JP6987742B2 - 抗ヒトｈｅｒ３抗体及びその使用 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、キメラ低フコースニューレグリン（ＮＲＧ）非競合アロステリック抗ヒトＨＥＲ３抗体及び治療方法におけるその使用に関する。
発明の背景
レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のヒト上皮成長因子レセプターＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーは、４つのメンバー：ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ｃ−Ｎｅｕ、ＨＥＲ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４）を含む。ＨＥＲレセプターは、１〜４の番号が付された４つの構造ドメインからなる細胞外グリコシル化ドメインと、それに続く膜貫通ドメインと、シグナリング経路へのカップリングのためのキナーゼドメインを含有する細胞内Ｃ末端部分とを含む。ＨＥＲ３を除いて、細胞内領域は、チロシンキナーゼ活性を含有する。シグナリングは、リガンド誘導性のレセプター二量体化及びそれに続くリン酸化を介して媒介され、細胞質シグナリング経路が活性化される。ＨＥＲ２は、本来的に「活性な」コンフォメーションであるので、特定のリガンドを有しない。他のＨＥＲレセプターは不活性な単量体として存在し、この分子は、二量体化を防止するような形でフォールディングされている。ドメイン１及び３に結合するリガンドは、大きなコンフォメーション変化を誘導し、最終的には、レセプターのドメイン２の二量体化ループを露出させる。二量体化ループのこの露出は、レセプターの二量体化を可能にする。
１９９０年に初めて記載されたＨＥＲ３レセプターは、低いキナーゼ活性を示す唯一のＨＥＲファミリーメンバーレセプターであり、下流シグナリングは、ヘテロ二量体化を介して達成される。したがって、単量体としてのＨＥＲ３レセプターは「非自己的」と称され、ホモ二量体を形成し得ない。ＨＥＲ３レセプターに対するリガンドのニューレグリン（ＮＲＧ）の結合は、ＨＥＲ３と他のＨＥＲファミリーレセプター（優先的には、ＨＥＲ２）とのヘテロ二量体化をトリガーする。ヘテロ二量体内では、ＨＥＲ３キナーゼドメインは、そのＨＥＲファミリーパートナーのアロステリックなアクチベーターとして作用する。
ＨＥＲ３は、乳ガン及び卵巣ガンを含む様々なガンの腫瘍発生に関与する（Lee-Hoeflich ST, Cancer Res. 2008; McIntyre E, Breast Cancer Res Treat. 2010; Tanner B, J Clin Oncol. 2006）。ＨＥＲ３発現は、悪性メラノーマ及び転移における腫瘍進行及び患者生存の減少に相関し、卵巣ガンにおける生存の低下に関連する。重要なことに、乳ガンでは、低いＨＥＲ２発現を有する腫瘍（これは、ハーセプチン処置に適さない）は、多くの場合、ＨＥＲ３を強く発現するように「プログラム化」され（Smith et al. Br. J. Cancer 2004）、ＨＥＲ２＋＋＋腫瘍（これは、長期処置後にハーセプチン耐性になる）は、ＨＥＲ３を強く発現するように「再プログラム化」される（Narayan, Cancer Res. 2009）。セツキシマブ耐性もまた、ＥＧＦＲのインターナリゼーション／分解の調節不全に加えて、肺ガン（Wheeler, Oncogene 2008）及び結腸直腸ガン（Lu Cancer Res 2007）におけるＨＥＲ３過剰発現に関連していた。最近、ＨＥＲ３過剰発現は、結腸直腸ガンにおける無転移生存の悪化に有意に関連していた（Ho-Pun-Cheung, Int J Cancer 2010）。したがって、ＨＥＲ３過剰発現、及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の活性化を介した代償的シグナリングは、ＨＥＲターゲット療法（抗体及びＴＫＩ）による処置（Wheeler 2008, Lu 2007, Narayan, 2009, Sergina, 2007）に対してだけではなく、ＩＧＦＲターゲット療法（Desbois-Mouthon, Clin Cancer Res 2009）及び化学療法剤（Kruser, Exp Cell Res 2010）による処置に対する耐性の発症にも関与している。
これらの知見は全て、ＨＥＲ３ターゲティング剤、特に抗体が、ガンにおけるＨＥＲ３シグナリングの役割のさらなる理解を助け、特に効率的な免疫療法薬として使用され得ることを示唆している。
治療腫瘍学では、既に商品化されている、又は商品化されていない多くの治療用抗体がＨＥＲ３に対して開発されている。
例えば、２つのヒト抗体が、Merrimack Pharmaceuticals/Sanofi Aventis（ＭＭ−１２１抗体；国際公開公報第２００８／１００６２４号）及びU3 PharmaAG/Daiichi Sankyo/Amgen（Ｕ３−１２８７又はＡＭＧ−８８８；国際公開公報第２００７／０７７０２８号）によって提案されている。１つのＨＥＲ２／ＨＥＲ３二重特異性抗体ＭＭ−１１１（Merrimack Pharmaceuticals；国際公開公報第２００５／１１７９７３号、国際公開公報第２００６／０９１２０９号）は単独で、又はトラスツズマブ若しくはラパチニブと組み合わせて、ＨＥＲ２増幅乳ガンの第Ｉ／ＩＩ相臨床試験に関与している。
これらの抗体は全て、ＨＥＲ３レセプターのヘレグリン結合部位を遮断して、リガンド依存的腫瘍に対するこれらの抗体療法を低減する。
しかしながら、耐性ＨＥＲ２増幅乳ガンにおけるターゲット療法若しくは化学療法に対する耐性を回避するために、及び現在はこのような処置の対象外であるＨＥＲ２ｌｏｗ乳ガンに対するターゲット療法の適用分野を拡大するために、又はＨＥＲ３を発現するトリプルネガティブ乳ガンであって、ターゲット療法がまだ利用可能ではないトリプルネガティブ乳ガンを処置するために、ＨＥＲ３のヘレグリン結合部位に対するものではない抗体によるＨＥＲ３のターゲティングが検討された。
当技術分野では、様々なＮＲＧ競合及びＮＲＧ非競合抗ヒトＨＥＲ３抗体が開示された（Lazrek et al., Neoplasia March 2013; Vol. 15; N °3, pp. 335-347）。Lazrek et al. (2013)では、それぞれＨ３Ａ−１２２、Ｈ４Ｂ−２５、Ｈ４Ｂ−１２１、９Ｆ７−Ｆ１１、１１Ｇ１０−Ｄ２、１２Ｈ８−Ｂ１１、１４Ｈ１−Ｈ８、１５Ｄ４−Ｆ２及び１６Ｄ３−Ｃ１と称される構造未知の様々な抗ＨＥＲ３抗体を含むアッセイが開示された。例示的には、Lazrek et al. (2013)では、９Ｆ７−Ｆ１１と称されるマウス抗ヒトＨＥＲ３抗体が開示され、この抗体は、ＮＲＧ非競合的であることが示された。
さらに、Lazrek et al. (2013)では、in vitroにおいて、ＨＥＲ３に対する９Ｆ７−Ｆ１１の結合のＮＲＧ依存的増加の存在が示された。
ＮＲＧがそのエピトープに対する９Ｆ７−Ｆ１１の結合を増加させる機構はまだ発見されていない。しかしながら、理論に縛られないが、そのレセプターに対するＮＲＧの結合は、ＨＥＲ３の構造のコンフォメーション変化をもたらし、９Ｆ７−Ｆ１１のエピトープのより良好なアベイラビリティ、及び／又は９Ｆ７−Ｆ１１とのより良好な親和性を提供する該エピトープの構造的改変をもたらすと想定され得る。
しかしながら、in vitroにおいて、そのリガンドであるニューレグリンの存在下では、ＨＥＲ３に対する９Ｆ７−Ｆ１１の結合は増加するにもかかわらず、in vivoにおいて、９Ｆ７−Ｆ１１は、ＮＲＧ競合抗体と比較して、ＮＲＧ発現腫瘍組織に対する抗腫瘍活性を増加させなかった（Lazrek et al., 2013）。
Lazrek et al. (2013)の結果により、例えばそれぞれ９Ｆ７−Ｆ１１抗体及び１６Ｄ３−Ｃ１抗体の場合のように、彼らがアッセイした抗体のほとんどにおいて、それらが認識するＨＥＲ３ドメインの同一性にかかわらず、さらには、これらの抗体がＮＲＧ非競合抗ＨＥＲ３抗体からなるか、又は対照的にＮＲＧ競合抗ＨＥＲ３抗体からなるかにかかわらず、同程度の抗腫瘍効果が得られたことが示された。これらの著者らは、これらの抗ＨＥＲ３抗体が全て、単一の作用機序（すなわち、ＨＥＲ３のＮＲＧ誘導性リン酸化の阻害）を介して全て作用すると思われ、最終的にはＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体形成が妨げられたと結論付けた。
当技術分野では、ＨＥＲ３陽性ガンの処置を目的とする抗ＨＥＲ３抗体（ＮＲＧ依存的腫瘍に対する高い抗腫瘍活性を有する抗ＨＥＲ３抗体を含む）のアベイラビリティが依然として必要である。
本発明は、抗ヒトＨＥＲ３抗体であって、
−配列番号：２に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１；
−配列番号：３に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２；
−配列番号：４に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３；
−配列番号：６に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ１；
−配列番号：７に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ２；及び
−配列番号：８に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ３
からなる群より選択されるＣＤＲの少なくとも１つを含み、
ヒト定常領域を有し；並びに
抗体のグリコシル化部位が有するグリカン構造の６５％未満がフコース分子を含む抗ヒトＨＥＲ３抗体を開示する。
特に、本発明は、ニューレグリン非競合アロステリック抗ヒトＨＥＲ３抗体であって、
−配列番号：２に記載されている配列を有するＨ−ＣＤＲ１；
−配列番号：３に記載されている配列を有するＨ−ＣＤＲ２；
−配列番号：４に記載されている配列を有するＨ−ＣＤＲ３；
−配列番号：６に記載されている配列を有するＬ−ＣＤＲ１；
−配列番号：７に記載されている配列を有するＬ−ＣＤＲ２；及び
−配列番号：８に記載されている配列を有するＬ−ＣＤＲ３
からなる群より選択されるＣＤＲの少なくとも１つを含み、
ヒト定常領域を有し；並びに
抗体のグリコシル化部位が有するグリカン構造の６５％未満がフコース分子を含むニューレグリン非競合アロステリック抗ヒトＨＥＲ３抗体を開示する。
本発明はまた、ニューレグリン非競合アロステリック抗ヒトＨＥＲ３抗体であって、
（ａ）可変ドメインが、
配列番号：２に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１；
配列番号：３に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２；及び
配列番号：４に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３
を含む重鎖
並びに
（ｂ）可変ドメインが少なくとも、
Ｌ−ＣＤＲ１として配列番号：６に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有する配列；
Ｌ−ＣＤＲ２として配列番号：７に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有する配列；及び
Ｌ−ＣＤＲ３として配列番号：８に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有する配列
からなる群より選択される配列を有するＣＤＲを含む軽鎖
を含み、
ヒト定常領域を有し；並びに
抗体のグリコシル化部位が有するグリカン構造の６５％未満がフコース分子を含むニューレグリン非競合アロステリック抗ヒトＨＥＲ３抗体を開示する。
したがって、本発明の第１の目的は、ニューレグリン非競合アロステリック抗ヒトＨＥＲ３抗体であって、
（ａ）可変ドメインが、
−配列番号：２に記載されている配列を有するＨ−ＣＤＲ１；
−配列番号：３に記載されている配列を有するＨ−ＣＤＲ２；及び
−配列番号：４に記載されている配列を有するＨ−ＣＤＲ３
を含む重鎖
並びに
（ｂ）可変ドメインが少なくとも、
−配列番号：６に記載されている配列を有するＬ−ＣＤＲ１；
−配列番号：７に記載されている配列を有するＬ−ＣＤＲ２；及び
−配列番号：８に記載されている配列を有するＬ−ＣＤＲ３
からなる群より選択されるＣＤＲを含む軽鎖
を含み、
ヒト定常領域を有し；並びに
抗体のグリコシル化部位が有するグリカン構造の６５％未満がフコース分子を含むニューレグリン非競合アロステリック抗ヒトＨＥＲ３抗体である。
一実施態様によれば、本発明の抗体は、Ｌ−ＣＤＲ１として配列番号：６に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有する配列、Ｌ−ＣＤＲ２として配列番号：７に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有する配列、及びＬ−ＣＤＲ３として配列番号：８に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。
特に、本発明の抗体は、配列番号：６に記載されている配列を有するＬ−ＣＤＲ１、配列番号：７に記載されている配列を有するＬ−ＣＤＲ２、及び配列番号：８に記載されている配列を有するＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
さらなる実施態様によれば、本発明の抗体の重鎖可変領域は、配列番号：１に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％若しくは９５％の同一性を有する配列を有し、及び／又は軽鎖可変領域は、配列番号：５に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％若しくは９５％の同一性を有する配列を有する。
特に、配列番号：１に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有する配列を有する本発明の抗体の重鎖可変領域は、
配列番号：２に記載されている配列を有するＨ−ＣＤＲ１；
