CN107771183A - 抗‑人‑her3抗体及其用途 - Google Patents

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C·拉鲍雷
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J-M·巴雷
S·德戈夫
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Universite de Montpellier I
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Gama Mar Buss Pharmaceutical Co
Universite de Montpellier I
Institut Regional du Cancer de Montpellier
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Abstract

本公开涉及神经调节蛋白非竞争性变构抗‑人‑HER3抗体，其具有人恒定区；且少于65％的由抗体的糖基化位点携带的聚糖结构包含岩藻糖分子。该抗体特征在于其可变序列。

Description

抗-人-HER3抗体及其用途
技术领域
本发明涉及嵌合低岩藻糖神经调节蛋白(NRG)-非竞争性变构抗-人-HER3抗体及其在治疗方法中的用途。
背景技术
受体酪氨酸激酶(RTK)的人表皮生长因子受体ErbB/HER家族包括四个成员：EGFR(ErbB1/HER1)、HER2(c-Neu,HER2)、HER3(ErbB3/HER3)和HER4(ErbB4/HER4)。HER受体包含由标记为1-4的四个结构域组成的细胞外糖基化结构域，接着跨膜结构域和包含用于与信号传导途径偶联的激酶结构域的细胞内C-末端部分。除了HER3外，细胞内区域包含酪氨酸激酶活性。信号传导通过配体诱导的受体二聚化和随后的磷酸化(这导致胞质信号传导途径的激活)介导。HER2没有特异性的配体，因为它天然处于“活性”构象中。其它HER受体作为非活性的单体存在，其分子以防止二聚化的方式折叠。配体结合于结构域1和3诱导主要构象改变，其最终暴露受体的结构域2中的二聚化环。二聚化环的这种暴露允许受体二聚化。
首次描述于1990年的HER3受体是显示低激酶活性的唯一HER家族成员受体，且下游信号传导通过异二聚化实现。因此，作为单体的HER3受体称为“非自身的”且不能形成同二聚体。配体神经调节蛋白(NRG)与HER3受体的结合触发HER3与其它HER家族受体(优先HER2)的异二聚化。在异二聚体内，HER3激酶结构域作为其HER家族伴体的变构激活剂发挥作用。
HER3参与各种癌症的肿瘤发生，包括乳腺癌和卵巢癌(Lee-Hoeflich ST,CancerRes.2008；McIntyre E,Breast Cancer Res Treat.2010；Tanner B,J Clin Oncol.2006)。HER3表达在恶性黑素瘤和转移瘤(metastase)中与肿瘤进展和降低的患者存活相关联，且与卵巢癌中降低的存活相关。重要的是，在乳腺癌中，具有低HER2表达的肿瘤(其不适合于赫塞汀治疗)通常“编程”为强表达HER3(Smith等，Br.J.Cancer 2004)，且HER2+++肿瘤(其在长期治疗后变成对赫塞汀是抗性的)被“重编程”为强表达HER3(Narayan,CancerRes.2009)。西妥昔单抗抗性也与肺癌(Wheeler,Oncogene 2008)和结肠直肠癌(Lu CancerRes 2007)中的HER3过表达以及EGFR内化/降解的失调相关。最近，HER3过表达与结肠直肠癌中恶化的无转移存活显著相关(Ho-Pun-Cheung,Int J Cancer 2010)。因此，HER3过表达和通过PI3K/AKT途径的激活的补偿信号传导牵涉到对HER-靶向治疗(抗体和TKI)的抗性的发生(Wheeler 2008,Lu 2007,Narayan,2009,Sergina,2007)，但也涉及到对IGFR-靶向治疗(Desbois-Mouthon,Clin Cancer Res 2009)和化疗剂的治疗(Kruser,Exp Cell Res2010)的抗性发生。
所有这些发现表明HER3-靶向剂且特别地抗体可能有助于进一步理解HER3信号传导在癌症中的作用和特别地用作有效的免疫治疗剂。
许多治疗性抗体(早已商业化的或未商业化的)已经在治疗肿瘤学中针对HER3开发。
例如，两种人抗体由Merrimack Pharmaceuticals/Sanofi Aventis(MM-121抗体；PCT WO2008/100624)和U3PharmaAG/Daiichi Sankyo/Amgen(U3-1287或AMG-888；PCTWO2007/077028)提出。一种HER2/HER3双特异性抗体MM-111(Merrimack Pharmaceuticals；PCT WO2005/117973,WO2006/091209)单独地或者与曲妥珠单抗或拉帕替尼组合参与到HER2-扩增的乳腺癌的I/II期临床试验中。
所有这些抗体阻断HER3受体的人表皮生长因子受体调节蛋白(heregulin)-结合位点，因此减少对配体成瘾肿瘤(ligand-addicted tumor)的这些抗体治疗。
但是，为了回避对于抗性的HER2-扩增乳腺癌中的靶向治疗或化疗的抗性和扩展靶向治疗的应用领域至HER2low乳腺癌(其目前不适用于这种治疗)，或者为了治疗三阴性乳腺癌(其表达HER3且还没有用于三阴性乳腺癌的靶向治疗)，研究了用非针对HER3的人表皮生长因子受体调节蛋白-结合位点的抗体靶向于HER3。
多种NRG-竞争性和非NRG-竞争性抗-人HER3抗体在本领域中公开(Lazrek等,Neoplasia March 2013；Vol.15；N°3,pp.335-347)。Lazrek等(2013)公开了涉及未知结构的各种抗-HER3抗体(其分别称为H3A-122、H4B-25、H4B-121、9F7-F11、11G10-D2、12H8-B11、14H1-H8、15D4-F2和16D3-C1)的分析。作为例证的，Lazrek等(2013)公开了称为9F7-F11的鼠抗-人HER3抗体，该抗体显示为非NRG-竞争性的。
此外，Lazrek等(2013)已经证明体外存在与HER3结合的9F7-F11的NRG-依赖性的增加。
NRG借以提高9F7-F11与其表位的结合的机制仍未被发现。但是，非局限于理论，可以假定NRG与其受体的结合导致HER3结构的构象改变，从而导致9F7-F11的表位的更好的可达性和/或表位的结构变化，其提供与9F7-F11的更好亲和力。
但是，尽管在HER3的配体神经调节蛋白的存在下具有9F7-F11与HER3结合的体外增加，9F7-F11如与NRG-竞争性抗体相比的不产生针对NRG-表达肿瘤组织的提高的体内抗肿瘤活性(Lazrek等,2013)。
Lazrek等(2013)的结果证明相同程度的抗肿瘤效果用他们已经测定的大多数抗体获得，无论它们识别的HER3结构域的身份，且因此也无论是否这些抗体由非NRG-竞争性抗-HER3抗体或相反地由NRG-竞争性抗-HER3抗体组成，如例如分别对于9F7-F11抗体和16D3-C1抗体的情况。这些作者得出结论，所有这些抗-HER3抗体表现为全部通过单一作用机制发挥作用，即抑制NRG-诱导的HER3的磷酸化，其最终影响HER2/HER3异二聚体形成。
本领域中仍然需要获得目的在于治疗HER3阳性癌症的抗-HER3抗体，包括具有针对NRG-成瘾肿瘤的高抗-肿瘤活性的抗-HER3抗体。
发明内容
本发明公开了包含选自以下的至少一个CDR的抗-人HER3抗体：
-具有与如SEQ ID NO:2所示的序列的至少90％或95％同一性的H-CDR1；
-具有与如SEQ ID NO:3所示的序列的至少90％或95％同一性的H-CDR2；
-具有与如SEQ ID NO:4所示的序列的至少90％或95％同一性的H-CDR3；
-具有与如SEQ ID NO:6所示的序列的至少90％或95％同一性的L-CDR1；
-具有与如SEQ ID NO:7所示的序列的至少90％或95％同一性的L-CDR2；和
-具有与如SEQ ID NO:8所示的序列的至少90％或95％同一性的L-CDR3；
所述抗体具有人恒定区；且
少于65％的由所述抗体的糖基化位点携带的聚糖结构包含岩藻糖分子。
特别地，本发明公开了神经调节蛋白非竞争性变构抗-人HER3抗体，其包含选自以下的至少一个CDR：
-具有如SEQ ID NO:2所示的序列的H-CDR1；
-具有如SEQ ID NO:3所示的序列的H-CDR2；
-具有如SEQ ID NO:4所示的序列的H-CDR3；
-具有如SEQ ID NO:6所示的序列的L-CDR1；
-具有如SEQ ID NO:7所示的序列的L-CDR2；和
-具有如SEQ ID NO:8所示的序列的L-CDR3；
所述抗体具有人恒定区；且
少于65％的由所述抗体的糖基化位点携带的聚糖结构包含岩藻糖分子。
本发明还公开了神经调节蛋白非竞争性变构抗-人HER3抗体，其包含：
(a)重链，其中可变域包含：
具有与如SEQ ID NO:2所示的序列的至少90％或95％同一性的H-CDR1；
具有与如SEQ ID NO:3所示的序列的至少90％或95％同一性的H-CDR2；和
具有与如SEQ ID NO:4所示的序列的至少90％或95％同一性的H-CDR3；
及
(b)轻链，其中可变域至少包含具有选自以下的序列的CDR：
作为L-CDR1的具有与如SEQ ID NO:6所示的序列的至少90％或95％同一性的序列；
作为L-CDR2的具有与如SEQ ID NO:7所示的序列的至少90％或95％同一性的序列；和
作为L-CDR3的具有与如SEQ ID NO:8所示的序列的至少90％或95％同一性的序列；
所述抗体具有人恒定区；且
少于65％的由所述抗体的糖基化位点携带的聚糖结构包含岩藻糖分子。
因此本发明的第一目的是神经调节蛋白非竞争性变构抗-人HER3抗体，其包含：
(a)重链，其中可变域包含：
具有如SEQ ID NO:2所示的序列的H-CDR1；
具有如SEQ ID NO:3所示的序列的H-CDR2；和
具有如SEQ ID NO:4所示的序列的H-CDR3；
及
(b)轻链，其中可变域至少包含选自以下的CDR：
具有如SEQ ID NO:6所示的序列的L-CDR1；
具有如SEQ ID NO:7所示的序列的L-CDR2；和
具有如SEQ ID NO:8所示的序列的L-CDR3；
所述抗体具有人恒定区；且
少于65％的由所述抗体的糖基化位点携带的聚糖结构包含岩藻糖分子。
根据一种实施方式，本发明的抗体包含轻链可变区，其包含作为L-CDR1的具有与如SEQ ID NO:6所示的序列的至少90％或95％同一性的序列、作为L-CDR2的具有与如SEQID NO:7所示的序列的至少90％或95％同一性的序列和作为L-CDR3的具有与如SEQ ID NO:8所示的序列的至少90％或95％同一性的序列。
特别地，本发明的抗体包含轻链可变区，其包含具有如SEQ ID NO:6所示的序列的L-CDR1、具有如SEQ ID NO:7所示的序列的L-CDR2和具有如SEQ ID NO:8所示的序列的L-CDR3。
