CN101039958A - 含有主要是man3glcnac2糖形的免疫球蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫球蛋白糖蛋白组合物，其在免疫球蛋白糖蛋白上具有赋予其特定效应物功能的主要N－聚糖结构。此外，本发明还涉及药物组合物，其中含有具有特定的富集的N－聚糖结构的抗体，其中所述N－聚糖结构是Man₃GlcNAc₂。

Description

含有主要是MAN3GLCNAC2糖形的免疫球蛋白

相关申请

本申请要求2004年7月21日提交的美国临时申请No.60/589,913和2004年7月21日提交的美国临时申请No.60/589,937的利益；并且是2004年6月25日提交的美国申请序列No.10/500,240的部分继续申请，该美国申请是2002年12月24日提交的国际申请No.PCT/US02/41510的国家阶段申请，该国际申请要求2001年12月27日提交的美国临时申请No.60/344,169的利益。上述被引用的申请的每一篇在此都以引用的方式引入其全文。

技术领域

本发明涉及用于产生具有特定的N-连接糖基化(N-linkedglycosylation)模式的糖蛋白的组合物和方法。特别地，本发明涉及含有多个具有特定N-聚糖结构的N-聚糖的免疫球蛋白糖蛋白组合物，更特别地，涉及含有免疫球蛋白糖蛋白的组合物，其中多数在免疫球蛋白上具有一种或多种调节，例如促进，特定效应物功能的主要糖形(glycoform)结构。

背景技术

在人和其它哺乳动物中，糖蛋白调节许多基本的功能，包括催化，信号传导，细胞间通讯，以及分子识别和结合。糖蛋白构成了真核生物体中的非胞质蛋白的大多数(Lis and Sharon，1993，Eur.J.Biochem.218：1-27)。多种糖蛋白已被用于治疗目的，在过去的二十年间，天然存在的糖蛋白的重组形式已成为生物技术工业的主要部分。用作治疗剂的重组糖基化蛋白的实例包括促红细胞生成素(EPO)，治疗用单克隆抗体(mAbs)，组织纤溶酶原激活物(tPA)，干扰素-β(IFN-β)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，和人绒膜促性腺激素(hCH)(Cumming et al，1991，Glycobiology 1：115-130)。随着作为潜在的预防剂和治疗剂生产的重组蛋白接近临床，重组产生的糖蛋白的糖基化模式的变化最近成为科学团体关注的课题。

抗体或免疫球蛋白(Ig)是在体液免疫反应中具有重要作用的糖蛋白。抗体可以视为是接头分子，其在体液和细胞防御机制之间提供连接。抗体对抗原的特异性识别导致形成免疫复合体，其可激活多种效应机制，导致该复合体的清除和破坏。在免疫球蛋白的大类中，五个种类的抗体——IgM，IgD，IgG，IgA，和IgE——可以从生物化学上和功能上被区分开，然而局限于可变区的更精细的差别决定着抗原结合特异性。在这五种Ig中，只有两种类型的轻链，称为lambda(λ)和kappa(κ)。没有发现在具有λ或κ链的抗体之间有功能上的差异，这两种类型的轻链的比率随物种而不同。有五种重链种类或同种型，它们决定了抗体分子的功能活性。这五种功能类别的免疫球蛋白是：免疫球蛋白M(IgM)，免疫球蛋白D(IgD)，免疫球蛋白G(IgG)，免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白E(IgE)。每个同种型在免疫反应中具有特定的功能，它们的不同的功能性质是由重链的羧基末端部分决定的，此处其不与轻链结合。IgG是血浆中最丰富的免疫球蛋白同种型，(参见例如，Immunobiology，Janeway et al，6^th Edition，2004，Garland Publishing，New York)。

免疫球蛋白G(IgG)分子含有具有恒定和可变区的Fab(抗原结合片段)域和Fc(结晶片段)域。每个重链的CH2域包括在天冬酰胺残基上的用于N-连接糖基化的单个位点，其将N-聚糖连接到Ig分子上，通常是在残基Asn-297处(Kabat et al.，Sequences of proteins ofimmunological interest，Fifth Ed.，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242)。

对于N-连接的低聚糖的结构和功能方面的分析是生物学中所关心的，有三个主要的原因：(1)CH2域的糖基化在进化上是保守的，暗示低聚糖具有重要的作用；(2)免疫球蛋白分子可作为低聚糖异质性分析的模型系统(Rademacher and Dwek，1984；Rademacheret al.，1982)；和(3)抗体含有两个重链的二聚连接，这使得两个低聚糖单位互相直接接触，以致于该免疫球蛋白分子同时包括特定的蛋白质-碳水化合物和碳水化合物-碳水化合物相互作用。

已表明Ig的不同的糖基化模式与不同的生物学性质相关(Jefferisand Lund，1997，Antibody Eng.Chem.Immunol.，65：111-128；Wrightand Morrison，1997，Trends Biotechnol.，15：26-32)。但是，只有少数特定的糖形已知能赋予所希望的生物学功能。例如，在N-连接聚糖上具有减少的岩藻糖化的免疫球蛋白组合物据报道具有增加的与人FcγRIII的结合，因而具有增强的抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)(Shields et al.，2002，J.Biol Chem，277：26733-26740；Shinkawa et al.，2003，J.Biol.Chem.278：3466-3473)。而且，在CHO细胞中制备的岩藻糖化的G2(Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)IgG组合物据报道增加补体依赖的细胞毒性(CDC)活性至比异源抗体组合物更大的程度(Raju，2004，美国专利申请No.2004/0136986)。也提示了抗肿瘤的最佳抗体是优先与激活的Fc受体(FcγRI，FcγRIIa，FcγRIII)结合，并且最小程度地与抑制性FcγRIIb受体结合的抗体(Clynes et al.，2000，Nature，6：443-446)。因此，在Ig糖蛋白上富集特定糖形的能力是高度期望的。

通常，糖蛋白上的糖基化结构(低聚糖)随表达宿主和培养条件而不同。非人宿主细胞产生的治疗蛋白质可能含有非人的糖基化，其可能在人中引发免疫原性反应-例如酵母中的超甘露糖化(Ballou，1990，Methods Enzymol.185：440-470)；植物中的α(1，3)-岩藻糖和β(1，2)-木糖，(Cabanes-Macheteau et al.，1999，Glycobiology，9：365-372)；中国仓鼠卵巢细胞中的N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid)(Noguchi et al.，1995，J.Biochem.117：5-62)和小鼠中的Galα-1，3Gal糖基化(Borrebaeck et al.，1993，Immun.Today，14：477-479)。而且，半乳糖苷化可能会随细胞培养条件而变化，可能会使一些免疫球蛋白组合物产生免疫原性，这取决于它们的特定的半乳糖模式(Patel et al.，1992.Biochem J.285：839-845)。非人哺乳动物细胞产生的糖蛋白的低聚糖结构倾向于与人糖蛋白更紧密相关。因此，大部分商业的免疫球蛋白都是在哺乳细胞中生产的。然而，哺乳动物细胞作为宿主细胞用于蛋白质生产有几个重要的缺点。除了成本高昂之外，哺乳细胞中的蛋白质表达过程产生糖形的异质群体(heterogeneous populations ofglycoforms)，具有低的体积滴度，并且需要持续的病毒抑制(ongoingviral containment)和显著的时间以产生稳定的细胞系。

应当理解，不同的糖形可以深切影响治疗剂的特性，包括药物代谢动力学，药物效应动力学，受体相互作用和组织特异性靶定(Graddiset al.，2002，Curr Pharm Biotechnol.3：285-297)。特别地，对于抗体来说，低聚糖结构可以影响与下列相关的特性：蛋白酶抗性，FcRn受体介导的抗体血清半衰期，与补体复合物C1的结合，其诱导补体依赖的细胞毒性(CDC)，以及与FcγR受体的结合，其负责调节抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)途径，吞噬作用和抗体反馈。(Nose andWigzell，1983；Leatherbarrow and Dwek，1983；Leatherbarrow et al.，1985；Walker et al.，1989；Carter et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，89：4285-4289)。

由于不同的糖形与不同的生物学特性相关，因此富集一种或多种特定糖形的能力可以用于阐明特定糖形和特定生物学功能之间的关系。当所希望的生物学功能与特定的糖形模式联系起来以后，富集该有利的糖形结构的糖蛋白组合物可以被生产。因此，产生富集特定糖形的糖蛋白组合物的能力是高度期望的。

发明内容

本发明提供了含有多个免疫球蛋白的组合物(a compositioncomprising a plurality of immunoglobulins)，每个免疫球蛋白含有至少一个与之相连的N-聚糖(at least one N-glycan attached thereto)，其中该组合物因此含有多个N-聚糖(a plurality of N-glycans)，其中主要的N-聚糖基本由Man₃GlcNAc₂组成。在优选的实施方案中，所述的多个N-聚糖中超过50摩尔百分比基本由Man₃GlcNAc₂组成。更优选地，所述的多个N-聚糖中超过75摩尔百分比基本由Man₃GlcNAc₂组成。最优选地，所述的多个N-聚糖中超过90摩尔百分比基本由Man₃GlcNAc₂组成。在其他优选的实施方案中，所述Man₃GlcNAc₂N-聚糖结构以比所述多个N-聚糖中次最主要的N-聚糖结构多大约5摩尔百分比到大约50摩尔百分比的水平存在。

本发明还提供了通过在免疫球蛋白上富集特定的糖形(例如Man₃GlcNAc₂)增加与FcγRIIIa和FcγRIIIb受体的结合并且减少与FcγRIIb受体的结合的方法。优选的实施方案提供了产生含有多个免疫球蛋白的组合物的方法，每个免疫球蛋白含有至少一个与之相连的N-聚糖，其中该组合物因而含有多个N-聚糖，其中主要的N-聚糖基本由Man₃GlcNAc₂组成，所述方法包括培养已被工程化的或被选择以表达所述免疫球蛋白或其片段的宿主细胞的步骤。另一个优选的实施方案提供了用于产生含有多个免疫球蛋白的组合物的方法，每个免疫球蛋白含有至少一个与之相连的N-聚糖，其中该组合物因而含有多个N-聚糖，其中主要的N-聚糖基本由Man₃GlcNAc₂组成，所述方法包括培养被工程化的或被选择以表达所述免疫球蛋白或其片段的低等真核宿主细胞的步骤。在本发明的其他实施方案中，宿主细胞含有编码免疫球蛋白或其片段的外源基因，所述宿主细胞被工程化或被选择以表达所述免疫球蛋白或其片段，从而产生含有多个免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白含有至少一个与之相连的N-聚糖，因而该组合物含有多个N-聚糖，其中主要的N-聚糖基本由Man₃GlcNAc₂组成。在本发明的其它实施方案中，低等真核宿主细胞含有编码免疫球蛋白或其片段的外源基因，所述宿主细胞被工程化或被选择以表达所述免疫球蛋白或其片段，从而产生含有多个免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白含有至少一个与之相连的N-聚糖，因而该组合物含有多个N-聚糖，其中主要的N-聚糖基本由Man₃GlcNAc₂组成。

在本发明的优选实施方案中，组合物含有多个免疫球蛋白，每个免疫球蛋白含有至少一个与之相连的N-聚糖，其中该组合物因而含有多个N-聚糖，其中主要的N-聚糖基本由Man₃GlcNAc₂组成，其中所述免疫球蛋白显示出降低的与FcγRIIb受体的结合亲和性。在本发明的其它优选实施方案中，组合物含有多个免疫球蛋白，每个免疫球蛋白含有至少一个与之相连的N-聚糖，其中该组合物因而含有多个N-聚糖，其中主要的N-聚糖基本由Man₃GlcNAc₂组成，其中所述免疫球蛋白显示出增加的与FcγRIIIa和FcγRIIIb受体的结合亲和性。在本发明的另一个优选实施方案中，组合物含有多个免疫球蛋白，每个免疫球蛋白含有至少一个与之相连的N-聚糖，因而该组合物含有多个N-聚糖，其中主要的N-聚糖基本由Man₃GlcNAc₂组成，其中所述免疫球蛋白显示出增加的抗体依赖的细胞的细胞毒性(antibody-dependentcellular cytoxicity，ADCC)。

在一个实施方案中，本发明的组合物含有基本不含岩藻糖的免疫球蛋白。在另一个实施方案中，本发明的组合物含有缺少岩藻糖的免疫球蛋白。本发明的组合物还含有药物组合物和药学可接受的载体。本发明的组合物还含有已被纯化并包括在诊断试剂盒中的免疫球蛋白的药物组合物。

相应地，本发明提供了用于产生具有预定糖基化结构的糖蛋白，特别是具有基本由Man₃GlcNAc₂组成的N-聚糖的免疫球蛋白或抗体分子，的组合物的材料和方法。

附图简述

图1是具有Man₃GlcNAc₂N-聚糖结构的IgG分子的示意图。

图2是在YAS309中表达(如实施例2中所述)并通过Protein A柱(条带1)和苯基sepharose柱(条带2)从培养基中纯化(如实施例3中所述)的JC-IgG的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶。(3.0μg蛋白/条带)。

图3是在YAS309中表达(如实施例2中所述)并通过Protein A柱(条带1)和苯基sepharose柱(条带2)从培养基中纯化(如实施例3中所述)的DX-IgG的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶。(3.5μg蛋白/条带)。

图4A是在YAS309中表达的JC-IgG的MALDI-TOF光谱，用半乳糖苷酶和氨基己糖苷酶处理，表明主要是Man₃GlcNAc₂N-聚糖。图4B是在YAS309中表达的DX-IgG的MALDI-TOF光谱，用半乳糖苷酶和氨基己糖苷酶处理，表明主要是Man₃GlcNAc₂N-聚糖。

图5A是图5B是FcγRIIIb与DX-IgG和Rituximab_的ELISA结合检测。(M3＝Man₃GlcNAc₂N-聚糖)

图6是FcγRIIIa-158F与JC-IgG和Rituximab_的ELISA结合检测。(M3＝Man₃GlcNAc₂N-聚糖)

图7A是FcγRIIb与JC-IgG和Rituximab_的ELISA结合检测。图7B是FcγRIIb与DX-IgG和Rituximab_的ELISA结合检测。(M3＝Man₃GlcNAc₂N-聚糖)

序列简述

SEQ ID NO：1编码DX-IgG1轻链的鼠可变区和人恒定区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2编码DX-IgG1重链的鼠可变区和人恒定区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3编码IgG1轻链的人恒定区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4编码IgG1重链的人恒定区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：5-19编码15个用于通过聚合酶链式反应(PCR)合成DX-IgG1的鼠轻链可变区的搭接(overlapping)寡核苷酸。

SEQ ID NO：20-23编码四个用于将DX-IgG1鼠轻链可变区与人轻链恒定区相连接的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：24-40编码17个用于通过PCR合成DX-IgG1的鼠重链可变区的搭接寡核苷酸。

SEQ ID NO：41-44编码四个用于将DX-IgG1鼠重链可变区与人重链恒定区相连接的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：45编码具有N-末端EcoRI位点的Kar2(Bip)信号序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：46-49编码用于将Kar2信号序列与DX-IgG1的轻链和重链相连接的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：50编码相应于JC-IgG1轻链的鼠IgG1可变区的核苷酸序列(GenBank#AF013576)。

SEQ ID NO：51编码相应于JC-IgG1重链的鼠IgG1可变区的核苷酸序列(GenBank#AF013577)。

SEQ ID NO：52-63编码12个用于PCR合成JC-IgG1的鼠轻链可变区的搭接寡核苷酸序列。

SEQ ID NO：64-75编码12个用于PCR合成JC-IgG1的鼠重链Fab片段的搭接寡核苷酸。

SEQ ID NO：76-87编码12个用于通过PCR合成JC-IgG1的鼠重链Fc片段的搭接寡核苷酸。

SEQ ID NO：88编码相应于Fc片段的3’末端的3’Kpn1引物。

SEQ ID NO：89编码人血清清蛋白(HSA)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：90编码用于本发明中凝血酶切割的核苷酸序列。

