测定来鉴别能够或不能够同时结合HER3的抗体对，由此鉴别结合至HER3上的相同或重叠表位的抗体对。表位框并实验提供存在抗原不同的表位的证据。对于结合的竞争可以评价任何抗体对或片段。例如，使用适当的检测试剂，来自任何来源的抗体或结合片段的结合特异性可以与本文中的公开的单克隆抗体的结合特异性进行比较。表位框并可以用“分离的抗体”或细胞培养物上清进行。经常地，用第一轮克隆上清进行框并以引导克隆的选择以进一步开发。要比较的抗体应基本上是同质的抗原结合结构域。在“双特异的”或“双功能的”抗体的情况下，两个不同结合位点的结合特异性需要独立地进行评价或框并。
本发明的抗体可以通过本领域已知的任何方法测定特异性结合。许多不同的竞争性结合测定形式可以用于表位框并。可以使用的免疫测定包括但不限于竞争性测定系统，使用的技术如蛋白质印迹，放射免疫测定，ELISA，“夹心”免疫测定，免疫沉淀，沉淀素测定，凝胶扩散沉淀素测定，免疫放射量测定，荧光免疫测定，蛋白质A免疫测定和补体结合测定。这样的测定是常规的并且在本领域是熟知的(参见例如，Ausubel等,eds,1994 CurrentProtocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & sons,Inc.,New York)。例如，BIACORE(GE Healthcare,Piscaataway,NJ)是常规用于单克隆抗体的表位框并组的各种各样的表面细胞质基因组共振测定形式之一。另外，可以进行常规的交叉封闭测定如在Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow和DavidLane,1988中描述的那些。
制备本发明的抗体的方法:
本发明的抗-人-HER3抗体可以通过本领域已知的任何技术如但不限于任何化学、生物、遗传或酶技术，或单独或组合来制备。
已知所需序列的氨基酸序列，本领域技术人员可以容易地通过用于制备多肽的标准技术制备所述抗体。例如，它们可以使用熟知的固相方法，优选使用商业上可获得的肽合成设备(如由Applied Biosystems,Foster City,California制造的)并依照制造商说明制造。可替换地，本发明的抗体可以通过本领域熟知的重组DNA技术合成。例如，抗体可以作为在编码抗体的DNA序列整合到表达载体中并且将这样的载体引入到将表达所需抗体的合适真核或原核宿主中之后的DNA表达产物获得，它们可以使用熟知的技术在后来从其分离。
因此，本发明的另一个目的涉及一种编码根据本发明的抗体的核酸序列。
在一个特定实施方式中，本发明涉及一种核酸序列，其编码本发明的抗体的VH结构域(例如，可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤的抗体(16D3-C1))或本发明的抗体的VL结构域(例如可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤的抗体(16D3-C1))。
典型地，所述核酸是DNA或RNA分子，其可包括在任何合适载体，如质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。
术语″载体″、″克隆载体″和″表达载体″是指这样的媒介物，通过其DNA或RNA序列(例如外来基因)可以引入到宿主细胞中以转化宿主并且促进所引入序列的表达(例如转录和翻译)。
所以，本发明的另一个目的涉及一种包含本发明的核酸的载体。
这样的载体可以包含调控元件，如启动子、增强子、终止子等，以在施用至受试者后引起或引导所述抗体的表达。用于动物细胞的表达载体中使用的启动子和增强子的实例包括SV40的早期启动子和增强子(Mizukami T.等1987),Moloney小鼠白血病病毒的LTR启动子和增强子(Kuwana Y等1987),免疫球蛋白H链的启动子(Mason JO等1985)和增强子(Gillies SD等1983)等。
可以使用用于动物细胞的任何表达载体，只要编码人抗体C区域的基因可以分泌和表达。合适载体的实例包括pAGE107(Miyaji H等1990),pAGE103(Mizukami T等1987),pHSG274(Brady G等1984),pKCR(O′Hare K等1981),pSG1βd2-4-(Miyaji H等1990)等。
质粒的其他实例包括复制质粒，其包含复制起源，或综合性质粒，如例如pUC,pcDNA,pBR,等。
病毒载体的其他实例包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。这样的重组病毒可以通过本领域已知的技术制备，如通过转染包装细胞或通过辅助质粒或病毒的瞬时转染。病毒包装细胞的典型实例包括PA317细胞,PsiCRIP细胞,GPenv+细胞,293细胞等。用于制备这样的复制缺陷重组病毒的详细方案可以例如在WO 95/14785,WO 96/22378,US 5,882,877,US 6,013,516,US 4,861,719,US 5,278,056和WO 94/19478中找到。
本发明的另一个目的涉及一种宿主细胞，其已通过根据本发明的核酸和或载体转染、感染或转化。
术语″转化″是指向宿主细胞引入″外来″(即，外在或细胞外)基因、DNA或RNA序列，使得宿主细胞将表达该引入的基因或序列而产生所期望的物质，典型地通过所引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。接收和表达所引入的DNA或RNA的宿主细胞已被″转化″。
本发明的核酸可以用来制备在合适表达系统中的本发明的抗体。术语″表达系统″是指在合适条件下的宿主细胞和相容性载体，例如用于表达由该载体携带并且引入到宿主细胞的外来DNA编码的蛋白质。
常用表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体，以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其他实例包括但不限于原核细胞(如细菌)和真核细胞(如酵母细胞，哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞等)。具体实例包括大肠杆菌、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或酿酒酵母(Saccharomyces yeasts)，哺乳动物细胞系(例如，Vero细胞,CHO细胞,3T3细胞,COS细胞等)以及原代或建立的哺乳动物细胞培养物(例如，产生自淋巴母细胞，成纤维细胞，胚胎细胞，表皮细胞，神经细胞，脂细胞等)。实例还包括小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581),小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580),其中缺乏二氢叶酸还原酶基因(下文称为″DHFR基因″)的CHO细胞(Urlaub G et al;1980),大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL1662,下文称为″YB2/0细胞″),等。
本发明还涉及一种制备表达根据本发明的抗体的重组宿主细胞的方，所述方法包括以下步骤：(i)上述重组核酸或载体体外或体表外引入到感受态宿主细胞，(ii)体外或体表外培养所获得的重组宿主细胞和(iii)，任选地，选择表达和/或分泌所述抗体的细胞。这样的重组宿主细胞可以用于制备本发明的抗体。
在另一个特定实施方式中，所述方法包括以下步骤：
(i)在适于允许表达16D3-C1抗体的条件下培养作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤；和
(ii)回收经表达的抗体。
本发明的抗体合适地分离自培养基，通过常规免疫球蛋白纯化程序如例如，A型蛋白质琼脂糖(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和性色谱。
在一个特定实施方式中，本发明的人嵌合抗体可以通过如下制备：获得之前描述的编码VL和VH结构域的核酸序列，通过将它们插入到用于具有编码人抗体CH和人抗体CL的基因的动物细胞的表达载体中构建人嵌合抗体表达载体，以及通过将该表达载体引入到动物细胞中表达该编码序列。
作为人嵌合抗体的CH结构域，它可以是属于人免疫球蛋白的任何区域，但IgG类的那些是合适的并且也可以使用属于IgG类的亚类（如IgG1,IgG2,IgG3和IgG4）中的任一种。而且，作为人嵌合抗体的CL，它可以是属于Ig的任何区域，并且可以使用κ类和λ类的那些。
用于制备嵌合抗体的方法涉及常规的重组DNA并且基因转化技术在本领域是熟知的(参见Morrison SL.等(1984)以及专利文献US5,202,238和US5,204,244)。
本发明的人源化抗体可以通过以下制备：如之前所述的，获得编码CDR结构域的核酸序列，通过将它们插入到用于具有基因的动物细胞的表达载体中构建人源化抗体表达载体，所述基因编码(i)与人抗体相同的重链恒定区和(ii)与人抗体相同的轻链恒定区，以及通过将该表达载体引入动物细胞中表达所述基因。
人源化抗体表达载体可以以下两种类型中的任一种，即其中编码抗体重链的基因和编码抗体轻链的基因存在于单独的载体上，或者其中两种基因存在于存在于同一载体(串联型)上。关于人源化抗体表达载体的构建容易性、引入到动物细胞中的容易性、以及动物细胞中的抗体和L链的表达水平之间的平衡性，串联型的人源化抗体表达载体是优选的(Shitara K等1994)。串联型人源化抗体表达载体的实例包括pKANTEX93(WO 97/10354),pEE18等。
基于常规重组DNA和基因转染技术的用于制备人源化抗体的方法在本领域是熟知的(参见，例如，Riechmann L.等1988;Neuberger MS.等1985)。抗体可以使用本领域已知的各种各样的技术被人源化，包括，例如，CDR-移植(EP 239,400;PCT公开WO91/09967;美国专利No.5,225,539;5,530,101;和5,585,089),镶盖或重塑(EP 592,106;EP 519,596;PadlanEA(1991);Studnicka GM等(1994);Roguska MA.等(1994)),和链改组(U.S.Pat.No.5,565,332)。用于制备这样的抗体的通用重组DNA技术也是已知的(参见欧洲专利申请EP 125023和国际专利申请WO 96/02576)。