根据进一步的实施方式，本发明的抗体的重链可变区的序列具有与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的至少90％或95％同一性，和/或轻链可变区的序列具有与如SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列的至少90％或95％同一性。
特别地，具有与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的至少90％或95％同一性的序列的本发明抗体的重链可变区具有：
具有如SEQ ID NO:2所示的序列的H-CDR1；
具有如SEQ ID NO:3所示的序列的H-CDR2；和
具有如SEQ ID NO:4所示的序列的H-CDR3。
特别地，具有与如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的至少90％或95％同一性的序列的轻链可变区具有：
具有如SEQ ID NO:6所示的序列的L-CDR1；
具有如SEQ ID NO:7所示的序列的L-CDR2；和
具有如SEQ ID NO:8所示的序列的L-CDR3。
优选地，所述抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和/或轻链可变区具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。更优选地，所述抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和轻链可变区具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
根据另一种实施方式，本发明抗体的重链的氨基酸序列具有与如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的至少90％或95％同一性，和/或所述抗体的轻链的氨基酸序列具有与如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的至少90％或95％同一性。
优选地，所述抗体的重链具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列和/或所述抗体的轻链具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。更优选地，所述抗体的重链具有如SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列和所述抗体的轻链具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
根据进一步的实施方式，根据本发明的抗体使得少于50％，优选少于40％，更优选少于30％，特别地少于20％的由所述抗体的糖基化位点携带的聚糖结构包含岩藻糖分子。
根据特定的实施方式，本发明的抗体是嵌合抗体，优选嵌合小鼠/人抗体，且优选人源化抗体。
本发明的第二目的涉及编码至少根据本发明的单克隆抗体的重链或轻链，优选编码本发明的抗体的核酸序列。
本发明的第三目的涉及包含根据本发明的核酸的载体。
本发明的第四目的涉及包含根据本发明的核酸或根据本发明的载体的宿主细胞。
本发明的第五目的涉及包含至少根据本发明的抗体及药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明的第六目的涉及包含与治疗剂连接的本发明的抗体的免疫偶联物。
本发明的第七目的涉及包含至少根据本发明的免疫偶联物及药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明的第八目的涉及根据本发明的抗体和/或根据本发明的免疫偶联物，其用作药物。
本发明的第九目的涉及根据本发明的抗体和/或免疫偶联物，其用于治疗受试者中与HER3的表达相关的癌症的用途，在该与HER3的表达相关的癌症中存在神经调节蛋白，特别地神经调节蛋白1β。
本发明的第十目的涉及根据本发明的抗体和/或免疫偶联物，其用于抑制受试者中其中存在神经调节蛋白，特别地神经调节蛋白1β的与HER3的表达相关的肿瘤细胞生长的用途。
根据一种实施方式，所存在的神经调节蛋白由肿瘤和/或肿瘤周围的组织和/或器官分泌。在特定的实施方式中，肿瘤是神经调节蛋白-依赖性的(neuregulin-dependant)，特别地神经调节蛋白1β-依赖性的。
为了根据本发明确定NRG和例如NRG1α或NRG1β是否存在，可以应用如Gilmour等December 2002,Vol.8,pp.3933-3942中所述的公知的免疫组织化学方法。
根据另一种实施方式，神经调节蛋白和特别地神经调节蛋白1β由于其在抗体和/或免疫偶联物之前、之后或与其同时施用于受试者而存在。
在特定的实施方式中，本发明中考虑的与HER3的表达相关的癌症或肿瘤细胞选自鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、神经胶质细胞瘤如成胶质细胞瘤和神经纤维瘤病、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾脏癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和头颈癌。
它们优选选自乳腺癌、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、胰腺癌和结肠直肠癌，且更特别地选自乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌。
附图说明
图1显示，为了表征本发明的GMB301对HER3的亲和力，通过ELISA分析获得的GMB301的剂量-效应曲线。ELISA分析如实施例2中所述进行。X-坐标：GMB301的浓度。Y-坐标：OD 450nm下的吸光度。
图2显示注射胰腺癌细胞HPAC的无胸腺的6-8周龄雌性BALB/c裸鼠(EGFR高,HER2/3低,PTEN/PIK3CA wt,NRG阴性和KRAS/BRAF-突变的，NRG1β-依赖性的)用GMB301、9F7-F11或PBS(对照)进行处理的体内效应。15mg/kg一周两次注射，连续四周(Q3D-4W)。肿瘤体积在纵坐标中显示并通过公式D1xD2xD3/2计算。
图3显示注射胰腺癌细胞BxPC3的无胸腺6-8周龄雌性BALB/c裸鼠(EGFR高,HER2/3低,KRAS/BRAF/PTEN/PIK3CA wt,NRG阳性，NRG1β-依赖性的)用GMB301、9F7-F11或PBS(对照)进行处理的体内效应。15mg/kg一周两次注射，连续四周(Q3D-4W)。肿瘤体积在纵坐标中显示并通过公式D1xD2xD3/2计算。
图4显示GMB301、抗体H4B 121的emabling形式或无关抗体(Px)(1μg/ml)的处理对于在100ng/ml的NRG1存在下MDA-MB453乳腺癌细胞以及效应外周血单核细胞(T:E比率1:15)的细胞裂解(ADCC)的影响。
横坐标：所使用的抗体的性质。纵坐标：靶向的肿瘤细胞的特异性裂解的％。
图5显示抗体H4B-121-emb和GMB301与HER3结合的％随所述抗体的浓度的变化。两种抗体的对应EC50也以nM显示。
横坐标：抗体的浓度(M)。纵坐标：与HER3结合的％。
图6显示GMB301、抗体H4B 121的emabling形式(H4B-121-emb)或媒介物(NaCl-阴性对照)的处理随时间对3种不同类型的NRG1-成瘾肿瘤的肿瘤体积的效应(左图)(图5A：NRG1-成瘾的胰腺BxPC3(3x106)；图5B：三阴性乳腺癌HCC-1806(1x106)；和图5C：肺A549癌细胞)。
在右图上，按照处理天数的相应增益对于应用于同样的不同癌症类型的相同处理来表示。
肿瘤生长数据(左图)显示为随时间(天)变化的各组裸鼠的平均肿瘤体积(mm3)+/-S.E.M。灰色区带对应于处理的时间。Kaplan-Meier存活曲线在肿瘤达到1500或2000mm3的体积时计算且小鼠被处死。
益处(处理vs对照组的以天数计的增益)(右图)显示在Kaplan-Meier曲线上。
左图：横坐标：肿瘤体积(mm3)，和纵坐标：移植后天数。
右图：横坐标：％肿瘤<1500mm3，和纵坐标：移植后天数。
具体实施方式
本发明人已经产生了嵌合低岩藻糖抗-人HER3抗体，称为GMB301，其包含之前由Lazrek等(2013)测定的小鼠抗体9F7-F11的互补决定区(CDR)，该GMB301抗体作为抗癌剂具有出人意料的性能。
本发明人已经证明，具有Lazrek等(2013)使用的9F7-F11抗体的CDR且具有低岩藻糖含量的嵌合抗体具有提高的体内抗肿瘤活性，特别是对抗NRG-表达肿瘤。
因此，本发明人出人意料地发现，具有特定的糖基化模式和更准确地具有低岩藻糖含量以及人恒定域的抗体可以作为抗癌剂的性能与具有相同CDR和较高岩藻糖含量的亲本小鼠抗体不同。
令人惊异地，本发明人已经证明，本文中描述的低岩藻糖抗体具有特定的肿瘤靶向活性，如与具有相同CDR、小鼠恒定域和较高岩藻糖含量的亲本抗体相比的。
本发明人获得的结果完全是更令人惊异的，因为与可能预期的相反，具有9F7-F11抗体的CDR、人恒定域和具有低岩藻糖含量的所述抗体在NRG不存在的情况下不表现出针对肿瘤的提高的抗肿瘤活性。
因此，本发明人出人意料地发现，本文中描述的低岩藻糖嵌合抗-HER3抗体的提高的体内抗肿瘤活性看起来不是通过增强的ADCC或ADCP性能介导的，而是相反通过未知和未预见到的机制介导。
在本文中描述的具有低岩藻糖含量的抗-HER3嵌合抗体在神经调节蛋白的存在下具有特异性地针对表达HER3的肿瘤群体的改善的抗肿瘤活性，其包括特异性地针对表达HER3和神经调节蛋白(自回分泌)两者，或其可以通过由来自微环境的非肿瘤细胞经由旁分泌途径分泌的神经调节蛋白刺激的肿瘤群体的改善的抗肿瘤活性。
本发明人已经发现，如本文的实施例中公开的且与所有预期相反：
(i)在GMB301处理的肿瘤中不存在神经调节蛋白的情况下，所述抗体抗肿瘤生长的活性与9F7-F11相似；和
(ii)在所考虑的肿瘤的位点处神经调节蛋白的存在下选择性地，GMB301的抗肿瘤活性显著高于9F7-F11的抗肿瘤活性。
本领域技术人员从已知抗体的低岩藻糖(emabling)形式预期比野生型抗体更高效地发挥作用。但是，在本发明的情况中并不是这样的，如通过本发明的实施例中证明的。
由此，本文中描述的抗-HER3嵌合低岩藻糖抗体提供了优于现有技术中描述的抗-HER3抗体的以下优势：
-其更有效地针对自分泌或旁分泌配体-依赖性肿瘤(由于其变构效应)；
-当发生由HER3配体的上调介导的抗性时，其是更有效的；
-其可用于治疗其中现有的治疗性抗体是临床无效的病症，如对抗三阴性乳腺癌、胰腺癌和其它特定癌症(ex:肾细胞癌)。
定义