配列番号：３に記載されている配列を有するＨ−ＣＤＲ２；及び
配列番号：４に記載されている配列を有するＨ−ＣＤＲ３
を有する。
特に、配列番号：５に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有する配列を有する軽鎖可変領域は、
配列番号：６に記載されている配列を有するＬ−ＣＤＲ１；
配列番号：７に記載されている配列を有するＬ−ＣＤＲ２；及び
配列番号：８に記載されている配列を有するＬ−ＣＤＲ３
を有する。
好ましくは、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号：１に記載されているアミノ酸配列を有し、及び／又は軽鎖可変領域は、配列番号：５に記載されているアミノ酸配列を有する。より好ましくは、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号：１に記載されているアミノ酸配列を有し、及び軽鎖可変領域は、配列番号：５に記載されているアミノ酸配列を有する。
別の実施態様によれば、本発明の抗体の重鎖は、配列番号：９に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％若しくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、及び／又は前記抗体の軽鎖は、配列番号：１０に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％若しくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
好ましくは、前記抗体の重鎖は、配列番号：９に記載されているアミノ酸配列を有し、及び／又は前記抗体の軽鎖は、配列番号：１０に記載されているアミノ酸配列を有する。より好ましくは、前記抗体の重鎖は、配列番号：９に記載されているアミノ酸配列を有し、及び前記抗体の軽鎖は、配列番号：１０に記載されているアミノ酸配列を有する。
さらなる実施態様によれば、本発明の抗体は、抗体のグリコシル化部位が有するグリカン構造の５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、特に２０％未満がフコース分子を含むようなものである。
特定の実施態様によれば、本発明の抗体は、キメラ抗体、好ましくはキメラマウス／ヒト抗体、好ましくはヒト化抗体である。
本発明の第２の目的は、少なくとも本発明のモノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖をコードし、好ましくは本発明の抗体をコードする核酸配列に関する。
本発明の第３の目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
本発明の第４の目的は、本発明の核酸又は本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。
本発明の第５の目的は、少なくとも本発明の抗体と、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物に関する。
本発明の第６の目的は、治療剤に連結された本発明の抗体を含むイムノコンジュゲートに関する。
本発明の第７の目的は、少なくとも本発明のイムノコンジュゲートと、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物に関する。
本発明の第８の目的は、薬物として使用するための、本発明の抗体及び／又はイムノコンジュゲートに関する。
本発明の第９の目的は、ＨＥＲ３の発現に関連するガンであって、ニューレグリン、特にニューレグリン１βが対象中に存在するガンの処置において使用するための、本発明の抗体及び／又はイムノコンジュゲートに関する。
本発明の第１０の目的は、ＨＥＲ３の発現に関連する腫瘍細胞であって、ニューレグリン、特にニューレグリン１βが対象中に存在する腫瘍細胞の成長の阻害において使用するための、本発明の抗体及び／又はイムノコンジュゲートに関する。
一実施態様によれば、存在するニューレグリンは、腫瘍によって、並びに／又は腫瘍周囲の組織及び／若しくは器官によって分泌される。特定の実施態様では、腫瘍は、ニューレグリン依存性、特にニューレグリン１β依存性である。
本発明にしたがってＮＲＧ、例えばＮＲＧ１α又はＮＲＧ１βが存在するかを決定するために、免疫組織化学の周知の方法は、Gilmour et al. December 2002, Vol. 8, pp. 3933-3942に記載されているように適用され得る。
別の実施態様によれば、ニューレグリン、特にニューレグリン１βは、抗体及び／又はイムノコンジュゲートの前、その後又はそれと同時に対象へのその投与により存在する。
特定の実施態様では、本発明において検討されるＨＥＲ３の発現に関連するガン又は腫瘍細胞は、扁平上皮細胞ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、胃ガン、膵臓ガン、膠細胞腫瘍、例えば膠芽細胞腫及び神経線維腫症、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、ヘパトーマ、乳ガン、結腸ガン、メラノーマ、結腸直腸ガン、子宮内膜ガン、唾液腺ガン、腎臓ガン、腎ガン、前立腺ガン、外陰ガン、甲状腺ガン、肝ガン及び頭頸部ガンの中から選択される。
それらは、好ましくは、乳ガン、卵巣ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、メラノーマ、膵臓ガン及び結腸直腸ガン、の中から選択され、より具体的には、乳ガン、卵巣ガン及び膵臓ガンの中から選択される。
図１は、本発明のＧＭＢ３０１について、ＨＥＲ３に対するその親和性を特性評価するためにＥＬＩＳＡアッセイによって得られた用量効果曲線を示す。実施例２に記載されているように、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。Ｘ軸：ＧＭＢ３０１の濃度。Ｙ軸：ＯＤ４５０nmの吸光度。 図２は、膵臓ガン細胞ＨＰＡＣ（ＥＧＦＲｈｉｇｈ、ＨＥＲ２／３ｌｏｗ、ＰＴＥＮ／ＰＩＫ３ＣＡ ｗｔ、ＮＲＧｎｅｇａｔｉｖｅ及びＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ突然変異ＮＲＧ１β非依存性）を注射した６〜８週齢の無胸腺雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードをＧＭＢ３０１、９Ｆ７−Ｆ１１又はＰＢＳ（コントロール）のいずれかで処置したin vivo効果を示す。１５mg/kgを４週間連続で週２回注射する（Ｑ３Ｄ−４Ｗ）。腫瘍体積は縦軸に示されており、式Ｄ１×Ｄ２×Ｄ３／２によって計算した。 図３は、膵臓ガン細胞ＢｘＰＣ３（ＥＧＦＲｈｉｇｈ、ＨＥＲ２／３ｌｏｗ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ／ＰＴＥＮ／ＰＩＫ３ＣＡ ｗｔ、ＮＲＧｐｏｓｉｔｉｖｅ、ＮＲＧ１β依存性）を注射した６〜８週齢の無胸腺雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードをＧＭＢ３０１、９Ｆ７−Ｆ１１又はＰＢＳ（コントロール）のいずれかで処置したin vivo効果を示す。１５mg/kgを４週間連続で週２回注射する（Ｑ３Ｄ−４Ｗ）。腫瘍体積は縦軸に示されており、式Ｄ１×Ｄ２×Ｄ３／２によって計算した。 図４は、エフェクター末梢血単核細胞と一緒に１００ng/ml ＮＲＧ１の存在下における（１：１５のＴ：Ｅ比）、ＭＤＡ−ＭＢ４５３乳ガン細胞の細胞溶解（ＡＤＣＣ）に対する、ＧＭＢ３０１（抗体Ｈ４Ｂ １２１のemablingバージョン）又は無関係な抗体（コントロールＰｘ）（１μg/ml）による処置の効果を示す。横軸：使用した抗体の性質。縦軸：ターゲット腫瘍細胞の特異的溶解の％。 図５は、抗体濃度に応じた、ＨＥＲ３に対する抗体Ｈ４Ｂ−１２１−ｅｍｂ及びＧＭＢ３０１の結合の変動の％を示す。２つの抗体の対応するＥＣ５０も示されている（nM単位）。横軸：抗体の濃度（Ｍ）。縦軸：ＨＥＲ３に対する結合の％。 図６は、３つの異なる種類のＮＲＧ１依存的腫瘍の経時的な腫瘍体積に対する、ＧＭＢ３０１（抗体Ｈ４Ｂ １２１のemablingバージョン）（Ｈ４Ｂ−１２１−ｅｍｂ）又はビヒクル（ＮａＣｌ−ネガティブコントロール）による処置の効果を示す（左パネル）（図５Ａ；ＮＲＧ１依存的膵臓ＢｘＰＣ３（３×１０６個）；図５Ｂ：トリプルネガティブ乳ガンＨＣＣ−１８０６（１×１０６個）；及び図５Ｃ：肺Ａ５４９ガン細胞）。右のパネルでは、この異なるガン型に適用した同じ処置について、対応する処置利益の日数が表されている。腫瘍成長データ（左のパネル）は、経時的（日）な各ヌードマウス群の平均腫瘍体積（mm3）＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示されている。灰色の領域は、処置時間に対応する。腫瘍が１５００又は２０００mm3の体積に達したらマウスを屠殺し、カプラン・マイヤー生存曲線を計算した。利益（コントロール群と対比した処置利益の日数）（右のパネル）は、カプラン・マイヤー曲線上に示されている。左のパネル：横軸：腫瘍体積（mm3）及び縦軸：移植後の日数。右のパネル：横軸：１５００mm3未満の％腫瘍及び縦軸：移植後の日数。
発明の詳細な説明
本発明者らは、Lazrek et al (2013)が以前にアッセイしたマウス抗体９Ｆ７−Ｆ１１の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＧＭＢ３０１と称されるキメラ低フコース抗ヒトＨＥＲ３抗体を作製したところ、このＧＭＢ３０１抗体は、抗ガン剤として予想外の特性を有する。
本発明者らは、Lazrek et al (2013)が使用した９Ｆ７−Ｆ１１抗体のＣＤＲを有するキメラ抗体であって、低フコース含量を有するキメラ抗体が、特にＮＲＧ発現腫瘍に対する増加したin vivo抗腫瘍活性を有することを示した。
したがって、本発明者らは、予想外のことに、特定のグリコシル化パターン、より正確には低フコース含量及びヒト定常ドメインを有する抗体が、同じＣＤＲ及び高フコース含量を有する親マウス抗体とは異なるように抗ガン剤として作用し得ることを見出した。
驚くべきことに、本発明者らは、本明細書に記載される低フコース抗体が、同じＣＤＲ、マウス定常ドメイン及び高フコース含量を有する親抗体と比較して、特異的な腫瘍ターゲティング活性を有することを示した。
本発明者らによって得られた結果は、予想とは対照的に、９Ｆ７−Ｆ１１抗体のＣＤＲ、ヒト定常ドメイン及び低フコース含量を有する前記抗体が、ＮＲＧの非存在下では、腫瘍に対する増加した腫瘍活性を示さないという一層驚くべきものである。
したがって、本発明者らは、予想外のことに、本明細書に記載される低フコースキメラ抗ＨＥＲ３抗体の増加したin vivo抗腫瘍活性が、増強したＡＤＣＣ又はＡＤＣＰ特性を介して媒介されるのではなく、未知かつ予想外の機構によって媒介されると思われることを見出した。
本明細書に記載される低フコース含量を有する抗ＨＥＲ３キメラ抗体は、ニューレグリンの存在下で、特にＨＥＲ３を発現する腫瘍集団に対する改善された抗腫瘍活性（これは、特にＨＥＲ３及びニューレグリンの両方を発現する腫瘍集団（オートクリン分泌）、又はパラクリン経路を介して微小環境から非腫瘍細胞によって分泌されるニューレグリンによって刺激され得る腫瘍集団に対する改善された抗腫瘍活性を包含する）を有する。
本明細書の実施例に開示されているように、本発明者らは、全く予想外のことに、
（ｉ）ニューレグリンの非存在下では、ＧＭＢ３０１で処置した腫瘍において、腫瘍成長に対する前記抗体の活性が９Ｆ７−Ｆ１１のものと同様であること；及び
（ｉｉ）ニューレグリンの存在下では選択的に、検討した腫瘍部位において、ＧＭＢ３０１の抗腫瘍活性が９Ｆ７−Ｆ１１の抗腫瘍活性よりも有意に高いことを見出した。
当業者であれば、公知の抗体の低フコース（emabling）バージョンは、野生型抗体よりも効率的に機能すると予想するであろう。しかしながら、本発明の実施例で実証されているように、これは今回の場合には当てはまらない。
本明細書に記載される抗ＨＥＲ３キメラ低フコース抗体は、従来技術に記載されている抗ＨＥＲ３抗体に対して少なくとも以下の利点を提供するということである：
−それは、（そのアロステリック効果により）オートクリン又はパラクリンリガンド依存性腫瘍に対してより効率的である；
−それは、ＨＥＲ３リガンドのアップレギュレーションによって媒介される耐性が生じる場合により効率的である；
−それは、既存の治療用抗体が臨床的に有効ではない症状、例えばトリプルネガティブ乳ガン、膵臓ガン及び他の特定のガン（例えば、腎細胞ガン）を処置するために使用され得る。
定義
「ニューレグリン」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、多くの場合、「ヘレグリン」という用語と互換的に使用される。ヘレグリンファミリーとしては、α、β及びγヘレグリン（Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992)；米国特許第５，６４１，８６９号；及びSchaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)）；ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、グリア細胞成長因子（ＧＧＦ）；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）；並びに感覚及び運動ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）が挙げられる。総説については、Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262 (1996)及びLee etal. Pharm. Rev. 47:51-85 (1995); Falls and D. (2003). “neuregulins: functions, forms, and signaling strategies.” Experimental Cell Research 284(1): 14-30を参照のこと。