本发明的Fab可以通过用蛋白酶木瓜蛋白酶处理特异地与人HER3反应的抗体而获得。而且，所述Fab可以通过如下制备：将编码抗体的Fab的DNA插入到用于原核表达系统或用于真核表达系统的载体中，并将所述载体引入到原核生物或真核生物（合适的情况下）中以表达该Fab。
本发明的F(ab′)2可以通过用蛋白酶胃蛋白酶处理特异地与人HER3反应的抗体而获得。而且，所述F(ab′)2可以通过经由硫醚键或二硫键结合以下描述的Fab′制备。
本发明的Fab′可以通过用还原剂二硫苏糖醇处理特异地与人HER3反应的F(ab′)2获得。而且所述Fab′可以通过如下制备：将编码上述抗体的Fab′片段的DNA插入到用于原核生物的表达载体或用于真核生物的表达载体中，并将所述载体引入到原核生物或真核生物（合适的情况下）中以进行其表达。
本发明的scFv可以通过如下制备：获得编码如之前所述的VH和VL结构域的cDNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA插入到用于真核生物的表达载体或用于原核生物的表达载体中，然后将所述表达咋提引入到原核生物或真核生物（合适的情况下）中以表达所述scFv。为了产生人源化scFv片段，可以使用称为CDR移植的熟知技术，其涉及从供体scFv片段选择互补决定区(CDR)，并将它们移植到已知的三种尺寸结构的人scFv片段框架上(参见，例如，W098/45322;WO 87/02671;US5,859,205;US5,585,089;US4,816,567;EP0173494)。
考虑了本文中描述的抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能期望改善抗体的结合亲和性和/或其他生物学性能。已知的是，当通过仅将来源于非人动物的抗体的VH和VL中的CDR简单移植到人抗体的VH和VL的FR中来制备人源化抗体时，相比于来源于非人动物的原始抗体，抗原结合活性降低。认为不仅在CDR而且在FR中的非人抗体的VH和VL的若干氨基酸残基直接或间接地与抗原结合活性相关。因此，这些氨基酸残基用来源于人抗体的VH和VL的FR的不同氨基酸残基替代将降低结合活性。为了解决这个问题，在用移植有人CDR的抗体中，已经尝试在人抗体的VH和VL的FR的氨基酸残基中鉴别这样的氨基酸残基，其直接与抗体的结合相关，或其与CDR的氨基酸残基相互作用，或其维持所述抗体的三维结构并且其直接与和抗原的结合相关。可以通过用来源于非人动物的原始抗体的氨基酸残基取代所鉴别的氨基酸来增大降低的抗原结合活性。
修饰和变化可以在本发明的抗体的结构中，以及编码它们的DNA序列中形成，并且仍然获得编码具有期望特性的功能分子。
在氨基序列中形成变化中，可以考虑氨基酸的水合指数(hydropathic index)。水合氨基酸指数在对蛋白质赋予交互活性的生物功能中的重要性在本领域是通常理解的。被接受的是，氨基酸的相对水合特性有助于所得蛋白质的二次结构，其又定义该蛋白与其他分子例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。基于其疏水性和电荷特性，每个氨基酸分配水合指数，这些是：异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);蛋氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5)。
本发明的另一方面还涵盖本发明的抗体的功能保守变体。
″功能保守变体″是其中蛋白质或酶中的指定氨基酸在没有改变所述多肽的总体构象和功能的情况下被改变的那些，包括但不限于氨基酸被具有列斯性质（如，例如，极性，氢键合势，酸性，碱性，疏水性，芳香性等）的氨基酸替代。不同于指定为保守的那些的氨基酸可以在蛋白质上不同使得类似功能的任何两个蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似性百分比可以变化，并且如根据比对方案如通过聚类法(Cluster Method)确定的可以例如为70%至99%，其中相似性基于MEGALIGN算法。″功能保守性变体″还包括具有如通过BLAST或FASTA算法至少60%，优选至少75%,更优选至少85%,仍优选至少90%,并且甚至更优选至少95%的氨基酸同一性，并且与它相比的天然或母体蛋白质具有相同或基本相似性质和功能的多肽。
当在较短序列的总长度上大于80%,优选大于85%,优选大于90%的氨基酸相同，或大于约90%,优选大于95%类似(功能相同)时，两个氨基酸序列是“基本同源的”或“基本类似的”。优选地，相似或同源序列通过使用例如GCG(Genetics Computer Group,ProgramManual for the GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)累积程序的比对，或序列比较算法如BLAST、FASTA等中的任一个进行鉴别。
例如，某些氨基酸可以在没有大量丧失活性情况下被蛋白质结构中的其他氨基酸取代。因为蛋白质的相互活性能力和性质定义蛋白质的生物学功能活性，所以某些氨基酸取代可以在蛋白质序列并且当然在其DNA编码序列中形成，而与获得具有类似性质的蛋白质无关。因此考虑了各种变化可以在本发明的抗体序列，或编码上述抗体的相应DNA序列中形成，而没有显著丧失其生物学活性。
本领域已知的是，某些氨基酸可以被具有相似水合指数或评分的其他氨基酸取代并且仍然导致产生具有相似生物学活性的蛋白质，即仍然获得生物学功能相当的蛋白质。
如上该书的，氨基酸取代因此通常是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑的各种前述特性的示例性取代对于本领域技术人员是熟知的并且包括：精氨酸和赖氨酸;谷氨酸和天冬氨酸;丝氨酸和苏氨酸;谷酰胺和天冬酰胺;和缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸。
本发明的抗体的另一种类型的氨基酸修饰可以用于改变抗体的原始糖基化模式。
“改变”是指缺失抗体中存在的一个或多个糖部分，和/或插入一个或多个在抗体中不存在的糖基化位点。
抗体的糖基化典型地是N-连接的。″N-连接的″是指糖部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除了脯氨酸的任意氨基酸，是用于糖部分与天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在产生潜在的糖基化位点。向抗体中插入糖基化位点方便地通过如下实现：改变氨基酸序列以使其含有一个或多个上述三肽序列(用于N-连接的糖基化位点)。
另一种类型的共价修饰涉及将糖苷化学或酶促地偶联至抗体。这些程序是有利的，因为它们不需要在具有用于N-或O-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生抗体。取决于所使用的偶联模式，所述糖可以连接至(a)精氨酸和组氨酸,(b)游离羧基,(c)游离巯基如半胱氨酸的那些,(d)游离羟基如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些,(e)芳族残基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些,或(f)谷酰胺的酰胺基。例如，这样的方法描述于WO87/05330。
抗体上存在的任何糖部分的除去可以化学或酶促地完成。化学去糖基化需要将抗体暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。这种处理导致除了连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-胰腺半乳糖胺)的大多数或全部糖裂解，而保持抗体完整。化学去糖基化由Sojahr H.等(1987)和Edge,AS.等(1981)描述。抗体上的糖部分的酶促裂解可以通过使用各种各样的内切和外切糖苷酶实现，如由Thotakura,NR.等(1987)描述的。
抗体的另一种类型的共价修饰包括将抗体以在美国专利No.4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192或4,179,337中提出的方式连接至各种各样的非蛋白质性质的聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。
还可能期望针对效应子功能改性本发明的抗体，例如以增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过将一个或多个氨基酸取代引入到抗体的Fc区实现。可替代地或另外地，半胱氨酸残基可以引入到Fc区中，由此允许在此区域中的链间二硫键形成。由此产生的同型二聚抗体可以具有改善的内在化能力和/或增加的补体介导的细胞杀死和/或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)(Caron PC.等1992;和Shopes B.1992)。
免疫轭合物:
本发明的抗体可以与可检测标记轭合以形成抗-HER3免疫轭合物。合适的可检测标记包括例如放射同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记、生物发光标记或胶体金。制备和检测这样的可检测标记的免疫轭合物的方法对于本领域普通技术人员是熟知的，并且在以下更详细地描述。
可检测标记可以是通过放射自显影检测的放射同位素。特别可用于本发明目的的同位素是3H,125I,131I,35S和14C。