术语“神经调节蛋白”具有本领域中的一般含义且经常与术语“人表皮生长因子受体调节蛋白”互换地使用。人表皮生长因子受体调节蛋白家族包括α、β和γ人表皮生长因子受体调节蛋白(Holmes等,Science,256:1205-1210(1992)；美国专利No.5,641,869；和Schaefer等,Oncogene 15:1385-1394(1997))；neu分化因子(NDF)、胶质细胞生长因子(GGF)；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)；和感觉与运动神经元衍生因子(SMDF)。对于综述，参见Groenen等,Growth Factors11:235-257(1994)；Lemke,G.Molec.&Cell.Neurosci.7:247-262(1996)和Lee等,Pharm.Rev.47:51-85(1995)；Falls and D.(2003).“Neuregulins:functions,forms,and signaling strategies.”Experimental CellResearch 284(1):14-30。
术语“HER3”是指如Plowman等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:4905-4909(1990)中描述的人HER3受体；也参见Kani等,Biochemistry44:15842-857(2005),Cho和Leahy,Science 297:1330-1333(2002))。HER3也称为“HER3”。
术语“抗-人-HER3抗体”是指针对人HER3的抗体。
根据本发明，“抗体”或“免疫球蛋白”具有相同的含义，并且在本发明中等同地使用。如本文所使用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性地结合抗原的抗原结合位点的分子。因此，术语抗体不仅涵盖完整抗体分子，而且涵盖抗体的变体(包括衍生物)。在天然抗体中，两条重链通过二硫键彼此连接，并且每条重链通过二硫键与轻链连接。存在两种类型的轻链，λ(l)和κ(k)。存在五种主要的重链类别(或同种型)，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条链含有独特的序列结构域。轻链包括两个结构域，可变域(VL)和恒定域(CL)。重链包括四个结构域，可变域(VH)和三个恒定域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)两者的可变区决定对抗原的结合识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区结构域赋予重要的生物学性质，诸如抗体链缔合、分泌、跨胎盘移动性、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-端部分，并且由一条轻链和一条重链的可变部分构成。抗体的特异性存在于抗体组合位点与抗原决定簇之间的结构互补性。抗体组合位点由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基构成。有时，来自非高变区或框架区(FR)的残基影响总体结构域结构，并因此影响组合位点。互补决定区或CDR是指一起限定天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别命名为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此，抗原结合位点包括六个CDR，包含来自重链和轻链V区域各自的CDR组。框架区(FR)是指插置在CDR之间的氨基酸序列。
术语“嵌合抗体”是指包含源自一个物种的抗体的VH结构域和VL结构域以及源自另一个物种的恒定域的抗体，例如其中可变区序列源自小鼠抗体和恒定区序列源自人抗体的抗体。
根据本发明，术语“人源化抗体”是指具有来自人抗体的可变区框架和恒定区，但保留本发明的抗体的小鼠CDR的抗体。
本文中使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物表现出单一结合特异性和对于特定表位的亲和力。
术语“治疗”或“疗法”是指以治愈、愈合、减轻、缓和、改变、补救、缓解、改善或影响病症(例如，疾病)、病症的症状，或者防止或延迟疾病的症状、并发症、生物化学指标的发作，或者以统计学显著的方式另外地阻止或抑制疾病、病症或障碍的进一步发展的目的而施用活性剂。
根据本发明，术语“患者”或“需要的患者”意指受到或很可能受到与人HER3的表达相关的癌症影响的人或非人哺乳动物。
本发明的抗体的“治疗有效量”意思是以适用于任何医学治疗的合理利益/风险比治疗所述癌症的抗体的足够量。但是，应当理解本发明的抗体和组合物的每日总使用量由负责医生在合理医学判断的范围内决定。对于任何特定患者的具体治疗有效剂量水平取决于多种因素，包括所治疗的障碍和障碍的严重性；所使用的具体抗体的活性；所使用的具体组合物，患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用的时间、施用途径和所使用的具体抗体的排泄率；治疗的持续时间；与所使用的具体抗体组合或同时使用的药物；及医学领域中公知的类似因素。例如，本领域中公知以低于获得所需治疗效果所需的剂量的水平开始化合物的剂量并逐渐增加剂量直到实现所需的效果。
如本文中使用的，两个氨基酸序列之间的百分同一性可以采用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:1 1-17,1988)的算法(其已经并入ALIGN程序(版本2.0)中)使用PAM120权重残差表、12的空位长度罚分和4的空位罚分确定。另外，两个氨基酸序列之间的百分同一性可以采用Needleman和Wunsch(J.MoI,Biol.48:444-453,1970)算法(其已经并入GCG软件包(在http://www.gcg.com可得)的GAP程序中)使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重确定。
本发明的抗体
本发明提供了神经调节蛋白(NRG)-非竞争性变构抗-HER3抗体，优选纯化的形式或分离的形式。
因此，本发明涉及抗-人-HER3抗体，包含：
(a)重链，其中可变域包含：
-具有如SEQ ID NO:2所示的序列的H-CDR1；
-具有如SEQ ID NO:3所示的序列的H-CDR2；和
-具有如SEQ ID NO:4所示的序列的H-CDR3；
和
(b)轻链，其中可变域至少包含具有选自以下的序列的CDR：作为L-CDR1的SEQ IDNO:6，作为L-CDR2的SEQ ID NO:7和作为L-CDR3的SEQ ID NO:8；
所述抗体具有人恒定区；且
少于65％的由所述抗体的糖基化位点携带的聚糖结构包含岩藻糖分子。
本申请中的目标序列显示在以下表1中：
表1：mAb GMB301的VH、VL、CDR及全重链和轻链的氨基酸序列
根据一种实施方式，本发明的抗体包含含有作为L-CDR1的SEQ ID NO:6，作为L-CDR2的SEQ ID NO:7和作为L-CDR3的SEQ ID NO:8的轻链可变区。
根据进一步的实施方式，本发明抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，和/或轻链可变区具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。优选地，所述抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和轻链可变区具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
根据另一种实施方式，本发明抗体的重链具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列和/或所述抗体的轻链具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。优选地，所述抗体的重链具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列和所述抗体的轻链具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
根据进一步的实施方式，根据本发明的抗体使得少于50％，优选少于40％，更优选少于30％，特别地少于20％的由所述抗体的糖基化位点携带的聚糖结构包含岩藻糖分子。
根据特定的实施方式，本发明的抗体是嵌合抗体，优选嵌合小鼠/人抗体，特别地人源化抗体。
产生本发明的抗体的方法
本发明的抗人HER3抗体可以通过本领域中已知的任何技术来产生，所述技术诸如但不限于单独或组合的任何化学、生物学、遗传学或酶学技术。
在了解所需序列的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以通过用于产生多肽的标准技术容易地产生所述抗体。例如，可以使用众所周知的固相方法，优选地使用可商购的肽合成装置(诸如由Applied Biosystems,Foster City,California制造的装置)并遵循制造商的说明来合成它们。或者，本发明的抗体可以通过本领域众所周知的重组DNA技术来合成。例如，抗体可以在将编码抗体的DNA序列并入表达载体中并将这种载体引入表达所需抗体的合适的真核或原核宿主中之后，作为DNA表达产物来获得，随后可以使用众所周知的技术从所述宿主分离抗体。
核酸序列
因此，本发明的进一步目的涉及编码本发明的抗体的核酸序列。
通常，所述核酸是DNA或RNA分子，其可以包括于任何合适的载体诸如质粒、黏粒、附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体中。
载体
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指可以借以将DNA或RNA序列(例如外来基因)引入宿主细胞中以便转化宿主并促进引入序列的表达(例如转录和翻译)的媒介物。
因此，本发明的进一步目的涉及包含本发明的核酸的载体。
这类载体可以包含调控元件诸如启动子、增强子、终止子等，以在施用于受试者后引起或指导所述抗体的表达。在用于动物细胞的表达载体中使用的启动子和增强子的实例包括SV40的早期启动子和增强子(Mizukami T.等,1987)、Moloney小鼠白血病病毒的LTR启动子和增强子(Kuwana Y等,1987)、免疫球蛋白H链的启动子(Mason JO等,1985)和增强子(Gillies SD等,1983)等。
可以使用用于动物细胞的任何表达载体，只要可以插入并表达编码人抗体C区域的基因。合适的载体的实例包括pAGE107(Miyaji H等,1990)、pAGE103(Mizukami T等,1987)、pHSG274(Brady G等,1984)、pKCR(O'Hare K等,1981)、pSG1 beta d2-4-(Miyaji H等,1990)等。
质粒的其它实例包括包含复制起点的复制型质粒或整合型质粒，诸如例如pUC、pcDNA、pBR等。