「ＨＥＲ３」という用語は、Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4905-4909 (1990)に記載されているヒトＨＥＲ３レセプターを指す；Kani et al., Biochemistry 44: 15842-857 (2005), Cho and Leahy, Science 297: 1330- 1333 (2002)も参照のこと。ＨＥＲ３は、「ＨＥＲ３」としても公知である。
「抗ヒトＨＥＲ３抗体」という用語は、ヒトＨＥＲ３に対する抗体を指す。
本発明によれば、「抗体」又は「イムノグロブリン」という用語は、同一の意味を有し、本発明において同様に使用される。本明細書で使用される「抗体」という用語は、イムノグロブリン分子、及びイムノグロブリン分子の免疫学的活性部分（すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子）を指す。したがって、抗体という用語は、抗体分子全体だけではなく、抗体の変異体（誘導体を含む）を包含する。天然抗体では、２本の重鎖がジスルフィド結合によって互いに連結しており、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結している。ラムダ（ｌ）及びカッパ（ｋ）という２種類の軽鎖がある。抗体分子の機能活性を決定する主要な５つの重鎖クラス（又はアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥがある。各鎖は、別個の配列ドメインを含有する。軽鎖は、２個のドメイン（可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ））を含む。重鎖は、４個のドメイン（可変ドメイン（ＶＨ）及び３個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３。ＣＨと総称される））を含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識及び特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、重要な生物学的特性、例えば抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、及びＦｃレセプター（ＦｃＲ）に対する結合を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１本の軽鎖及び１本の重鎖の可変部分から構成される。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）に主に由来する残基から構成される。時には、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）に由来する残基が全体的なドメイン構造、したがって結合部位に影響を与える。相補性決定領域又はＣＤＲは、ネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を共に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖はそれぞれ、３個のＣＤＲ（それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と称される）を有する。したがって、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖Ｖ領域のそれぞれに由来するＣＤＲセットを含む６個のＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に介在するアミノ酸配列を指す。
「キメラ抗体」という用語は、ある種に由来する抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインと、別の種に由来する定常ドメインとを含む抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指す。
本発明によれば、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体由来の可変領域フレームワーク及び定常領域を有するが、本発明の抗体のマウスＣＤＲを保持する抗体を指す。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。
「処置」又は「治療」という用語は、症状（例えば、疾患）、症状の症候を治癒し、癒し、緩和し、軽減し、変更させ、修正し、改善し、向上させ若しくはそれに影響を与えるか、又は疾患の症候、合併症、生化学的兆候の発症を予防し若しくは遅延させるか、又は統計的に有意な様式で疾患、症候若しくは障害のさらなる進行を別様に停止若しくは阻害する目的で、活性剤を投与することを指す。
本発明によれば、「患者」又は「それを必要とする患者」という用語は、ヒトＨＥＲ３の発現に関連するガンに罹患しているか又は罹患する可能性があるヒト又は非ヒト哺乳動物を意図する。
本発明の抗体の「治療有効量」は、任意の医薬的治療に適用可能な適切なベネフィット／リスク比において、前記ガンを処置するための抗体の十分な量を意味する。しかしながら、本発明の抗体及び組成物の１日当たりの総用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決められることが理解されよう。任意の特定の患者のための特定の治療有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度、使用される特定の抗体の活性、使用される特定の組成物、患者の年齢、体重、総合的な健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路、使用される特定の抗体の排出率、治療の期間、使用される特定の抗体と組み合わせで使用される又は同時に使用される薬物、並びに医学分野で周知の因子を含む様々な因子に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルの化合物の用量で開始すること、及び所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加することは当業者に周知である。
本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列間の同一性の割合は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:1 1-17, 1988)のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、１２のギャップレングスペナルティ及び４のギャップペナルティを使用して決定され得る。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性の割合は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comにおいて入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch (J. MoI, Biol. 48:444-453, 1970)アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか及び１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップウェイト及び１、２、３、４、５又は６のレングスウェイトを使用して決定され得る。
本発明の抗体
本発明は、好ましくは精製された形態で又は単離された形態で、ニューレグリン（ＮＲＧ）非競合アロステリック抗ＨＥＲ３抗体を提供する。
したがって、本発明は、抗ヒトＨＥＲ３抗体であって、
（ａ）可変ドメインが、
−配列番号：２に記載されている配列を有するＨ−ＣＤＲ１；
−配列番号：３に記載されている配列を有するＨ−ＣＤＲ２；及び
−配列番号：４に記載されている配列を有するＨ−ＣＤＲ３
を含む重鎖
並びに
（ｂ）可変ドメインが少なくとも、Ｌ−ＣＤＲ１として配列番号：６、Ｌ−ＣＤＲ２として配列番号：７、及びＬ−ＣＤＲ３として配列番号：８からなる群より選択される配列を有するＣＤＲを含む軽鎖
を含み、
ヒト定常領域を有し；並びに
抗体のグリコシル化部位が有するグリカン構造の６５％未満がフコース分子を含む抗ヒトＨＥＲ３抗体に関する。
本出願における目的の配列は、以下の表１に示されている：
Figure 0006987742
一実施態様によれば、本発明の抗体は、Ｌ−ＣＤＲ１として配列番号：６、Ｌ−ＣＤＲ２として配列番号：７、及びＬ−ＣＤＲ３として配列番号：８を含む軽鎖可変領域を含む。
さらなる実施態様によれば、本発明の抗体の重鎖可変領域は、配列番号：１に記載されているアミノ酸配列を有し、及び／又は軽鎖可変領域は、配列番号：５に記載されているアミノ酸配列を有する。好ましくは、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号：１に記載されているアミノ酸配列を有し、及び軽鎖可変領域は、配列番号：５に記載されているアミノ酸配列を有する。
別の実施態様によれば、本発明の抗体の重鎖は、配列番号：９に記載されているアミノ酸配列を有し、及び／又は前記抗体の軽鎖は、配列番号：１０に記載されているアミノ酸配列を有する。好ましくは、前記抗体の重鎖は、配列番号：９に記載されているアミノ酸配列を有し、及び前記抗体の軽鎖は、配列番号：１０に記載されているアミノ酸配列を有する。
さらなる実施態様によれば、本発明の抗体は、抗体のグリコシル化部位が有するグリカン構造の５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、特に２０％未満がフコース分子を含むようなものである。
特定の実施態様によれば、本発明の抗体は、キメラ抗体、好ましくはキメラマウス／ヒト抗体、特にヒト化抗体である。
本発明の抗体を生産する方法
本発明の抗ヒトＨＥＲ３抗体は、当技術分野で公知の任意の技術、例えば限定されないが、任意の化学的技術、生物学的技術、遺伝的技術又は酵素学的技術（単独又は組み合わせのいずれか）によって生産され得る。
所望の配列のアミノ酸配列を認識することによって、当業者であれば、標準的なポリペプチド生産技術によって前記抗体を容易に生産し得る。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、好ましくは商業的に入手可能なペプチド合成装置（例えば、Applied Biosystems, Foster City, Californiaによって作製された）を使用して、製造業者の説明書にしたがって合成され得る。あるいは、本発明の抗体は、当技術分野で周知のリコンビナントＤＮＡ技術によって合成され得る。例えば、抗体は、抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、このようなベクターを、所望の抗体を発現する適切な真核宿主又は原核宿主に導入した後に、ＤＮＡ発現産物として得ることができ、そこからそれらは、周知の技術を使用して後に単離され得る。
核酸配列
したがって、本発明のさらなる目的は、本発明の抗体をコードする核酸配列に関する。
典型的には、前記核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ又はウイルスベクターなどの任意の適切なベクターに含められ得るＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。
ベクター
本明細書で使用される「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」という用語は、宿主生物をトランスフォーメーションして導入配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進するために、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入し得るビヒクルを意味する。
よって、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
このようなベクターは、対象に投与されると前記抗体の発現を引き起こし又は指令するための調節要素、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを含み得る。動物細胞のための発現ベクターに使用されるプロモーター及びエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー（Mizukami T. et al. 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー（Kuwana Y et al. 1987）、イムノグロブリンＨ鎖のプロモーター（Mason JO et al. 1985）及びエンハンサー（Gillies SD et al. 1983）などが挙げられる。
ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子が挿入及び発現され得る限り、動物細胞のための任意の発現ベクターが使用され得る。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Miyaji H et al. 1990）、ｐＡＧＥ１０３（Mizukami T et al. 1987）、ｐＨＳＧ２７４（Brady G et al. 1984）、ｐＫＣＲ（O’Hare K et al. 1981）、ｐＳＧ１ ｂｅｔａ ｄ２−４−（Miyaji H et al. 1990）などが挙げられる。
プラスミドの他の例としては、複製開始点を含む複製プラスミド、又はｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの組み込みプラスミドが挙げられる。
ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びＡＡＶベクターが挙げられる。このようなリコンビナントウイルスは、当技術分野で公知の技術によって、例えばパッケージング細胞のトランスフェクションによって、又はヘルパープラスミド若しくはウイルスによる一過性トランスフェクションによって生産され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠損リコンビナントウイルスを生産するための詳細なプロトコールは、例えば、国際公開公報第９５／１４７８５号、国際公開公報第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号及び国際公開公報第９４／１９４７８号に見られ得る。