抗-HER3免疫轭合物也可以用荧光化合物标记。荧光标记的抗体的存在通过如下确定：将免疫轭合物暴露于适当波长的光并检测所得的荧光。荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素,罗丹明,藻红蛋白,藻青蛋白,别藻蓝蛋白,邻苯二甲醛和荧光胺。
替代地，抗-HER3免疫轭合物可以通过将抗体偶联至化学发光化合物而可检测地标记。化学发光标记的免疫轭合物的存在通过如下确定：检测在化学反应过程期间出现的发光的存在。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺,异氨基苯二酰肼,芳族吖啶酯,咪唑,吖啶盐和草酸酯。
类似地，生物发光化合物可以用来标记本发明的抗-HER3免疫轭合物。生物发光是在其中催化蛋白增大化学发光反应的效率的生物学系统中发现的一类化学发光。生物发光蛋白质的存在通过检测发光的存在而确定。可用于标记的生物发光化合物包括萤光素,萤光素酶和水母荧光素。
替代地，抗-HER3免疫轭合物可以通过将抗-人-HER3单克隆抗体连接至酶而可见地标记。当抗-HER3-酶轭合物在适当底物存在下温育时，酶部分与底物反应产生可以例如通过分光光度计、荧光计或视觉手段检测的化学部分。可以用来可检测地标记多特异性免疫轭合物的酶的实例包括β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化酶和碱性磷酸酶。
本领域技术人员将知晓可以依照本发明采用的其他合适标记。标记物部分与抗-人-HER3单克隆抗体的结合可以使用本领域已知的标准技术完成。这方面的典型方法由Kennedy等,Clin.Chim.Acta 70:1,1976;Schurs等,Clin.Chim.Acta81:1,1977;Shih等,Int′l J.Cancer 46:1101,1990;Stein等,Cancer Res.50:1330,1990;和Coligan,supra描述。
此外，免疫化学检测的方便性和通用性可以通过使用已与抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素和生物素轭合的抗-人-HER3单克隆抗体增强。(参见例如，Wilchek等(eds.),“Avidin-Biotin Technology,”Methods In Enzymology(Vol.184)(Academic Press1990);Bayer等,“Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,”inMethods In Molecular Biology(Vol.10)149-162(Manson,ed.,The人a Press,Inc.1992)。)
用于进行免疫测定的方法被很好建立。(参见例如，Cook and Self,“MonoclonalAntibodies in Diagnostic Immunoassays,”in Monoclonal Antibodies:Production,Engineering,and Clinical Application 180-208(Ritter and Ladyman,eds.,Cambridge University Press 1995);Perry,“The Role of Monoclonal Antibodies inthe Advancement of Immunoassay Technology,”in Monoclonal Antibodies:Principles and Applications 107-120(Birch and Lennox,eds.,Wiley-Liss,Inc.1995);Diamandis,Immunoassay(Academic Press,Inc.1996)。)
在另一方面，本发明提供一种抗-人-HER3单克隆抗体-药物轭合物。如本文使用的，“抗-人-HER3单克隆抗体-药物轭合物”是指轭合至治疗剂的根据本发明的抗-人-HER3单克隆抗体。当施用于受试者，如，例如，具有HER3-表达癌症的受试者时，典型地单独但还联合其他治疗剂施用时，这样的抗-人-HER3单克隆抗体-药物轭合物对HER3-表达细胞产生临床有益的作用。
在典型的实施方式中，抗-人-HER3单克隆抗体轭合至细胞毒性剂，使得当被细胞吸收或内在化时，所得的抗体-药物轭合物对HER3-表达细胞(例如，HER3-表达癌症细胞)施加细胞毒性或细胞抑制作用。对于与抗体轭合的特别合适的部分是化疗剂、前药转化酶、放射活性同位素或化合物，或毒素。例如，抗-人-HER3单克隆抗体可以轭合至细胞毒性剂如化疗剂或毒素(例如，细胞抑制剂或杀细胞剂如，例如，相思豆毒蛋白(abrin),蓖麻蛋白A(ricin A),假单胞菌外毒素（pseudomonas exotoxin）或白喉毒素)。
可用种类的细胞毒性剂包括，例如，微管蛋白抑制剂,奥瑞他汀(auristatins),DNA小沟粘合剂,DNA复制抑制剂,烷基化剂(例如，铂复合物如顺铂,单(铂),二(铂)和三-核铂复合物和卡铂),蒽环类,抗生素,抗叶酸剂,抗代谢药,化疗敏化剂,多卡米星(duocarmycins),依托泊甙,氟化嘧啶类,离子载体(ionophores),lexitropsins,亚硝基脲类,顺氯氨铂(platinols),预形成化合物，嘌呤抗代谢药，嘌呤霉素,辐射敏化剂,甾类,紫杉烷类,拓扑异构酶抑制剂,长春花生物碱类等。
个体细胞毒性剂包括，例如，雄激素,氨茴霉素(AMC),天冬酰胺酶,5-氮胞苷,硫唑嘌呤,博来霉素,白消安,丁硫氨酸硫酸亚胺,喜树碱,卡铂,卡莫司汀(BSNU),CC-1065(Li等,Cancer Res.42:999-1004,1982),苯丁酸氮芥,顺铂,秋水仙素,环磷酰胺,阿糖胞苷,阿糖胞苷,细胞松弛素B,达卡巴嗪,更生霉素(以前的放射菌素),柔红霉素,氨烯咪胺,多西他赛,多柔比星,雌激素,5-氟脱氧尿苷,磷酸依托泊甙(VP-16),5-氟尿嘧啶,短杆菌肽D,羟基脲,伊达比星,异环磷酰胺,伊立替康,洛莫司汀(CCNU),氮芥,美法仑,6-巯嘌呤,甲氨蝶呤,光神霉素,丝裂霉素C,米托蒽醌,硝基咪唑,紫杉酚,普利霉素,甲基苄肼(procarbizine),链脲霉素,替尼泊苷(VM-26),6-硫代鸟嘌呤,硫代TEPA,托泊替坎,长春碱,长春新碱和长春瑞滨。
特别合适的细胞毒性剂包括，例如，多拉司他汀(例如，奥瑞他汀E,AFP,MMAF,MMAE),DNA小沟粘合剂(例如，烯二炔和lexitropsins),多卡米星,紫杉烷类(例如，紫杉酚和多西他赛),嘌呤霉素,长春花生物碱类,CC-1065,SN-38(7-乙基-10-羟基-喜树碱),托泊替坎,吗啉代-多柔比星,根霉素,氰基吗啉代-多柔比星,棘霉素,考布他汀,纺缍菌素,埃博霉素A和B,雌氮芥,cryptophysins,西马多丁,美登木素,discodermolide,软珊瑚醇和米托蒽醌。
在某些实施方式中，细胞毒性剂是常规的化疗剂如，例如，多柔比星,紫杉酚,美法仑,长春花生物碱类,甲氨蝶呤,丝裂霉素C或依托泊甙。另外，有效试剂如CC-1065类似物,加利车霉素,美坦辛,多拉司他汀10的类似物,根霉素,和海葵毒素可以连接至抗-HER3-表达抗体。
在具体变形中，细胞毒性剂或细胞抑制剂是奥瑞他汀E(在本领域也称为多拉司他汀-10)或其衍生物。典型地，奥瑞他汀E衍生物是，例如，奥瑞他汀E和酮酸之间形成的酯。例如，奥瑞他汀E可以与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰戊酸反应而分别产生AEB和AEVB。其他典型的奥瑞他汀衍生物包括AFP(二甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸-海兔脑氨酸-苯丙氨酸-p-苯二胺),MMAF(dovaline-缬氨酸-海兔异亮氨酸-海兔脑氨酸-苯丙氨酸),和MAE(单甲基奥瑞他汀E)。奥瑞他汀E及其衍生物的合成和结构描述于每个专利申请公开No.20030083263;国际专利公开No.WO 2002/088172和WO 2004/010957;和美国专利No.6,884,869;6,323,315;6,239,104;6,034,065;5,780,588;5,665,860;5,663,149;5,635,483;5,599,902;5,554,725;5,530,097;5,521,284;5,504,191;5,410,024;5,138,036;5,076,973;4,986,988;4,978,744;4,879,278;4,816,444;和4,486,414。
在其他变形中，细胞毒性剂是DNA小沟粘接剂。(参见例如，美国专利No.6,130,237.)。例如，在某些实施方式中，小沟粘接剂是CBI化合物。在其他实施方式中，小沟粘接剂是烯二炔(例如，加利车霉素)。
在某些实施方式中，抗体-药物轭合物包括抗-微管蛋白剂。抗-微管蛋白剂的实例包括，例如，紫杉烷类(例如，Taxol(紫杉酚),Taxotere(多西他赛)),T67(Tularik),长春花生物碱类(例如，长春新碱,长春碱,长春地辛,和长春瑞滨),和多拉司他汀(例如，奥瑞他汀E,AFP,MMAF,MMAE,AEB,AEVB)。其他抗-微管蛋白剂包括，例如，浆果赤霉素衍生物,紫杉烷类似物(例如，埃博霉素A和B),诺考达唑,秋水仙素和colcimid,雌氮芥,cryptophysins,西马多丁,美登木素,考布他汀,discodermolide,和软珊瑚醇。在一些实施方式中，细胞毒性剂是美登木素,另一类的抗-微管蛋白剂。例如，在具体实施方式中，美登木素是美坦辛或DM-1(ImmunoGen,Inc.;see also Chari等,Cancer Res.52:127-131,1992)。
在其他实施方式中，细胞毒性剂是抗代谢物。抗代谢物可以是,例如，嘌呤拮抗剂(例如，硫唑嘌呤或吗替麦考酚酯),二氢叶酸还原酶抑制剂(例如，甲氨蝶呤),阿昔洛韦,更昔洛韦(gangcyclovir),齐多夫定,阿糖腺苷,利巴韦林,叠氮胸腺嘧啶,阿糖胞苷,金刚烷胺,二脱氧尿苷,碘待脱氧尿苷,膦甲酸或三氟尿苷。