病毒载体的其它实例包括腺病毒、反转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。这类重组病毒可以通过本领域已知的技术来产生，诸如通过转染包装细胞或通过用辅助质粒或病毒瞬时转染。病毒包装细胞的典型实例包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、293细胞等。产生这类复制缺陷型重组病毒的详细方案可以在例如WO 95/14785、WO 96/22378、US 5,882,877、US 6,013,516、US 4,861,719、US5,278,056和WO 94/19478中找到。
宿主细胞
本发明的进一步目的涉及已经用本发明的核酸和/或载体转染、感染或转化的宿主细胞。
术语“转化”意指将“外来”(即外部或细胞外的)基因、DNA或RNA序列引入宿主细胞中，以便宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生所需物质，通常为引入的基因或序列编码的蛋白或酶。接受并表达引入的DNA或RNA的宿主细胞已经被“转化”。
本发明的核酸可用于在合适的表达系统中产生本发明的抗体。术语“表达系统”意指在合适条件下的宿主细胞和相容载体，例如用于由载体携带并引入宿主细胞的外来DNA编码的蛋白质的表达。
常用表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体，昆虫宿主细胞和杆状病毒载体，以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其它实例包括但不限于原核细胞(诸如细菌)和真核细胞(诸如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体实例包括大肠杆菌、克鲁维酵母属或酵母属酵母、哺乳动物细胞系(例如Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞等)以及原代或建立的哺乳动物细胞培养物(例如由成淋巴细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生的)。实例还包括小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCCCRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、二氢叶酸还原酶基因(在下文中称为“DHFR基因”)缺陷的CHO细胞(Urlaub G等，1980)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCCCRL1662，在下文中称为“YB2/0细胞”)等。
嵌合抗体
在特定的实施方式中，本发明的人嵌合抗体可以通过如下产生：获得如前所述编码VL和VH结构域的核酸序列，通过将它们插入具有编码人抗体CH和人抗体CL的基因的用于动物细胞的表达载体中来构建人嵌合抗体表达载体，并通过将所述表达载体引入动物细胞中来表达所述编码序列。
作为人嵌合抗体的CH结构域，它可以是属于人免疫球蛋白的任何区域，但IgG类的那些区域是合适的，并且也可以使用属于IgG类的任一亚类，诸如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。此外，作为人嵌合抗体的CL，它可以是属于Ig的任何区域，并且可以使用κ类或λ类的那些区域。
用于产生嵌合抗体的方法涉及本领域中众所周知的常规重组DNA和基因转染技术(参见Morrison SL.等，(1984)和专利文献US5,202,238；和US5,204,244)。
根据优选的实施方式，本发明的抗体是人源化的。
功能保守性的变体
本发明的进一步目的还涵盖本发明的抗体的功能保守性变体。
“功能保守性变体”是其中在不改变多肽的总体构象和功能的情况下改变蛋白质或酶中的给定氨基酸残基的那些变体，包括但不限于将氨基酸用具有相似性质(例如极性、氢键形成潜力、酸性、碱性、疏水性、芳香性等)的氨基酸替代。在蛋白质中除了被指明为保守的那些之外的氨基酸可以不同，以使得功能相似的任何两个蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似性的百分数可以变化，并且当根据比对方案例如通过其中相似性基于MEGALIGN算法的Cluster方法进行测定时，可以为例如70％至99％。“功能保守性变体”还包括当通过BLAST或FASTA算法确定时具有至少60％、优选地至少75％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、甚至更优选地至少95％的氨基酸同一性，并且具有与进行比较的天然或亲本蛋白质相同或基本上相似的性质或功能的多肽。
当在较短序列的整个长度上超过80％、优选地超过85％、优选地超过90％的氨基酸相同，或者超过约90％、优选地超过95％的氨基酸相似(功能上相同)时，两个氨基酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。优选地，通过使用例如GCG(Genetics ComputerGroup，GCG软件包程序手册，第7版，Madison，Wisconsin)堆积(pileup)程序或任何序列比较算法诸如BLAST、FASTA等的比对来鉴定相似或同源的序列。
例如，蛋白质结构中的某些氨基酸可以被其它氨基酸置换而没有可察觉的活性丧失。由于蛋白质的相互作用能力和特性限定蛋白质的生物学功能活性，因此可以在蛋白质序列中以及当然在其DNA编码序列中做出某些氨基酸置换，同时仍获得具有类似性质的蛋白质。因此，预期可以在本发明的抗体序列或编码所述抗体的相应DNA序列中做出各种改变而没有可察觉的其生物活性的丧失。
在本领域中已知，某些氨基酸可以被具有相似亲水性指数(hydropathic index)或得分的其它氨基酸置换并仍产生具有相似生物活性的蛋白质，即仍然获得生物学功能等同的蛋白质。
因此，正如上面所概括的，氨基酸置换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。将各种上述特性考虑在内的示例性置换对于本领域技术人员是众所周知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
糖基化
本发明抗体的糖基化就其岩藻糖含量而言是改变的。
抗体的糖基化通常是N-连接的。“N-连接的”是指碳水化合物部分连接于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸)是用于碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列任一的存在产生潜在的糖基化位点。
抗体上存在的任何碳水化合物部分的去除可以化学地或酶促地完成。化学去糖基化需要将抗体暴露于化合物三氟甲磺酸或等同的化合物。这种处理导致除连接的糖(N-乙酰萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大多数或所有糖的切割，而同时保留抗体完整。化学去糖基化由Sojahr H.等(1987)和由Edge,AS.等(1981)描述。抗体上碳水化合物部分的酶促切割可以如Thotakura,NR.等(1987)所述通过使用多种内切-和外切-糖苷酶实现。
更特别地，本发明抗体的糖基化的改变在于少于65％的由抗体的糖基化位点携带的聚糖结构包含岩藻糖分子。
这些碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域中已得到描述，并且可以用作在其中表达本发明的重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。
例如，Hang等的EP1,176,195描述了具有功能破坏的编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因的细胞系，使得在这种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化或不含岩藻糖基残基。
Presta的PCT公开WO03/035835描述了变体CHO细胞系，Lecl3细胞，其具有降低的将岩藻糖连接于Asn(297)连接糖的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields,R.L.等,2002J.Biol.Chem.277:26733-26740)。
此外，US7931895和WO 01/77181描述了在YB2/0细胞系(参考CRL-1662)中产生的低岩藻糖抗体的产生。
Eureka Therapeutics进一步描述了能够产生具有缺乏岩藻糖残基的改变的哺乳动物糖基化模式的抗体的遗传工程化CHO哺乳动物细胞(http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html)。
或者，可以在针对哺乳动物样糖基化模式工程化并且能够产生作为糖基化模式缺少岩藻糖的抗体的酵母或丝状真菌中产生本发明的抗体(参见例如EP1297172B1)。
抗体测定
可以通过本领域已知的任何方法来测定所有这些抗体的特异性结合。许多不同的竞争性结合分析形式可用于表位结合。可以使用的免疫测定法包括但不限于使用诸如western印迹的技术的竞争性测定系统、放射免疫测定法、ELISA、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素测定法、凝胶扩散沉淀素测定法、免疫放射测量分析、荧光免疫测定法、蛋白A免疫测定法和补体固定测定法。这些测定法在本领域中是常规且众所周知的(参见例如Ausubel等,eds,1994Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley&sons,Inc.,New York)。例如，(GE Healthcare,Piscaataway,NJ)是常规用于单克隆抗体的表位框并组(epitope bin panel)的多种表面等离子体共振测定形式之一。另外，可以进行常规的交叉阻断分析，例如在Antibodies,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane,1988中所描述的那些。
免疫偶联物
可检测标记
本发明的抗体可以与可检测标记物偶联以形成抗HER3免疫偶联物。合适的可检测标记物包括例如放射性同位素、荧光标记物、化学发光标记物、酶标记物、生物发光标记物或胶体金。制备和检测这些可检测地标记的免疫偶联物的方法对于本领域的普通技术人员是众所周知的，并且在下面更详细地描述。
可检测标记物可以是通过放射自显影检测的放射性同位素。出于本发明的目的，特别有用的同位素是3H、125I、131I、35S和14C。
本发明的抗HER3免疫偶联物也可以用荧光化合物标记。通过将免疫偶联物暴露于适当波长的光并检测所得荧光来确定荧光标记的抗体的存在。荧光标记化合物包括荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。
或者，可以通过将抗体与化学发光化合物偶联而对本发明的抗HER3免疫偶联物进行可检测地标记。通过检测在化学反应期间产生的化学发光的存在来确定带有化学发光标签的免疫偶联物的存在。化学发光标记化合物的实例包括发光氨、异发光氨、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶盐(acridinium salt)和草酸酯。