发明详述

除非本文中另外指出，与本发明有关的科学和技术术语和短语具有所属领域普通技术人员通常理解的意义。进一步，除非上下文另外要求，单数的术语包括复数，复数的术语包括单数。通常，本文所述的与生物化学，酶学，分子和细胞生物学，微生物学，遗传学和蛋白质和核酸化学和杂交技术有关的专有名词是本领域中熟知和经常使用的。本发明的方法和技术一般根据本领域中熟知的常规方法和按照本发明说明书中引用和通篇论述的各种常规的和更具体的参考文献中所描述的实施，除非另外指出。参见，例如，Sambrook et al.MolecularCloning：ALaboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel etal.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992，and Supplements to 2002)；Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1990)；Taylor and Drickamer，Introduction to Glycobiology，OxfordUniv.Press(2003)；Worthington Enzyme Manual，Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，Vol I，CRC Press(1976)；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，Vol II，CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)；Immunobiology，Janeway et al，6th Edition，2004，Garland Publishing，New York)。

本文提及的所有出版物，专利和其他参考文献在此以引用的方式引入其全文。

下述术语，除非另外指出，将被理解为具有下述含义：

如本文所用的术语“N-聚糖”，“聚糖”和“糖形”可以互换使用，指N-连接的低聚糖，例如通过N-乙酰氨基葡萄糖残基连接的低聚糖，该残基连接到蛋白质中的天冬酰胺残基的氨基氮上。存在于糖蛋白上的主要的糖是葡萄糖，半乳糖，甘露糖，岩藻糖，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和唾液酸(例如，N-乙酰-神经氨酸(NANA))。糖基团的加工在ER的腔内与翻译同时进行，在高尔基体(Golgi apparatus)中继续加工形成N-连接的糖蛋白。

N-聚糖具有共同的五糖核Man₃GlcNAc₂(“Man”指甘露糖；“Glc”指葡萄糖；“NAc”指N-乙酰基；GlcNAc指N-乙酰氨基葡萄糖)。N-聚糖的分支(天线(antennae))数目有所不同，该分支包括加入到也被称为“三甘露糖核”，“五糖核”或“少甘露糖核(paucimannose core)”的Man₃GlcNAc₂(“Man3”)核结构上的外周的糖(例如，GlcNAc，半乳糖，岩藻糖和唾液酸)。N-聚糖依据其分支成分(例如，高甘露糖形，复合型或杂交型)被分类。“高甘露糖”型的N-聚糖具有五个或更多个甘露糖残基。“复合”型的N-聚糖典型地具有至少一个连接在“三甘露糖”核的1，3甘露糖臂上的GlcNAc，和至少一个连接在“三甘露糖”核的1，6甘露糖臂上的GlcNAc。复合型N-聚糖还可以具有任选地被唾液酸或衍生物(例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”指神经氨酸，“Ac”指乙酰基)修饰的半乳糖(“Gal”)或N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)残基。复合型N-聚糖还可以具有链内的取代，包括“平分的(bisecting)”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)。复合型N-聚糖还可以在“三甘露糖核”上具有多个天线，通常称为“多天线聚糖”。“杂交型”N-聚糖在三甘露糖核的1，3甘露糖臂的末端上至少有一个GlcNAc，在三甘露糖核的1，6甘露糖臂上有零个或更多个甘露糖。不同的N-聚糖也被称为“糖形”。

本文中所使用的缩写是本领域中通常所使用的，参见，例如，上述糖的缩写。其他常见缩写包括“PNGase”，或“聚糖酶(Glycanase)”或“葡糖苷酶(glucosidase)”，它们均指肽N-糖苷酶F(EC 3.2.2.18)。

“分离的”或“基本上纯的”核酸或多核苷酸(例如RNA，DNA或混合聚合物)是基本上与在天然宿主细胞中与原生的(native)多核苷酸天然一起存在的其它细胞组分，例如与其天然相结合的核糖体，聚合酶和基因组序列分离开。该术语包括如下核酸或多核苷酸，其(1)已从其天然存在的环境中移出，(2)不与该“分离的多核苷酸”天然存在于其中的多核苷酸的全部或部分联在一起，(3)与其在天然状态下不相连接的多核苷酸可操作地相连，或(4)天然不存在。术语“分离的”或“基本上纯的”还可以用于重组的或克隆的DNA分离物，化学合成的多核苷酸类似物，或者通过异种系统生物合成的多核苷酸类似物。

但是，“分离的”不必然要求所述的核酸或多核苷酸自身从其天然环境中被物理分离出来。例如，如果异源序列被置于内源核酸序列相邻处，使得该内源核酸序列的表达被改变，那么生物体的基因组中的该内源核酸序列在本文中被视为是“分离的”。在这种情况下，异源序列是天然地不与该内源核酸序列相邻的序列，无论该异源序列本身是内源的(来自于相同的宿主细胞或其后代)还是外源的(来自于不同的宿主细胞或其后代)。作为实例，启动子序列可以替换(例如通过同源重组)宿主细胞基因组中基因的天然启动子，以使该基因具有改变的表达模式。该基因现在成为“分离的”，因为它与至少一些天然在其侧翼的序列分离开了。

如果核酸含有任何不天然存在于基因组中的相应核酸上的修饰，其也被视为是“分离的”。例如，如果内源编码序列含有人工地，例如通过人为干预引入的插入，缺失或点突变，则其被视为是“分离的”。“分离的核酸”还包括整合到宿主细胞染色体的异源位点上的核酸和作为游离基因存在的核酸构建体。而且，当通过重组技术产生的时候，“分离的核酸”可以是基本上不含其它细胞物质的，或者基本上不含培养基的，或者当化学合成的时候基本上不含化学前体或其它化学物质的。

本文所用的短语参考核酸序列的“简并变体”包括根据标准遗传密码能被翻译从而提供与从参考核酸序列翻译而得的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸序列。术语“简并寡核苷酸”或“简并引物”用于表示能与靶核酸序列杂交的，不必需在序列上相同但在一个或多个特定区段内彼此同源的寡核苷酸。

涉及核酸序列的术语“百分序列相同性”或“相同的”指当按照最大限度对应的方式排列的时候两个序列中相同的残基。序列相同性比较的长度可以是多于至少大约9个核苷酸，通常至少大约20个核苷酸，更通常至少大约24个核苷酸，典型地至少大约28个核苷酸，更典型地至少大约32个核苷酸，优选至少大约36个或更多个核苷酸。有许多本领域已知的算法可用于计算核苷酸序列相同性。例如，多核苷酸序列可以用FASTA，Gap或Bestfit进行比较，它们是WisconsinPackage Version 10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin中的程序。FASTA提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的排列和百分序列相同性。Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)(在此以引用的方式引入其全文)。例如，核酸序列之间的百分序列相同性可以用FASTA以及其缺省参数(字长为6，计分矩阵用NOPAM因子)或者用Gap以及缺省参数确定，在GCG Version 6.1中提供。或者，序列也可以用计算机程序，BLAST(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Gish and States，Nature Genet.3：266-272(1993)；Madden et al.，Meth.Enzymol.266：131-141(1996)；Altschul et al.，Nucleic AcidsRes.25：3389-3402(1997)；Zhang and Madden，Genome Res.7：649-656(1997))，特别是blastp或tblastn(Altschul et al.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))来比较。

术语“显著的同源性”或“显著的相似性”，当用于核酸或其片段的时候，表示当与另一个核酸(或其互补链)利用适当的核苷酸插入或缺失进行最佳排列的时候，核苷酸序列相同性为核苷酸碱基的至少大约50％，更优选为核苷酸碱基的60％，通常为至少大约70％，更通常为至少大约80％，优选为至少大约90％，更优选为核苷酸碱基的至少大约95％，96％，97％，98％或99％，由任何熟知的序列相同性算法，例如如上所述的FASTA，BLAST或Gap测定而得。

或者，当核酸或其片段与另一种核酸，与另一种核酸的一条链，或者与其互补链在严谨杂交条件下杂交时，也存在显著的同源性或相似性。述及核酸杂交试验时，“严谨杂交条件”和“严谨洗涤条件”取决于多种不同的物理参数。核酸杂交会受到各种条件例如盐浓度，温度，溶剂，杂交物质的碱基组成，互补区域的长度，和杂交核酸之间的核苷酸碱基错配数目的影响，如所属领域技术人员容易意识到的。具有所属领域普通技术的人员知道如何改变这些参数以获得特定严谨性的杂交。

通常，“严谨杂交”在大约25℃在特定DNA杂交物的热熔解温度(T_m)以下在特定的一组条件下进行。“严谨洗涤”在大约5℃的温度在特定DNA杂交物的T_m以下在特定的一组条件下进行。T_m是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，page 9.51，在此以引用的方式引入。为本发明的目的，对于溶液相杂交，“严谨条件”定义为在6X SSC(其中20X SSC含有3.0M NaCl和0.3M柠檬酸钠)，1％SDS在65℃进行水性杂交(即不含甲酰胺)8-12小时，然后在0.2XSSC，0.1％SDS在65℃20分钟洗涤两次。技术人员将会意识到65℃杂交将会以不同的速度发生，这取决于多种因素包括杂交序列的长度和百分相似性。

术语“突变的”当应用于核酸序列的时候意味着与参考核酸序列相比，核酸序列中的核苷酸可以被插入，缺失或改变。单个的改变可以在某个基因座被制造(点突变)或者多个核苷酸可以在单个基因座被插入，缺失或改变。此外，一个或多个改变可以在核酸序列中的任何数目的基因座被制造。核酸序列可以用所属领域已知的任何方法被突变，包括但不限于诱变技术例如“易错PCR”(在DNA聚合酶的复制保真度低的条件下进行PCR的方法，使得在PCR产物的全长上获得高比率的点突变；参见，例如，Leung et al.，Technique，1：11-15(1989)and Caldwell and Joyce，PCR Methods Applic.2：28-33(1992))；和“寡核苷酸定向诱变”(能够在任何所感兴趣的克隆的DNA区段中产生位点特异性突变的方法；参见，例如Reidhaar-Olson and Sauer，Science241：53-57(1988))。

本文所用的术语“载体”是指能够转运另一个与之相连接的核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是一种环状双链DNA环，另外的DNA区段可以连接到其中。其它载体包括粘粒，细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段(segment)可以被连接到病毒基因组中(在下面更详细讨论)。某些载体能够在其被引入的宿主载体中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。其它载体能够在引入到宿主细胞中的时候整合到宿主细胞基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。而且，某些优选的载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。这种载体在本发明中被称为“重组表达载体”(或者简单地，“表达载体”)。

本文所用的术语“感兴趣的序列”或“感兴趣的基因”指宿主细胞中通常不产生的核酸序列，典型地编码蛋白质。本文中公开的方法允许一种或多种感兴趣的序列或感兴趣的基因稳定整合到宿主细胞基因组中。感兴趣的序列的非限制性实例包括编码一种或多种具有酶活性的多肽的序列，例如影响N-聚糖在宿主中合成的酶例如甘露糖基转移酶，N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶，UDP-N-乙酰氨基葡萄糖运输蛋白，半乳糖基转移酶，UDP-N-乙酰半乳糖基转移酶，唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶。

术语“标记序列”或“标记基因”指能表达某种活性以允许对宿主细胞中该序列的存在与否进行正或负选择的核酸序列。例如，P.pastoris URA5基因是标记基因，因为它的存在可以通过含有该基因的细胞在缺乏尿嘧啶的条件下生长的能力被选择。它的存在还可以通过含有该基因的细胞不能在存在5-FOA的条件下生长被反向选择(selected against)。标记序列或基因不一定需要正和负的可选择性都能显示。来自P.pastoris的标记序列或基因的非限制性实例包括ADE1，ARG4，HIS4和URA3。对于抗生素抗性标记基因，卡那霉素，新霉素，遗传霉素(或G418)，巴龙霉素和潮霉素抗性基因通常被用于允许在存在这些抗生素的条件下生长。

“可操作地连接的”表达控制序列指一种连接，其中该表达控制序列与所感兴趣的基因相邻以控制感兴趣的基因，以及以顺式或在一定距离内控制感兴趣的基因的表达控制序列。

本文所用的术语“表达控制序列”指影响与其可操作地连接的编码序列的表达所必需的多核苷酸序列。表达控制序列是控制核酸序列的转录，转录后事件和翻译的序列。表达控制序列包括合适的转录起始，终止，启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如核糖体结合位点)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要的时候，增强蛋白质分泌的序列。这些控制序列的特性随宿主生物体而不同；在原核生物中，这种控制序列通常包括启动子，核糖体结合位点，和转录终止序列。术语“控制序列”意指包括，至少，其存在是表达所必需的所有组分，还可以包括其存在是有利的其它组分，例如前导序列和融合伴侣(fusion partner)序列。

如本文所用的，术语“重组宿主细胞”(“表达宿主细胞”，“表达宿主系统”，“表达系统”或简单地“宿主细胞”)，指重组载体被引入其中的细胞。应当理解这种术语不仅仅指特定的主题细胞(subject cell)，而且指这种细胞的后代。由于突变或环境影响，某些修饰可能在随后的传代中发生，这种后代可能实际上与亲本细胞不相同，但是仍然包括在本文所使用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是分离的细胞或者在培养基中生长的细胞系，或者可以是存在于活组织或生物体中的细胞。

术语“真核”指有核的细胞或生物体，包括昆虫细胞，植物细胞，哺乳动物细胞，动物细胞和低等真核细胞。

术语“低等真核细胞”包括酵母，真菌，领鞭毛虫，微孢子虫，alveolates(例如沟鞭藻类)，stramenopiles(例如褐藻，原生动物)，rhodophyta门(例如红藻)，植物(例如绿藻，植物细胞，苔藓)和其它原生生物。酵母和真菌包括，但不限于：毕赤酵母属(Pichia sp.)，例如Pichia pastoris，Pichia finlandica，Pichia trehalophila，Pichiakoclamae，Pichia membranaefaciens，Pichia minuta (Ogataea minuta，Pichia lindneri)，Pichia opunitiae，Pichia thermotolerans，Pichiasalictaria，Pichia guercuum，Pichia pijperi，Pichia stiptis和Pichiamethanolica；酵母属(Saccharomyces sp.)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；Hansenula polymorpha，克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)，例如Kluyveromyces lactis；白假丝酵母(Candidaalbicans)，Aspergillus nidulans，黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，木霉(Trichoderma reesei)，Chrysosporiumlucknowense，镰刀菌属(Fusarium sp.)，例如Fusarium gramineum，Fusarium venenatum；Physcomitrella patens和粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)。

本文所用的术语“肽”指短的多肽，例如典型地长度少于大约50个氨基酸以及更典型地长度少于约30个氨基酸的多肽。本文所用的术语包括模拟结构从而模拟生物学功能的类似物和模拟物。

术语“多肽”包括天然存在的和非天然存在的蛋白质，及其片段，突变体，衍生物和类似物。多肽可以是单体的或是聚合的。而且，多肽可以包括多个不同的域，其中每一个都具有一种或多种不同的活性。

术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是蛋白质或多肽，由于其来源或衍生的来源，(1)不与天然状态下与之相伴的组分自然结合，(2)以自然中不存在的纯度存在，其中纯度可以依据其它细胞材料的存在而被判断(例如不含同一物种的其它蛋白质)，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然中不存在(例如，它是自然中存在的多肽的片段或者它包括自然中不存在的氨基酸类似物或衍生物或与标准肽键不同的连接)。因此，化学合成的或在与它天然来源的细胞不同的细胞系统中合成的多肽是和与之天然结合的组分“分离的”。多肽或蛋白质还可以通过用所属领域熟知的蛋白质纯化技术进行分离从而基本不含与之天然结合的组分。如所定义的那样，“分离的”不必定要求所述的蛋白质，多肽，肽或寡肽从其天然环境中被物理地分离出。