在其他实施方式中，抗-人-HER3单克隆抗体轭合至前药转化酶。前药转化酶可以使用已知的方法重组地融合至所述抗体或化学地轭合至其。示例性前药转化酶是羧肽酶G2,β-葡糖醛酸糖苷酶,青霉素-V-酰胺酶,青霉素-G-酰胺酶,β-内酰胺酶,β-葡糖苷酶,硝基还原酶和羧肽酶A。
用于将治疗剂轭合至蛋白质，并且尤其是至抗体的技术是熟知的。(参见例如，Arnon等,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy,”in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Reisfeld等eds.,AlanR.Liss,Inc.,1985);Hellstrom等,“Antibodies For Drug Delivery,”in ControlledDrug Delivery(Robinson等eds.,Marcel Deiker,Inc.,2nd ed.1987);Thorpe,“Antibodies Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review,”inMonoclonal Antibodies ′84:Biological And Clinical Applications(Pinchera等eds.,1985);“Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use ofRadiolabeled Antibodies In Cancer Therapy,”in Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy(Baldwin等eds.,Academic Press,1985);and Thorpe等,1982,Immunol.Rev.62:119-58.也参见,例如，PCT公开WO89/12624。)
诊断用途:
本发明的另一个目的涉及用于诊断和/或监控与HER3表达相关的癌症疾病的本发明的抗-人-HER3抗体。与HER3表达相关的癌症疾病通常包括但不限于鳞状细胞癌,小细胞肺癌,非小细胞肺癌,胃癌,胰腺癌,神经胶质细胞肿瘤如胶质母细胞瘤和神经纤维瘤病,宫颈癌,卵巢癌,肝癌,膀胱癌,肝瘤,乳腺癌,结肠癌,黑素瘤,结直肠癌,子宫内膜癌,唾液腺癌,肾癌,肾癌,前列腺癌,外阴癌,甲状腺癌症,肝癌和各种类型的头颈癌。在一个特定实施方式中，使用本发明的方法诊断的癌症是乳腺癌或卵巢癌。在一个优选实施方式中，本发明的抗体可用于诊断乳腺癌和卵巢癌。
在一个优选实施方式中，本发明的抗体可以用可检测分子或物质如荧光分子、放射活性分子或上述的本领域已知的任何其他标记进行标记。例如，本发明的抗体可以通过本领域已知的任何方法用放射活性分子标记。例如放射活性分子包括但不限于用于闪烁法研究的放射活性原子如I123,I124,In111,Re186,Re188。本发明的抗体也可以用用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物标记，如碘-123,碘-131,铟-Ill,氟-19,碳-13,氮-15,氧-17,钆,锰或铁。在施用所述抗体后，检测患者体内的抗体的分布。用于检测任何特定标记物的分布的方法对于本领域技术人员是已知的并且可以使用任何适当方法。一些非限制性实例包括，电脑断层扫描(CT),正电子发射体层摄影(PET),磁共振成像(MRI),荧光,化学发光和超声检查。
本发明的抗体可以用于与HER3表达相关的癌症疾病的分期(例如，在放射成像中)。例如，本发明的抗体可以用于对乳腺癌或卵巢癌分期。它们可以单独使用或联合其他乳腺癌或卵巢癌标记，包括但不限于，HER2,CAl 25,HE4和对间皮素(mesothelin)。
典型地，诊断方法涉及使用获自患者的生物学样品。如本文使用的，术语″生物学样品″涵盖获自受试者的各种各样的样品类型并且可以用于诊断或监测测定。生物学样品包括但不限于血液和生物学起源的其他液体样品，固体组织样品如生物活检样本或源于其的组织培养物或细胞，及其后代。例如，生物学样品包括获自组织样品的细胞，该组织样品收集自怀疑具有与HER3表达相关的癌症疾病的个体，并且在优选的实施方式中收集自乳腺或卵巢。因此，生物学样品涵盖临床样品，培养物中的细胞，细胞上清，细胞溶解物，血清，血浆，生物学流体和组织样品。
在一个特定实施方式中，本发明是诊断受试者的与HER3表达相关的癌症疾病的方法，其通过使用本发明的抗体检测来自受试者的细胞上的HER3.特别是，所述诊断方法可以包括由以下组成的步骤：
(a)在足以用于抗体与表达HER3的生物学样品的细胞形成复合物的条件下，使可能患有与HER3表达相关的癌症疾病的受试者的生物学样品与跟进本发明的抗体与跟进本发明的抗体接触；
(b)检测和/或定量所述复合物，由此所述复合物的检测是与HER3表达相关的癌症疾病的指示。
为了监测癌症疾病，跟进本发明的诊断方法可以以不同时间间隔重复，以确定结合至样品的抗体是否增加或减少，由此确定该癌症疾病是否进展或消退。
治疗用途:
本发明的抗体、片段或免疫轭合物可以用于治疗任何HER3-表达癌症。本发明的抗体可以单独或联合任何合适试剂使用。
HER3-表达癌症的实例包括但不限于，癌,淋巴瘤,母细胞瘤,肉瘤,和白血病。这样的癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌,小细胞肺癌,非小细胞肺癌,胃癌,胰腺癌,神经胶质细胞肿瘤如胶质母细胞瘤和神经纤维瘤病,宫颈癌,卵巢癌,肝癌,膀胱癌,肝瘤,乳腺癌,结肠癌,黑素瘤,结直肠癌,子宫内膜癌,唾液腺癌,肾癌,肾癌,前列腺癌,外阴癌,甲状腺癌症,肝癌和各种类型的头颈癌。在一个特定实施方式中，使用本发明方法治疗的癌症是乳腺癌或卵巢癌。
因此，本发明的一个目的涉及一种用于治疗与HER3的表达相关的癌症的方法，包括向需要其的受试者施用治疗有效量的本发明的抗体、片段或免疫轭合物。
在本发明的上下文中，如本文使用的，术语″治疗″或″处理″是指逆转、减轻、抑制这样的术语应用的障碍或病症的进展或或防止其，或者这样的障碍或病症的一种或多种症状。
根据本发明，术语″患者″或″需要其的患者″用于受与HER3的表达相关的癌症（与HER3的表达相关的癌症）影响或可能影响的人或非人哺乳动物。
本发明的抗体的″治疗有效量″是指在可应用于任何医学治疗的合理益处/风险比下，抗体治疗所述癌症的足够量。然而，将理解本发明的抗体和组合物的总日用量将由有力医学判断范围内的参与医师决定。对于任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于各种各样的因素，包括治疗的障碍和该障碍的严重度；所采用的具体抗体的活性；所采用的具体组合物，或者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；施用时间、施用途径，和所采用的具体抗体的排泄速率；治疗的持续时间，与所采用的具体抗体组合或同时使用的药物；以及医学领域熟知的类似因素。例如，本领域技术人员熟知的是化合物的开始记录在低于实现企稳治疗效果所需水平的水平并且逐渐增加剂量直至获得期望效果。
在某些实施方式中，抗-人-HER3单克隆抗体或抗体-药物轭合物联合用于治疗疾病或障碍的第二试剂使用。当用于治疗癌症时，本发明的抗-人-HER3单克隆抗体或抗体-药物轭合物可以联合常规癌症疗法使用，如，例如，外科手术，放射疗法，化疗法或其组合。在某些方面，可用于与跟进本发明的抗-HER3抗体或抗体-药物轭合物的组合癌症疗法的其他治疗剂包括抗-血管生成剂。在一些方面，根据本发明的抗体或抗体-药物轭合物与细胞因子(例如，刺激针对肿瘤的免疫反应的细胞因子)共施用。
在一些其他方面，可用于组合疗法的其他治疗剂包括参与肿瘤生长的某些因子的（如，例如，EGFR,HER2,或HER4）的拮抗剂。
在一个优选实施方式中，本发明的抗-人-HER3单克隆抗体或抗体-药物轭合物联合抗-人-HER2单克隆抗体,如曲妥珠单抗或帕妥珠单抗使用。
在一些实施方式中，本文所述的抗-人-HER3单克隆抗体或抗体-药物轭合物联合酪氨酸激酶抑制剂(TKI)使用。BAY43-9006(索拉非尼,Nexavar)和SU11248(舒尼替尼,Sutent)是已被批准的两种这样的TKI。其他TKI包括但不限于：甲磺酸伊马替尼(GleevecNovartis);吉非替尼(IressaAstraZeneca);盐酸厄洛替尼(TarcevaGenentech);凡德他尼(ZactimaAstraZeneca),替吡法尼(ZarnestraJanssen-Cilag);达沙替尼(SprycelBristol Myers Squibb);洛那法尼(SarasarSchering Plough);丁二酸凡塔蓝尼(Novartis,Schering AG);拉帕替尼(Tykerb,GlaxoSmithKline);尼洛替尼(Novartis);来他替尼(Cephalon);盐酸帕唑帕尼(GlaxoSmithKline);阿昔替尼(Pfizer);二盐酸卡奈替尼(Pfizer);培利替尼(National Cancer Institute,Wyeth);坦度替尼(Millennium);波舒替尼(Wyeth);司马沙尼(Sugen,Taiho);AZD-2171(AstraZeneca);VX-680(Merck,Vertex);EXEL-0999(Exelixis);ARRY-142886(Array BioPharma,AstraZeneca);PD-0325901(Pfizer);AMG-706(Amgen);BIBF-1120(BoehringerIngelheim);SU-6668(Taiho);CP-547632(OSI);(AEE-788(Novartis);BMS-582664(Bristol-Myers Squibb);JNK-401(Celgene);R-788(Rigel);AZD-1152 HQPA(AstraZeneca);NM-3(Genzyme Oncology);CP-868596(Pfizer);BMS-599626(Bristol-Myers Squibb);PTC-299(PTC Therapeutics);ABT-869(Abbott);EXEL-2880(Exelixis);AG-024322(Pfizer);XL-820(Exelixis);OSI-930(OSI);XL-184(Exelixis);KRN-951(Kirin Brewery);CP-724714(OSI);E-7080(Eisai);HKI-272(Wyeth);CHIR-258(Chiron);ZK-304709(Schering AG);EXEL-7647(Exelixis);BAY-57-9352(Bayer);BIBW-2992(Boehringer Ingelheim);AV-412(AVEO);YN-968D1(Advenchen Laboratories);米哚妥林(Novartis);哌立福辛(AEterna Zentaris,Keryx,National Cancer Institute);AG-024322(Pfizer);AZD-1152(AstraZeneca);ON-01910Na(Onconova);和AZD-0530(AstraZeneca)。