类似地，可以使用生物发光化合物来标记本发明的抗HER3免疫偶联物。生物发光是在生物系统中发现的化学发光类型，在所述系统中催化蛋白质提高化学发光反应的效率。通过检测发光的存在来确定生物发光蛋白质的存在。可用于标记的生物发光化合物包括荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。
或者，可以通过将抗HER3单克隆抗体与酶连接来可检测地标记抗HER3免疫偶联物。当将抗HER3抗体-酶偶联物在适当底物存在下孵育时，酶部分与底物反应以产生可以通过例如分光光度、荧光测量或目测手段检测的化学部分。可用于可检测地标记多特异性免疫偶联物的酶的实例包括β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶。
本领域技术人员知道可根据本发明使用的其它适合标记物。标志物部分与抗人HER3单克隆抗体的结合可以使用本领域已知的标准技术来实现。在这方面，典型的方法描述于下列文献中：Kennedy等,Clin.Chim.Acta 70:1,1976；Schurs等,Clin.Chim.Acta 81:1,1977；Shih等,Int'l J.Cancer 46:1101,1990；Stein等,Cancer Res.50:1330,1990；和Coligan，同上。
此外，免疫化学检测的方便性和通用性可以通过使用与亲和素、链霉亲合素和生物素偶联的抗人HER3单克隆抗体来提高(参见例如Wilchek等,(编),“Avidin-BiotinTechnology,”Methods In Enzymology(Vol.184)(Academic Press 1990)；Bayer等,“Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,”Methods InMolecular Biology(Vol.10)149-162(Manson编,The Humana Press,Inc.1992).)。
进行免疫测定的方法是良好建立的(参见例如Cook和Self,“MonoclonalAntibodies in Diagnostic Immunoassays,”Monoclonal Antibodies:Production,Engineering,and Clinical Application 180-208(Ritter和Ladyman编,CambridgeUniversity Press 1995)；Perry,“The Role of Monoclonal Antibodies in theAdvancement of Immunoassay Technology,”Monoclonal Antibodies:Principles andApplications 107-120(Birch和Lennox编,Wiley-Liss,Inc.1995)；Diamandis,Immunoassay(Academic Press,Inc.1996).)。
抗体-药物偶联物(ADC)
另一方面，本发明提供抗人HER3单克隆抗体-药物偶联物。如本文所使用，“抗人HER3单克隆抗体-药物偶联物”是指与治疗剂偶联的本发明的抗人HER3单克隆抗体。
这些抗人HER3单克隆抗体-药物偶联物(ADC)在施用于受试者诸如例如患有表达HER3的癌症的受试者时，通常是在单独施用时，但也在与其它治疗剂组合施用时，对表达HER3的细胞产生临床有益的效应。
在典型的实施方式中，将抗人HER3单克隆抗体与细胞毒性剂偶联，以便所得抗体-药物偶联物(ADC)在被表达HER3的细胞(例如表达HER3的癌细胞)摄取或内化时对该细胞发挥细胞毒性或细胞生长抑制性效应。用于与抗体偶联的特别合适的部分是化疗剂、前药转化酶、放射活性同位素或化合物或者毒素。例如，可以将抗人HER3单克隆抗体与细胞毒性剂偶联，诸如化疗剂或毒素(例如细胞生长抑制剂或杀细胞剂，诸如例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素)。
有用的细胞毒性剂种类包括例如抗微管蛋白剂、奥瑞斯他汀类(auristatins)、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂(例如铂复合物如顺铂、单(铂)、双(铂)及三核铂复合物和卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗敏化剂、倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊苷、氟代嘧啶、离子载体、lexitropsins、亚硝基脲、顺铂(platinols)、预形成化合物、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素类、辐射敏化剂、类固醇类、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱类等。
单个细胞毒性剂包括例如雄激素、安曲霉素(AMC)、天冬酰胺酶、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、白消安、丁硫氨酸亚砜胺、喜树碱、卡铂、卡莫司汀(BSNU)、CC-1065(Li等,Cancer Res.42:999-1004,1982)、苯丁酸氮芥、顺铂、秋水仙碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、细胞松弛素B、氮烯唑胺、更生霉素(之前称为放线菌素)、道诺霉素、氨烯咪胺、多烯紫杉醇、阿霉素、雌激素、5-氟脱氧尿苷、磷酸依托泊苷(VP-16)、5-氟尿嘧啶、短杆菌肽D、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀(CCNU)、二氯甲基二乙胺、美法仑、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、硝基咪唑、紫杉醇、普卡霉素、丙卡巴肼、链脲霉素、替尼泊苷(VM-26)、6-硫鸟嘌呤、噻替派(thioTEPA)、托泊替康、长春花碱、长春新碱和长春瑞滨。
特别合适的细胞毒性剂包括例如多拉司他汀类(例如奥瑞斯他汀E、AFP、MMAF、MMAE)、DNA小沟结合剂(例如烯二炔类和lexitropsins)、倍癌霉素类、紫杉烷类(例如，紫杉醇和多烯紫杉醇)、嘌呤霉素类、长春花生物碱类、CC-1065、SN-38(7-乙基-10-羟基-喜树碱)、托泊替康、吗啉基阿霉素、根霉素、氰基吗啉基阿霉素、棘霉素、考布他汀、纺锤菌素、埃博霉素A和B、雌氮芥、隐藻素(cryptophysins)、西马多丁、美登木素类、圆皮海绵内酯(discodermolide)、五加苷素(eleutherobin)和米托蒽醌。
在某些实施方式中，细胞毒性剂是常规化疗剂，诸如例如阿霉素、紫杉醇、美法仑、长春花生物碱、甲氨蝶呤、丝裂霉素C或依托泊苷。此外，可以将有效药剂诸如CC-1065类似物、卡奇霉素、美登木素、多拉司他汀10的类似物、根霉素和海葵毒素连接至抗HER3表达抗体。
在特定变化形式中，细胞毒性剂或细胞生长抑制剂是奥瑞斯他汀E(在本领域中也称为多拉司他汀-10)或其衍生物。奥瑞斯他汀E衍生物通常是例如奥瑞斯他汀E与酮酸之间形成的酯。例如，可以将奥瑞斯他汀E与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应以分别产生AEB和AEVB。其它典型的奥瑞斯他汀衍生物包括AFP(二甲基缬氨酸-缬氨酸-多拉异亮氨酸-多拉脯氨酸-苯丙氨酸-对苯二胺)、MMAF(朵缬氨酸(dovaline)-缬氨酸-多拉异亮氨酸-多拉脯氨酸-苯丙氨酸)和MAE(单甲基奥瑞斯他汀E)。奥瑞斯他汀E及其衍生物的合成和结构描述于美国专利申请公开号20030083263、国际专利公开号WO2002/088172和WO2004/010957以及美国专利号6,884,869；6,323,315；6,239,104；6,034,065；5,780,588；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,816,444；和4,486,414中。
在其它变化形式中，细胞毒性剂是DNA小沟结合剂(参见例如美国专利号6,130,237)。例如，在某些实施方式中，小沟结合剂是CBI化合物。在其它实施方式中，小沟结合剂是烯二炔(例如卡奇霉素)。
在某些实施方式中，抗体-药物偶联物(ADC)包含抗微管蛋白剂。抗微管蛋白剂的实例包括例如紫杉烷(例如，(紫杉醇)、(多烯紫杉醇))、T67(Tularik)、长春花生物碱(例如长春新碱、长春花碱、长春地辛和长春瑞滨)和多拉司他汀类(例如奥瑞斯他汀E、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)。其它抗微管蛋白剂包括例如浆果赤霉素衍生物、紫杉烷类似物(例如，埃博霉素A和B)、诺考达唑、秋水仙素和秋水仙胺(colcimid)、雌氮芥、隐藻素类、西马多丁、美登木素类、考布他汀类、圆皮海绵内酯和五加苷素。在某些实施方式中，细胞毒性剂是类美登素，另一组抗微管蛋白剂。例如，在特定实施方式中，类美登素是美登木素或DM-1(ImmunoGen,Inc.；也参见Chari等,Cancer Res.52:127-131,1992)。
在其它实施方式中，细胞毒性剂是抗代谢物。抗代谢物可以是例如嘌呤拮抗剂(例如，硫唑嘌呤或麦考酚酸酯)、二氢叶酸还原酶抑制剂(例如，甲氨蝶呤)、阿昔洛韦、更昔洛韦、齐多夫定、阿糖胞苷、雷巴威林、叠氮胸苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、金刚烷胺、双脱氧尿苷、碘代脱氧尿苷、膦甲酸(poscarnet)或曲氟胸苷。
在其它实施方式中，将抗人HER3单克隆抗体与前药转化酶偶联。前药转化酶可以使用已知方法与抗体重组地融合或与抗体化学偶联。示例性的前药转化酶是羧肽酶G2、β-葡萄糖醛酸酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、β-内酰胺酶、β-葡萄糖苷酶、硝基还原酶和羧肽酶A。
用于将治疗剂与蛋白质、特别是与抗体偶联的技术是众所周知的(参见例如Arnon等,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,”Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Reisfeld等编,Alan R.Liss,Inc.,1985)；Hellstrom等,“Antibodies For Drug Delivery,”Controlled Drug Delivery(Robinson等编,Marcel Deiker,Inc.,第2版1987)；Thorpe,“Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy:A Review,”Monoclonal Antibodies'84:Biological AndClinical Applications(Pinchera等编,1985)；“Analysis,Results,and FutureProspective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy,”Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy(Baldwin等编,Academic Press,1985)；和Thorpe等,1982,Immunol.Rev.62:119-58。也参见例如PCT公开WO89/12624.)。