本文所用的术语“多肽片段”指与全长多肽相比具有缺失，例如氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。在优选的实施方案中，多肽片段是连续序列，其中该片段的氨基酸序列与天然存在的序列中的相应位置是相同的。片段典型地是至少5，6，7，8，9或10个氨基酸长，优选至少12，14，16或18个氨基酸长，更优选至少20个氨基酸长，更优选至少25，30，35，40或45个氨基酸，更优选至少50或60个氨基酸长，更优选至少70个氨基酸长。

“被修饰的衍生物”指其初级结构序列基本上同源，但是包括，例如体内或体外化学和生物化学修饰或者引入了在天然多肽中不存在的氨基酸的多肽或其片段。这种修饰包括，例如乙酰化，羧化，磷酸化，糖基化，泛素化(ubiquitination)，标记，例如用放射性核素标记，以及各种酶修饰，如所属领域技术人员容易意识到的。各种标记多肽的方法和各种用于这些目的的取代基或标记是本领域中熟知的，包括放射性同位素，例如¹²⁵I，³²P，³⁵S，和³H，与标记的抗配体(例如抗体)相结合的配体，荧光团，化学发光试剂，酶，和能作为标记的配体的特异性结合对成员的抗配体。标记的选择取决于所需要的敏感性，与引物结合的容易性，稳定性要求，和可使用的仪器。标记多肽的方法是所属领域熟知的。参见，例如Ausubel et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992，andSupplements to 2002)(在此以引用的方式引入)。

术语“融合蛋白”指含有与异源氨基酸序列连在一起的多肽或片段的多肽。融合蛋白是有用的，这是因为它们可以被构建成包含来自两个或更多个不同蛋白质的两个或更多个所希望的功能元件。融合蛋白含有来自所感兴趣多肽的至少10个连续氨基酸，更优选至少20个或30个氨基酸，更优选至少40，50或60个氨基酸，更优选至少75，100或125氨基酸。包括本发明的完整蛋白质的融合物是特别有用的。包含在本发明的融合蛋白中的异源多肽为至少6个氨基酸长，通常至少8个氨基酸长，有用地为至少15，20和25个氨基酸长。包含更大的多肽，例如免疫球蛋白Fc片段，或免疫球蛋白Fab片段或者甚至全长蛋白，例如含有绿色荧光蛋白(“GFP”)发色基团的蛋白质或全长免疫球蛋白的融合物是特别有用的。融合蛋白可以通过将编码多肽或其片段的核酸序列与编码不同的蛋白质或肽的核酸序列构建在框内，然后表达融合蛋白而被重组产生。或者，融合蛋白可以通过将多肽或其片段与另一个蛋白质交联以化学方法产生。

本文所用的术语“抗体”，“免疫球蛋白”，“Ig”和“Ig分子”可互换使用。每个抗体分子有独特的结构，允许其与其特异的抗原结合，但是所有的抗体/免疫球蛋白具有相同的本文所述的整体结构。基本的抗体结构单位已知含有亚基的四聚体。每个四聚体具有两个相同的多肽链对，每对具有一条“轻”链(大约25kDa)和一条“重”链(大约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括大约100到110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原的识别。每条链的羧基末端部分确定恒定区，主要负责效应物功能。轻链被分为kappa或lambda。重链被分为gamma，mu，alpha，delta，或epsilon，分别限定抗体的同种型IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。轻链和重链再分为可变区和恒定区(通常参见，Fundamental Immunology(Paul，W.，ed.，2^nd ed.RavenPress，N.Y.，1989)，Ch.7(为所有的目的以引用的方式引入其全文)。每条轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，完整的抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，这两个结合位点是相同的。所有的链都具有相同的一般结构，相对保守的框架区(FR)由三个超可变区，也称为互补决定区或CDR连接起来。每一对的两条链的CDR由框架区排列，使得能够与特定的表位结合。该术语包括天然存在的形式，以及片段和衍生物。包括在该术语范围内的是Ig的类别，即IgG，IgA，IgE，IgM，和IgD。包括在该术语范围内的还有IgG的亚型，即IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。该术语以其最广泛的意义使用，包括单一的单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗体)以及与多个表位或抗原结合的抗体组合物。该术语特别覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们包含或被修饰以包含至少重链免疫球蛋白恒定区的C_H2域的部分，其含有C_H2域的N-连接糖基化位点，或其变体。包含在该术语中的有含有Fc区域的分子，例如免疫粘附素(美国专利申请No.2004/0136986)，Fc融合物和抗体样分子。或者，这些术语可以指至少包含N-连接糖基化位点的至少Fab区域的抗体片段。

术语“Fc”片段指含有C_H2和C_H3域的抗体的C-末端区域‘结晶片段’(图1)。术语“Fab”片段指含有VH，CH1，VL和CL域的抗体的‘抗原结合片段’(图1)。

本文所用的术语“单克隆抗体”(mAb)指得自于基本上均一抗体群体的抗体，即该群体中的各个抗体都是相同的，除了可能少量存在的可能的天然发生的突变。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单一的抗原位点。而且，与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的传统的(多克隆)抗体制备物相反，每个mAb针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们可以通过杂交瘤培养物被合成，不被其它免疫球蛋白污染。术语“单克隆”指抗体的特性，即其是得自于基本上均一的抗体群体，不应被解释为要求通过任何特定的方法产生抗体。例如，根据本发明所使用的单克隆抗体可以用杂交瘤方法制备，其首次由Kohler et al.，(1975)Nature，256：495描述，或者可以用重组DNA方法制备(参见，例如Cabilly etal.的美国专利No.4,816,567)

本文的单克隆抗体包括杂交的和重组的抗体，它们通过将抗体的可变(包括超变)域与恒定域拼接(例如“人源化”抗体)，或者将轻链与重链拼接，或者将来自一个物种的链与来自另一个物种的链拼接，或与异源蛋白融合产生，而不管其来源物种或免疫球蛋白类或亚类名称，(参见，例如Cabilly et al.的美国专利No.4,816,567；Mage andLamoyi，in Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.79-97(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987).)本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来自第一个物种的或属于特定抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而该链的其余部分与来自不同物种的或属于不同抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，以及这种抗体的片段，只要它们包含或被修饰以包含至少一个C_H2。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含来自于人免疫球蛋白的序列的特殊的嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白链或其片段(例如Fv，Fab，Fab’，F(ab’)₂，或抗体的其它抗原结合亚序列)。抗体的Fv片段是保留有整个分子的结合特性和特异性的抗体的最小单位。Fv片段是抗体重链和轻链的可变域的非共价结合异二聚体。F(ab)’2片段是含有由二硫桥连接的Fab片段的两个臂的片段。

人源化抗体的最常见的形式是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区(CDR)的残基被具有所希望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、或兔的CDR的残基取代。在一些例子中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基取代。进一步，人源化抗体可以含有在受体抗体和输入的CDR或框架序列中都不存在的残基。这些修饰被作出以进一步改善和最优化抗体性能。通常，人源化抗体含有至少一个，典型地两个可变域的基本上全部，其中CDR区域的全部或基本上全部相应于非人免疫球蛋白的那些，CDR区域的全部或基本上全部是人免疫球蛋白共有序列中的那些。人源化抗体最佳地还含有免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一个部分，典型地是人免疫球蛋白的。更详细的信息参见Jones et al.，1986，Nature 321：522-524；Reichmann et al.，1988，Nature 332：323-327，和Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。

在术语抗体或免疫球蛋白的范围内“片段”包括那些通过不同蛋白酶消化产生的，那些通过化学切割和/或化学解离产生的以及那些重组产生的，只要该片段还能特异地结合靶分子。这些片段有Fc，Fab，Fab’，Fv，F(ab’)2，和单链Fv(scFv)片段。

本发明的抗体的感兴趣的靶包括生长因子受体(例如FGFR，PDGFR，EGFR，NGFR，和VEGF)和它们的配体。其它靶是G蛋白受体，包括物质K受体，血管紧张素受体，α-和β-肾上腺素能受体，五羟色胺受体，和PAF受体。参见，例如Gilman，Ann，Rev.Biochem.56：625-649(1987)。其它靶包括离子通道(例如钙，钠，钾通道)，蕈毒碱受体，乙酰胆碱受体，GABA受体，谷氨酸盐受体，和多巴胺受体(参见Harpold，U.S.5,401,629和U.S.5,436,128)。其它靶是粘附蛋白例如整联蛋白，选择蛋白，和免疫球蛋白超家族成员(参见Springer，Nature 346：425-433(1990).Osborn，Cell 62：3(1990)；Hynes，Cell 69：11(1992))。其它靶是细胞因子，例如白介素IL-1到IL-13，肿瘤坏死因子α&β，干扰素α，β和γ，肿瘤生长因子β(TGF-β)，集落刺激因子(CSF)和粒细胞单核细胞集落刺激因子(GMCSF)，参见HumanCytokines：Handbook for Basic & Clinical Research(Aggrawal et al.eds.，Blackwell Scientific，Boston，MA 1991)。其它靶是激素，酶，和细胞内和细胞间信使，例如，腺苷酸环化酶，鸟嘌呤环化酶，和磷脂酶C。其它感兴趣的靶是白细胞抗原，例如CD20，和CD33。药物可以是感兴趣的靶，靶分子可以是人的，哺乳动物的，或细菌的。其它靶是抗原，例如来自微生物病原体，包括病毒和细菌以及肿瘤的蛋白质、糖蛋白和碳水化合物。还有其它靶在U.S.4,366,241中描述。

本文讨论的免疫Fc受体可以包括：FcγRI，FcγRIIa，FcγRIIb，FcγRIIIa，FcγRIIIb和FcRn(新生受体)。术语FcγRI可以指任何FcγRI亚型，除非特别指出。术语FcγRII可以指任何FcγRII受体，除非特别指出。术语FcγRIII可以指任何FcγRIII亚型，除非特别指出。

该术语范围内的“衍生物”包括在序列上被修饰，但仍然能与靶分子特异性结合的抗体(或其片段)，包括：种间嵌合和人源化抗体；抗体融合物；异聚抗体复合物(heteromeric antibody complexes)和抗体融合物，例如双抗体(diabodies)(双特异性抗体)，单链双抗体，和胞内抗体(intrabodies)(参见，例如，Intracellular Antibodies：Researchand Disease Applications，(Marasco，ed.，Springer-Verlag New York，Inc.，1998))。

术语“非肽类似物”指具有与参考多肽相似的特性的化合物。非肽化合物还可以叫做“肽模拟物”或者“拟肽”。参见，例如，

                                                               Amino Acid andPeptide Synthesis，Oxford University Press(1992)；Jung，Combinatorial Peptide andNonpeptide Libraries：A Handbook，John Wiley(1997)；Bodanszky et al.，PeptideChemistry--A Practical Textbook，Springer Verlag(1993)；Synthetic Peptides：AUsers Guide，(Grant，ed.，W.H.Freeman and Co.，1992)；Evans et al.，J.Med.Chem.30：1229(1987)；Fauchere，J.Adv.DrugRes.15：29(1986)；Veber and Freidinger，Trends Neurosci.，8：392-396(1985)；

以及上述每一篇中引用的参考文献，在此以引用的方式引入。这种化合物通常是借助计算机化的分子建模被研发的。在结构上与本发明的有用的肽相似的肽模拟物可以用于产生等同的效果，因而是本发明的组成部分。

氨基酸取代可以包括那些：(1)减少对蛋白质水解作用的易感性的，(2)减少对氧化作用的易感性的，(3)改变形成蛋白质复合体的结合亲和性的，(4)改变结合亲和性或酶活性的，以及(5)赋予或改变该类似物的其它物理化学或功能特性的。

如本文所用的，二十个常规氨基酸和它们的缩写遵循常规的用法。参见Immunology-A Synthesis(Golub and Gren eds.，SinauerAssociates，Sunderland，Mass.，2^nd ed.1991)，在此以引用的方式引入。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)，非天然氨基酸例如α-，α-双取代的氨基酸，N-烷基氨基酸，和其它非常规氨基酸也可以是本发明的多肽的合适的组成成分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N-乙酰基赖氨酸，O-磷酸丝氨酸，N-乙酰基丝氨酸，N-甲酰基甲硫氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟基赖氨酸，N-甲基精氨酸，和其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽标记中，左手末端相应于氨基末端，右手末端相应于羧基末端，与标准用法和惯例一致。

如果编码蛋白质的核酸序列与编码第二种蛋白质的核酸序列具有相似的序列，那么该蛋白质与该第二种蛋白质具有“同源性”或者是“同源的”。或者，如果一个蛋白质与第二个蛋白质具有“相似的”氨基酸序列，那么两个蛋白质是同源的。(因此，术语“同源蛋白质”是指两个蛋白质具有相似的氨基酸序列。)在优选的实施方案中，同源的蛋白质是与野生型蛋白质具有至少65％序列同源性的，更优选是具有至少70％序列同源性的。更优选的是与野生型蛋白质具有至少75％，80％，85％或90％序列同源性的同源蛋白质。在更优选的实施方案中，同源蛋白质具有至少95％，98％，99％或99.9％序列相同性。本文所用的，氨基酸序列的两个区域之间的同源性(特别是预测的结构的相似性)理解为暗示了功能上的相似性。

当“同源的”用于指蛋白质或多肽的时候，应当意识到不相同的残基位置通常是保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被另一个具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基取代。通常，保守的氨基酸取代不会显著地改变蛋白质的功能特性。对于其中两个或多个氨基酸序列由于保守取代而互不相同的情况，百分序列相同性或同源性程度可以被向上调整以就取代的保守性进行校正。进行这种调整的方法是所属领域技术人员熟知的。参见，例如，Pearson，1994，Methods Mol.Biol.24：307-31和25：365-89(在此以引用的方式引入)。

下述六组每组都包含互为保守取代的氨基酸：1)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷胺酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。

多肽的序列同源性，也称为百分序列相同性，典型地用序列分析软件测定。参见，例如，the Sequence Analysis Software Package of thegenetics Computer Group (GCG)，University of WisconsinBiotechnology Center，910 University Avenue，Madison，Wisconsin53705。蛋白质分析软件用为各种取代，缺失和其它修饰，包括保守性氨基酸取代设定的同源性衡量标准匹配相似的序列。例如，GCG包括程序如“Gap”和“Bestfit”，它们可以以缺省参数被用于确定非常相关的多肽，例如来自不同物种的生物体的同源多肽之间，或者野生型蛋白和其突变体之间的序列同源性或序列相同性。参见，例如，GCGVersion 6.1。

当将特定的多肽序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库相比较的时候，优选的算法是计算机程序

                   BLAST(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Gishand States，Nature Genet.3：266-272(1993)；Madden et al.，Meth.Enzynol.266：131-141(1996)；Altschul et al.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997)；Zhang andMadden，Genome Res.7：649-656(1997))，

特别是blastp或tblastn(Altschul et al.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))。

BLASTp的优选参数是：Expectation value：10(默认)；Filter：seg(默认)；Cost to open a gap：11(默认)；Cost to extend a gap：1(默认)；Max.alignments：100(默认)；Word size：11(默认)；No.of descriptions：100(默认)；Penalty Matrix：BlOWSUM62。

用以比较同源性的多肽序列的长度一般是至少大约16个氨基酸残基，通常至少大约20个残基，更通常至少大约24个残基，典型地至少大约28个残基，优选多于大约35个残基。当在包含来自大量不同生物体的序列的数据库中搜索的时候，优选比较氨基酸序列。用氨基酸序列进行数据库搜索可以通过本领域已知的除blastp以外的其它算法测定。例如多肽序列可以用FASTA，GCG Version 6.1中的程序，进行比较。FASTA提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的排列和百分序列相同性。Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)(在此以引用的方式引入)。例如，氨基酸序列之间的百分序列相同性可以用FASTA用其缺省参数(字长为2，PAM250计分矩阵)确定，如GCGVersion 6.1中提供，在此以引用的方式引入。