宿主細胞
本発明のさらなる目的は、本発明の核酸及び／又はベクターによってトランスフェクション、感染又はトランスフォーメーションされた宿主細胞に関する。
「トランスフォーメーション」という用語は、宿主細胞が導入遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、典型的には導入遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素を産生するように、「外来」（すなわち、外因性又は細胞外）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を宿主細胞に導入することを意味する。導入ＤＮＡ又はＲＮＡを受け取って発現する宿主細胞は、「トランスフォーメーションされている」。
本発明の核酸は、適切な発現系において本発明の抗体を生産するために使用され得る。「発現系」という用語は、例えば、ベクターによって運搬されて宿主細胞に導入される外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のための適切な条件下にある宿主細胞及び適合ベクターを意味する。
一般的な発現系としては、E.coli宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞及びバキュロウイルスベクター、並びに哺乳動物宿主細胞及びベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、限定されないが、原核細胞（例えば、細菌）及び真核細胞（例えば、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられる。特定の例としては、E.coli、Kluyveromyces又はSaccharomyces酵母、哺乳動物細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）、及び初代哺乳動物細胞又は樹立哺乳動物細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから生産される）が挙げられる。例としては、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸レダクダーゼ遺伝子（以下、「ＤＨＦＲ遺伝子」と称される）が欠損されたＣＨＯ細胞（Urlaub G et al; 1980）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、以下、「ＴＢ２／０細胞」と称される）なども挙げられる。
キメラ抗体
特定の実施態様では、本発明のヒトキメラ抗体は、以前に記載されているようにＶＬドメイン及びＶＨドメインをコードする核酸配列を得、それらを、ヒト抗体ＣＨ及びヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターに挿入することによってヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞に導入することによってコード配列を発現させることによって生産され得る。
ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとしては、それは、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域であり得るが、ＩｇＧクラスのものが適切であり得、ＩｇＧクラスに属するサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のいずれか１つが使用され得る。また、ヒトキメラ抗体のＣＬとしては、それは、Ｉｇに属する任意の領域であり得、κクラス又はλクラスのものが使用され得る。
キメラ抗体を生産するための方法は、当技術分野で周知の従来のリコンビナントＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション技術を含む（Morrison SL. et al. (1984)並びに特許文献の米国特許第５，２０２，２３８号；及び米国特許第５，２０４，２４４号を参照のこと）。
好ましい実施態様によれば、本発明の抗体は、ヒト化される。
機能保存変異体
本発明のさらなる目的はまた、本発明の抗体の機能保存変異体を包含する。
「機能保存変異体」は、ポリペプチドの全体的なコンフォメーション及び機能の変化を伴わずに、タンパク質又は酵素中の所定のアミノ酸残基が変更されているものであり、限定されないが、類似の特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香性など）を有するアミノ酸によるアミノ酸の置き換えが挙げられる。類似の機能の任意の２つのタンパク質間のタンパク質又はアミノ酸配列類似性の割合は変動し得、アライメントスキームにしたがって、例えば類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくクラスタ法によって決定した場合に７０％〜９９％であり得るように、保存されていると示されているもの以外のアミノ酸は、タンパク質において異なり得る。「機能保存変異体」はまた、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定した場合に、少なくとも６０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドであって、比較されるネイティブな又は親のタンパク質と同じ又は実質的に同様の特性又は機能を有するポリペプチドを含む。
２つのアミノ酸配列は、アミノ酸の８０％超、好ましくは８５％超、好ましくは９０％超が同一であるか、又はより短い配列の全長にわたって約９０％超、好ましくは９５％超が類似（機能的に同一）である場合に「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。好ましくは、類似配列又は相同配列は、例えば、ＧＣＧ（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）ｐｉｌｅｕｐプログラム、又はＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列比較アルゴリズムのいずれかを使用してアライメントによって同定される。
例えば、活性の認識可能な喪失を伴わなければ、特定のアミノ酸は、タンパク質構造中の他のアミノ酸によって置換され得る。タンパク質の相互作用能力及び性質は、タンパク質の生物学的機能活性を規定するので、同様の特性を有するタンパク質を得ながら、タンパク質配列において、及び当然ながらそのＤＮＡコード配列において、特定のアミノ酸置換を行い得る。したがって、生物学的活性の認識可能な喪失を伴わなければ、本発明の抗体の配列、又は前記抗体をコードする対応するＤＮＡ配列において、様々な変更を行い得ることが企図される。
特定のアミノ酸を、類似のヒドロパシー指標又はスコアを有する他のアミノ酸によって置換して、類似の生物学的活性を有するタンパク質を依然としてもたらすことができる（すなわち、生物機能的に同等のタンパク質を依然として得ることができる）ことが当技術分野で公知である。
したがって、上記のように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷及びサイズなどに基づく。様々な上記特徴を考慮した例示的な置換は当業者に周知であり、アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；並びにバリン、ロイシン及びイソロイシンが挙げられる。
グリコシル化
本発明の抗体のグリコシル化は、そのフコース含量を考慮して変更される。
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型である。「Ｎ結合型」は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。
抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、トリフルオロメタンスルホン酸化合物又は同等の化合物への抗体の曝露を必要とする。この処置は、抗体をインタクトに保ちながら、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんど又は全ての糖の切断をもたらす。化学的脱グリコシル化は、Sojahr H. et al. (1987)及びEdge, AS. et al. (1981)に記載されている。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura, NR. et al. (1987)に記載されているように、様々なエンド−及びエキソ−グリコシダーゼを使用することによって達成され得る。
より具体的には、本発明の抗体のグリコシル化は、抗体のグリコシル化部位が有するグリカン構造の６５％未満がフコース分子を含むという点において変更されている。
このような炭水化物改変は、例えば変更されたグリコシル化機構を有する宿主細胞で抗体を発現することによって達成され得る。変更されたグリコシル機構を有する細胞は、当技術分野で説明されており、本発明のリコンビナント抗体を発現し、それにより、変更されたグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。
例えば、Hangらによる欧州特許出願公開第１，１７６，１９５号には、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株が記載されており、このような細胞株で発現された抗体は、低フコシル化を示すか、又はフコシル残基を欠く。
Prestaによる国際公開公報第０３／０３５８３５号には、Ａｓｎ（２９７）結合炭水化物にフコースを結合する能力が低下している変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞であって、その細胞株で発現される抗体の低フコシル化をもたらす変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞が記載されている（Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照のこと）。
また、米国特許第７９３１８９５号及び国際公開公報第０１／７７１８１号には、ＹＢ２／０細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）、参照ＣＲＬ−１６６２）において生産された低フコース抗体の生産が記載されている。
さらに、Eureka Therapeuticsは、変更された哺乳動物グリコシル化パターンを有する抗体であって、フコシル残基を欠く抗体を産生することができる遺伝子操作ＣＨＯ哺乳動物細胞について記載している（http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html）。
あるいは、本発明の抗体は、哺乳動物様グリコシル化パターンについて操作された酵母又は糸状菌であって、グリコシル化パターンとしてフコースを欠く抗体を産生することができる酵母又は糸状菌において生産され得る（例えば、欧州特許第１２９７１７２号を参照のこと）。
抗体アッセイ
これらの抗体の全ては、当技術分野で公知の任意の方法によって、特異的結合についてアッセイされ得る。多くの異なる競合的結合アッセイフォーマットがエピトープ結合に使用され得る。使用され得るイムノアッセイとしては、限定されないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素アッセイ、ゲル拡散沈降素アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ及び補体結合アッセイなどの技術を使用した競合アッセイシステムが挙げられる。このようなアッセイはルーチンであり、当技術分野で周知である（例えば、Ausubel et al., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New Yorkを参照のこと）。例えば、BIACORE（登録商標）（GE Healthcare, Piscaataway, NJ）は、モノクローナル抗体のパネルをエピトープビニングするためにルーチンに使用される様々な表面プラズモン共鳴アッセイフォーマットの１つである。加えて、ルーチンな交差ブロッキングアッセイ、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988に記載されているものが実施され得る。
イムノコンジュゲート：
検出可能な標識
本発明の抗体は、抗ＨＥＲ３イムノコンジュゲートを形成するために、検出可能な標識とコンジュゲートされ得る。適切な検出可能な標識としては、例えば放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識又は金コロイドが挙げられる。このような検出可能に標識されたイムノコンジュゲートを作製及び検出する方法は、当業者に周知であり、以下により詳細に記載する。
検出可能な標識は、オートラジオグラフィーによって検出される放射性同位体であり得る。本発明の目的のために特に有用なアイソトープは、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ及び１４Ｃである。
本発明の抗ＨＥＲ３イムノコンジュゲートはまた、蛍光化合物によって標識され得る。蛍光標識抗体の存在は、イムノコンジュゲートを適切な波長の光に曝露し、生じた蛍光を検出することによって決定される。蛍光標識化合物としては、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレスカミンが挙げられる。