接头
通常，抗体-药物偶联物化合物包含药物单元和抗体单元之间的接头单元。在一些实施方式中，接头在细胞内条件下可切割，使得在细胞内环境中接头的切割从抗体释放药物单元。在再其它的实施方式中，接头单元不是可切割的且药物通过例如抗体降解来释放。
在一些实施方式中，接头可通过存在于细胞内环境中(例如，在溶酶体或核内体或胞膜窖内)的切割剂切割。接头可以是例如肽基接头，其通过细胞内肽酶或蛋白酶(包括，但不限于溶酶体或核内体蛋白酶)切割。在一些实施方式中，肽基接头是至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。切割剂可以包括组织蛋白酶B和D及血纤维蛋白溶酶，其全部已知水解二肽药物衍生物，导致靶细胞内活性药物的释放(参见，例如，Dubowchik and Walker,1999,Pharm.Therapeutics83:67-123)。
最典型的是可通过存在于191P4D12-表达细胞中的酶切割的肽基接头。这些接头的实例描述于例如U.S.专利No.6,214,345中，其全文通过引用和为所有目的并入本文中。在具体的实施方式中，可通过细胞内蛋白酶切割的肽基接头是Val-Cit接头或Phe-Lys接头(参见，例如，U.S.专利No.6,214,345，其描述阿霉素用Val-Cit接头的合成)。使用治疗剂的细胞内蛋白水解释放的一个优势是治疗剂通常在偶联时被减弱且偶联物的血清稳定性通常是高的。
在其它实施方式中，可切割接头是pH-敏感的，即对某些pH值下的水解敏感。
通常，pH-敏感的接头在酸性条件下可水解。例如，可以使用在溶酶体中可水解的酸不稳定的接头(例如，腙、缩氨基脲、氨硫脲、顺-乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)(参见，例如，U.S.专利No.5,122,368；5,824,805；5,622,929；Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123；Neville等,1989,Biol.Chem.264:14653-14661)。这些接头在中性pH条件(如在血液中的那些pH)下是相对稳定的，但在低于pH 5.5或5.0(大致溶酶体的pH)下是不稳定的。在某些实施方式中，可水解接头是硫醚接头(如，例如，通过酰腙键连接于治疗剂的硫醚)(参见，例如，U.S.专利No.5,622,929)。
在再其它的实施方式中，接头在还原条件下可切割(例如，二硫化物接头)。多种二硫化物接头是本领域中已知的，包括，例如，可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)、SPDB和SMPT形成的那些(参见，例如，Thorpe等,1987,Cancer Res.47:5924-5931；Wawrzynczak等,Immunocongugates:Antibody Conjugates in Radioimagery andTherapy of Cancer(C.W.Vogel ed.,Oxford U.Press,1987.也参见U.S.专利No.4,880,935.))。
在再其它的具体实施方式中，接头是丙二酸酯接头(Johnson等,1995,AnticancerRes.15:1387-93)、马来酰亚胺苯甲酰基接头(Lau等,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)或3′-N-酰胺类似物(Lau等,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。
在再其它的实施方式中，接头单元不是可切割的且药物通过抗体降解释放。
通常，接头基本上对细胞外环境不是敏感的。如本文中使用的，“基本上对细胞外环境不是敏感的”在接头的情况中意思是在抗体-药物偶联物化合物的样品中，不超过约20％，通常不超过约15％，更通常不超过约10％和甚至更通常不超过约5％，不超过约3％或不超过约1％的接头在抗体-药物偶联物化合物存在于细胞外环境中(例如，在血浆中)时被切割。是否接头基本上对细胞外环境不敏感可以例如通过与血浆一起孵育抗体-药物偶联物化合物预定的时间段(例如，2、4、8、16或24小时)和然后定量血浆中存在的游离药物的量来确定。
治疗性应用
本发明的抗体或免疫偶联物，特别是抗体-药物偶联物，可用于治疗任何表达HER3的癌症。本发明的抗体可以单独地或与任何适合药剂组合使用。
表达HER3的癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。
这些癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、神经胶质细胞肿瘤诸如成胶质细胞瘤和神经纤维瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾脏癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌。
它们优选选自乳腺癌、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、胰腺癌和结肠直肠癌，且更特别选自乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌。
在一种特定实施方式中，使用本发明的方法治疗的癌症是乳腺癌或卵巢癌。
本发明公开了用于治疗与HER3的表达相关的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的抗体或免疫偶联物。
本发明的抗体和免疫偶联物对于治疗其中存在神经调节蛋白，特别地神经调节蛋白1β的与HER3的表达相关的癌症特别有效。
因此，本发明的目的是根据本发明的抗体和/或免疫偶联物，其用于治疗受试者中其中存在神经调节蛋白，特别地神经调节蛋白1β的与HER3的表达相关的癌症。
在一个实施方式中，本发明的抗体和免疫偶联物特别适合于治疗配体(即，NRG)依赖性癌症。
在一个实施方式中，本发明的抗体特别适合于治疗自分泌或旁分泌配体依赖性肿瘤(由于其变构效应)。
因此，在本发明的一个实施方式中，存在的神经调节蛋白通过肿瘤和/或通过肿瘤周围的组织和/或器官分泌。
在一些实施方式中，本发明的抗体和免疫偶联物特别适合于治疗对用抗体、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、化疗剂或抗激素剂的治疗抗性的癌症。
在一些实施方式中，本发明的抗体特别适合于治疗选自三阴性乳腺癌、胰腺癌和肾细胞癌的癌症。
在某些实施方式中，抗-人-HER3单克隆抗体或免疫偶联物，特别地抗体-药物偶联物，与用于治疗疾病或病症的第二药剂组合使用。
当用于治疗癌症时，本发明的抗-人-HER3单克隆抗体或免疫偶联物可以与常规的癌症疗法组合使用，所述常规疗法诸如例如手术、放疗、化疗或其组合。
在某些方面，可用于与本发明的抗-HER3抗体或抗体-药物偶联物的组合癌症疗法的其它治疗剂包括抗血管生成剂。
在一些方面，本发明的抗体或抗体-药物偶联物与细胞因子(例如刺激针对肿瘤的免疫应答的细胞因子)共同施用。
在一些其它方面，可用于组合疗法的其它治疗剂包括参与肿瘤生长的某些因子(诸如，例如，EGFR、HER2或HER4)的拮抗剂。
在一个特定实施方式中，本发明的抗-人-HER3单克隆抗体或免疫偶联物，特别地抗体-药物偶联物，与抗-人-HER2单克隆抗体诸如曲妥珠单抗或帕妥珠单抗组合使用。
在一些实施方式中，如本文中所述的抗-人-HER3单克隆抗体或免疫偶联物，特别地抗体-药物偶联物与酪氨酸激酶抑制剂(TKI)组合使用。BAY 43-9006(索拉非尼,)和SU11248(舒尼替尼,)是已被批准的两种这样的TKI。其它TKI包括但不限于：甲磺酸伊马替尼(Novartis)；吉非替尼(AstraZeneca)；盐酸厄洛替尼(Genentech)；凡德他尼(AstraZeneca)，替吡法尼(Janssen-Cilag)；达沙替尼(Bristol Myers Squibb)；洛那法尼(Schering Plough)；丁二酸凡塔蓝尼(Novartis,Schering AG)；拉帕替尼(GlaxoSmithKline)；尼洛替尼(Novartis)；来他替尼(Cephalon)；盐酸帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)；阿昔替尼(Pfizer)；二盐酸卡奈替尼(Pfizer)；培利替尼(NationalCancer Institute,Wyeth)；坦度替尼(Millennium)；波舒替尼(Wyeth)；司马沙尼(Sugen,Taiho)；AZD-2171(AstraZeneca)；VX-680(Merck,Vertex)；EXEL-0999(Exelixis)；ARRY-142886(Array BioPharma,AstraZeneca)；PD-0325901(Pfizer)；AMG-706(Amgen)；BIBF-1120(Boehringer Ingelheim)；SU-6668(Taiho)；CP-547632(OSI)；(AEE-788(Novartis)；BMS-582664(Bristol-Myers Squibb)；JNK-401(Celgene)；R-788(Rigel)；AZD-1152HQPA(AstraZeneca)；NM-3(Genzyme Oncology)；CP-868596(Pfizer)；BMS-599626(Bristol-Myers Squibb)；PTC-299(PTC Therapeutics)；ABT-869(Abbott)；EXEL-2880(Exelixis)；AG-024322(Pfizer)；XL-820(Exelixis)；OSI-930(OSI)；XL-184(Exelixis)；KRN-951(Kirin Brewery)；CP-724714(OSI)；E-7080(Eisai)；HKI-272(Wyeth)；CHIR-258(Chiron)；ZK-304709(Schering AG)；EXEL-7647(Exelixis)；BAY-57-9352(Bayer)；BIBW-2992(Boehringer Ingelheim)；AV-412(AVEO)；YN-968D1(Advenchen Laboratories)；米哚妥林(Novartis)；哌立福辛(AEterna Zentaris,Keryx,National Cancer Institute)；AG-024322(Pfizer)；AZD-1152(AstraZeneca)；ON-01910Na(Onconova)；和AZD-0530(AstraZeneca)。