“特异性结合”指两个分子优先于与环境中的其它分子结合而彼此结合的能力。典型地，“特异性结合”以至少两倍，更典型地以至少10倍，通常至少100倍区别于反应中的偶然结合。典型地，特异性结合反应的亲和力或亲和力强度(avidity)，以解离常数计，是大约10^-7M或更强(例如，大约10^-8M，10^-9M或甚至更强)。

本文所用的术语“区域”指生物分子的初级结构的物理上连续的部分。在蛋白质中，区域定义为该蛋白质的氨基酸序列的连续部分。

本文所用的术语“域”指对生物分子的已知的或怀疑的功能作出贡献的生物分子的结构。域可以与区域或其部分是同延的(co-extensive)；域还可以包括生物分子的不同的，非连续的区域。

本文所用的术语“分子”意指任何化合物，包括但不限于小分子，肽，蛋白质，糖蛋白，糖，核苷酸，核酸，脂类等，这样的化合物可以是天然的或是合成的。

本文所用的术语“含有”应当被理解为是指包含所说的整体(integers)或整体组，但是不排除任何其它整体或整体组。

本文所用的术语“基本上由......组成”应当被理解为是指包含所说的整体或整体组；同时排除了显著影响或改变了所说的整体的修饰或其它整体。对于N-聚糖的种类，术语“基本上由”所说的N-聚糖“组成”应当被理解为包括N-聚糖，无论该N-聚糖是否是在直接与糖蛋白的天冬酰胺相连的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)处被岩藻糖化。

本文所用的术语“主要”或其变化形式例如“主要的”或者“是主要的”应当被理解为是指在糖蛋白用PNGase处理并用质谱例如MALDI-TOF MS分析释放的聚糖以后，占总N-聚糖的最高的摩尔百分比(％)的聚糖种类。换句话说，短语“主要”定义为单个实体，例如特定的糖形，以比任何其它单个实体更大的摩尔百分比存在。例如，如果组合物由40摩尔百分比的A物质，35摩尔百分比的B物质和25摩尔百分比的C物质组成，则该组合物主要含有A物质，B物质是次最主要的物质。

本文所用的术语“基本不含”特定的糖残基，例如岩藻糖，或半乳糖等，用于表示糖蛋白组合物基本上缺少包含这种残基的N-聚糖。用纯度来表示，基本上不含表示包含这种糖残基的N-聚糖结构的数量不超过10％，优选低于5％，更优选低于1％，更优选低于0.5％，其中百分率是以重量或摩尔百分比计。因此，根据本发明，糖蛋白组合物中的基本上所有N-聚糖结构不含岩藻糖，或半乳糖，或二者。

如本文所用的，当任何时候都没有可检测量的特定糖残基存在于N-聚糖结构上的时候，糖蛋白组合物“缺少”这种特定的糖残基，例如岩藻糖或半乳糖。例如，在本发明的优选的实施方案中，糖蛋白组合物由上述的低等真核生物，包括酵母[例如Pichia sp.；Saccharomycesap.；Kluyveromyces sp.；Aspergillus sp.]产生，将会“缺少岩藻糖”，这是因为这些生物体的细胞没有产生岩藻糖化N-聚糖结构所需要的酶。因此，术语“基本不含岩藻糖”包括术语“缺少岩藻糖”。然而，如上所述的，即使组合物在某个时候包含岩藻糖化的N-聚糖结构或者包含有限的，但是可检测量的岩藻糖化N-聚糖结构，该组合物也可以是“基本不含岩藻糖”。

本文所用的短语“增加的结合活性”与“增加的结合亲和性”可互换使用，指IgG分子与受体-或者另外提到的分子的结合的增加。

本文所用的短语“减少的结合活性”与“减少的结合亲和性”可互换使用，指IgG分子与受体-或者另外提到的分子的结合的减少。

本文所用的短语“吞噬作用”是指免疫复合体的清除。吞噬作用是免疫细胞——包括但不限于巨噬细胞和嗜中性白细胞的免疫活性。

抗体和抗体-抗原复合体与免疫系统的细胞之间的相互作用和反应的种类，包括抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)，免疫复合体的清除(吞噬作用)，B细胞产生抗体和IgG血清半衰期分别在如下文献中定义：Daeron et al.，1997，Annu.Rev.Immunol.15：203-234；Ward and Ghetie，1995，Therapeutic Immunol.2：77-94；Cox and Greenberg，2001，Semin.Immunol.13：339-345；Heyman，2003，Immunol. Lett.88：157-161；and Ravetch，1997，Curr.Opin.Immunol.9：121-125。

除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意思。示例性的方法和材料描述如下，虽然与本文描述的类似或等同的方法和材料也可以用于实施本发明，这对本领域技术人员来说是显而易见的。本文提及的所有出版物和其它参考文献都以引用的方式引入其全文。在不一致的情况下，以本说明书，包括定义，为准。材料，方法和实施例仅是举例说明而不是进行限制。

重组Ig-Man₃GlcNAc₂分子

本发明提供含有具有主要是Man₃GlcNAc₂N-连接糖形的糖基化Ig群体的组合物。本发明还提供具有主要是Man₃GlcNAc₂N-连接糖形的Ig和Ig组合物，该糖形调节抗体效应物功能，例如受体结合。优选本发明的Ig和FcγRIII受体之间的相互作用提供了直接结合活性的增加。而且，优选本发明的Ig和FcγRIIb受体之间的相互作用提供了直接结合活性的减少(或缺少)。在另一个实施方案中，本发明的Ig或Ig组合物显示出由于糖形结构的富集/优势而赋予的结合活性增加。本发明的突出特征是它提供了具有主要的特定糖形的Ig和Ig组合物，该糖形介导抗体效应物功能，例如ADCC活性的增加或B细胞抗体产生的减少。在另一个实施方案中，本发明的Ig或Ig组合物显示出由于一种糖形的富集/优势而赋予的增加的ADCC活性或B细胞的抗体产生。进一步，技术人员显然可知产生具有主要(predominant)糖形的Ig组合物的一个优点是它避免了具有不希望糖形的Igs的产生和/或可能导致不希望的效果和/或稀释更有效Ig糖形的浓度的Ig的异质混合物的产生。因此，预期含有具有主要是Man₃GlcNAc₂糖形的Ig的药物组合物会具有有益的特性，包括但不限于减少的与FcγRIIb的结合和增加的与FcγRIIIa和FcγRIIIb的结合，因而可能在更低剂量也是相当有效的，因此具有更高的功效/效力。

在一个实施方案中，本发明的Ig分子含有在Ig分子中Fc区域上的重链的C_H2域的Asn-297位含有至少一个调节抗体效应物功能的Man₃GlcNAc₂聚糖结构。优选地，在二聚化的Ig中，Man₃GlcNAc₂聚糖结构位于每个CH2区域的每个Asn-297上(图1)。在另一个实施方案中，本发明提供了含有主要被基本上由Asn-297位的Man₃GlcNAc₂聚糖结构组成的N-聚糖糖基化的Ig的组合物(图1)。或者，Ig分子上存在的一个或多个碳水化合物部分可以被除去和/或加入到该分子上，从而增加或除去Ig上糖基化位点的数量。进一步，Ig分子的C_H2区域内的N-连接糖基化位点的位置可以通过在该分子内的不同位置引入天冬酰胺(Asn)或N-糖基化位点被改变。虽然Asn-297是在鼠和人IgG分子中发现的典型的N-糖基化位点(Kabat et al.，Sequences ofProteins of Immunological Interest，1991)，该位点并不是可预见的唯一位点，而且该位点也不必须被保持以维持功能。使用已知的突变方法，技术人员可以改变编码本发明的Ig的DNA分子，以使Asn-297处的N-糖基化位点被除去，还可以进一步改变DNA分子以使一个或多个N-糖基化位点在该Ig分子内的其它位置上被制造出来。优选N-糖基化位点在Ig分子的C_H2区域内被制造。然而，Ig的Fab区域的糖基化在30％的血清抗体中已有描述——通常是在Asn-75处(Rademacheret al.，1986，Biochem.Soc.Symp.，51：131-148)。Ig分子的Fab区域的糖基化是另外的位点，其可以和Fc区域的N-糖基化一起存在，或者单独存在。

在一个实施方案中，本发明提供了具有主要是Man₃GlcNAc₂N-聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述Man₃GlcNAc₂聚糖结构以超过该重组Ig组合物中的次主要的聚糖结构至少大约5个摩尔百分比的水平存在。在优选的实施方案中，本发明提供了具有主要是Man₃GlcNAc₂聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述Man₃GlcNAc₂聚糖结构以超过该重组Ig组合物中的次主要的聚糖结构至少大约10个摩尔百分比到大约25个摩尔百分比的水平存在。在更优选的实施方案中，本发明提供了具有主要是Man₃GlcNAc₂聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述Man₃GlcNAc₂聚糖结构以超过该重组Ig组合物中的次主要的聚糖结构至少大约25个摩尔百分比到大约50个摩尔百分比的水平存在。在优选的实施方案中，本发明提供了具有主要是Man₃GlcNAc₂聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述Man₃GlcNAc₂聚糖结构以超过该重组Ig组合物中的次主要的聚糖结构大约50个摩尔百分比的水平存在。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有主要是Man₃GlcNAc₂聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述Man₃GlcNAc₂聚糖结构以超过该重组Ig组合物中的次主要的聚糖结构大约75个摩尔百分比的水平存在。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了具有主要是Man₃GlcNAc₂聚糖结构的重组Ig组合物，其中所述Man₃GlcNAc₂聚糖结构以超过该重组Ig组合物中的次主要的聚糖结构90个摩尔百分比的水平存在。具有主要是Man₃GlcNAc₂N-聚糖(75％)的JC-IgG的N-聚糖的MALDI-TOF分析显示于图4A中。具有主要是Man₃GlcNAc₂(64％)的DX-IgG的N-聚糖的MALDI-TOF分析显示于图4B中。

增加的Ig-Man₃GlcNAc₂与FcγRIII受体的结合

与FcγRIIIa和FcγRIIIb结合的Ig的效应物功能，例如ADCC的激活，受到Ig分子的Fc区域的调节。不同的功能由该区域中的不同域调节。相应地，本发明提供了Ig分子和组合物，其中Ig分子上的Fc区域具有主要是Man₃GlcNAc₂的N-聚糖，其能够实现效应物功能。在一个实施方案中，具有主要是Man₃GlcNAc₂N-聚糖的Fc区域使得与FcγRIIIa(图6)和FcγRIIIb(图5)受体的结合增加。在另一个实施方案中，Fc具有主要是Man₃GlcNAc₂的N-聚糖。所属领域技术人员显然可知，含有Fc区域的分子，例如免疫粘附素(immunoadhesion)(Chamow and Ashkenazi，1996，Trends Biotechnol.14：52-60；Ashkenazi and Chamow，1997，Curr.Opin.Immunol.9：195-200)，Fc融合体和抗体样分子也包括在本发明中。

Ig分子与Fc受体的结合活性(亲和性)可以通过检测确定。FcγRIII与IgG结合检测的实例在实施例6中描述。本领域技术人员知道，该检测可以容易地适用于检测任何免疫球蛋白分子。

具有主要是Man₃GlcNAc₂N-聚糖的JC-IgG(根据本发明制备的Ig)与FcγRIIIb和FcγRIIIa的结合活性与Rituximab_相比增加50-100倍，如图5A和图6所示。具有主要是Man₃GlcNAc₂N-聚糖的DX-IgG(根据本发明制备的另一种Ig)与FcγRIIIb的结合活性与Rituximab_相比也增加50-100倍，如图5B所示。

更有趣的是，FcγRIIIa基因二态性产生两种同种异形：FcγRIIIa-158V和FcγRIIIa-158F(Dall’Ozzo et al.，2004，Cancer Res.64：4664-4669)。FcγRIIIa-158V纯合基因型与对Rituximab_更高的临床反应有关(Cartron et al.，2002，Blood，99：754-758)。但是，大部分群体携带一种FcγRIIIa-158F等位基因，使得对于大多数群体来说Rituximab_通过FcγRIIIa的结合诱导ADCC的有效性降低。但是，当Rituximab_样抗CD20抗体在缺少岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞中表达的时候，该抗体通过FcγRIIIa-158F和FcγRIIIa-158V增强ADCC是等效的(Niwa et al.，2004，Clin.Canc Res.10：6248-6255)。本发明的某些优选实施方案的抗体在不向N-聚糖加入岩藻糖的宿主细胞(例如P.pastoris，一种缺少岩藻糖的酵母；参见实施例1和2)中表达。因此，预期缺少岩藻糖的和与FcγRIIIa-158F的结合增强的本发明的抗体特别可用于治疗许多对Rituximab_的临床反应减少的患者。

减少的Ig-Man₃GlcNAc₂与FcγRIIb受体的结合

与FcγRIIb结合的Ig的效应物功能，例如增加的B细胞的抗体产生和增加的ADCC活性，受到Ig分子的Fc区域的调节。不同的功能由该区域中的不同域调节。相应地，本发明提供了Ig分子和组合物，其中Ig分子上的Fc区域具有主要是Man₃GlcNAc₂的N-聚糖，其能够实现效应物功能。在一个实施方案中，具有主要是Man₃GlcNAc₂N-聚糖的Fc区域使得与FcγRIIb受体的结合减少。所属领域技术人员显然可知，含有Fc区域的分子，例如免疫粘附素(immunoadhesion)(Chamow and Ashkenazi，1996，Trends Biotechnol.14：52-60；Ashkenazi and Chamow，1997，Curr.Opin.Immunol.9：195-200)，Fc融合体和抗体样分子也包括在本发明中。

Ig分子与Fc受体的结合活性(亲和性)可以通过检测确定。FcγRIIb与IgG结合检测的实例在实施例6中描述。本领域技术人员知道，该检测可以容易地适用于检测任何免疫球蛋白分子。

具有主要是Man₃GlcNAc₂N-聚糖的JC-IgG(本发明的Ig)与FcγRIIb的结合活性与Rituximab_相比减少至1/2-1/3，如图7A所示。具有主要是Man₃GlcNAc₂N-聚糖的DX-IgG(本发明的另一种Ig)与FcγRIIb的结合活性与Rituximab_相比也减少至1/2-1/3，如图7B所示。

增加的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性

在另一个实施方案中，FcγRIIIa和FcγRIIIb与具有Man₃GlcNAc₂作为主要的N-聚糖的Ig分子或组合物结合的增加可以导致FcγRIII-介导的ADCC的增加。已经确定FcγRIII(CD16)受体负责ADCC活性(Daeron et al.，1997，Annu.Rev.Immunol.15：203-234)。在另一个实施方案中，FcγRIIb与具有Man₃GlcNAc₂作为主要的N-聚糖的Ig分子或组合物的结合的减少导致ADCC的增加(Clynes et al.，2000，supra)。在另一个实施方案中，本发明的Ig分子或组合物显示出增加的ADCC活性，这是由于主要是Man₃GlcNAc₂的聚糖的存在。

测定B-细胞损耗(depletion)的体外检测和荧光释放ADCC检测的实例在实施例7中公开。本领域技术人员知道这些公开的检测可容易地适用于任何Ig分子的检测。进一步，在动物模型中的体内ADCC检测可以适用于Borchmann et al.，2003，Blood，102：3737-3742，Niwa et al.，2004，Cancer Research，64：2127-2133和实施例7中所述的任何特异的IgG。