药物组合物:
用于施用，将抗-人-HER3单克隆抗体或抗体-药物轭合物配制为药物组合物。包含抗-人-HER3单克隆抗体或抗体-药物轭合物的药物组合物可以根据用来制备药用组合物的已知方法配制，由此治疗分子与药用载体组合成混合物。如果其施用可以被受体患者忍受则组合物被说成是“药用载体”。无菌磷酸盐缓冲盐水是药用载体的一个实例。其他合适载体对本领域技术人员是熟知的。(参见例如，Gennaro(ed.),Remington′s PharmaceuticalSciences(Mack Publishing Company,19th ed.1995)。)制剂可以还包括一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、白蛋白以防止小瓶表面上的蛋白质损失等。
药物组合物的形式、施用途径剂量和方案自然取决于要治疗的病症、疾病严重度、患者的年龄、体重和性别等。
本发明的药物组合物可以配制用于局部、经口、肠胃外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下或眼内施用等。
优选地，药物组合物含有对于能够被注射的制剂是药用的媒介物。这些可以特别是等张、无菌的盐水溶液(磷酸一钠或二钠，氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这样的盐的混合物),或干的，特别是冻干的组合物，根据情况，其在添加灭菌水或生理盐水后，允许构件可注射液。
用于施用的剂量可以作为各种参数的函数改变，并且尤其作为所使用的施用模式的函数、相关病理学的函数或可替代地作为期望的治疗持续时间的函数改变。
为了制备药物组合物，有效量的抗体可以溶解或分散在药用载体或含水介质中。
适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；和用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是流体，其程度为存在容易注射性。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且对于微生物如细菌和真菌的污染作用必须是防腐的。
作为游离碱或药理学可接受盐的活性化合物的溶液可以在适合与表面活性剂如羟丙基纤维素混合的水中制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用的条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
本发明的抗体可以配制成中性或盐形式的组合物。药用盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)并且其与无机酸如，例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。与游离羧基形成的盐也可以来源于无机碱如，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱如异丙基胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。
载体也可以是这样的溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物，以及植物油。适当流动性可以例如通过使用包衣如卵磷脂，在分散体情况下通过保持所需粒度和通过使用表面活性剂而维持。微生物的作用的防止可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等产生。在许多情况下，优选包括等张剂，例如糖类或氯化钠。可注射组合物的延迟吸收可以通过以延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和白明胶的组合物使用产生。
无菌注射液通过如下制备：根据需要，将所需量的活性化合物在适当溶剂中与以上列举的各种其他成分混合，接着过滤消毒。通常，分散体通过如下制备：将各种灭菌的活性成分混合到无菌媒介物中，其含有基本分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空感知和冻干技术，其生成活性成分加来自其之前的无菌过滤溶液的任何额外的所需成分的粉末。
还考虑了用于直接注射的更大或高度浓缩溶液的制备，其中设计了使用DMSO作为溶剂以导致极快速的渗透，将高浓度的活性试剂递送至小肿瘤区域。
在配制后，溶液以与剂型相容的方式和以治疗有效的量施用。制剂容易以各种各样的剂型施用，如上述注射液类型，但也可以采用药物释放胶囊等。
对于以水溶液的肠胃外施用，如果需要，所述溶液应适当缓冲并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等张。这些特别的水溶液尤其适用于静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内施用。在这方面，可以采用的无菌含水介质依据本公开内容对于本领域技术人员是已知的，例如，一个剂量可以溶解在1ml的等张NaCl溶液中并且任一个添加到1000ml的皮下输注流体中或在预计的输注部位注射，(参见例如，″Remington′s PharmaceuticalSciences″15th Edition,第1035-1038和1570-1580页)。剂量上的一些变形将根据所治疗的受试者的病症有必要地发生。复合施用的人在任何情况下将决定用于个体受试者的合适剂量。
本发明的抗体可以配制在治疗混合物内以每个剂量包含约0.0001至1.0毫克,或约0.001至0.1毫克,或约0.1至1.0或甚至约10毫克等。也可以施用多个剂量。
除了配制用于肠胃外施用如静脉内或肌肉内注射的化合物之外，其他药用形式包括例如用于经口施用的片剂或其他固体；缓释胶囊；以及目前使用的任何其他形式。
在某些实施方式中，使用脂质体和/或纳米颗粒被考虑用于将抗体引入到宿主细胞中。脂质体和/或纳米颗粒的形成和使用对于本领域技术人员是已知的。
纳米胶囊通常可以以稳定且可再现方式俘获化合物。为了避免由于细胞内聚合物过载导致的副作用，这样的超细颗粒（尺寸约0.1μm)通常使用能够在体内降解的聚合物设计。满足这些要求的生物可降解聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒被考虑用于本发明，并且这样的颗粒可以是容易制备的。
脂质体形成自分散在含水介质中且自发形成多层同心的双分子层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))的磷脂。MLV通常的直径为25nm至4μm。MLV的声处理导致形成小的单层囊泡(SUV)，其直径范围为200至500，在核芯中含有水溶液。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。
试剂盒:
最后，本发明还提供包含本发明的至少一种抗体的试剂盒。含有本发明的抗体的试剂盒可用布检测HER3表达，或治疗或诊断测定。本发明的试剂盒可以含有偶联至固体载体，例如组织培养板或珠子(例如琼脂糖株)的抗体。提供的试剂盒含有用于在体外检测和定量HER3的抗体，例如在ELISA或蛋白质印迹中。可用于检测的这样的抗体可以提供有标记如荧光或放射标记。
本发明将通过以下附图和实施例进一步说明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图:
图1A示出了所选单克隆抗体的HER3对HER2和Fc结合。
图1B示出了关于Ab6抗体，纯化的本发明的小鼠IgG抗体对于小鼠HER3的反应活性。
图2示出了纯化的mAb与HER3抗原的ELISA结合曲线(A)和产生(B)。
图3示出了纯化的小鼠IgG4H9-B11,9B4-D6,9F7-F11,11G10-D2,12H8-B11,14H1-H8,15D4-F2和16D3-C1对wt-,EGFR-,HER2-,HER3-,HER2/HER3-和EGFR/HER4-转染的NIH3T3细胞的流式细胞仪特异性结合分布(几何平均值)。Px抗体是阴性对照。指示了竞争抗体Ab6和U1-59。
图4示出了mAb16D3-C1,9F7-F11和12H8-B11的BIACORE结合动力学。表6示出了本发明的纯化的小鼠抗体9F7-F11,11G10-D2,12H8-B11,14H1-H8,15D4-F2和16D3-C1对于Ab6抗体的亲和性。
图5示出了HER3-特异性抗体16D3-C1,9F7-F11和12H8-B11与神经生长因子之间对SKBR3细胞的FACS竞争性实验。指示了HER3-特异性阳性对照抗体A,B和C。
图6示出了如通过ELISA确定的用抗-HER3鼠类mAb处理的HER2/HER3-转染的NIH3T3细胞的完全HER2磷酸化。
图7示出了如通过ELISA确定的用抗-HER3鼠类mAb处理的HER2/HER3-转染的NIH3T3细胞的完全HER3磷酸化。
图8示出了在HER2/HER3-转染的NIH 3T3细胞中Y1289 HER3/Y1196HER2(A)和Y1262HER3/Y1112 HER2(B)的磷酸化通过抗-HER3mAb的抑制。GAPDH用作蛋白质印迹中的对照。