药物组合物
对于施用，将本发明的抗-人-HER3单克隆抗体或抗体-药物偶联物配制成药物组合物。
包含抗-人-HER3单克隆抗体或抗体-药物偶联物的药物组合物可以根据制备可药用组合物的已知方法来配制，由此将治疗性分子与药学上可接受的载体组合于混合物中。
如果组合物的施用可以被接受体患者耐受，则它被称为是“药学上可接受的载体”。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上可接受的载体的一个实例。其它合适的载体对于本领域技术人员是众所周知的(参见例如Gennaro(编),Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack PublishingCompany,第19版1995))。制剂可以进一步包括一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、防止病毒表面上的蛋白损失的白蛋白等。
施用的方式
药物组合物的形式、施用途径、剂量和方案自然取决于待治疗的病症、疾病的严重性、患者的年龄、体重和性别等。
本发明的药物组合物可以被配制成用于局部、经口、肠胃外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下或眼内施用等。
优选地，药物组合物含有对于能够注射的制剂药学上可接受的媒介物。这些可以特别地是等渗的、无菌的盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等或这些盐的混合物)，或者是干燥的、特别是冷冻干燥的组合物，其在根据情况添加无菌水或生理盐水后，允许构成可注射溶液。
用于施用的剂量可以随着各种参数而适应，尤其是随着所使用的施用方式、相关病理或者所需的治疗持续时间而变化。
为了制备药物组合物，可以将有效量的抗体溶解或分散于药学上可接受的载体或水性介质中。
适合于注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散液，包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须为流体以达到存在容易的可注射性能的程度。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须进行防腐以对抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用。
作为游离碱或药学上可接受的盐的活性化合物的溶液可以在与表面活性剂诸如羟丙基纤维素适当地混合的水中制备。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中制备，以及在油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制备物含有防腐剂以防止微生物的生长。
载体
本发明的抗体可以以中性或盐形式配制成组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并且与无机酸诸如例如盐酸或磷酸或者有机酸诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱诸如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁以及有机碱诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。
载体也可以是溶剂或分散体介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物及植物油。可以例如通过使用包衣剂诸如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需粒径以及通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。微生物作用的阻止可以通过各种抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，包括等渗剂例如糖类或氯化钠将是优选的。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
通过将活性化合物以所需量并入根据需要具有上面列举的各种其它成分的适合溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，通过将各种灭菌活性成分并入含有基本分散体介质和选自上面列举的所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从事先无菌过滤的溶液产生活性成分加任何其它所需成分的粉末。
还预期制备更加或高度浓缩的用于直接注射的溶液，其中设想使用DMSO作为溶剂以产生极快的渗透，从而将高浓度的活性剂递送到小的肿瘤区域。
在配制后，将溶液以与剂量制剂相容的方式和以诸如治疗有效的量施用。制剂以各种剂型诸如上面描述的可注射溶液的类型容易地施用，但是也可以使用药物释放胶囊等。
对于在水性溶液中的肠胃外施用，例如，溶液应该进行适当缓冲(如果需要)，并首先用足够的盐水或葡萄糖使得液体稀释剂等渗。这些特定水性溶液尤其适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。关于这点，可以使用的无菌水性介质对于本领域技术人员考虑本公开内容是已知的。例如，可以将一个剂量溶解于1ml等渗NaCl溶液中，然后添加至1000ml皮下输注流体或在建议输注部位注射(参见例如"Remington's PharmaceuticalSciences"第15版，第1035-1038和1570-1580页)。取决于待治疗的受试者的病症，必需对剂量进行一些改变。在任何情况下，负责施用的人决定个别受试者的适当剂量。
本发明的抗体可以配制在治疗性混合物内以在每剂量中包含约0.0001至1.0毫克，或约0.001至0.1毫克，或约0.1至1.0或甚至约10毫克左右。也可以施用多个剂量。
除了为肠胃外施用诸如静脉内或肌肉内注射配制的化合物之外，其它药学上可接受的形式包括例如用于口服施用的片剂或其它固体；时间释放胶囊；以及目前使用的任何其它形式。
在某些实施方式中，考虑使用脂质体和/或纳米颗粒以将抗体引入宿主细胞中。脂质体和/或纳米颗粒的形成和使用对于本领域技术人员是已知的。
纳米胶囊(nanocapsule)通常可以以稳定且可重复的方式捕集化合物。为了避免由于细胞内聚合物过载导致的副作用，通常使用能够在体内降解的聚合物来设计这种超细颗粒(大小在0.1μm左右)。考虑将满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒用于本发明中，且这种颗粒可以容易地制造。
脂质体从分散于水性介质中并自发形成多片层同心双层囊泡(也被称为多层囊泡(MLV))的磷脂形成。MLV通常具有25nm至4μm的直径。MLV的超声处理导致形成小的单层囊泡(SUV)，其直径在200至的范围内，从而在核心中含有水性溶液。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。
试剂盒
最后，本发明还提供包含至少一种本发明的抗体的试剂盒。含有本发明抗体的试剂盒可用于检测HER3表达，或用于治疗性或诊断性测定。本发明的试剂盒可以含有与固相支持物例如组织培养板或珠(例如琼脂糖凝胶珠)偶联的抗体。可以提供用于在体外(例如在ELISA或Western印迹中)检测和定量HER3的含有抗体的试剂盒。这种可用于检测的抗体可以提供有标记物诸如荧光或放射性标记物。
本发明将通过下面的附图和实施例进一步说明。然而，这些实施例和附图不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：GMB301的生成和产生
低岩藻糖嵌合抗体GMB301通过亲本9F7-F11抗体的VH和VL DNA序列亚克隆到哺乳动物表达载体中人Cg1和Ck基因的下游而获得。这样的低岩藻糖抗体基本上在YB2/0细胞系(参考CRL-1662)中产生。
简言之，VH-CH1-CH2-CH3γ链同种型1和VL-CκDNA序列利用密码子优化通过基因合成构建。新合成的重链和轻链亚克隆到pMGM09-H和pMGM09-Lk载体中用于各抗体链表达。
这些哺乳动物表达载体允许通过CMV启动子驱动的IgG1形式同种型抗体的表达。YB2/0细胞被转染以产生稳定池且在一周内完成一批产生。
实施例2:GMB301以高亲和力结合HER3细胞外结构域
GMB301在平板(Nunc)涂覆孔中37℃下与50ng人HER3-Fc(重组HER3细胞外结构域Fc融合体，R&D systems)孵育1小时。
使用的GMB301浓度在3.3nM-6.5pM的范围内。
结合的GMB301抗体通过偶联的HRP-F(ab’)2山羊抗人IgG F(ab’)2特异性抗体(Interchim)检测。在37℃下2小时和用PBS-Tween20 0.5％的三次洗涤后，TMB(3,3,5,5-四甲基联苯胺，Sigma)用作底物以检测HRP活性且1M H2SO4添加以终止反应，且平板在450nm下读数。
如图1中所示，GMB301抗体表现出对于HER3细胞外结构域的亚纳摩尔亲和力(EC500.19nM)。
实施例3：GMB301对用胰腺癌细胞系异种移植的小鼠中的肿瘤生长降低的体内效 应和与9F7-F11的比较
A.无胸腺的6-8周龄雌性BALB/c裸鼠购自Janvier and Charles RiversLaboratories。EGFR高,HER2/3低,PTEN/PIK3CA wt,NRG阴性和KRAS/BRAF-突变的NRG1β-依赖性胰腺癌细胞HPAC(3x106)s.c.注射到无胸腺BALB/c裸鼠的右侧腹中。HPAC不分泌配体NRG1β。所有体内实验符合法国实验动物研究指南(Agreement no.B34-172-27)。
当肿瘤达到大约150mm3的体积时，携带肿瘤的小鼠随机分组到不同的处理组中。小鼠通过i.p.注射GMB301vs抗体9F7-F11vs媒介(PBS)进行处理。注射的抗体的量是300μg/注射(15mg/kg)，一周两次，连续4周(Q3D-4W)。肿瘤尺寸每周用卡尺测量，且体积通过公式D1xD2xD3/2计算。
如图2中所示，HPAC肿瘤生长的显著降低相对于在用媒介处理的小鼠中测量的平均肿瘤尺寸在GMB301-处理的小鼠中观察到。令人惊异地，类似的结果在9F7-F11-处理的小鼠中观察到。事实上，在两种类型的抗体的肿瘤生长降低中没有观察到显著差异。
B.执行类似于A点的实验方案，除了注射到无胸腺BALB/c裸鼠侧腹中的胰腺癌细胞系是EGFR高,HER2/3高,KRAS/BRAF/PTEN/PIK3CA wt,NRG阳性NRG1β-依赖性胰腺癌细胞BxPC3(3x106)。BxPC3以低水平表达HER3受体(大约10,000受体/细胞)并分泌配体NRG1β(NRG1β-依赖性旁分泌模型)。