增加的B细胞的抗体产生

通过调控的FcγR途径抗肿瘤的抗体结合(antibody engagement)已有报道(Clynes et al.，2000，Nature，f6：443-446)。特别地，已知，当FcγRIIb与含有免疫受体酪氨酸基激活基序(immunoreceptortyrosine based activation motifs)(ITAM)的受体，例如B细胞受体(BCR)，FcγRI，FcγRIII，和FcεRI共交联的时候，它抑制ITAM介导的信号(Vivier and Daeron，1997，Immunol.Today，18：286-291)。例如，FcgRII特异性抗体的加入阻断Fc与FcgRIIB的结合，导致增加的B细胞增殖(Wagle et al.，1999，J of Immunol.162：2732-2740)。相应地，在一个实施方案中，本发明的Ig分子可以介导FcγRIIb受体结合的减少，导致B细胞的激活，其依次催化浆细胞产生抗体(Parker，D.C.1993，Annu.Rev.Immunol.11：331-360)。用IgG1测定B细胞的抗体产生的检测的实例在实施例6中描述。本领域技术人员知道该检测可以容易地适用于任何免疫球蛋白分子的检测。

其它免疫活性

嗜中性白细胞上的效应物细胞分子的改变的表面表达已被发现会增加对细菌感染的易感性(Ohsaka et al.，1997，Br.J.Haematol.98：108-113)。已进一步证明与FcγRIIIa效应物细胞受体结合的IgG调控肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达(Blom et al.，2004，Arthritis Rheum.，48：1002-1014)。进一步，FcγR-诱导的TNF-α也增加了嗜中性白细胞与IgG包被的红细胞的结合和吞噬它的能力(Capsoni et al.，1991，J.Clin.Lab Immunol.34：115-124)。因此预期显示出与FcγRIII的结合的增加的本发明的Ig分子和组合物可能使得TNF-α的表达增加。

FcγRIII受体活性的增加已被表明增加溶酶体β-葡糖醛酸酶以及其它溶酶体酶的分泌(Kavai et al.，1982，Adv.Exp Med.Biol.141：575-582；Ward and Ghetie，1995，Therapeutic Immunol.，2：77-94)。进一步，免疫受体与其配体结合后的重要步骤是它们的内在化和向溶酶体的递送(Bonnerot et al.，1998，EMBO J.，17：4906-4916)。因此预期显示出与FcγRIIIa和FcγRIIIb的结合的增加的本发明的Ig分子或组合物可能导致溶酶体酶的分泌的增加。

仅在嗜中性白细胞上存在的FcγRIIIb在免疫复合体的组装中具有最重要的作用，它的聚集激活吞噬作用，去颗粒作用，和呼吸爆发(respiratory burst)，导致被吞噬的病原体的破坏。嗜中性白细胞的激活导致相应于它的两个胞外域的受体的蛋白溶解性切割的可溶形式的分泌。可溶性FcγRIIIb通过FcγR依赖的效应物功能的竞争性抑制以及通过与补体受体CR3结合行使调控功能，导致炎性介体的产生(Sautes-Fridman et al.，2003，ASHI Quarterly，148-151)。

因此本发明提供含有基本由Man₃GlcNAc₂组成的N-聚糖的免疫球蛋白分子；并且提供含有免疫球蛋白和与之相连的多个N-聚糖的组合物，其中在所述多个N-聚糖中的主要N-聚糖基本由Man₃GlcNAc₂组成。在任一实施方案中，除了提高的与FcγRIIIa和FcγRIIIb的结合以及减少的与FcγRIIb的结合之外，所述Man₃GlcNAc₂N-聚糖在免疫球蛋白上的优势优选提供了所希望的治疗效应物活性，如本文所示的。

免疫球蛋白亚类

IgG亚类已被表明具有不同的与Fc受体的结合亲和性(Huizingaet al.，1989，J.of Immunol.，142：2359-2364)。IgG亚类的每一个可以在本发明的不同方面提供特别的优势。因此，在一个方面，本发明提供含有Man₃GlcNAc₂作为与IgG1分子连接的主要N-聚糖的IgG1组合物。在另一个方面，本发明包括含有Man₃GlcNAc₂作为与IgG2分子连接的主要N-聚糖的IgG2组合物。在另一个方面，本发明包括含有Man₃GlcNAc₂作为与IgG3分子连接的主要N-聚糖的IgG3组合物。在另一个方面，本发明包括含有Man₃GlcNAc₂作为与IgG4分子连接的主要N-聚糖的IgG4组合物。

或者，本发明可以应用于免疫球蛋白的所有五个主要类别：IgA，IgD，IgE，IgM和IgG。本发明的优选的免疫球蛋白是人IgG，优选是亚型IgG1，IgG2，IgG3或IgG4中的一个。更优选地，本发明的免疫球蛋白是IgG1分子。

介导抗体效应物功能和活性的重组免疫球蛋白(Ig)分子的产生

在一个方面，本发明提供了产生具有基本上由C_H2域的Asn-297处的Man₃GlcNAc₂聚糖结构组成的N-聚糖的重组Ig分子的方法，其中该Ig分子介导抗体效应物功能和活性，以及类似地，免疫球蛋白组合物，其中与该免疫球蛋白连接的主要N-聚糖是Man₃GlcNAc₂。在一个实施方案中，Ig的重链和轻链用搭接寡核苷酸(overlappingoligonucleotides)合成并分别克隆到用于在宿主细胞中表达的表达载体(实施例1)中。在优选的实施方案中，重组Ig重链和轻链在主要催化Man₃GlcNAc₂的添加的宿主菌株中被表达。在一个实施方案中，这种糖形结构更明确地表示为[(Manα1，3)(Manα1，6)Manβ1，4-GlcNAcβ1，4-GlcNAc]，在Ig上的Fc区域的氨基酸Asn-297的氮和Man₃GlcNAc₂聚糖的N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖的羟基之间形成连接。在另一个实施方案中，这种主要的聚糖可以被添加到Ig分子中不同位点的天冬酰胺(不同于Asn-297)上，或者与Fab区域中的N-糖基化位点共同存在。

具有主要是Man₃GlcNAc₂的Ig在低等真核生物中的产生

本发明的一个方面提供了可用于产生具有主要是Man₃GlcNAc₂的糖形的免疫球蛋白或抗体分子的重组的低等真核宿主细胞，其与在以低产量天然产生所述糖形的哺乳动物细胞中表达的糖蛋白组合物相比具有优势。

本发明的另一个优点是具有容易再生的预定糖基化模式的糖蛋白组合物被提供。这种组合物的特性被评估并被最优化以获得所希望的特性，而副作用可以被最小化或被完全避免。

本发明还提供产生被工程化或被选择出以表达用于产生含有基本上由Man₃GlcNAc₂组成的N-聚糖的Ig分子的一种或多种核酸的重组宿主细胞的方法和具有主要是Man₃GlcNAc₂的聚糖结构的Ig组合物。在本发明的特定的优选实施方案中，重组宿主细胞，优选重组低等真核宿主细胞，被用于产生所述具有主要是Man₃GlcNAc₂聚糖的Ig分子和组合物。

在其它优选的实施方案中，本发明包括可以从重组宿主细胞中或者通过本发明的方法获得的糖蛋白。

本发明的宿主细胞可以用编码所希望的Ig区域的载体，以及用编码本文所述的一种或多种糖基化相关酶的载体转化，然后筛选具有主要是Man₃GlcNAc₂聚糖的重组Ig分子或组合物的表达。本发明的重组宿主细胞可以是真核或原核宿主细胞，例如动物，植物，昆虫，细菌细胞等，其被工程化或被选择以产生具有主要是Man₃GlcNAc₂N-聚糖结构的Ig组合物。

优选地，本发明的重组宿主细胞是根据本领域中所述的在在遗传上被工程化的低等真核宿主细胞

(WO 02/00879，WO 03/056914，WO 04/074498，WO 04/074499，Choi et al.，2003，PNAS，100：5022-5027；Hamilton et al.，2003，Nature，301：1244-1246 andBobrowicz et al.，2004，Glycobiology，14：757-766)。

特别地，WO 03/056914在图22中公开了获得75％Man₃GlcNAc₂的方法，以及在图30，31和第207-211段中公开了免疫球蛋白。

在本发明的一个实施方案中，编码IgG1的载体，例如含有JC-IgG的AOX1/pPICZA载体(实施例1)被引入到酵母P.pastoris YAS309株中。该YAS309株与其中K3报道子蛋白被除去的YSH44株相似(Hamilton et al.，2003，Sclience，301：1244-1246)，如文献所述，其PNO1和MNN4b基因被破坏(美国专利申请No.11/020808)，以及如文献所述，β-1，4半乳糖基转移酶I基因被引入(美国专利申请No.11/108088)。Δpno1Δmnn4b双破坏导致甘露糖磷酸化的消除。如YSH44(Hamiltonet al.，2003)那样被引入且其侧翼是URA5基因的甘露糖苷酶II基因通过在5-氟乳清酸(5-FOA)上培养菌株而被敲除(Guthrieand Fink，1991，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Vol.169，Academic Press，San Diego)。然后甘露糖苷酶II活性被再次引入到AMR2位点，导致甘露糖苷酶II活性的重新引入和AMR2基因的丢失，因此消除β-甘露糖基化，如文献所述(美国专利申请No.11/118008)。来自用β-半乳糖苷酶和β-N-乙酰基氨基己糖苷酶处理的YAS309株的糖蛋白具有主要是Man₃GlcNAc₂的N-聚糖。因此，在YAS309中表达并用β-半乳糖苷酶和β-N-乙酰基氨基己糖苷酶(实施例3)处理的JC-IgG具有主要是Man₃GlcNAc₂的N-聚糖(图4B)。

在另一个实施方案中，编码IgG1的载体，例如含有DX-IgG(实施例1)的AOX1/pPICZA也被引入到酵母P.pastoris YAS309株(上述的)中，纯化，然后用β-N-乙酰基氨基己糖苷酶(实施例3)处理，产生具有主要是Man₃GlcNAc₂N-聚糖的DX-IgG。

或者，本发明的抗体可以用本领域已知的几种方法被表达(Monoclonal Antibody Production Techniques and Application，pp.79-97(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。

具有主要是Man₃GlcNAc₂的Ig在Δalg3酵母宿主中的产生

或者，本发明的Ig可以在体内合成Man₃GlcNAc₂N-聚糖的低等真核宿主中被表达。这种宿主被工程化成为Δalg3突变体，如WO03/056914中所述，而且α-1，2甘露糖苷酶基因也如文献所述被引入。引入到这种宿主中的免疫球蛋白通过体内方法表达主要是Man₃GlcNAc₂的N-聚糖。

糖基转移酶的表达和在低等真核生物中的稳定基因整合

使用选择标记例如URA3，URA5，HIS4，SUC2，G418，BLA或SH BLA在低等真核宿主菌株(例如P.pastoris)中引入和确认异源基因的整合的方法已有描述。当表达系统在低等真核生物中被产生的时候，这些方法可以适用于产生本发明的Ig。此外，已描述了重复使用URA3标记以消除不希望的甘露糖基转移酶活性的方法。Alani et al.，1987，Genetics，116：541-545和美国专利No.6,051,419描述了基于在P.pastoris中破坏URA3的选择系统。优选地，PpURA3-或PpURA5-blastercassettes用于破坏URA3，URA5，或尿嘧啶生物合成途径中的任何基因，以提供正选择和负选择，其是基于尿嘧啶的营养缺陷型和对5-氟乳清酸(5FOA)的抗性(Boeke，et al.，1984，Mol.Gen.Genet.，197：345-346)。因此所属领域技术人员知道这种系统允许通过选择和反向选择插入多个异源基因。

进一步的酶促修饰

进一步的酶促缺失可以是对于分离可能在人中导致异常的免疫原性活性的不含甘露糖磷酸化或β-甘露糖基化的Ig是有益的或是必需的。如所提及的，美国专利申请No.11/020808公开了用于消除甘露糖磷酸化的方法，美国专利申请No.11/118008公开了用于消除β-甘露糖基化的方法。

具有主要是Man₃GlcNAc₂聚糖结构的Ig在其它蛋白质表达系统中的产生

所属领域技术人员应当理解，表达宿主系统(生物体)被选择用于异源蛋白质的表达，其可以被或者可以不需要被工程化以表达具有主要聚糖结构的Ig。本文提供的实例是实施具有在Asn-297处或另一个N-糖基化位点处，或在这两处的特定聚糖的Ig表达的一种方法的实例。所属领域技术人员可以容易地将本发明和实例的详细情况用于任何蛋白质表达宿主系统(生物体)。

其它蛋白质表达宿主系统包括动物，植物，昆虫，细菌细胞等，其可以被用于产生根据本发明的Ig分子和组合物。这种蛋白质表达宿主系统可以被工程化或被选择以表达主要糖形，或者可以天然产生具有主要糖形结构的糖蛋白。产生具有主要糖形的糖蛋白的工程化蛋白质表达宿主系统的实例包括基因敲除/突变(Shields et al.，2002，JBC，277：26733-26740)；遗传工程插入(

et al.，1999，Nature Biotech.，17：176-180)或二者的组合。或者，特定的细胞天然表达主要糖形——例如，鸡，人和奶牛(Raju et al.，2000，Glycobiology，10：477-486)。因此，具有主要是根据本发明的一种特定聚糖结构的Ig糖蛋白或组合物的表达可以由所属领域技术人员通过选择多个表达宿主系统中的至少一个而被获得。本领域中用于产生糖蛋白的更多表达宿主系统包括：CHO细胞；Raju WO9922764A1和Presta WO03/035835A1；杂交瘤：Trebak et al.，1999，J.Immunol.Methods，230：59-70；昆虫细胞：Hsu et al.，1997，JBC，272：9062-970，以及植物细胞；Gerngross et al.，2O04/074499A2。

IgG的纯化

抗体的纯化和分离的方法是本领域已知并已被公开的。参见，例如，

                       Kohler & Milstein，(1975)Nature 256：495；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody，Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；.Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-104(Academic Press，1986)；and Jakobovits et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.sci.USA 90：2551-255 and Jakobovits et al，(1993)Nature362：255-258。

在另一个实施方案中，抗体或抗体片段可以用MaCafferty et al.(1990)Nature，348：552-554(1990)中描述的技术，从生成的抗体噬菌体文库中被分离，用感兴趣的抗原选择合适的抗体或抗体片段。

根据本发明的方法产生的重组Ig分子可以依据实施例3中描述的方法被纯化。图2显示了从YAS309纯化的JC-IgG的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色凝胶。图3显示了从YAS309纯化的DX-IgG的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色凝胶。在一个实施方案中，纯化的Ig抗体具有Man₃GlcNAc₂作为主要的N-聚糖。任何Ig分子上的聚糖分析和分布可以通过所属领域技术人员已知的几种质谱方法确定，包括但不限于：HPLC，NMR，LCMS和MALDI-TOF MS。在优选的实施方案中，聚糖分布由MALDI-TOF MS分析确定，如实施例5中所述。图4A显示了从YAS309纯化的并用半乳糖苷酶和氨基己糖苷酶处理的JC-IgG的MALDI-TOF谱(实施例3)。该MALDI-TOF显示出总N-聚糖的大约75％摩尔百分比是Man₃GlcNAc₂。图4B显示了从YSH44纯化并用半乳糖苷酶和氨基己糖苷酶处理的DX-IgG的MALDI-TOF谱。该MALDI-TOF显示出总N-聚糖的大约64％摩尔百分比是Man₃GlcNAc₂。

药物组合物

本发明的抗体可以被包含在含有该抗体作为活性治疗剂以及各种其它药学可接受的组分的药物组合物中。参见Remington’sPharmaceutical Science(15^th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1980)。优选的形式取决于预期的给药方式和治疗应用。组合物还可以包括，这取决于所希望的配方设计，药学可接受的，非毒性的载体或稀释剂，其被解释为通常用于配制用于动物或人给药的药物组合物的媒介物。稀释剂被选择以不影响该组合的生物活性。这种稀释剂的实例是蒸馏水，生理磷酸缓冲盐水，Ringer’s溶液，右旋糖溶液，和Hank’s溶液。此外，药物组合物或制剂还可以包含其它载体，佐剂，或者非毒性，非治疗性，非免疫原性的稳定剂等。