あるいは、本発明の抗ＨＥＲ３イムノコンジュゲートは、抗体を化学発光化合物にカップリングすることによって検出可能に標識され得る。化学発光タグ付イムノコンジュゲートの存在は、化学的反応の過程の間に生じる発光の存在を検出することによって決定される。化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。
同様に、生物発光化合物は、本発明の抗ＨＥＲ３イムノコンジュゲートを標識するために使用され得る。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的システムにおいて見出された化学発光の１つである。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識に有用な生物発光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びイクオリンが挙げられる。
あるいは、抗ＨＥＲ３イムノコンジュゲートは、酵素に抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体を連結することによって検出可能に標識され得る。抗ＨＥＲ３酵素コンジュゲートを適切な基質の存在下でインキュベーションすると、酵素部分が基質と反応して、例えば分光光度法、蛍光分析法又は可視的手段によって検出され得る化学的部分が生成する。多重特異性イムノコンジュゲートを検出可能に標識するために使用され得る酵素の例としては、βガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼが挙げられる。
当業者であれば、本発明にしたがって使用され得る他の適切な標識を認識するであろう。抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体に対するマーカー部分の結合は、当技術分野で公知の標準的な技術を使用して達成され得る。これに関する典型的な方法論は、Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1, 1976; Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1, 1977; Shih et al., Int’l J. Cancer 46:1101, 1990; Stein et al., Cancer Res. 50:1330, 1990；及び上記Coliganに記載されている。
また、免疫化学検出の簡便性及び汎用性は、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンとコンジュゲートされた抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体を使用することによって増強され得る（例えば、Wilchek et al. (eds.), “Avidin-Biotin Technology,” Methods In Enzymology (Vol. 184) (Academic Press 1990); Bayer et al., “Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,” in Methods In Molecular Biology (Vol. 10) 149-162 (Manson, ed., The Humana Press, Inc. 1992).を参照のこと）。
イムノアッセイを実施するための方法は、十分に確立されている（例えば、Cook and Self, “Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application 180-208 (Ritter and Ladyman, eds., Cambridge University Press 1995); Perry, “The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 107-120 (Birch and Lennox, eds., Wiley-Liss, Inc. 1995); Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996).を参照のこと）。
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
別の態様では、本発明は、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体−薬物コンジュゲートを提供する。本明細書で使用される「抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体−薬物コンジュゲート」は、治療剤にコンジュゲートされた本発明の抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体を指す。
このような抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、対象（例えば、ＨＥＲ３発現ガンを有する対象など）に投与した場合に、典型的には、単独で投与した場合だけではなく他の治療剤と組み合わせて投与した場合にも、ＨＥＲ３発現細胞に対する臨床的に有益な効果をもたらす。
典型的な実施態様では、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体は、得られる抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が、ＨＥＲ３発現細胞（例えば、ＨＥＲ３発現ガン細胞）に取り込まれ、又はインターナリゼーションされると、前記細胞に対する細胞毒性効果又は細胞増殖抑制効果を発揮するように、細胞毒性薬にコンジュゲートされる。抗体にコンジュゲートするために特に適切な部分は、化学療法剤、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体若しくは化合物又は毒素である。例えば、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体は、細胞毒性薬、例えば化学療法剤又は毒素（例えば、細胞増殖抑制剤又は細胞破壊剤、例えばアブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素又はジフテリア毒素など）にコンジュゲートされ得る。
細胞毒性薬の有用なクラスとしては、例えば、抗チューブリン剤、オーリスタチン、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、白金錯体、例えばシスプラチン、単核（白金）、二核（白金）及び三核白金錯体、並びにカルボプラチン）、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、プレフォーミング化合物、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤又はビンカアルカロイドなどが挙げられる。
個々の細胞毒性薬としては、例えばアンドロゲン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブサルファン、ブチオニン、スルホキシミン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ＣＣ−１０６５（Li et al., Cancer Res. 42:999-1004, 1982）、クロランブシル、シスプラチン、コルヒシン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、シトカラシンＢ、ダカルバジン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、５−フルオロデオキシウリジン、リン酸エトポシド（etopside phosphate）（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル、グラミシジンＤ、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ストレプトゾトシン、テノポシド（ＶＭ−２６）、６−チオグアニン、チオＴＥＰＡ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビンが挙げられる。
特に適切な細胞毒性薬としては、例えば、ドラスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ）、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤（例えば、エンジイン及びレキシトロプシン）、デュオカルマイシン、タキサン（例えば、パクリタキセル及びドセタキセル）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８（７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテイン）、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、エチノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンＡ及びＢ、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、ディスコデルモリド、エリュテロビン並びにミトキサントロンが挙げられる。
特定の実施態様では、細胞毒性薬は、従来の化学療法剤、例えばドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、マイトマイシンＣ又はエトポシドなどである。加えて、ＣＣ−１０６５類似体、カリケアミシン、メイタンシン、ドラスタチン１０の類似体、リゾキシン及びパリトキシンなどの強力な薬剤を抗ＨＥＲ３発現抗体に連結され得る。
特定のバリエーションでは、細胞毒性薬又は細胞増殖抑制剤は、オーリスタチンＥ（当技術分野でドラスタチン１０としても公知である）又はその誘導体である。典型的には、オーリスタチン誘導体は、例えば、オーリスタチンＥとケト酸との間で形成されるエステルである。例えば、オーリスタチンＥをパラアセチル安息香酸又はベンゾイル吉草酸と反応させて、ＡＥＢ及びＡＥＶＢをそれぞれ生成し得る。他の典型的なオーリスタチン誘導体としては、ＡＦＰ（ジメチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロリン−フェニルアラニン−ｐ−フェニレンジアミン）、ＭＭＡＦ（ドバリン−バリン−ドライソロイニン−ドラプロリン−フェニルアラニン）及びＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）が挙げられる。オーリスタチンＥ及びその誘導体の合成及び構造は、米国特許出願公開第２００３００８３２６３号；国際公開公報第２００２／０８８１７２号及び国際公開公報第２００４／０１０９５７号；並びに米国特許第６，８８４，８６９号；米国特許第６，３２３，３１５号；米国特許第６，２３９，１０４号；米国特許第６，０３４，０６５号；米国特許第５，７８０，５８８号；米国特許第５，６６５，８６０号；米国特許第５，６６３，１４９号；米国特許第５，６３５，４８３号；米国特許第５，５９９，９０２号；米国特許第５，５５４，７２５号；米国特許第５，５３０，０９７号；米国特許第５，５２１，２８４号；米国特許第５，５０４，１９１号；米国特許第５，４１０，０２４号；米国特許第５，１３８，０３６号；米国特許第５，０７６，９７３号；米国特許第４，９８６，９８８号；米国特許第４，９７８，７４４号；米国特許第４，８７９，２７８号；米国特許第４，８１６，４４４号；及び米国特許第４，４８６，４１４号に記載されている。
他のバリエーションでは、細胞毒性薬は、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤である（例えば、米国特許第６，１３０，２３７号を参照のこと）。例えば、特定の実施態様では、マイナーグルーブ結合剤は、ＣＢＩ化合物である。他の実施態様では、マイナーグルーブ結合剤は、エンジインである（例えば、カリケアミシン）。
特定の実施態様では、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、抗チューブリン剤を含む。抗チューブリン剤の例としては、例えば、タキサン（例えば、Taxol（登録商標）（パクリタキセル）、Taxotere（登録商標）（ドセタキセル））、Ｔ６７（Tularik）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びビノレルビン）並びにドラスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ）が挙げられる。他の抗チューブリン剤としては、例えば、バッカチン誘導体、タキサン類似体（例えば、エポチロンＡ及びＢ）、ノコダゾール、コルチシン及びコルシミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド並びにエリュテロビンが挙げられる。いくつかの実施態様では、細胞毒性薬は、別のグループの抗チューブリン剤であるメイタンシノイドである。例えば、特定の実施態様では、メイタンシノイドは、メイタンシン又はＤＭ−１である（ImmunoGen, Inc.；Chari et al., Cancer Res. 52:127-131, 1992も参照のこと）。
他の実施態様では、細胞毒性薬は、代謝拮抗剤である。代謝拮抗剤は、例えば、プリンアンタゴニスト（例えば、アゾチオプリン又はミコフェノレートモフェチル）、ジヒドロフォレートレダクターゼ阻害剤（例えば、メトトレキサート）、アシクロビル、ガンシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リババリン、アジドチミジン、シチジン、アラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカーネット又はトリフルリジンであり得る。