如图3中所示，BxPC3肿瘤生长的强降低相对于在用媒介处理的小鼠中测量的平均肿瘤尺寸在GMB301-处理的小鼠中观察到。
但是这一次，与在GMB301-处理的小鼠中观察到降低相比，在用9F7-F11处理的小鼠组中观察到平均肿瘤尺寸的较小降低。相对于9F7-F11而言GMB301的较佳效能一到植入后29天就可见到。
总的说来，这些结果证明在用NRG1β分泌型癌症异种移植的小鼠中GMB301比9F7-F11更有效地延迟肿瘤生长，但类似的结果在用非NRG1β分泌型癌症异种移植的小鼠中比较GMB301和9F7-F11的效力时获得。
本发明人因此鉴定有效对抗NRG-依赖性和非依赖性癌症的抗体，在其中表达天然配体NRG的癌症中与已知抗-HER3抗体相比具有优异效力。
实施例4：与H4B-121 EMABLING相比对于肿瘤细胞的GMB301 ADCC
H4B-121 emabling(H4B-121-emb)按照来自LFB的Technology在YB2/0细胞系中产生，其导致产生低岩藻糖H4B-121。
ADCC使用Cytotox 96非放射性细胞毒性分析(Promega)进行，其测量乳酸脱氢酶(LDH)从受损细胞的释放。
来自乳腺癌MDA-MB-453的靶细胞(T)在DMEM+10％FCS+抗生素中培养并在指数生长期中用胰蛋白酶/EDTA收集。
在洗涤步骤及检查细胞数量和存活力后，20,000个MDA-MB-453细胞添加到无菌平底96-孔平板的各孔中，并在37℃,5％CO2下预孵育24h。
1μg/ml的测试抗体(GMB301、H4B-121-emb和不相关对照抗体(Px))然后针对靶细胞MDA-MB-453与NRG1β(100ng/ml)孵育30分钟，然后添加效应细胞(一式三份)。
来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)按照制造商的实验方案通过密度梯度离心(Ficoll-Paque；d＝1.077；GE Healthcare)制备为效应细胞(E)。PBMC的细胞数调节到6x106细胞/ml且300,000个效应细胞添加到各孔(15:1E:T比率)。
对于各实验设定以下对照：单独靶细胞(靶自发LDH释放)、单独PBMC(效应自发LDH释放)、靶细胞与PBMC(非抗体依赖性LDH释放)、用Triton X-100处理的靶细胞(靶最大LDH释放)。
在细胞裂解产物孵育20h后，来自各孔的50μl上清液小心地转移到新的平底96-孔平板用于LDH释放测量。
重构LDH底物混合物(50μl/well)添加到包含从细胞毒性分析平板转移的样品的酶分析平板的各孔。
在室温下黑暗中30min孵育后，添加50μl/孔的终止溶液并在490nm下测量吸光度。
各样品的百分特异性裂解使用下式测定：
百分特异性裂解＝(样品的LDH释放值-效应自发释放-靶自发释放)/(靶最大释放-靶自发释放)*100
如图4中所示，GMB301诱导比H4B-121抗体的emabling形式(约25％裂解)更强的MDA-MB-453肿瘤细胞的ADCC(约65％裂解)。
实施例5:低岩藻糖抗-HER3抗体H4B-121-Emb和在YB2/0细胞中产生的GMB301以类 似的亲和力结合HER3受体
重组人HER3细胞外结构域(ECD)购自R&D Systems且H4B-121如实施例4中所示产生。
Nunc Maxisorp平板在4℃下用50ng/孔重组人HER3 ECD涂覆16小时并用PBS中的2％BSA封闭。抗-HER3抗体GMB301和H4B-121-emb从0.5μg/ml系列稀释到1ng/ml(3nM至6.5pM)并在37℃下孵育1小时。
在用含0.1％Tween 20的PBS洗涤后，结合的抗-HER3抗体通过偶联的HRP-F(ab’)2山羊抗人F(ab’)2特异性抗体(Interchim)检测。
在37℃下两小时和三次洗涤后，TMB(3,3,5,5-四甲基联苯胺，Sigma)用作底物以检测过氧化酶活性，添加1M H2SO4以终止反应，平板在450nm下阅读且结合数据曲线使用GraphPad Prism的四参数非线性回归拟合来分析。
如图4中所示，H4B-121-Emb和GMB301以类似的亲和力结合HER3受体，H4B-121-emb具有0.11nM+/-0.02的EC50，而GMB301具有0.19nM+/-0.01的EC50。
实施例6：GMB301与抗体H4B-121EMABLING相比更有效地降低肿瘤生长和增加 NRG1-成瘾肿瘤的存活时间
H4B-121如实施例4中所示产生。
无胸腺的6-8周龄雌性BALB/c裸鼠购自Janvier and Charles RiversLaboratories。NRG1-成瘾胰腺BxPC3(3x106)、三阴性乳腺癌HCC-1806(1x106)和肺A549癌细胞(4x106)s.c.注射到无胸腺BALB/c裸鼠的右侧腹中。
所有体内实验符合法国实验动物研究指南(Agreement no.B34-172-27)。
当肿瘤达到大约120-150mm3的体积时，携带肿瘤的小鼠随机分组到不同的处理组中。小鼠通过i.p.注射GMB301 vs H4B-121-Emb vs媒介(NaCl-阴性对照)进行处理。注射的抗体的量是300μg/注射(15mg/kg)，一周两次，连续4周(Q3D-4W)。
肿瘤尺寸每周用卡尺测量一次，且体积通过公式D1xD2xD3/2计算。
如图5，左图中所示，NRG1-成瘾BxPC3、HCC-1806和A549肿瘤生长的较大降低相对于在用对照或抗体H4B-121-emb处理的小鼠中测量的平均肿瘤尺寸在GMB301-处理的小鼠中观察到。
相关地，较大的益处(相对于对照组以处理天数计的增益)在异种移植的NRG1-成瘾肿瘤的三个模型(BxPC3:+21天，GMB301 vs+14天，H4B-121-emb组；HCC-1806:+21天，GMB301 vs+7天，H4B-121-emb；A549:+21天，GMB301vs-7，H4B-121-emb)中在GMB301处理组vs H4B-121-emb处理组中观察到(图5，右图)。

Claims (19)

1.一种神经调节蛋白非竞争性变构抗-人HER3抗体，包含：
(a)重链，其中可变域包含：
-具有如SEQ ID NO:2所示的序列的H-CDR1；
-具有如SEQ ID NO:3所示的序列的H-CDR2；和
-具有如SEQ ID NO:4所示的序列的H-CDR3；
及
(b)轻链，其中可变域包含至少选自以下的CDR：
-具有如SEQ ID NO:6所示的序列的L-CDR1，
-具有如SEQ ID NO:7所示的序列的L-CDR2；和
-具有如SEQ ID NO:8所示的序列的L-CDR3；
所述抗体具有人恒定区；且
少于65％的由所述抗体的糖基化位点携带的聚糖结构包含岩藻糖分子。
2.如权利要求1所述的抗体，包含轻链可变区，该轻链可变区含有具有如SEQ ID NO:6所示的序列的L-CDR1、具有如SEQ ID NO:7所示的序列的L-CDR2和具有如SEQ ID NO:8所示的序列的L-CDR3。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和/或所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，优选地所述抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和所述轻链可变区具有如SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列。
4.如前述权利要求任一项所述的抗体，其中所述抗体的重链具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列和/或所述抗体的轻链具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，优选地所述抗体的重链具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列和所述抗体的轻链具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
5.如前述权利要求任一项所述的抗体，其中少于50％，优选地少于40％，更优选少于30％，特别地少于20％的由所述抗体的糖基化位点携带的聚糖结构包含岩藻糖分子。
6.如前述权利要求任一项所述的抗体，其是嵌合抗体，特别地嵌合小鼠/人抗体，和优选地人源化抗体。
7.一种编码至少根据权利要求1-6任一项所述的单克隆抗体的重链或轻链，优选编码根据权利要求1-6任一项所述的抗体的核酸序列。
8.一种包含根据权利要求7所述的核酸的载体。
9.一种包含根据权利要求7所述的核酸或根据权利要求9所述的载体的宿主细胞。
10.一种药物组合物，其包含至少根据权利要求1-6任一项所述的抗体及药学上可接受的载体。
11.一种免疫偶联物，其包含与治疗剂连接的根据权利要求1-6任一项所述的抗体。
12.一种药物组合物，其包含至少根据权利要求11所述的免疫偶联物及药学上可接受的载体。
13.根据权利要求1-6任一项所述的抗体和/或根据权利要求11所述的免疫偶联物，其用作药物。
14.根据权利要求1-6任一项所述的抗体和/或根据权利要求11所述的免疫偶联物，其用于治疗受试者中其中存在神经调节蛋白，特别地神经调节蛋白1β的与HER3的表达相关的癌症的用途。
15.根据权利要求1-6任一项所述的抗体和/或根据权利要求11所述的免疫偶联物，其用于抑制受试者中其中存在神经调节蛋白，特别地神经调节蛋白1β的与HER3的表达相关的肿瘤细胞生长的用途。
16.用于根据权利要求14或15所述的用途的抗体和/或免疫偶联物，其中神经调节蛋白和特别地神经调节蛋白1β由所述肿瘤和/或所述肿瘤周围的组织和/或器官分泌。
17.用于根据权利要求16所述的用途的抗体和/或免疫偶联物，其中所述肿瘤是神经调节蛋白-依赖性的，特别地神经调节蛋白1β-依赖性的。
18.用于根据权利要求14或15所述的用途的抗体和/或免疫偶联物，其中神经调节蛋白和特别地神经调节蛋白1β由于其在所述抗体和/或免疫偶联物之前、之后或与其同时施用于所述受试者而存在。
19.用于根据权利要求14-18任一项所述的用途的抗体和/或免疫偶联物，其中所述与HER3的表达相关的癌症或肿瘤细胞选自鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、神经胶质细胞瘤如成胶质细胞瘤和神经纤维瘤病、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾脏癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和头颈癌，且优选选自乳腺癌、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、胰腺癌和结肠直肠癌，更特别地选自乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌。
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