肠胃外给药的药物组合物是无菌的，基本上等渗的，无热原的，并且是依据FDA或类似团体的GMP制备的。抗体可以作为物质在生理学可接受的稀释剂中的溶液或悬液的注射剂量给药，该溶液或悬液含有可以是无菌液体例如水，油，盐水，甘油或乙醇的药物载体。此外，辅助物质，例如湿润剂或乳化剂，表面活性剂，pH缓冲物质等可以存在于组合物中。药物组合物的其它组分是石油，动物，植物，或合成来源的组分，例如花生油，大豆油，和矿物油。通常，二醇例如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，特别是用于注射溶液。抗体可以以储存注射(depot injection)或制备成允许持续释放活性成分的植入制备物的形式给药。典型地，组合物被制备成可注射的，其是液体溶液或悬液；适于在注射前在液体介质中形成溶液或悬液的固体形式也可以被制备。制备物还可以被乳化或制成脂质体或微颗粒例如聚交酯，聚乙交酯，或用以增强佐剂效果的共聚物中的胶囊，如上所述(参见Langer，Science 249，1527(1990)和Hanes，Advanced Drug DeliveryReviews 28，97-119(1997))。

诊断产品

本发明的抗体也可以包含在多种诊断试剂盒和其它诊断产品例如阵列中。抗体通常被预固定在固相，例如微量滴定盘的孔中。试剂盒通常也含有用于检测抗体结合，和标记的试剂，并提供试剂盒使用的说明书。免疫测量和夹心检测是诊断试剂盒的优选方式(参见US4,376,110，4,486,530；5,914,241，和5,965,375)。抗体阵列在例如US5,922,615，US 5,458,852，US 6,019,944，和US 6,143,576中描述。

治疗应用

本发明提供在糖蛋白上含有主要是特定糖形的糖蛋白组合物。本发明的一个特征是当被给予哺乳动物包括人的时候，含有该新的糖蛋白组合物的药物组合物，在优选的实施方案中，当与具有相似初级结构的其它糖蛋白组合物相比较的时候，有利地显示出较好的体内特性。因此，本发明的新的组合物可以用于任何糖蛋白药物试剂正在被使用的地方，可以有利地提供增强的特性以及增加的生产批次之间和过程中的均一性。本发明的制备物可以包含在溶液，单位剂量形式例如口服递送的片剂和胶囊中，以及悬液，油膏中等，这取决于特定的药物或药剂及其靶区域。

在特定的方面，本发明提供了用于糖蛋白药物试剂，药物或药剂的新的组合物，其中糖蛋白包含含有主要是糖蛋白试剂的特定糖形的免疫球蛋白分子和组合物。根据本发明的特定方面，含有具有主要是本发明所述的Man₃GlcNAc₂聚糖结构的N-连接低聚糖的免疫球蛋白糖蛋白的组合物被提供。在优选的方面，糖蛋白是抗体，特别可以是单克隆抗体。本发明进一步提供了用于产生本发明的组合物的方法和工具。

本发明进一步包括含有本发明的糖形制备物的药物组合物。该组合物优选是无菌的。在组合物是水溶液的情况下，优选糖蛋白是可溶的。在组合物是冻干粉末的情况下，优选该粉末可以被重新溶解到合适的溶剂中。

在其它的方面，本发明涉及用于治疗病况的方法，包括给需要的哺乳动物施用治疗有效量的本发明的药物组合物。本发明的另一个目的是提供可以被用于治疗疾病或失调目的的糖形制备物的制造物或试剂盒。

具有主要是Man₃GlcNAc₂N-聚糖的本发明的Ig分子具有多种治疗应用，例如癌症，炎性疾病，感染，免疫疾病，自身免疫疾病包括特发性血小板减少性紫癜，关节炎，系统性红斑狼疮，和自身免疫性溶血性贫血。

下述是举例说明有关Ig糖蛋白组合物的产生的本发明的组合物和方法的实施例。这些实施例不应理解为是限制——这些实施例被包括进来仅仅是为了举例说明。本领域技术人员知道，对本发明公开内容的多种修改和延伸包括最优化是可能的。这种修改和延伸视为是本发明的部分。

                     实施例1

克隆DX-IgG1以在P.pastoris中表达

DX-IgG1(抗CD20的IgG1)的轻链(L)和重链(H)由鼠可变区和人恒定区组成。轻链在SEQ ID NO：1中公开，重链在SEQ ID NO：2中公开。重链和轻链序列用购自Integrated DNA Technologies(IDT)的搭接(overlapping)寡核苷酸合成。对于轻链可变区，15个搭接寡核苷酸(SEQ ID NO：5-19)被购买，在PCR反应中用Extaq(Takada)退火，产生具有5’MlyI位点的轻链可变区片段。该轻链可变片段然后用5’MlyI引物CD20L/up(SEQ ID NO：20)，3’可变/5’恒定引物LfusionRTVAAPS/up(SEQ ID NO：21)，3’恒定区引物LfusionRTVAAPS/lp(SEQ ID NO：22)和3’CD20L/lp(SEQ ID NO：23)通过搭接PCR与轻链恒定区(SEQ ID NO：3)(Gene Art，Toronto，Canada)连接。最终的MlyI-轻链片段(其包括5’AG碱基对)然后被插入到pCR2.1 topo载体(Invitrogen)中得到pDX343。对于重链，相应于鼠重链可变区的17个搭接寡核苷酸(SEQ ID NO：24-40)购自IDT，用Extaq退火。该重链可变片段然后用5’MlyI引物CD20H/up(SEQ ID NO：41)，5’可变/恒定引物HchainASTKGPS/up(SEQ IDNO：42)，3’可变/恒定引物HchainASTKGPS/lp(SEQ ID NO：43)和3’恒定区引物HFckpn1/lp(SEQ ID NO：44)通过搭接PCR与重链恒定区(SEQ ID NO：4)(Gene Art)连接。最终的MlyI-重链片段(其包括5’AG碱基对)然后被插入到pCR2.1 topo载体(Invitrogen)中得到pDX360。全长轻链和全长重链被从各自的topo载体中分离为MlyI和NotI片段。这些轻链和重链片段然后用4个搭接寡核苷酸——P.BiPss/UP1-EcoRI，P.BiPss/LP1，P.BiPss/LP2和P.BiP/LP2(分别为SEQ ID NO：46-49)连接到Kar2(Bip)信号序列(SEQ ID NO：45)上，然后连接到pPICZA的MlyI-NotI位点中，得到携带有Kar2-轻链的pDX344和携带有Kar2-重链的pDX468。pDX344的BglII-BamHI片段然后被亚克隆到含有用于染色体整合的AOX2启动子基因的pBK85中，得到pDX458。携带有重链的pDX468的BglII-BamHI片段然后被亚克隆到pDX458中，得到含有在AOX1启动子控制下的CD20的重链和轻链的pDX478。然后该质粒在转化到YAS309中之前用SpeI线性化，以整合到AOX2位点，转化体用Zeocin抗性选择。(参见实施例2)。

克隆JC-IgG1以在P.pastoris中表达

JC-IgG1的轻链(L)和重链(H)由鼠可变区和人恒定区组成。鼠可变轻链在SEQ ID NO：50(GenBank#AF013576)中公开，鼠可变重链在SEQ ID NO：51(GenBank#AF013577)中公开。重链和轻链序列用购自Integrated DNA Technologies(IDT)的搭接寡核苷酸合成。对于轻链，12个搭接寡核苷酸(SEQ ID NO：52-63)被购买，在PCR反应中用Extaq(Takada)退火，产生具有5’EcoRI位点和3’KpnI位点的660个碱基对的轻链。该轻链的EcoRI-Kpn1片段然后被亚克隆到pPICZA载体(Invitrogen)中。对于重链，相应于Fab片段的12个搭接寡核苷酸(SEQ ID NO：64-75)被购买，用Extaq退火，产生660个碱基对的Fab片段。Fc片段用12个搭接寡核苷酸(SEQ IDNO：76-87)合成，其在类似的搭接PCR反应中退火。重链的Fab和Fc片段然后用相应于重链Fab片段的5’末端的5’EcoRI引物(SEQ IDNO：64)和相应于Fc片段的3’末端的3’KpnI引物(SEQ ID NO：88)，用pFU Turbo聚合酶(Stratagene)退火，产生1330个碱基对的重链。使用引物中编码的5’EcoRI和3’KpnI位点，重链被克隆到pPICZa载体中。AOX2启动子序列，其起整合位点的作用，被亚克隆到最终的pPICZa载体中。接下来，含有AOX1启动子的BglII-BstBI片段和含有来自人肝脏cDNA文库的HAS序列(SEQ ID NO：89)的BstBI-BamHI片段，凝血酶位点(SEQ ID NO：90)和JC轻链均被亚克隆到该AOX2/pPICZa载体的BamHI位点处。然后另一个含有AOX1启动子的BglII-BstBI片段和含有HAS序列的BstBI-BamHI片段，凝血酶位点和JC重链被亚克隆到相同的pPICZa载体的BamHI位点处。最后的载体包括AOX2整合位点，HAS标记的JC轻链和HAS标记的JC重链，得到pJC140。该表达盒被整合到P.astoris菌株的AOX2位点，转化体用Zeocin抗性选择。(参见实施例2)。

Rituximab_/Rituxan_是购自于Biogen-IDEC/Genentech，San Francisco，CA的抗CD20鼠/人嵌合IgG1。

PCR扩增

Eppendorf Mastercycler被用于所有PCR反应中。PCR反应包含模板DNA，125μM dNTP，0.2μM每种正向和反向引物，Ex Taq聚合酶缓冲液(Takara Bio Inc.)，和Ex Taq聚合酶或pFU Turbo聚合酶缓冲液(Stratagene)和pFU Turbo聚合酶。DNA片段被扩增，30个循环，每个循环是97℃15秒，55℃15秒和72℃90秒，起始变性步骤是97℃2分钟，最后的延伸步骤是72℃7分钟。

PCR样品通过琼脂糖凝胶电泳被分离，DNA条带用Qiagen的GelExtraction Kit提取并纯化。所有DNA纯化物用10mM Tris，pH 8.0洗脱，除了最后的PCR(所有三种片段的搭接)，其用去离子水洗脱。

                       实施例2

IgG(pDX478和pJC140)载体向P.pastoris菌株YAS309中的转化

pDX478和pJC140的载体DNA通过加入乙酸钠至终浓度为0.3M而被制备。然后百分之百冰冷的乙醇被加入到DNA样品中至终浓度为70％。DNA通过离心(12000g×10分钟)并用70％冰冷的乙醇洗涤而被收集。DNA被干燥并重悬于50μl 10mM Tris，pH 8.0中。要被转化的YAS309酵母培养物(见上)通过将较少的培养物在BMGY(缓冲的最小甘油：100mM磷酸钾，pH6.0；1.34％酵母氮源；4×10^-5％生物素；1％甘油)中扩大培养至O.D.为～2-6而被制备。然后酵母细胞被制成电转化感受态，在1M山梨醇中洗涤3次，重悬于～1-2ml 1M的山梨醇中，载体DNA(1-2μg)与100μl感受态酵母混合并在冰上培育10分钟。然后酵母细胞用BTX Electrocell Manipulator 600进行电穿孔，参数是1.5kV，129ohms，和25μF。一毫升的YPDS(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％右旋糖，1M山梨醇)被加入到电穿孔的细胞中。随后转化的酵母被接种到含有zeocin的选择性琼脂平板上。

用于在P.pastoris中产生IgG1的培养条件

用pDX478或pJC140转化的YAS309的单群体被接种到50mlFalcon Centrifuge管中的10ml BMGY培养基(由1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，1.34％酵母氮源；4×10^-5％生物素；1％甘油)中。该培养物在24℃/170-190rpm摇动培养48小时直到培养物饱和。然后100ml的BMGY被加入到500ml的带挡板的烧瓶(baffled flask)中。然后种子培养物被转移到含有100ml BMGY培养基的带挡板的烧瓶中。该培养物在24℃/170-190rpm摇动培养24小时。烧瓶内物质被轻轻移入两个50ml的Falcon Centrifuge管中，3000rpm离心10分钟。细胞沉淀用20ml不含甘油的BMGY洗涤一次，然后用20ml的BMMY(用1％MeOH替换1％甘油的BMGY)轻轻重悬。该重悬的细胞被转移至250ml带挡板的烧瓶中。该培养物在24℃/170-190rpm摇动培养24小时。然后烧瓶内物质被轻轻移入两个50ml的Falcon Centrifuge管中，3000rpm离心10分钟。在蛋白质分离之前，培养物上清用ELISA分析，确定近似抗体滴度(参见实施例3)。

培养物上清中抗体的定量分析通过酶联免疫吸附检测(ELISA)进行：高结合力微量滴定板(Costar)用10ml PBS，pH 7.4的24μg山羊抗人Fab(Biocarta，Inc，San Diego，CA)包被，4℃培育过夜。除去缓冲液，加入封闭缓冲液(PBS中3％BSA)，然后室温培养1个小时。除去封闭缓冲液，将板用PBS洗涤3次。最后一次洗涤之后，加入递增体积的抗体培养物上清(0.4，0.8，1.5，3.2，6.25，12.5，25和50μl)，室温培育1小时。然后将板用PBS+0.05％Tween20洗涤。最后一次洗涤之后，加入1∶2000的PBS溶液中的抗人Fc-HRP，然后室温培育1小时。然后板用PBS-Tween20洗涤4次。板用TMB底物试剂盒进行分析，根据制造商的说明书(Pierce Biotechnology)操作。

                       实施例3

IgG1的纯化

单克隆抗体用Streamline Protein A柱从培养物上清中收集。抗体在Tris-Glycine pH 3.5中洗脱，用1M Tris pH 8.0中和。进一步的纯化用疏水相互作用色谱(HIC)进行。HIC柱的特定类型取决于抗体。对于JC-IgG和DX-IgG，苯基sepharose柱(也可以使用辛基sepharose)被使用，使用20mM Tris(7.0)，1M(NH₄)₂SO₄缓冲液，用1M到6M(NH₄)₂SO₄线性梯度缓冲液洗脱。苯基sepharose柱的抗体级分被收集并交换到50mM NaOAc/Tris pH 5.2缓冲液中，通过阳离子交换(SP Sepharose Fast Flow)柱进行最后的纯化。抗体用50mM Tris，1MNaCl(pH 7.0)进行线性梯度洗脱。

用β-半乳糖苷酶和β-N-乙酰基-氨基己糖苷酶处理JC-IgG或DX-IgG

5mg纯化的IgG(JC-IgG或DX-IgG)被缓冲交换到50mM NH₄AcpH5.0中。在硅化管中，0.3U β-N-乙酰基-氨基己糖苷酶和0.03U β-1，4-半乳糖苷酶(EMD Biosciences，La Jolla，CA)被加入到在50mM NH4AcpH5.0中的纯化的IgG中，在37℃培育16-24小时。该样品被蒸发干燥，重悬于水中，用MALDI-TOF分析。然后用前述的苯基sepharose纯化将抗体从β-N-乙酰基-氨基己糖苷酶和β-1，4-半乳糖苷酶中纯化出来。

                     实施例4

纯化IgG1的检测

纯化的JC-IgG或DX-IgG与适当体积的样品加载缓冲液混合，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，使用预制胶，根据制造商的说明书(NuPAGE双Tris电泳系统；InvitrogenCorporation，Carlsbad，Calif.)操作。凝胶蛋白质用考马斯亮蓝染料(Bio-Rad，Hercules，CA)染色。参见图2和3。

抗体浓度

蛋白质色谱级分的浓度用Bradford检测(Bradford，M.1976，Anal.Biochem.(1976)72，248-254)测定，使用清蛋白作为标准(Pierce，Rockford，IL)。