图9示出了在BxPC3胰腺癌细胞中通过使用抗-HER3鼠类mAb16D3-C1和9F7-F11对HER2/HER3受体和下游PI3K/Akt信号转导的磷酸化的抑制。
图10示出了通过蛋白质应激(A)和HER3内在化的定量(Image J software)(B)对在BxPC3胰腺癌中的HER3内在化的抗体诱导的抑制。
图11示出了如通过MTS测定测量的，HER2/HER3-转染的NIH 3T3细胞和各种肿瘤细胞系的增生通过鼠类HER3-特异性抗体的抑制。
图12示出了如通过TR-FRET分析测量的，在HER2/HER3-转染的NIH 3T3细胞中HER2/HER3异源二聚化通过抗-HER3mAb的抑制。
图13鉴别通过16D3-C1 mAb识别的表位。(A)由抗-HER3抗体16D3-C1识别的区域的斑点分析。(B)由16D3-C1 mAb识别的区域的Alascan分析，和(C)结合至HER3肽的16D3-C1的像素定量(Image J软件)。
图14鉴别通过9F7-F11mAb识别的表位。(A)由抗-HER3抗体9F7-F11识别的区域的斑点分析。(B)由9F7-F11 mAb识别的区域的Alascan分析，和(C)结合至HER3肽的9F7-F11的像素定量(Image J软件)。
图15示出了由mAb 16D3-C1和9F7-F11识别的斑点贡献残基(Spot-ContribudingResidues)在未结合配体的HER3受体(pdb 1M6B)的晶体结构上的定位(左侧)，和此表位在结合至帕妥珠单抗(pdb 1S78)的HER2受体的晶体结构上的叠加(右侧)。
图16示出了在用HRG-成瘾的、HER2-未扩增的/PIK3CA-wt/p53-mut表皮样瘤A431癌细胞异种移植的裸小鼠中通过mAb 16D3-C1和9F7-F11对肿瘤进展的抑制(A)，以及相应的Kaplan-Meier存活曲线(B)。
图17示出了在用HER2-未扩增的/PIK3CA-wt/p53-wt胰腺BxPC3癌细胞(A)异种移植的裸小鼠中通过mAb 9F7-F11和16D3-C1对肿瘤进展的抑制(A)以及相应的Kaplan-Meier存活曲线(B)。
图18示出了在从媒介物-或16D3-C1-治疗小鼠提取的BxPC3异种移植物中的Y1289-HER3的磷酸化水平和完全HER3表达。
图19示出了HRG-成瘾的HER2低表皮样瘤A431(A)和肺A549(B)癌细胞中，通过单独或联合曲妥珠单抗使用的HER3-特异性mAb 16D3-C1对肿瘤进展的抑制。
实施例1:通过免疫化的小鼠单克隆抗体传代
杂交瘤的Balb/c免疫和传代。
针对HER3的单克隆抗体通过对Balb/c小鼠依次免疫开发。HER3-Fc蛋白质(R&D系统)用作抗原。5只Balb/c小鼠的第一组在佐剂(弗氏完全或不完全的)存在下在第0天、第14天和第28天皮下地注射10μg的可溶性HER3-Fc。5只Balb/c小鼠的第二组腹膜内注射HER2/HER3-转染的NIH 3T3细胞系(约2x106细胞)，之前用神经生长因子(HRG)刺激以促进HER2/HER3异源二聚体形成。为了监测抗体反应，通过ELISA或流式细胞仪测量抗体效价。来自免疫化小鼠的脾细胞根据已经描述的方案(Salhi等Biochem.J.2004)使用骨髓瘤PX63Ag8.653融合。105个融合细胞/孔在具有HAT介质的板中培养以进行杂交瘤选择。在融合后12天之后，通过使用蛋白质HER3-Fc作为抗原进行杂交瘤上清筛选。在对照中，利用单独的区分抗原HER2-Fc和Fc片段同时进行筛选。
如图1A所示，选择十三个HER3-特异性单克隆抗体(mAb)。它们对可溶性HER3-Fc是特异性的并且不识别Fc部分。四种抗-HER3选自HER3-Fc-免疫化Balb/c小鼠并且9种抗-HER3选自用神经生长因子-刺激的HER2/HER3-转染的3T3细胞免疫的Balb/c小鼠。在HER2-Fc抗原下没有观察到结合。
将所选的抗-HER3抗体与两种其他抗-HER3抗体Ab6(MerrimackPharmaceuticals)和U1-59(Amgen/U3 Pharma-Daiichi Sankyo)进行比较。U1-59和Ab6分别基于专利US2008/0124345A1和US2009/0291085A1中的序列公开内容进行构建。
与小鼠HER3受体的交叉反应性通过利用以250ng/ml涂覆的固定化人HER3-Fc和小鼠HER3-Fc(重组小鼠细胞外结构域ErbB3/HER3 Fc嵌合体,R&D Systems)的比较性ELISA测定进行评估。本发明的大部分克隆，在1μg/ml浓度下，不会与小鼠HER3交叉反应(图1B)而Ab6抗体识别小鼠和人HER3。克隆9F7-F11和16D3-C1是最佳粘合剂。不相关的对照抗体Px既不结合至人HER3受体也不结合至小鼠HER3受体。
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与HER3的ELISA结合
九十六-孔酶免疫测定板(Nunc,Paisley,UK)在160mM PBS pH7.2中在250ng/ml的浓度下用HER3-Fc抗原在4℃涂覆过夜。在160mM PBS pH7.2(含有0.1%Tween20(PBS-T))中四次洗涤后，这些板在37℃在PBS-T缓冲液中用牛血清(BSA)的1%溶液饱和60min。纯化的HER3-特异性mAb的两倍系列稀释液在PBS-T中洗涤四次后加入并且板在37℃温育2h。在PBS-T中洗涤四次后，向每个孔中加入100μl的过氧化酶-轭合的抗-小鼠IgG抗体(Sigma)。该轭合物以在PBS-T-1% BSA中的1:2000稀释液使用。这些板在37℃温育60min，然后在PBS-T中洗涤四次。最后在黑暗中在环境温度加入邻苯二胺溶液(Sigma)持续30min并测量在450nm的吸光度。抗-HER3 mAb以剂量-特异性方式与HER3抗原特异地反应；抗体16D3-C1,9F7-F11,15D4-F2和23H2-B3具有最大反应活性(图2A)。相反，Ab6和U1-59抗体对于结合至HER3受体具有较低反应活性。获得50%吸光度的抗体浓度对于抗体16D3-C1,9F7-F11,15D4-F2和23H2-B3低于1-10ng/ml，而Ab6和U1-59显示50%-信号为约200ng/ml。所有的HER3-特异性抗体在腹水中产生并通过蛋白质A-免疫亲和性纯化(图2B)。
对HER3-阳性细胞的流式细胞仪分析
EGFR-,HER2-,HER3-,HER2/HER3-和EGFR/HER4-转染的NIH3T3成纤维细胞(106细胞)在4℃在PBS-BSA 0.1%中用抗-HER3 mAb温育1h。在PBS-BSA 0.1%中三次洗涤后，细胞在黑暗中在4℃用荧光素-轭合的抗-小鼠IgG(1:50)(Sigma)温育45min。然后细胞洗涤三次并悬浮在PBS中用于施用EPICS流式细胞仪(Beckman-Coulter,Fullerton,CA)进行分析。如图3所示，所有的HER3-特异性mAb结合至HER3-和HER2/HER3-，但不结合至野生型-,EGFR-,HER2-和EGFR/HER4-转染的NIH 3T3细胞。对于HER2/HER3-转染的NIH3T3细胞(几何平均值)的结合，抗体9B4-D6,12H8-B11,15D4-F2和16D3-C1比抗体Ab6和U1-59更高。
通过BIACORE的亲和性测量
所选抗体的HER3结合通过BIACORE分析确认(图4)。BIACORE分析已使用位于蒙彼利埃的癌症研究所的相互作用分析设施(PP2I platform,M.Pugnière)进行。HER3受体与所选抗体的结合的动力学参数使用BIACORE3000仪器(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)通过表面表面等离激元共振分析在25℃确定。HER3-特异性抗体使用捕获的兔抗-小鼠多克隆抗体(Sigma-Aldrich)在CM5传感器芯片表面上固定。捕获的抗体根据制造商说明固定。在含有10mM Hepes(pH7.4),3mM EDTA,150mM NaCl和0.005%非离子型表面活性剂P20(GEHealthcare)的HBS-EP缓冲液中的HER3受体然后在整个流动池上以50μg/ml的浓度注射，并且离解相之后是用10mM HCl溶液的再生步骤(图4)。流速为50μl/min。所有的sensorgrams通过减去对照流动池信号进行校正。使用BIAevaluation版本4.1.1软件将数据全部拟合至二价分析物模型(图4)。所选抗体的离解速率(ka)范围为约1x105M-1s-1，与Ab6抗体所获得那些十分相似(表6)。相反，每种抗体的离解常数是更可变的，解释了为什么我们观察到KD值的显著差异。抗体16D3-C1、12H8-B11和9F7-F11显示最佳亲和性，在1-5nM的范围内，与对于Ab6抗体测得的值相似。
表6
与神经生长因子的竞争
进行细胞计数法竞争实验以定量在基于SKBR3细胞的测定中HRG抑制与HER3的抗体结合的能力。为此，105SKBR3细胞在冰上用各种浓度的竞争性HRG配体预温育1.5h。在用PBS-1%BSA洗涤一次后，抗-HER3mAb，以获得50%最大结合的浓度，加入到在冰上的每个孔达1h。在一些实验中，HRG配体和抗-HER3抗体在冰上共温育2h。然后洗涤细胞并且在冰上用适当的FITC-轭合的二抗的1:60稀释液(Sigma)进一步温育45min，然后在Quanta设备(Beckman-Coulter)上进行细胞计数分析。通过FACS的竞争性实验证实了，9F7-F11抗体不与神经生长因子竞争，由此表明这种抗体不结合至HRG-结合位点(图5)。当加入HRG时，9F7-F11抗体结合甚至被增强，而阳性对照抗体A的结合没有通过HRG温育修饰。相反，抗体12H8-B11和16D3-C1，以及阳性对照抗体B和C，显示与HER3受体的HRG-依赖性结合降低，证实当HRG诱导用于二聚化的活性HER3受体的转型，由这些抗体识别的表位靠近或位于HRG-结合位点，或者可以是抗体结合的立体受损(图5)。导致50%结合的抑制浓度对于抗体12H8-B11和16D3-C1为约2.5nM的HRG配体。通过用抗体依次或共温育HRG获得类似结果。