他の実施態様では、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体は、プロドラッグ変換酵素にコンジュゲートされる。プロドラッグ変換酵素は、公知の方法を使用して、抗体にリコンビナント融合又は化学的にコンジュゲートされ得る。例示的なプロドラッグ変換酵素は、カルボキシペプチダーゼＧ２、βグルクロニダーゼ、ペニシリン−Ｖ−アミダーゼ、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ、βラクタマーゼ、β−グルコシダーゼ、ニトロレダクターゼ及びカルボキシペプチダーゼＡである。
治療剤をタンパク質（特に、抗体）にコンジュゲートするための技術は、周知である（例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985);及びThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照のこと。例えば、国際公開公報第８９／１２６２４号も参照のこと）。
リンカー
典型的には、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、薬物ユニットと抗体ユニットとの間にリンカーユニットを含む。いくつかの実施態様では、リンカーの切断が、細胞内環境において抗体から薬物ユニットを放出するように、リンカーは、細胞内条件下で切断可能である。また他の実施態様では、リンカーユニットは切断可能ではなく、薬物は、例えば抗体分解によって放出される。
いくつかの実施態様では、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソーム又はエンドソーム又はカベオラ）に存在する切断物質によって切断可能である。例えば、リンカーは、限定されないが、リソソームプロテアーゼ又はエンドソームプロテアーゼを含む細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであり得る。いくつかの実施態様では、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長又は少なくとも３アミノ酸長である。切断物質としては、カテプシンＢ及びＤ並びにプラスミン（これらは全て、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して、ターゲット細胞内において活性薬物の放出をもたらすことが公知である）が挙げられ得る（例えば、Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123を参照のこと）。
１９１Ｐ４Ｄ１２発現細胞中に存在する酵素によって切断可能なペプチジルリンカーが最も典型的である。このようなリンカーの他の例は、例えば、米国特許第６，２１４，３４５号（これは、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。特定の実施態様では、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー又はＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである（例えば、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカーを有するドキソルビシンの合成について記載されている米国特許第６，２１４，３４５号を参照のこと）。治療剤の細胞内タンパク質分解性放出を使用する１つの利点は、コンジュゲートされると薬剤が典型的には弱毒化され、コンジュゲートの血清安定性が典型的には高いことである。
他の実施態様では、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性である（すなわち、特定のｐＨ値において加水分解に対して感受性である）。
典型的には、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソーム内で加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）が使用され得る（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号；米国特許第５，８２４，８０５号；米国特許第５，６２２，９２９号；Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661.を参照のこと）。このようなリンカーは、血中などの中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームの近似ｐＨであるｐＨ５．５未満又は５．０では不安定である。特定の実施態様では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカーである（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合されたチオエーテルなど（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号を参照のこと））。
また他の実施態様では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセタート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）並びにＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）、ＳＰＤＢ及びＳＭＰＴを使用して形成され得るものを含む様々なジスルフィドリンカーが当技術分野で公知である（例えば、Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987）を参照のこと。米国特許第４，８８０，９３５号も参照のこと）。
また他の特定の実施態様では、リンカーは、マロン酸リンカー（Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93）、マレイミドベンゾイルリンカー（Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304）又は３’−Ｎ−アミド類似体（Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12）である。
また他の実施態様では、リンカーユニットは切断可能ではなく、薬物は抗体分解によって放出される。
典型的には、リンカーは、細胞外環境に対して実質的に感受性ではない。リンカーとの関連で本明細書で使用される「細胞外環境に対して実質的に感受性ではない」は、抗体薬物コンジュゲート化合物が細胞外環境（例えば、血漿）に存在する場合、抗体−薬物コンジュゲート化合物のサンプル中のリンカーの約２０％以下、典型的には約１５％以下、より典型的には約１０％以下、さらにより典型的には約５％以下、約３％以下又は約１％以下が切断されることを意味する。リンカーが細胞外環境に対して実質的に感受性ではないかは、例えば、抗体−薬物コンジュゲートを血漿と共に所定時間（例えば、２時間、４時間、８時間、１６時間又は２４時間）インキュベーションし、次いで、血漿中に存在する遊離薬物の量を定量することによって決定され得る。
治療用途
本発明の抗体又はイムノコンジュゲート、特に抗体−薬物コンジュゲートは、任意のＨＥＲ３発現ガンを処置するために有用であり得る。本発明の抗体は単独で、又は任意の適切な薬剤と組み合わせて使用され得る。ＨＥＲ３発現ガンの例としては、限定されないが、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が挙げられる。
このようなガンのより具体的な例としては、扁平上皮細胞ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、胃ガン、膵臓ガン、膠細胞腫瘍、例えば膠芽細胞腫及び神経線維腫症、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、ヘパトーマ、乳ガン、結腸ガン、メラノーマ、結腸直腸ガン、子宮内膜ガン、唾液腺ガン、腎臓ガン、腎ガン、前立腺ガン、外陰ガン、甲状腺ガン、肝ガン及び様々な種類の頭頸部ガンが挙げられる。
それらは、好ましくは、乳ガン、卵巣ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、メラノーマ、膵臓ガン及び結腸直腸ガン、の中から選択され、より具体的には、乳ガン、卵巣ガン及び膵臓ガンの中から選択される。
特定の一実施態様では、本発明の方法を使用して処置されるガンは、乳ガン又は卵巣ガンである。
本発明は、ＨＥＲ３の発現に関連するガンを処置するための方法であって、治療有効量の本発明の抗体又はイムノコンジュゲートを、それを必要とする対象に投与することを含む方法を開示する。
より具体的には、本発明の抗体及びイムノコンジュゲートは、ＨＥＲ３の発現に関連するガンであって、ニューレグリン、特にニューレグリン１βが存在するガンを処置するために有効である。
したがって、本発明の目的は、ＨＥＲ３の発現に関連するガンであって、ニューレグリン、特にニューレグリン１βが対象中に存在するガンの処置において使用するための、本発明の抗体及び／又はイムノコンジュゲートである。
一実施態様では、本発明の抗体及びイムノコンジュゲートは、リガンド（すなわち、ＮＲＧ）依存性ガンの処置に特に適切である。
一実施態様では、本発明の抗体は、（そのアロステリック効果により）オートクリン又はパラクリンリガンド依存性腫瘍の処置に特に適切である。
したがって、本発明の実施態様では、存在するニューレグリンは、腫瘍によって、並びに／又は腫瘍周囲の組織及び／若しくは器官によって分泌される。
いくつかの実施態様では、本発明の抗体及びイムノコンジュゲートは、抗体、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、化学療法剤又は抗ホルモン剤による処置に対して耐性のガンの処置に特に適切である。
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、トリプルネガティブ乳ガン、膵臓ガン及び腎細胞ガンからなる群より選択されるガンの処置に特に適切である。
特定の実施態様では、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又はイムノコンジュゲート、特に抗体−薬物コンジュゲートは、疾患又は障害の処置のための第２の薬剤と組み合わせて使用される。
ガンを処置するために使用される場合、本発明の抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又はイムノコンジュゲートは、従来のガン療法、例えば外科手術、放射線療法、化学療法又はそれらの組み合わせなどと組み合わせて使用され得る。
特定の態様では、本発明の抗ＨＥＲ３抗体又は抗体−薬物コンジュゲートとの併用ガン療法に有用な他の治療剤としては、抗血管新生剤が挙げられる。
いくつかの態様では、本発明の抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、サイトカイン（例えば、腫瘍に対する免疫応答を刺激するサイトカイン）と同時投与される。
いくつかの他の態様では、併用療法に有用な他の治療剤としては、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＨＥＲ４などの、腫瘍成長に関与する特定の因子のアンタゴニストが挙げられる。
特定の一実施態様では、本発明の抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又はイムノコンジュゲート、特に抗体−薬物コンジュゲートは、抗ヒトＨＥＲ２モノクローナル抗体、例えばトラスツズマブ又はペルツズマブなどと組み合わせて使用される。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又はイムノコンジュゲート、特に抗体−薬物コンジュゲートは、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）と組み合わせて使用される。BAY 43-9006（ソラフェニブ、Nexavar（登録商標））及びSU11248（スニチニブ、Sutent（登録商標））は、承認されている２つのＴＫＩである。他のＴＫＩとしては、限定されないが、イマチニブメシル酸塩(Gleevec（登録商標）、Novartis)；ゲフィチニブ(Iressa（登録商標）、AstraZeneca)；エルロチニブ塩酸塩(Tarceva（登録商標）、Genentech)；バンデタニブ(Zactima（登録商標）、AstraZeneca)、ティピファニブ(Zarnestra（登録商標）、Janssen-Cilag)；ダサチニブ(Sprycel（登録商標）、Bristol Myers Squibb)；ロナファニブ(Sarasar（登録商標）、Schering Plough)；バタラニブコハク酸塩(Novartis, Schering AG)；ラパチニブ(Tykerb（登録商標）、GlaxoSmithKline)；ニロチニブ(Novartis)；レスタウルチニブ(Cephalon)；パゾパニブ塩酸塩(GlaxoSmithKline)；アキシチニブ(Pfizer)；カネルチニブ二塩酸塩(Pfizer)；ペリチニブ(National Cancer Institute, Wyeth)；タンヅチニブ(Millennium)；ボスチニブ(Wyeth)；セマキサニブ(Sugen, Taiho)；AZD-2171 (AstraZeneca)；VX-680 (Merck, Vertex)；EXEL-0999 (Exelixis)；ARRY-142886 (Array BioPharma, AstraZeneca)；PD-0325901 (Pfizer)；AMG-706 (Amgen)；BIBF-1120 (Boehringer Ingelheim)；SU-6668 (Taiho)；CP-547632 (OSI)；(AEE-788 (Novartis)；BMS-582664 (Bristol-Myers Squibb)；JNK-401 (Celgene)；R-788 (Rigel)；AZD-1152 HQPA (AstraZeneca)；NM-3 (Genzyme Oncology)；CP-868596 (Pfizer)；BMS-599626 (Bristol-Myers Squibb)；PTC-299 (PTC Therapeutics)；ABT-869 (Abbott)；EXEL-2880 (Exelixis)；AG-024322 (Pfizer)；XL-820 (Exelixis)；OSI-930 (OSI)；XL-184 (Exelixis)；KRN-951 (Kirin Brewery)；CP-724714 (OSI)；E-7080 (Eisai)；HKI-272 (Wyeth)；CHIR-258 (Chiron)；ZK-304709 (Schering AG)；EXEL-7647 (Exelixis)；BAY-57-9352 (Bayer)；BIBW-2992 (Boehringer Ingelheim)；AV-412 (AVEO)；YN-968D1 (Advenchen Laboratories)；ミドスタウリン(Novartis)；ペリフォシン(AEterna Zentaris, Keryx, National Cancer Institute)；AG-024322 (Pfizer)；AZD-1152 (AstraZeneca)；ON-01910Na (Onconova)；及びAZD-0530 (AstraZeneca)が挙げられる。