                         实施例5

IgG1碳水化合物分析

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MassSpectrometry(MALDI-TOF MS)。天冬酰胺-连接的低聚糖的MALDI-TOF分析：N-连接的聚糖通过修改的Papac et al.，Glycobiology8，445-454(1998)的方法从JC-IgG和DX-IgG释放出来。抗体样品被还原并被羧甲基化，膜被封闭，孔用水洗涤三次。IgG蛋白通过加入30μl含有1mU N-聚糖酶(EMD Biosciences，La Jolla，CA)的10mMNH₄HCO₃(pH 8.3)被去糖基化。37℃培育16小时后，含有聚糖的溶液通过离心被取出并被蒸发干燥。每个孔的干燥的聚糖溶解于15μl水中，0.5μl被点在不锈钢样品板上，与0.5μl S-DHB基质(9mg/ml二羟基苯甲酸/1mg/ml 5-甲氧基-水杨酸以1∶1在水/乙腈/0.1％三氟乙酸中)混合，干燥。通过用脉冲氮激光器(337nm)以4-ns的脉冲时间照射产生离子。该仪器在延迟提取模式(delayed extraction mode)以125-ns的延迟操作，加速电压为20kV。栅极电压为93.00％，指示线电压(guide wire voltage)为0.1％，内压力是＜5×10^-7torr(1torr＝133Pa)，低质门控(low mass gate)是875Da。谱图从100-200个激光脉冲产生，用500-MHz的数字转换器获得。(Man)₅(GlcNAc)₂低聚糖被用作外部分子量标准。所有谱图用正离子模式的仪器产生。

                         实施例6

抗原结合ELISA检测

高结合力微量滴定板(Costar)用PBS，pH 7.4中的10μg抗原包被，4℃培育过夜。除去缓冲液，加入封闭缓冲液(PBS中3％BSA)，然后室温培养1个小时。除去封闭缓冲液，将板用PBS洗涤3次。最后一次洗涤之后，加入递增体积的从0.2ng到100ng的纯化抗体，室温培育1小时。然后将板用PBS+0.05％Tween20洗涤。最后一次洗涤之后，加入1∶2000的PBS溶液中的抗人Fc-HRP，然后室温培育1小时。然后板用PBS-Tween20洗涤4次。板用TMB底物试剂盒进行分析，根据制造商的说明书(Pierce Biotechnology)操作。

Fc受体结合检测

FcγRIIb，FcγRIIIa和FcγRIIIb的Fc受体结合检测根据以前描述的实验方法(Shields et al.，2001，J.Biol.Chem，276：6591-6604)进行。对于FcγRIII结合：PBS，pH 7.4中的1μg/ml的FcγRIIIb(图5)和FcγRIIb(图7)融合蛋白或者0.8μg/ml的FcγRIIIa-LF(图6)融合蛋白被包被到ELISA板(Nalge-Nune，Naperville，IL)上，4℃48h。板用PBS中的3％牛血清清蛋白(BSA)在25℃封闭1h。JC-IgG或DX-IgG二聚复合体通过将JC-IgG或DX-IgG和HRP-结合的F(Ab’)2anti-F(Ab’)2以2∶1的摩尔量在25℃混合1h制备于含有1％BSA的PBS中。所使用的底物是3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(VectorLaboratories)。根据制造商(Vector Laboratories)的说明书读取450nm的吸收值。

B细胞中抗体反馈的ELISPOT检测

该检测如Westman，et al.，1997，Scand.J.Immunol.46：10-15所述的实施。BSA(牛血清清蛋白)首先与IgG抗体结合得到BSA-IgG复合体。分泌BSA-特异的IgG的B细胞的数量用ELISPOT检测确定。从注射的小鼠中除去脾，用0.5％正常小鼠血清在DMEM(Gibco，NewYork)中制备细胞悬液。一百微升的细胞悬液被应用于BSA-包被的微量滴定板(参见上述的ELISA实验方法)上，在37℃，5％CO2培育3.5h。板被洗涤并在4℃o.n.与50μl在PBS-Tween中以1/100稀释的碱性磷酸酶结合的绵羊抗小鼠IgG培育。样品点在室温在50μl的5溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(Sigma-Aldrich)中显影1小时，并在立体显微镜下计数。

                        实施例7

对于用血基质研究(blood matrix studv)(例如B-细胞损耗)检测的ADCC，如Vugmeyster and Howell，2004，Int.Immunopharm.4：1117-1124中所述的。不含血浆和红细胞(RBC)的全血在染色缓冲液(含有1％BSA和0.1％叠氮钠的Hank’s平衡的盐溶液))，得到染色缓冲液中的白细胞悬液。然后全血样品在1000g旋转5分钟。上清(血浆)被丢弃，沉淀用氯化铵裂解(ACL)试剂处理，洗涤，重悬于等量的染色缓冲液中。对于B-细胞损耗检测：10μl 100μg/ml的抗体溶液或染色缓冲液被加入到90μl SB基质中，37℃培育1小时。样品立刻用抗-CD19-FITC和抗-CD45-PE在25℃染色30分钟。然后样品被固定于1％甲醛中，一式三份。B-细胞损耗的定量分析通过流式细胞术进行。B-细胞损耗的流式细胞分析：装备有自动FACS Loader和Cell QuestSoftware的FACS Calibur(BD Biosciences)仪器被用于所有样品的获得和分析。Cytometer QC和设置包括运行CaliBrite珠和Sphero Tech彩虹珠(BD Biosciences)以确认仪器的功能性和探测器的线性。同种型和补偿控制对每个检测都被运行以确认仪器的设置。总淋巴细胞的B细胞的百分比由下述门控策略(gating strategy)获得。淋巴细胞群体在前向散射/侧向散射散射图上被标记以定义Region 1(R1)。用R1中的事件，显示CD19和CD45标记的荧光密度点绘制图。荧光标记的同种型控制被用于确定CD19和CD45阳性各自的截止点。％B用CellQuest测定为具有CD19-阳性，CD45-阳性表型的R1区域中的细胞的级分。每个处理组的样品都是一式三份。B细胞损耗百分比用公式平均的[100^*(1-用对照抗体处理的％B/平均的[用SB处理的％B])。 荧光染色释放ADCC检测：PBMC分离：来自健康个体或者血液捐赠者(10-20)的外周静脉血被收集到肝素化的vacutainer管(BectonDickinson Vacutainer Systems，Rutherford，NJ，USA)中。植入2个小鼠需要大约5ml的血。外周血单核细胞(PBMC)用OptiPrep根据制造商的说明书通过离心分离。PBMC用由RPMI 1640，2mM L-谷胺酰胺，100IU/ml青霉素，100g/ml链霉素(Gibco/BRL)组成并补充了20％胎牛血清的完全培养基(CM)洗涤一次，然后以1×10⁶/ml CM的浓度重悬，并转移至250ml的培养瓶(Falcon，NJ，USA)中以使单核细胞消耗。在37℃和5％CO2培育1小时以后，非贴壁细胞被除去，用培养基洗涤一次，外周血淋巴细胞(PBL)被调整至浓度为2.5×10⁷/ml CM。荧光染料-释放ADCC。ADCC检测的前提是与CD20或CD40抗原呈递靶细胞(分别是Raji细胞系或BCL1-3B3细胞)结合的抗体刺激靶细胞与效应细胞上的Fcγ受体结合。这依次促使靶细胞裂解，呈递CD20或CD40抗原，释放可以被定量检测的内部荧光染料。使用Alamar-蓝荧光取代靶细胞的⁵¹Cr标记。50μl的CD20呈递Raji细胞悬液(1×10⁴细胞)与50μl量的抗-DX-IgG或抗-JC-IgG mAb(不同浓度)，以及50μl量的如上所述分离的PBMC效应细胞(效应物与靶细胞比率可以是100∶1，50∶1，25∶1和12.5∶1)在96孔组织培养板中组合在一起，在37℃，5％CO₂培育4小时以便于Raji或BCL1-3B3细胞的裂解。加入50μl的Alamar蓝，继续再培育5小时，使得染料被吸收并代谢为荧光状态。将板在振荡器上冷却到室温，在荧光计上读取荧光值，在530nm激发，在590nm发射。相对荧光单位(RFU)相对于mAb浓度绘制，用对照抗体——例如Rituximab_从标准曲线计算样品浓度。用SevereCombined Immunodeficient(SCID)小鼠测定体内ADCC(Niwa et al.，2004，Cancer Research，64：2127-2133)。体内ADCC活性可以用从包括杂合(FcγRIIIa-LF/FcγRIIIa-LV)和杂合(FcγRIIIa-LV/FcγRIIIa-LV和FcγRIIIa-LF/FcγRIIIa-LF)基因型的健康供体移植了人外周血单核细胞(PMBC)的小鼠模型检测。用该模型系统，具有主要的N-聚糖的Ig被检测其与Rituximab_或任何其它对照抗体相比增强的ADCC活性。体内ADCC检测的详细的和充分的实验方法可以在Niwa et al.，2004，supra中找到。

                           序列表

SEQ ID NO：01(小鼠/人嵌合IgG1轻链)

caaatcgtcttgtctcaatccccagctattttgtctgcttcccctggagagaaggtcaccatgacttgtagagcctcttcctctgt

ctcttacattcactggtccagcaaaagccaggttcctctccaaagccatggatctacgctacttccaacttggcttccggtgtt

ccagttagattctctggttctggttccggtacctcctactctcttaccatctccagagttgaagccgaggacgctgctacttact

actgtcagcaatggacttctaacccaccaactttcggtggtggtaccaaattggagattaagagaactgttgctgctccatcc

gttttcattttcccaccatccgacgaacaattgaagtctggtacagcttccgttgtttgtttgttgaacaacttctacccaagaga

ggctaaggttcagtggaaggttgacaacgctttgcaatccggtaactcccaagaatccgttactgagcaggattctaaggatt

ccacttactccttgtcctccactttgactttgtccaaggctgattacgagaagcacaaggtttacgcttgtgaggttacacatca

gggtttgtcctccccagttactaagtccttcaacagaggagagtgttaa

SEQ ID NO：02(小鼠/人嵌合IgG1重链)

caagtccagttgcaacagcctggtgccgagttggtcaagccaggtgcttctgttaagatgtcctgtaaggcttctggttacact

ttcacctcctacaacatgcactgggtcaagcaaactccaggtagaggtttggagtggttggtgccatctacccaggtaacgg

tgacacttcttacaaccaaaaattcaagggaaaggctactcttaccgctgataagtcctcttccaccgcctacatgcaattgtct

tccttgacttctgaagattctgctgtttactactgtgctagatccacctactacgtgggagactggtacttcaacgtttggggtgc

tggtaccactgtcaccgtttccgctgcttctactaagggaccatccgtttttccattggctccatcctctaagtctacttccggtg

gtactgctgctttgggatgtttggttaaggactacttcccagagcctgttactgtttcttggaactccggtgctttgacttctggtg

ttcacactttcccagctgttttgcaatcttccggtttgtactccttgtcctccgttgttactgttccatcctcttccttgggtactcaga

cttacatctgtaacgttaaccacaagccatccaacactaaggttgacaagaaggctgagccaaagtcctgtgacaagacac

atacttgtccaccatgtccagctccagaattgttgggtggtccatccgttttcttgttcccaccaaagccaaaggacactttgat

gatctccagaactccagaggttacatgtgttgttgttgacgtttctcacgaggacccagaggttaagttcaactggtacgttga

cggtgttgaagttcacaacgctaagactaagccaagagaggagcagtacaactccacttacagagttgttccgttttgactg

ttttgcaccaggattggttgaacggaaaggagtacaagtgtaaggtttccaacaaggctttgccagctccaatcgaaaagac

tatctccaaggctaagggtcaaccaagagagccacaggtttacactttgccaccatccagagatgagttgactaagaacca

ggtttccttgacttgtttggttaaaggattctacccatccgacattgctgttgagtgggaatctaacggtcaaccagagaacaa

ctacaagactactccaccagttttggattctgacggttccttcttcttgtactccaagttgactgttgacaagtccagatggaaca

gggtaacgttttctcctgttccgttatgcatgaggctttgcacaaccactacactcaaaagtccttgtctttgtccccaggtaagt

aa

SEQ ID NO：03(人IgG1的轻链恒定区)

agaacttgttgctgctccatccgttttcattttcccaccatccgacgaacaattgaagtctggtacagcttccgttgtttgtttgttg

aacaacttctacccaagagaggctaaggttcagtggaaggttgacaacgctttgcaatccggtaactcccaagaatccgtta

ctgagcaggattctaaggattccacttactccttgtcctccactttgactttgtccaaggctgattacgagaagcacaaggttta

cgcttgtgaggttacacatcagggtttgtcctccccagttactaagtccttcaacagaggagagtgttaa

SEQ ID NO：04(人IgG1的重链恒定区)

tctactaagggaccatccgtttttccattggctccatcctctaagtctacttccggtggtactgctgctttgggatgtttggttaag

gactacttcccagagcctgttactgtttcttggaactccggtgctttgacttctggtgttcacactttcccagctgttttgcaatctt

ccggtttgtactccttgtcctccgttgttactgttccatcctcttccttgggtactcagacttacatctgtaacgttaaccacaagc

catccaacactaaggttgacaagaaggctgagccaaagtcctgtgacaagacacatacttgtccaccatgtccagctccag

aattgttgggtggtccatccgttttcttgttcccaccaaagccaaaggacactttgatgatctccagaactccagaggttacatg

tgttgttgttgacgtttctcacgaggacccagaggttaagttcaactggtacgttgacggtgttgaagttcacaacgctaagac

aagccaagagaggagcagtacaactccacttacagagttgtttccgttttgactgttttgcaccaggattggttgaacggaa

aggagtacaagtgtaaggtttccaacaaggctttgccagctccaatcgaaaagactatctccaaggctaagggtcaaccaa

gagagccacaggtttacactttgccaccatccagagatgagttgactaagaaccaggtttccttgacttgtttggttaaaggat

tctacccatccgacattgctgttgagtgggaatctaacggtcaaccagagaacaactacaagactactccaccagttttggat

tctgacggttccttcttcttgtactccaagttgactgttgacaagtccagatggaacagggtaacgttttctcctgttccgttatgc

atgaggctttgcacaaccactacactcaaaagtccttgtctttgtccccaggtaagtaa

SEQ ID NO：05(CD20LF1)

aggagtcgtattcaaatcgtcttgtctcaatccccagctattttg

SEQ ID NO：06(CD20LF2)

tctgcttcccctggagagaaggtcaccatgacttgtagagcctct

SEQ ID NO：07(CD20LF3)

tcctctgtctcttacattcactggttccagcaaaagccaggttcc

SEQ ID NO：08(CD20LF4)

tctccaaagccatggatctacgctacttccaacttggcttccggt

SEQ ID NO：09(CD20LF5)

gttccagttagattctctggttctggttccggtacctcctactct

SEQ ID NO：10(CD20LF6)

cttaccatctccagagttgaagccgaggacgctgctacttactac

SEQ ID NO：11(CD20LF7)

tgtcagcaatggacttctaacccaccaactttcggtggtggtacc

SEQ ID NO：12(CD20LF8)

aaattggagattaagagaactgttgctgctccatcc

SEQ ID NO：13(CD20LR1)

caacagttctcttaatctccaatttggtaccaccaccgaaagttg

SEQ ID NO：14(CD20LR2)

gtgggttagaagtccattgctgacagtagtaagtagcagcgtcct

SEQ ID NO：15(CD20LR3)

cggcttcaactctggagatggtaagagagtaggaggtaccggaac

SEQ ID NO：16(CD20LR4)

agaaccagagaatctaactggaacaccggaagccaagttggaag

SEQ ID NO：17(CD20LR5)

tagcgtagatccatggctttggagaggaacctggcttttgctgga

SEQ ID NO：18(CD20LR6)

ccagtgaatgtaagagacagaggaagaggctctacaagtcatgg

SEQ ID NO：19(CD20LR7)

tgaccttctctccaggggaagcagacaaaatagctggggattgag

SEQ ID NO：20(CD20L/up)

aggagtcgtattcaaatcgtc

SEQ ID NO：21(LfusionRTVAAPS/up)

agaactgttgctgctccatcc

SEQ ID NO：22(LfusionRTVAAPS/lp)

ggatggagcagcaacagttc

SEQ ID NO：23(CD20L/lp)

ctggtaccttaacactctcctctgttgaag

SEQ ID NO：24(CD20HF1)

aggagtcgtattcaagtccagttgcaacagcctggtgccgagttg

SEQ ID NO：25(CD20HF2)

gtcaagccaggtgcttctgttaagatgtcctgtaaggcttctggt

SEQ ID NO：26(CD20HF3)

tacactttcacctcctacaacatgcactgggtcaagcaaactcca

SEQ ID NO：27(CD20HF4)

ggtagaggtttggagtggattggtgccatctacccaggtaacggt

SEQ ID NO：28(CD20HF5)

gacacttcttacaaccaaaaattcaagggaaaggctactcttacc

SEQ ID NO：29(CD20HF6)

gctgataagtcctcttccaccgcctacatgcaattgtcttccttg

SEQ ID NO：30(CD20HF7)

acttctgaagactctgctgtttactactgtgctagatccacctac

SEQ ID NO：31(CD20HF8)

tacggtggagactggtacttcaacgtttggggtgctggtaccact

SEQ ID NO：32(CD20HF9)

gtcaccgtttccgctgcttctactaagggaccatcc

SEQ ID NO：33(CD20HR1)

tagtagaagcagcggaaacggtgacagtggtaccagcaccccaaa

SEQ ID NO：34(CD20HR2)

cgttgaagtaccagtctccaccgtagtaggtggatctagcacag

SEQ ID NO：35(CD20HR3)

agtaaacagcagagtcttcagaagtcaaggaagacaattgcatgt

SEQ ID NO：36(CD20HR4)

aggcggtggaagaggacttatcagcggtaagagtagcctttccct

SEQ ID NO：37(CD20HR5)

tgaatttttggttgtaagaagtgtcaccgttacctgggtagatgg

SEQ ID NO：38(CD20HR6)

caccaatccactccaaacctctacctggagtttgcttgacccagt

SEQ ID NO：39(CD20HR7)

gcatgttgtaggaggtgaaagtgtaaccagaagccttacaggaca

SEQ ID NO：40(CD20HR8)

tcttaacagaagcacctggcttgaccaactcggcaccaggctgtt

SEQ ID NO：41(CD20H/up)