实施例2:HER2和HER3磷酸化通过本发明的抗-HER3抗体抑制
转化的NIH3T3成纤维细胞的HRG刺激
将总共8x104ErB2/HER3-转染的NIH 3T3细胞在RPMI-FCS 5%中在6-孔板中培养72h并在RPMI-FCS 1%中再培养24h。然后细胞在37℃在RPMI-FCS 1%中在20μg/ml浓度用HER3-特异性小鼠mAb温育1h。移除抗体后，在37℃通过用100ng/ml HRG的溶液温育抗体处理的细胞达10min进行配体刺激。在冷Dulbecco-PBS(D-PBS)中洗涤后，在0.5ml冷D-PBS中使用橡胶片从塑料皿刮细胞两次。在以11,000g的1min-离心后，将细胞团粒溶解在50μl的含有20mM Tris pH7.5,150mM NaCl,1.5mM MgCl2,1mM EDTA,1%Triton X-100(v/v),10%甘油(v/v),100mM氟化钠,0.1mM苯基甲基磺酰基氟化物,1mM原钒酸钠(Sigma)和一个完整蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche Diagnostics,Meylan,France)的溶解缓冲液中。在温育30分钟后，通过离心清除样品的不溶部分并且细胞溶解物中的蛋白质浓度通过Bradford比色反应确定。
在HER2/HER3-转染的3T3成纤维细胞中的HER2和HER3完全磷酸化的ELISA测量
细胞溶解物中的酪氨酸-磷酸化的HER2和HER3使用DuoSetR夹心ELISA(RDSystems,Minneapolis,MN)如制造商所述进行定量。如图6和图7所示，mAb 16D3-C1和9B4-D6抑制HER2和HER3完全磷酸化，如同对照曲妥珠单抗一样。Mab 9F7-F11和24E3-C10阻断HER2的磷酸化。
在HER2/HER3-转染的3T3成纤维细胞中Y1112和Y1196 HER2磷酸化相对于Y1262和Y1289 HER3磷酸化的PAGE-SDS和蛋白质印迹分析
在还原条件下在7%SDS-PAGE上电泳后，将细胞溶解物转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore,Molsheim,France)，其在环境温度在25mM Tris pH7.4,含有0.1%Tween20(TNT)和5%脱脂奶粉的150mM NaCl缓冲液饱和1h。针对HER2-磷酸化的Y1112(Millipore)或Y1196(RD Systems)，和针对HER3-磷酸化的Y1262(RD系统s)或Y1289(Cell SignalingTechnology)的抗体在TNT-BSA 5%中的1μg/ml溶液在4℃温育18h。在TNT中五次洗涤后，根据需要，在环境温度在TNT-5%脱脂奶粉中，印迹用过氧化酶-轭合的小鼠-特异性(1/2000)或兔-特异性(1/10000)抗体(Sigma)温育1h。在TNT中5次洗涤后，使用化学发光物质(Western Lightning Plus-ECL,Perkin Elmer)使印迹可视化。如图8A和8B中的蛋白质印迹指示的，mAb 16D3-C1和9B4-D6阻断Y1196和Y1112 HER2磷酸化，以及Y1262和Y1289 HER3磷酸化，与对照曲妥珠单抗一样。
BxPC3胰腺癌细胞中HER3受体的磷酸化和内在化的抑制
五百和千个BxPC3肿瘤细胞在37℃添加到6-孔培养板的每个孔中达24h。在具有1%FCS的RPMI完全培养基中血清饥饿达16h并进一步洗涤后，细胞用50μg/ml浓度的抗体16D3-C1和9F7-F11，或阴性对照抗体在37℃预温育15min，然后用神经生长因子的100ng/ml稀释液洗涤和随后的刺激或没有。然后细胞洗涤、破碎并用含有20mM Tris-HCl pH7.5,150mMNaCl,1.5mM MgCl2,1mM EDTA,1%Triton,10%甘油,0.1mM苯基甲基磺酰基氟,100mM氟化钠,1mM原钒酸钠(Sigma-Aldrich)，以及一个完整蛋白酶抑制剂混合物片剂(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN)的缓冲液溶解。在30min温育时间后，通过离心清除样品的不溶部分，并且细胞溶解物中的蛋白质浓度通过Bradford测定确定。这些蛋白质溶解物直接与Laemmli缓冲液(1-20μg总蛋白质，根据靶标和细胞系)混合物并在95℃加热5分钟。在还原条件下在7% SDS-PAGE上电泳，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore)，其然后在25℃在含有5%脱脂奶粉的TNT缓冲液(Tris 25mM pH7.4,NaCl 150mM,Tween 0.1%)中饱和1h。原代抗体，针对激酶受体或信号转导激酶，以及它们的磷酸化形式，在4℃在TNT-5%BSA缓冲液中温育18h。在TNT缓冲液中五次洗涤后，过氧化酶-轭合的兔、山羊或小鼠多克隆抗体(Sigma-Aldrich)根据需要在25℃加入在含有5%脱脂奶粉的TNT缓冲液中。在TNT缓冲液中五次洗涤后，使用化学发光物质(Western lightning Plus-ECL,Perkin Elmer)可视化印迹。
显著地，抗体16D3-C1和9F7-F11租单在HER3残基Y1289和Y1262的配体诱导的磷酸化(图9)；抗体9F7-F11是最有效的一个。在Ser473和Thr308上的Akt磷酸化的抑制伴随地证实了遵循在BxPC3细胞上的抗体16D3-C1 abd 9F7-F11的15min短时间处理。AKT触发的下游信号转导的磷酸化也受所选抗体的影响，即，减少蛋白质合成的磷酸-S6核糖体蛋白质的磷酸化的抑制，有利于基因核转录的FoxO1a磷酸化的阻断（导致细胞凋亡和细胞周期停滞），防止p53降解的磷酸-MDM2的减少，以及阻断细胞周期且促进细胞凋亡的磷酸-GSK3α/β的抑制(图9)。
在暴露于9F7-F11和16D3-C1抗体达不同时间和温度后，对BxPC3细胞分析HER3受体的细胞表面表达。如图10A所示，在37℃ BxPC3细胞的2h-抗体温育强烈减少HER3细胞表面表达。这样的抗体-诱导的HER3下调当细胞在4℃处理时被消除，由此证实HER3-特异性抗体9F7-F11和16D3-C1诱导HER3内在化。相反，当BxPC3细胞用Ab6抗体处理时，HER3内在化较低(图10A)。HER3内在化的定量确认了16D3-C1和9F7-F11抗体比Ab6更有效地诱导HER3内在化(图10B)。用抗体16D3-C1和9F7-F11的2h-抗体处理分别诱导73%和78%HER3内在化，而对于Ab6抗体仅诱导42%内在化(图10B)。
实施例3:细胞增生的抑制
总共104HER2/HER3-转染的NIH 3T3成纤维细胞在DMEM完全培养基中在96-孔板中培养24h。然后细胞在37℃以终浓度为100μg/ml用抗-HER3抗体温育5天。通过加入40μl/孔的含有四唑鎓化合物MTS[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓]和电子耦合剂PMS（吩嗪甲硫酸盐）溶液测量增生。MTS由细胞还原为在组织培养基中可溶的甲臜产物。甲臜在490nm的吸光度可以使用分光光度计测量。如图11所示，mAb 16D3-C1和9F7-F11分别抑制HER2/HER3-转染的NIH3T3成纤维细胞的增生的23.7%和32.0%。在其他HER3-特异性抗体下没有观察到HER2/HER3-转染的NIH 3T3的显著抑制。另外，16D3-C1和9F7-F11抑制A431表皮样瘤癌,乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB361,来自原来腹水1（克隆A5）和2（克隆C9）的表皮卵巢肿瘤、转移2815以及OVCAR3和SKOV3细胞细胞系的增生。乳腺癌细胞系T47D和A549肺癌的增生被mAb9F7-F11单独地抑制。
实施例4:通过时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)测量HER2/HER3异源二聚化的抗体-诱导的抑制
使用分别用Lumi4-铽穴状化合物和D2受体染料(Cisbio Bioassays)标记的抗-HER2(FRP5)和抗-HER3(15D4-F2)在粘附性细胞上进行测定。选择这些mAb是因为它们不同于研究的感兴趣的mAb的靶向表位。HER2/HER3-转染的NIH3T3细胞在补充有10%胎牛血清的DMEM培养基(没有苯酚红)在96-孔无菌黑色微板中以3x105/孔铺板24h。在37℃它们用各种浓度的HER3-特异性鼠类mAb处理30min。在KREBS缓冲液中洗涤后，细胞然后在10%福尔马林(Sigma-Aldrich)中固定2min并用KREBS洗涤一次。在37℃用KREBS中稀释的标记标记抗体(各自5nM)温育6小时后，细胞用KREBS洗涤4次。在Pherastar FS仪器上的337nm激发后，分别在620和665nm(60μs延迟,400μs整合)测量Lumi4-铽和D2的荧光。在KREBS中的Lumi4-铽标记的抗体的系列稀释液在相同微滴定板上测量，并且665nm发射对于620nm发射作图。使用样品的620nm发射(E620)，所得曲线用来从铽(E665Tb)计算665nm贡献。TR-FRET信号表示为Δ665(%)=Δ665/665Tb，其中Δ665=E665c-E665Tb；来自样品的665nm和620nm发射从背景校正为E665c=E665样品-E665背景和E620c=E620样品-E620背景。E665背景和E620背景在仅含有读数缓冲液的空白上进行测量。表示为Δ665(%)的TR-FRET信号代表HER2/HER3二聚体量。620nm时间分辨荧光发射用HER2量校正。同时，D2的延迟荧光在620nm激发后在670nm进行测量以定量HER3受体。对于每个样品，通过用未处理的细胞或用不相关抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗处理的细胞进行相同实验获得对照。如图12所示，mAbs 16D3-C1,24E3-C10和9F7-F11诱导HER2/HER3异源二聚化的剂量依赖性抑制，而其他抗体（并且尤其是12H8-B11）不会诱导。在不相关抗体下没有观察到阻断。帕妥珠单抗以及曲妥珠单抗强烈诱导二聚体抑制。