医薬組成物
投与のために、本発明の抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、医薬組成物として製剤化される。
抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又は抗体−薬物コンジュゲートを含む医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法にしたがって製剤化され得、それにより、治療分子は、薬学的に許容し得る担体との混合物で組み合わされる。
組成物は、その投与がレシピエント患者に許容し得る場合、「薬学的に許容し得る担体」と言われる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容し得る担体の一例である。他の適切な担体は、当業者に周知である（例えば、Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995).）を参照のこと）。製剤は、１つ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面のタンパク質のロスを防止するためのアルブミンなどをさらに含み得る。
投与方法
医薬組成物の形態、投与経路、用量及びレジメンは、当然のことながら、処置すべき症状、疾患の重症度、患者の年齢、体重及び性別などに依存する。
本発明の医薬組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与又は眼内投与などのために製剤化され得る。
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤のための薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張滅菌生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど又はこのような塩の混合物）、又は乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物（これは場合に応じて、滅菌水又は生理学的食塩水の追加により、注射液の構成を可能にする）であり得る。
投与に使用される用量は、様々なパラメータに応じて、特に、使用される投与様式、関連する病変、あるいは所望の処置期間に応じて適合され得る。
医薬組成物を調製するために、有効量の抗体を薬学的に許容し得る担体又は水性媒体に溶解又は分散され得る。
注射用途に適切な医薬形態としては、滅菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は滅菌されていなければならず、容易にシリンジで扱える程度に流動性でなければならない。それは製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して防腐されていなければならない。
遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びその混合物中で及び油中で調製され得る。通常の保存及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
担体
本発明の抗体は、中性形態又は塩形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容し得る塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）酸付加塩、及び無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）で形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化鉄）及び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、適切なその混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物作用の抑制は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に使用することによってもたらされ得る。
必要に応じて上記に列挙されている様々な他の成分と一緒に、必要量の活性化合物を適切な溶媒に組み込み、続いて滅菌ろ過することによって、滅菌注射液を調製する。一般に、基本分散媒体と上に列挙されている必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌有効成分を組み込むことによって、分散液を調製する。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過したその溶液から有効成分と任意のさらなる所望の成分との粉末が得られる真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
より濃縮された又は高濃縮された直接注射用溶液の調製も企図され、この場合、極めて迅速な浸透をもたらして高濃度の活性薬剤を小腫瘍領域に送達するために、溶媒としてＤＭＳＯを使用することが想定される。
製剤化したら、投与製剤と適合性の方法によって治療有効量で溶液を投与する。製剤は、上記注射液型などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども用いられ得る。
水溶液による非経口投与の場合、例えば、必要の場合には前記溶液を適切に緩衝化し、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて液体希釈剤を最初に等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適切である。これに関して、当業者であれば、本開示を考慮して、用いられ得る滅菌水性媒体を理解するであろう。例えば、１投与量を等張ＮａＣｌ溶液１mlに溶解し、皮下注入液１０００mlに追加し得るか、又は推奨注入部位に注射し得る（例えば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。処置される対象の症状に応じて、投与量のいくらかの変更が必ず生じるであろう。いずれにしても、投与責任者は、個々の対象に適切な用量を決定するであろう。
本発明の抗体は、１用量当たり約０．０００１〜１．０ミリグラム又は約０．００１〜０．１ミリグラム又は約０．１〜１．０又はさらには約１０ミリグラムほどを含むように治療混合物内に製剤化され得る。複数回用量も投与され得る。
静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された化合物に加えて、他の薬学的に許容し得る形態としては、例えば、錠剤又は経口投与のための他の固体；徐放性カプセル；及び現在使用されている任意の他の形態が挙げられる。
特定の実施態様では、抗体を宿主細胞に導入するために、リポソーム及び／又はナノ粒子の使用が企図される。リポソーム及び／又はナノ粒子の形成及び使用は、当業者に公知である。
ナノカプセルは、一般に、化合物を安定かつ再現可能な方法で捕捉し得る。細胞内ポリマーオーバーローディングによる副作用を回避するために、一般に、in vivoで分解可能なポリマーを使用して、このような超微細粒子（約０．１μmのサイズ）を設計する。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリラートナノ粒子が本発明における使用に企図され、このような粒子は容易に作製され得る。
水性媒体に分散されて多層状で同心円状の二層ベシクル（多層ベシクル（ＭＬＶ）とも称される）を自然に形成するリン脂質から、リポソームが形成される。ＭＬＶは、一般に、２５nm〜４μmの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理により、２００〜５００Åの範囲の直径を有する小単層ベシクル（ＳＵＶ）であって、コアに水溶液を含有する小単層ベシクルが形成される。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度及び二価カチオンの存在に依存する。
キット
最後に、本発明はまた、少なくとも１つの本発明の抗体を含むキットを提供する。本発明の抗体を含有するキットは、ＨＥＲ３発現の検出において、又は治療的アッセイ若しくは診断的アッセイにおいて使用される。本発明のキットは、例えば組織培養プレート又はビーズ（例えば、セファロースビーズ）などの固体支持体にカップリングされた抗体を含有し得る。in vitroにおいて、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおいてＨＥＲ３を検出及び定量するための抗体を含有するキットが提供され得る。検出に有用なこのような抗体は、蛍光又は放射性標識などの標識と共に提供され得る。
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例１：ＧＭＢ３０１の作製及び生産
ヒトＣｇ１及びＣｋ遺伝子の下流にある親９Ｆ７−Ｆ１１抗体のＶＨ及びＶＬ ＤＮＡ配列を哺乳動物発現ベクターにサブクローニングすることによって、低フコースキメラ抗体ＧＭＢ３０１を得た。実質的には、ＹＢ２／０細胞株（ATCC（登録商標）、参照ＣＲＬ−１６６２）において、このような低フコース抗体を生産した。
簡潔に言えば、コドン最適化を用いた遺伝子合成（Geneart（登録商標））によって、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３γ鎖アイソタイプ１及びＶＬ−ＣκＤＮＡ配列を構築した。各抗体鎖の発現のために、新たに合成した重鎖及び軽鎖をｐＭＧＭ０９−Ｈ及びｐＭＧＭ０９−Ｌｋベクターにサブクローニングした。
これらの哺乳動物発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＩｇＧ１型アイソタイプの抗体の発現を可能にする。安定プールの作製のために、ＹＢ２／０細胞をトランスフェクションし、バッチ生産を１週間行った。
実施例２：ＧＭＢ３０１は、高い親和性でＨＥＲ３細胞外ドメインに結合する
Maxisorp（登録商標）プレート（Nunc）コーティングウェル中で、ＧＭＢ３０１を、ヒトＨＥＲ３−Ｆｃ（リコンビナントＨＥＲ３細胞外ドメインＦｃ融合物、R&Dsystems）５０ngと共に３７℃で１時間インキュベーションした。
使用したＧＭＢ３０１濃度は、３．３nM〜６．５pMの範囲内であった。ＨＲＰコンジュゲートＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２特異的（Interchim）によって、結合したＧＭＢ３０１抗体を検出した。３７℃で２時間経過し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２００．５％で３回洗浄した後、ＨＲＰ活性を検出するための基質としてＴＭＢ（３，３，５，５−テトラメチルベンジジン、Sigma）を使用し、１M Ｈ２ＳＯ４を追加して反応を停止し、プレートを４５０nmで読み取った。
図１に示されているように、ＧＭＢ３０１抗体は、ＨＥＲ３細胞外ドメインに対してナノモル以下の親和性を示す（ＥＣ５０ ０．１９nM）。
実施例３：膵臓ガン細胞株を異種移植したマウスにおける腫瘍成長の減少に対する、９Ｆ７−Ｆ１１と比較したＧＭＢ３０１のin vivo効果
Ａ．６〜８週齢の無胸腺雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードは、Janvier and Charles Rivers Laboratoriesから購入した。ＥＧＦＲｈｉｇｈ、ＨＥＲ２／３ｌｏｗ、ＰＴＥＮ／ＰＩＫ３ＣＡ ｗｔ、ＮＲＧｎｅｇａｔｉｖｅ及びＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ突然変異ＮＲＧ１β非依存性膵臓ガン細胞ＨＰＡＣ（３×１０６個）を無胸腺ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右脇腹に皮下注射した。ＨＰＡＣは、リガンドＮＲＧ１βを分泌しない。実験動物研究に関するフランスのガイドラインにしたがって、全てのin vivo実験を行った（承諾番号Ｂ３４−１７２−２７）。
腫瘍が約１５０mm3の体積に達したら、腫瘍担持マウスを異なる処置群に無作為に分けた。ＧＭＢ３０１及び抗体９Ｆ７−Ｆ１１及びビヒクル（ＰＢＳ）を腹腔内注射することによって、マウスを処置した。注射した抗体の量は、３００μg／注射（１５mg/kg）、週２回、４週間連続（Ｑ３Ｄ−４Ｗ）であった。キャリパーを用いて腫瘍の寸法を毎週測定し、式Ｄ１×Ｄ２×Ｄ３／２によって体積を計算した。
図２に示されているように、ビヒクルで処置したマウスにおいて測定した平均腫瘍サイズと比べて、ＧＭＢ３０１処置マウスでは、ＨＰＡＣ腫瘍成長の有意な減少が観察される。驚くべきことに、９Ｆ７−Ｆ１１−処置マウスでは、同様の結果が観察される。実際、これら２種類の抗体では、腫瘍成長の減少について、有意差は観察されない。