Aggagtcgtattcaagtccag

SEQ ID NO：42(HchainASTKGPs/up)

gcttctactaagggaccatcc

SEQ ID NO：43(HchainASTKGPs/lp)

ggatggtcccttagtagaagc

SEQ ID NO：44(HFckpnl/lp)

ctggtattacttacctggggacaaagac

SEQIDNO：45(具有 EcoRI的Kar2信号序列)

gaattcgaaacgatgctgtcgttaaaaccatcttggctgactttggcggcattaatgtatgccatgctattggtcgtagtgccat

ttgctaaacctgttagagct

SEQ ID NO：46(P.BiPss/UP1-EcoRI)

aattcgaaacgatgctgtctttgaagccatcttggcttactttggctgctttgatgtacgctatgctttt

SEQ ID NO：47(P.BiPss/LP1)

ccaaagtaagccaagatggcttcaaagacagcatcgtttcg

SEQ ID NO：48(P.BiPss/UP2)

ggttgttgttccatttgctaagccagttagagct

SEQ ID NO：49(P.BiPss/LP2)

agctctaactggcttagcaaatggaacaacaaccaaaagcatagcgtacatcaaagcag

SEQ ID NO：50(GenBank#AF013576)

gatgctgttatgactcaaaacccattgtctttgcctgtttctcttggtgatgaagcttctatttcttgtagatcctctcaatctttgga

aaactctaacggtaacactttcttgaactggttctttcagaagccaggtcaatctccacaattgttgatttacagagtttctaaca

gattttctggtgttccagatagattttctggttctggttctggtactgatttcactttgaagatttctagagttgaagctgaagatttg

ggtgtttacttctgtttgcaagttactcatgttccatacacttttggtggtggtactactttggaaattaagagaactgttgctgctc

catctgtcttcatctttccaccatctgatgaacaattgaagtctggtactgcttctgttgtttgtcttcttaacaacttctacccaaga

gaagctaaggttcagtggaaggttgataacgctttgcaatctggtaactctcaagaatctgttactgaacaagattctaaggat

tctacttactctttgtcttctactttgactttgtctaaggctgattacgaaaagcataaggtttacgcttgtgaagttactcatcaag

gtttgtcttctccagttactaagtcctttaacagaggtgaatgttag

SEQ ID NO：51(GenBank#AF013577)

gatattcaattgcaacaatctggtccaggtttggttaagccatctcaatctttgtctttgacttgttctgttactggttactctattact

actaactacaactggaactggattagacaatttccaggtaacaagttggaatggatgggttacattagatacgatggtacttct

gaatacaccccatctttgaagaacagagtttctattactagagatacttctatgaaccaattcttcttgagattgacttctgttactc

cagaagatactgctacttactactgtgctagattggattactggggtcaaggtacttctgttactgtttcttctgcttctactaagg

gtccatctgtttttccacttgctccatcttctaagtctact tctggtggtactgctgctttgggttgtttggttaaggattactttccag

aaccagttactgtttcttggaactctggtgctttgacttctggtgttcatacttttccagctgttttgcaatcttctggtttgtactcttt

gtcttctgttgttactgttccatcttcttctttgggtactcaaacttacatttgtaacgttaaccataagccatctaacactaaggttg

ataagagagttgaaccaaaatcttgtgataaaactcatacatgtccaccatgtccagctcctgaacttctgggtggaccatca

gttttcttgttcccaccaaaaccaaaggatacccttatgatttctagaactcctgaagtcacatgtgttgttgttgatgtttctcatg

aagatcctgaagtcaagttcaactggtacgttgatggtgttgaagttcataatgctaagacaaagccaagagaagaacaata

caactctacttacagagttgtctctgttcttactgttctgcatcaagattggctgaatggtaaggaatacaagtgtaaggtctcca

acaaagctcttccagctccaattgagaaaaccatttccaaagctaaaggtcaaccaagagaaccacaagtttacaccttgcc

accatccagagatgaactgactaagaaccaagtctctctgacttgtctggttaaaggtttctatccatctgatattgctgttgaat

gggagtctaatggtcaaccagaaaacaactacaagactactcctcctgttctggattctgatggttccttcttcctttactctaag

cttactgttgataagtccagatggcaacaaggtaacgtcttctcatgttccgttatgcatgaagctttgcataaccattacactca

gaagtctctttccctgtctccaggtaaataa

SEQ ID NO：52mh285L-1 cggaattc-

gatgctgttatgactcaaaacccattgtctttgcctgtttctcttggtga

tgaagcttctatttcttgtag

SEQ ID NO：53mh285L-2

agaaccagttcaagaaagtgttaccgttagagttttccaaagattgagaggatctacaagaaatagaagcttcat

SEQ ID NO：54mh285L-3

actttcttgaactggttctttcagaagccaggtcaatctccacaattgttgatttacagagtttctaacagattt

SEQ ID NO：55mh285L-4

caaagtgaaatcagtaccagaaccagaaccagaaaatctatctggaacaccagaaaatctgttagaaactctgta

SEQ ID NO：56mh285L-5

tctggtactgatttcactttgaagatttctagagttgaagctgaagatttgggtgtttacttctgtttgcaagttac

SEQ ID NO：57mh285L-6

caacagttctcttaatttccaaagtagtaccaccaccaaaagtgtatggaacatgagtaacttgcaaacagaagtaa

SEQ ID NO：58mh285L-7

tggaaattaagagaactgttgctgctccatctgtcttcatctttccaccatctgatgaacaattgaagtctggta

SEQ ID NO：59mh285L-8

tgaaccttagcttctcttgggtagaagttgttaagaagacaaacaacagaagcagtaccagacttcaattgttcat

SEQ ID NO：60mh285L-9

cccaagagaagctaaggttcagtggaaggttgataacgctttgcaatctggtaactctcaagaatctgttactgaa

SEQ ID NO：61mh285L-10

ccttagacaaagtcaaagtagaagacaaagagtaagtagaatccttagaatcttgttcagtaacagattcttgaga

SEQ ID NO：62mh285L-11

ctactttgactttgtctaaggctgattacgaaaagcataaggtttacgcttgtgaagttactcatcaaggtttgtc

SEQ ID NO：63mh285L-12

ggggtaccctaacattcacctctgttaaaggacttagtaactggagaagacaaaccttgatgagtaac

SEQ ID NO：64mh285H-1

cggaattc-gatattcaattgcaacaatctggtccaggtttggttaagccatctcaatctttgtctttgacttgttctg

SEQ ID NO：65mh285H-2

ggaaattgtctaatccagttccagttgtagttagtagtaatagagtaaccagtaacagaacaagtcaaagacaaag

SEQ IDNO：66mh285H-3

aactggattagacaatttccaggtaacaagttggaatggatgggttacattagatacgatggtacttctgaatac

SEQ ID NO：67mh285H-4

attggttcatagaagtatctctagtaatagaaactctgttcttcaaagatggggtgtattcagaagtaccatcgta

SEQ ID NO：68mh285H-5

gagatacttctatgaaccaattcttcttgagattgacttctgttactccagaagatactgctacttactactgtgc

SEQ ID NO：69mh285H-6

agtagaagcagaagaaacagtaacagaagtaccttgaccccagtaatccaatctagcacagtagtaagtagcagta

SEQ ID NO：70mh285H-7

ctgtttcttctgcttctactaagggtccatctgtttttccacttgctccatcttctaagtctacttctggtggta

SEQ ID NO：71mh285H-8

gaaacagtaactggttctggaaagtaatccttaaccaaacaacccaaagcagcagtaccaccagaagtagactta

SEQ ID NO：72mh285H-9

tccagaaccagttactgtttcttggaactctggtgctttgacttctggtgttcatacttttccagctgttttgcaa

SEQ ID NO：73mh285H-10

ccaaagaagaagatggaacagtaacaacagaagacaaagagtacaaaccagaagattgcaaaacagctggaaaagt

SEQ ID NO：74mh285H-11

ctgttccatcttcttctttgggtactcaaacttacatttgtaacgttaaccataagccatctaacactaaggttga

SEQ ID NO：75mh285H-12

tgtatgagttttatcacaagattttggttcaactctcttatcaaccttagtgttagatgg

SEQ ID NO：76Fc-1

5’gctgaaccaaaatcttgtgataaaactcatacatgtccaccatgtccagctcctgaacttctgggtggaccatcagtttt 3’

SEQ ID NO：77Fc-2

5’atgtgacttcaggagttctagaaatcataagggtatcctttggttttggtgggaacaagaaaactgatggtccacccaga

3’

SEQ ID NO：78Fc-3

5’ctagaacccctgaagtcacatgtgttgttgttgatgtttctcatgaagatcctgaagtcaagttcaactggtacgttgat 3’

SEQ ID NO：79Fc-4

5’taagtagagttgtattgttcttctcttggctttgtcttagcattatgaacttcaacaccatcaacgtaccagttgaactt 3’

SEQ ID NO：80Fc-5

5’agaacaatacaactctacttacagagttgtctctgttcttactgttctgcatcaagattggctgaatggtaaggaataca 3’

SEQ ID NO：81Fc-6

5’a gctttggaaatggttttctcaattggagctggaagagctttgttggagaccttacacttgtattccttaccattcagcc 3’

SEQ ID NO：82Fc-7

5’gagaaaaccatttccaaagctaaaggtcaaccaagagaaccacaagtttacaccttgccaccatccagagatgaactga

c 3’

SEQ ID NO：83Fc-8

5’cagcaatatcagatggatagaaacctttaaccagacaagtcagagagacttggttcttagtcagttcatctctggatggt

3’

SEQ ID NO：84Fc-9

5’tctatccatctgatattgctgttgaatgggagtctaatggtcaaccagaaaacaactacaagactactcctcctgttctg 3’

SEQ ID NO：85Fc-10

5’tgccatctggacttatcaacagtaagcttagagtaaaggaagaaggaaccatcagaatccagaacaggaggagtagtct

t 3’

SEQ ID NO：86Fc-11

5’tgttgataagtccagatggcaacaaggtaacgtcttctcatgttccgttatgcatgaagctttgcataaccattacactc 3’

SEQ ID NO：87Fc-12

5’ttatttacctggagacagggaaagagacttctgagtgtaatggttatgcaaag 3’

SEQ ID NO：88Fc/LP5

5’ggggtaccttatttacctggagacagggaaagagacttct 3’

SEQ ID NO：89(人血清清蛋白，HSA)

atgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattccaggggtgtgtttcgtcgagatgcacacaagagt

gaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagt

gtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgtgttgctgatgagtcagctgaaaattg

tgacaaatcacttcataccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctgactgc

tgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgattggtgaga

ccagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacatttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagac

atccttacttttatgccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaag

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SEQ ID NO：90(凝血酶位点)

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Claims (24)

1.一种含有多个免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白含有至少一个与之相连的N-聚糖，其中所述组合物因而含有多个N-聚糖，其中主要的N-聚糖基本由Man₃GlcNAc₂组成。

2.权利要求1的组合物，其中超过50摩尔百分比的所述多个N-聚糖基本由Man₃GlcNAc₂组成。

3.权利要求1的组合物，其中超过75摩尔百分比的所述多个N-聚糖基本由Man₃GlcNAc₂组成。

4.权利要求1的组合物，其中超过90摩尔百分比的所述多个N-聚糖基本由Man₃GlcNAc₂组成。

5.权利要求1的组合物，其中所述Man₃GlcNAc₂N-聚糖以超过所述多个N-聚糖的次最主要的N-聚糖结构大约5摩尔百分比到大约50摩尔百分比的水平存在。

6.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白显示出减少的与FcγRIIb受体的结合亲和性。

7.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白显示出增加的与FcγRIII受体的结合亲和性。

8.权利要求7的组合物，其中所述FcγRIII受体是FcγRIIIa受体。

9.权利要求7的组合物，其中所述FcγRIII受体是FcγRIIIb受体。

10.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白显示出增加的抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)活性。

11.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白基本不含岩藻糖。

12.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白缺少岩藻糖。

13.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白与选自下组的抗原结合：生长因子，FGFR，EGFR，VEGF，白细胞抗原，CD20，CD33，细胞因子，TNF-α和TNF-β。

14.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白含有选自下组的Fc区域：IgG1，IgG2，IgG3和IgG4区域。

15.含有权利要求1-14任一项的组合物，和药学可接受载体的药物组合物。

16.权利要求15的药物组合物，其中所述免疫球蛋白基本不含岩藻糖。

17.权利要求15的组合物，其中所述免疫球蛋白缺少岩藻糖。

18.权利要求15的药物组合物，其中所述免疫球蛋白含有与选自下组的抗原结合的抗体：生长因子，FGFR，EGFR，VEGF，白细胞抗原，CD20，CD33，细胞因子，TNF-α和TNF-β。

19.权利要求15的药物组合物，其中所述免疫球蛋白含有选自下组的Fc区域：IgG1，IgG2，IgG3和IgG4区域。

20.含有权利要求1的组合物的试剂盒。

21.含有编码免疫球蛋白或其片段的外源基因的真核宿主细胞，所述真核宿主细胞被工程化或被选择以表达所述免疫球蛋白或其片段，由此产生含有多个免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白含有至少一个与之相连的N-聚糖，其中所述组合物因而含有多个N-聚糖，其中主要的N-聚糖基本由Man₃GlcNAc₂组成。

22.权利要求21的宿主细胞，其中所述宿主细胞是低等真核宿主细胞。

23.在真核宿主中产生含有多个免疫球蛋白的组合物的方法，每个免疫球蛋白含有至少一个N-聚糖，其中所述组合物因而含有多个N-聚糖，其中主要的N-聚糖基本由Man₃GlcNAc₂组成。

24.权利要求23的方法，其中所述宿主细胞是低等真核宿主细胞。

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