实施例5:抗-HER3抗体的表位作图
膜获自Abimed(Langenfeld,Germany)。Fmoc氨基酸和N-羟基苯甲酰三唑获自Novabiochem(Switzerland)。ASP222机器人(Abimed)用于偶联步骤。移码一个残基的两百一十三该重叠的十二肽，代表HER3受体的细胞外结构域，在纤维素膜上合成。所有肽在它们的N-末端处乙酰基化。在肽序列组装后，侧链保护基通过三氟乙酸处理去除。在TBS缓冲液(137mM NaCl,2.68mM KCl,50mM Tris)中三次洗涤后，该膜在4℃用含有0.1%Tween20(TBS-T)和2%半脱脂乳的TBS缓冲液饱和18h，在TBS-T中一次洗涤后，将抗-HER3mAbs 16D3-C1和9F7-F11的1μg/ml溶液在37℃加入到膜达1h30。结合的抗体通过在过氧化酶-轭合的抗-小鼠IgG(Sigma,St Louis,MO)的1:2000稀释液中温育该膜1h，和接着的电化学发光揭示进行检测。16D3-C1 mAb识别区111-129(图13A)而9F7-F11 mAb结合区35-53(图14A)；这两个区域位于HER3受体的D1结构域上。
为了精确地鉴别通过这些抗体识别的表位，进行斑点丙氨酸扫描分析。对应于之前在图13A和13B中鉴别的抗体-免疫反应性氨基酸序列的12个十五肽，和每个肽的实物个丙氨酸类似物通过所述斑点方法合成。纤维素结合的肽的抗体反应活性如上所述类似地测定。斑点的反应活性通过扫描膜并用Image J软件1.44(http://rsbweb.nih.gov/ij)测量斑点的强度进行评价。斑点贡献残基(SCR)，属于由mAbs 16D3-C1和9F7-F11识别的HER3表位基于等于或优于未修饰肽序列的20%的降低的抗体-结合能力进行鉴别。来自HER3/D1结构域(图13B)的5个十五肽111ALRQLRLTQLTEILS125(SEQ ID NO:1),112LRQLRLTQLTEILSG126(SEQ ID NO:2),113RQLRLTQLTEILSGG127(SEQ ID NO:3),114QLRLTQLTEILSGGV128(SEQ ID NO:4)和115LRLTQLTEILSGGVY129(SEQ ID NO:5)鉴别112L―LT―LTEILS122(SEQ ID NO:6)作为用于mAb16D3-C1的结合基序，其中Leu120,Glu122,Ile123和Leu124是主要的SCR(图13C)。抗-HER3抗体9F7-F11识别HER3/D1结构域中的基序44LEIVL48(SEQ ID NO:7)，其中Leu44,Ile46和Leu48被鉴别为SCR(图14C)。
我们进行在未结合配体的HER3受体(pdb 1M6B)的晶体结构上定位来自抗体16D3-C1和9F7-F11的结合基序的SCR(图15,左图)。9F7-F11表位44LEIVL48在结构域1开始处的优势β-链之一中成层，60-距离处面对结构域3，并悬挂D2结构域。16D3-C1结合基序更深地位于D1结构域的β-链结构内部。在目前，没有报道结合至配体的HER3受体的晶体结构。通过序列同源性，由HER3-特异性抗体16D3-C1和9F7-F11识别的表位添加到结合至帕妥珠单抗(pdb1S78)的HER2受体的晶体结构上(图15,右图)。
实施例6:异种移植肿瘤研究
无胸腺的6-8-周龄雌性BALB/c裸小鼠购自Janvier和Charles Rivers实验室。HER2-未扩增的/PIK3CA-wt/p53-mut表皮样瘤A431(1x106),HER2-未扩增的/PIK3CA-wt/p53-wt胰腺BxPC3(3.5x106)和HER2-未扩增的/PIK3CA-wt/p53-wt肺A549(5x106)癌细胞皮下注射到无胸腺的BALB/c裸小鼠的右侧中。它们二者在低水平(10000至20000受体/细胞)表达HER3受体。另外，A431和A549癌细胞分泌HER3配体HRG并且是HRG-成瘾的(Yonesaka,2011,Zhou 2006)。
所有体内实验依照法国实验动物研究指南(协议no.B34-172-27)进行。
带有肿瘤的小鼠当肿瘤达到大约100mm3的体积时随机化到不同治疗中。小鼠通过腹膜内注射HER3-特异性抗体16D3-C1或9F7-F11相对于媒介物(PBS)进行治疗。注射的抗体的量为300μg/注射，一周三次(Q2d,15mg/kg)，连续6周。肿瘤尺寸用卡尺每周测量两次并且体积通过公式D1xD2xD3/2计算。肿瘤进展使用公式[(最终体积)-(初始体积)]/(初始体积)计算。结果也通过Kaplan-Meier存活曲线表示，使用肿瘤达到2,000mm3的确定最终体积所花的时间。中值延迟定义为50%的小鼠具有达到确定体积的肿瘤的时间。
A431癌细胞分泌HER3配体HRG(Yonesaka,2011),并且表达17000个HER3受体/细胞。在植入后第31天(对应于在开始治疗后的20天)，相比于媒介物对照，抗-HER3 mAbs显著抑制异种移植有A431癌细胞的小鼠中肿瘤生长达大约53±6%(图16A;p<0.001)。16D3-C1和9F7-F11mAbs延迟50%-平均存活时间达21天，其中八只治疗小鼠中的一只在实验结束时(120天)在每组中被治愈(图16B).
如图17A所示，我们观察到，关于在用媒介物治疗的小鼠中测得的肿瘤尺寸，在肿瘤移植后第56天（对应于在开始抗体治疗后26天），在抗体治疗小鼠中胰腺BxPC3肿瘤生长显著降低68±4%(p<0.001)。在实验结束时(135天)，Kaplan-Meier分析揭示，对于用抗-HER3 muAb 9F7-F11治疗的胰腺BxPC3-异种移植小鼠，50%-平均存活时间的18-天延迟(图17B)。另外，在用HER2-未扩增的/PIK3CA-wt BxPC3胰腺肿瘤细胞异种移植的小鼠的存活之间上，HER3-特异性mAb 16D3-C1诱导更长的24-天延迟，其中八只小鼠中的一只被完全治愈。在这种情况下(图18)，关于提取自媒介物治疗小鼠的肿瘤，肿瘤提取自16D3-C1-治疗小鼠证实Y1289 HER3磷酸化的抑制和HER3受体的下调。总之，这些结果证实，mAbs 16D3-C1和9F7-F11在肿瘤中可以上有效的，与HRG添加或p53突变状态无关。
我们之前证实了，治疗性抗体曲妥珠单抗与其他靶向疗法的组合证实了对具有低HER2表达的癌症的协同作用(Larbouret,2007,2010)。为了检查HER3-特异性抗体作为与抗-HER2曲妥珠单抗(Tz)的双重试剂对具有低HER2表达的癌症的体内作用，我们用HER2低表皮样瘤A431和肺A549癌细胞异种移植小鼠，其分泌HRG(Yonesaka,2011;Zhou,2006)，并且分别显示对曲妥珠单抗疗法没有(Farhan,2006)至中度作用(Nakamura,2005)。为了区分潜在的协同作用，将与曲妥珠单抗组合的抗-HER3 muAb 16D3-C1的亚有效剂量以每3天仅10mg/kg施用达4周(Q3d-4W)。如图19A所示，关于在用单独的曲妥珠单抗或媒介物治疗的异种移植小鼠中观察到的16D3-C1-治疗小鼠的肿瘤尺寸的25%-减小和没有作用，在用16D3-C1和Tz的双重组合治疗的小鼠中在第35天肿瘤植入后显著观察到A431肿瘤生长的60%-消退(p<0.001)。类似地，相比于单独用抗体治疗的小鼠中观察到的那些(50%)，在用双重组合16D3-C1+Tz治疗的A549-异种移植小鼠中测得肿瘤生长的75%以上的显著消退。总之，这些结果证实，Taken together,these results demonstrated that dual combination ofHER3-特异性抗体和抗-HER2抗体的双重组合可以对于曲妥珠单抗疗法不合格的HER2低癌症是有效的。
参考文献:
在整个此申请中,各个参考文献描述了本发明所属领域的状态.将这些参考文献的公开内容在此通过引用结合于本公开内容中。

Claims (7)

1.一种分离的单克隆抗体，其特异结合至HER-3的细胞外结构域并与可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤产生的抗体竞争结合至人HER-3的细胞外结构域；
其包括可变轻链(VL)和可变重链(VH)，所述可变轻链(VL)包含可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤的抗体的VL链的CDR，所述可变重链(VH)包含可获自作为CNCM-I-4486保藏的杂交瘤的抗体的VH链的CDR；并且
其是可获自以CNCM保藏号I-4486可得的杂交瘤的鼠类单克隆抗体(16D3-C1)。
2.一种根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体的抗体片段，其选自由以下各项组成的组：Fv,Fab,F(ab’)2,Fab’,dsFv,scFv,sc(Fv)2和双特异抗体。
3.一种编码根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体的VH结构域和根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体的VL结构域的核酸。
4.一种载体，其包含根据权利要求3所述的核酸。
5.一种宿主细胞，其已经通过根据权利要求3所述的核酸或根据权利要求4所述的载体转染、感染或转化。
6.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或根据权利要求2所述的抗体片段。
7.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或根据权利要求2所述的抗体片段，其用于治疗癌症。
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