Ｂ．無胸腺ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの脇腹に注射した膵臓ガン細胞株がＥＧＦＲｈｉｇｈ、ＨＥＲ２／３ｈｉｇｈ、ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ／ＰＴＥＮ／ＰＩＫ３ＣＡ ｗｔ、ＮＲＧｐｏｓｉｔｉｖｅＮＲＧ１β依存性膵臓ガン細胞ＢｘＰＣ３（３×１０６個）であることを除いて、項目Ａのものと同様のプロトコールを実施した。ＢｘＰＣ３は、低レベルでＨＥＲ３レセプターを発現し（レセプター約１０，０００個／細胞）、リガンドＮＲＧ１βを分泌した（ＮＲＧ１β依存性パラクリンモデル）。
図３に示されているように、ビヒクルで処置したマウスにおいて測定した平均腫瘍サイズと比べて、ＧＭＢ３０１処置マウスでは、ＢｘＰＣ３腫瘍成長の大きな減少が観察される。
しかしながら、今回は、ＧＭＢ３０１処置マウスにおいて観察された減少と比較して、９Ｆ７−Ｆ１１で処置したマウス群では、平均腫瘍サイズのよりも小さな減少が観察された。早ければ腫瘍移植の２９日後に、９Ｆ７−Ｆ１１よりも良好なＧＭＢ３０１の効果を見ることができた。
まとめると、これらの結果は、ＮＲＧ１β分泌ガンを異種移植したマウスでは、ＧＭＢ３０１が９Ｆ７−Ｆ１１よりも効率的に腫瘍成長を遅延させたが、非ＮＲＧ１β分泌ガンを異種移植したマウスでは、ＧＭＢ３０１及び９Ｆ７−Ｆ１１の有効性を比較した場合、同様の結果が得られることを実証している。
したがって、本発明者らは、ＮＲＧ依存性及び非依存性ガンに対して有効な抗体であって、天然リガンドＮＲＧが発現されるガンにおいて、公知の抗ＨＥＲ３抗体と比較して優れた有効性を有する抗体を同定した。
実施例４：Ｈ４Ｂ−１２１ emablingと比較した、腫瘍細胞に対するＧＭＢ３０１のＡＤＣＣ
LFBのEmabling（登録商標）Technologyにしたがって、Ｈ４Ｂ−１２１ emabling（Ｈ４Ｂ−１２１−ｅｍｂ）をＹＢ２／０細胞株において生産し、低フコースＨ４Ｂ−１２１を作製した。
Cytotox 96非放射性細胞毒性アッセイ（Promega）を使用してＡＤＣＣを行って、損傷細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定した。
ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋抗生物質中で、乳ガンＭＤＡ−ＭＢ−４５３由来のターゲット細胞（Ｔ）を培養し、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて指数増殖期に回収した。
洗浄工程並びに細胞数及び生存率のチェック後、２０，０００個のＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を滅菌平底９６ウェルプレートの各ウェルに追加し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間プレインキュベーションした。
次いで、エフェクター細胞の追加前に、１μg/ml試験抗体（ＧＭＢ３０１、Ｈ４Ｂ−１２１−ｅｍｂ及び無関係なコントロール抗体（Ｐｘ））を、ターゲット細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＮＲＧ１β（１００ng/ml）と共に３０分間インキュベーションした。（トリプリケート）
製造業者のプロトコールにしたがって密度勾配遠心分離（Ficoll-Paque；ｄ＝１．０７７；GE Healthcare）によって、健常ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞（Ｅ）として調製した。ＰＢＭＣの細胞数を細胞６×１０６個／mlに調整し、３００，０００個のエフェクター細胞を各ウェルに追加した（１５：１のＥ：Ｔ比）。
以下のコントロールを各実験に用意した。ターゲット細胞のみ（ターゲットの自発的ＬＤＨ放出）、ＰＢＭＣのみ（エフェクターの自発的ＬＤＨ放出）、ターゲット細胞＋ＰＢＭＣ（抗体非依存的ＬＤＨ放出）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処置したターゲット細胞（ターゲットの最大ＬＤＨ放出）。
細胞溶解のために２０時間インキュベーションした後、ＬＤＨ放出測定のために、各ウェルの上清５０μlを新たな平底９６ウェルプレートに慎重に移した。
再構成したＬＤＨ基質ミックス（５０μl／ウェル）を、細胞毒性アッセイプレートから移したサンプルを含有する酵素アッセイプレートの各ウェルに追加した。
暗所、室温で３０分間インキュベーションした後、５０μl／ウェルの停止溶液を追加し、吸光度を４９０nmで測定した。
以下の式：
特異的溶解の％＝（サンプル値からのＬＤＨ放出−エフェクターの自発的放出−ターゲットの自発的放出）／（ターゲットの最大放出−ターゲットの自発的放出）＊１００
を使用して、各サンプルの特異的溶解の％を決定した。
図４に示されているように、ＧＭＢ３０１は、Ｈ４Ｂ−１２１抗体のemablingバージョン（約２５％の溶解）よりも強力なＭＤＡ−ＭＢ−４５３腫瘍細胞のＡＤＣＣを誘導する（約６５％の溶解）。
実施例５：ＹＢ２／０細胞において生産された低フコース抗ＨＥＲ３抗体Ｈ４Ｂ−１２１−ｅｍｂ及びＧＭＢ３０１は、同様の親和性でＨＥＲ３レセプターに結合する
リコンビナントヒトＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）はR&D Systemsから購入し、Ｈ４Ｂ−１２１は、実施例４に示されているように生産した。
Nunc Maxisorpプレートを、５０ng／ウェルのリコンビナントヒトＨＥＲ３ ＥＣＤによって４℃で１６時間コーティングし、ＰＢＳ中２％ＢＳＡでブロッキングした。抗ＨＥＲ３抗体ＧＭＢ３０１及びＨ４Ｂ−１２１−ｅｍｂを０．５μg/ml〜１ng/ml（３nM〜６．５pM）で連続希釈し、３７℃で１時間インキュベーションした。
０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、結合した抗ＨＥＲ３抗体を、ＨＲＰコンジュゲートＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２特異的抗体（Interchim）によって検出した。
３７℃で２時間経過し、３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ活性を検出するための基質としてＴＭＢ（３，３，５，５−テトラメチルベンジジン、Sigma）を使用し、１M Ｈ２ＳＯ４を追加して反応を停止し、プレートを４５０nmで読み取り、GraphPad Prismの４パラメータ非線形回帰フィットを使用して、結合データ曲線を分析した。
図４に示されているように、Ｈ４Ｂ−１２１−Ｅｍｂ及びＧＭＢ３０１は、同様の親和性でＨＥＲ３レセプターに結合し、Ｈ４Ｂ−１２１−ｅｍｂは０．１１nM＋／−０．０２のＥＣ５０を有する一方、ＧＭＢ３０１は０．１９nM＋／−０．０１のＥＣ５０を有する。
実施例６：腫瘍成長を減少させるために、及びＮＲＧ１依存的腫瘍の生存時間を増加させるために、ＧＭＢ３０１は抗体Ｈ４Ｂ−１２１ emablingよりも効率的である
実施例４に示されているように、Ｈ４Ｂ−１２１を生産した。
６〜８週齢の無胸腺雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスは、Janvier and Charles Rivers Laboratoriesから購入した。ＮＲＧ１依存的膵臓ＢｘＰＣ３（３×１０６個）、トリプルネガティブ乳ガンＨＣＣ−１８０６（１×１０６個）及び肺Ａ５４９ガン細胞（４×１０６個）を無胸腺ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右脇腹に皮下注射した。
実験動物研究に関するフランスのガイドラインにしたがって、全てのin vivo実験を行った（承諾番号Ｂ３４−１７２−２７）。
腫瘍が約１２０〜１５０mm3の体積に達したら、腫瘍担持マウスを異なる処置群に無作為に分けた。ＧＭＢ３０１及びＨ４Ｂ−１２１−Ｅｍｂ及びビヒクル（（ＮａＣｌ−ネガティブコントロール）を腹腔内注射することによって、マウスを処置した。注射した抗体の量は、３００μg／注射（１５mg/kg）、週２回、４週間連続（Ｑ３Ｄ−４Ｗ）であった。
キャリパーを用いて腫瘍の寸法を週１回測定し、式Ｄ１×Ｄ２×Ｄ３／２によって体積を計算した。
図５の左のパネルに示されているように、コントロール又は抗体Ｈ４Ｂ−１２１−ｅｍｂで処置したマウスにおいて測定した平均腫瘍サイズと比べて、ＧＭＢ３０１処置マウスでは、ＮＲＧ１依存的ＢｘＰＣ３、ＨＣＣ−１８０６及びＡ５４９腫瘍成長のより大きな減少が観察される。
対比では、３つの異種移植ＮＲＧ１依存的腫瘍モデルにおいて、Ｈ４Ｂ−１２１−ｅｍｂで処置した群と対比して、ＧＭＢ３０１で処置した群では、より大きな利益（コントロール群と対比した処置利益の日数）が観察された（ＢｘＰＣ３：Ｈ４Ｂ−１２１−ｅｍｂ群は＋１４日間であるのに対して、ＧＭＢ３０１は＋２１日間；ＨＣＣ−１８０６：Ｈ４Ｂ−１２１−ｅｍｂは＋７日間であるのに対して、ＧＭＢ３０１は＋２１日間；Ａ５４９：Ｈ４Ｂ−１２１−ｅｍｂは−７日間であるのに対して、ＧＭＢ３０１は＋２１日間）（図５、右のパネル）。

Claims (21)

  1. （ａ）可変ドメインが、
    −配列番号：２に記載されている配列を有するＨ−ＣＤＲ１；
    −配列番号：３に記載されている配列を有するＨ−ＣＤＲ２；及び
    −配列番号：４に記載されている配列を有するＨ−ＣＤＲ３
    を含む重鎖
    並びに
    （ｂ）可変ドメインが、
    −配列番号：６に記載されている配列を有するＬ−ＣＤＲ１；
    −配列番号：７に記載されている配列を有するＬ−ＣＤＲ２；及び
    −配列番号：８に記載されている配列を有するＬ−ＣＤＲ３
    を含む軽鎖
    を含み、
    ヒト定常領域を有し；並びに
    抗体のグリコシル化部位が有するグリカン構造の６５％未満がフコース分子を含む、ニューレグリン非競合アロステリック抗ヒトＨＥＲ３抗体。
  2. 前記抗体の重鎖可変領域が配列番号：１に記載されているアミノ酸配列を有し、及び／又は軽鎖可変領域が配列番号：５に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記抗体の重鎖が配列番号：９に記載されているアミノ酸配列を有し、及び／又は前記抗体の軽鎖が配列番号：１０に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. 抗体のグリコシル化部位が有するグリカン構造の５０％未満がフコース分子を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
  5. キメラ抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体をコードする、核酸配列。
  7. 請求項６に記載の核酸を含む、ベクター。
  8. 請求項６に記載の核酸又は請求項７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  9. 少なくとも請求項１〜５のいずれかに記載の抗体と、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
  10. 治療剤に連結された請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体を含む、イムノコンジュゲート。
  11. 少なくとも請求項１０に記載のイムノコンジュゲートと、薬学的に許容し得る担体とを含む、ＨＥＲ３の発現に関連するガンの処置のための、医薬組成物。
  12. 薬物として使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体及び／又は請求項１０に記載のイムノコンジュゲート。
  13. ＨＥＲ３の発現に関連するガンであって、ニューレグリンが対象中に存在するガンの処置において使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体及び／又は請求項１０に記載のイムノコンジュゲート。
  14. ＨＥＲ３の発現に関連する腫瘍細胞であって、ニューレグリンが対象中に存在する腫瘍細胞の成長の阻害において使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体及び／又は請求項１０に記載のイムノコンジュゲート。
  15. ニューレグリンが、腫瘍によって、並びに／又は腫瘍周囲の組織及び／若しくは器官によって分泌される、請求項１３又は１４に記載の使用のための抗体及び／又はイムノコンジュゲート。
  16. 腫瘍がニューレグリン依存性である、請求項１５に記載の使用のための抗体及び／又はイムノコンジュゲート。
  17. ニューレグリンが、抗体及び／又はイムノコンジュゲートの前、その後又はそれと同時に対象へのその投与により存在する、請求項１３又は１４に記載の使用のための抗体及び／又はイムノコンジュゲート。
  18. ＨＥＲ３の発現に関連するガン又は腫瘍細胞が、扁平上皮細胞ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、胃ガン、膵臓ガン、膠細胞腫瘍、例えば膠芽細胞腫及び神経線維腫症、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、ヘパトーマ、乳ガン、結腸ガン、メラノーマ、結腸直腸ガン、子宮内膜ガン、唾液腺ガン、腎臓ガン、腎ガン、前立腺ガン、外陰ガン、甲状腺ガン、肝ガン及び頭頸部ガンの中から選択される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の使用のための抗体及び／又はイムノコンジュゲート。
  19. 抗体の重鎖可変領域が、配列番号１に記載されているアミノ酸配列を有し、そして軽鎖可変領域が、配列番号５に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の抗体。
  20. 抗体の重鎖が、配列番号９に記載されているアミノ酸配列を有し、そして抗体の軽鎖が、配列番号１０に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の抗体。
  21. ヒト化抗体である、請求項５に記載の抗体。
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