CN115724979A - 一种多功能重组抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种多功能重组抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多功能重组抗体及其制备方法和应用，本发明不仅提供了一种能够特异性识别人HER3蛋白的单克隆抗体，还提供了其人源化的重组抗体，以及在此基础上进一步重构得到既能够识别人HER3，又具有IL15功能的多功能抗体，能够有效增强原抗体对肿瘤细胞的杀伤作用。同时，本发明还通过引入突变的人IgG1恒定区，得到一种改构的特异性HER3单抗‑IL15双功能分子，可有效降低了抗体的毒性，提高安全性。本发明的抗体可识别多种肿瘤细胞中的HER3蛋白，进而对多种肿瘤细胞具有杀伤作用，同时重构的多功能重组抗体具有还具有药物代谢周期短、毒性低、安全性高的优点，具有巨大的应用前景。

Description

一种多功能重组抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于治疗肿瘤的多功能重组抗体及其制备方法和应用；具体涉及一种能够既识别HER3又具有IL15功能的多功能重组抗体及其应用。
背景技术
人表皮受体(HER)蛋白属于受体酪氨酸激酶家族，在正常细胞和肿瘤细胞中均发挥作用。HER3作为HER家族的成员，与其他成员不同的是，其没有或几乎没有胞内酪氨酸激酶活性，其配体包括神经调节蛋白1(NRG-1)和神经调节蛋白2(NRG-2)。HER3在各种癌症中普遍表达，包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胃癌、肺癌、皮肤癌和胰腺癌，其高表达也与疾病进展和/或预后不良有关。近年来，随着HER3在肿瘤进展和耐药中的重要性逐渐显现，HER3越来越受到人们的关注。目前已有的针对HER3为靶点的药物临床有效性不够显著，后续开发的潜力较小。
IL15是一种由多种细胞表达的细胞因子，这些细胞包括单核细胞、巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等，但T淋巴细胞则不表达。与其他多种细胞因子不同，IL15一般不分泌出细胞发挥作用，而是与IL15Rα组合后定位在特定的细胞膜，从而刺激附近的效应细胞，主要是NK和CD8+T细胞。IL15与IL2关系密切，IL15与IL15Rα形成复合物后可以与IL2共用的β/γ受体结合，介导生物学活性。在抗肿瘤作用方面，IL15比IL2的一个优势是IL15/Rα不会刺激Treg的增殖。目前，有多种IL15相关的分子在研发阶段用于治疗恶性肿瘤。其中进展最快的是ALT-803，其分子由IL15和IL15Rαsushi-hFc1形成的复合物。多个临床研究显示，ALT-803对包括黑色素瘤在内的多种肿瘤有效，但同时会出现严重的毒副作用，主要包括肝功能损害，低血压和发烧等。
如何提高HER3作为靶点的抗肿瘤药物的效用，并开发一种安全有效的药物具有重要的意义。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种够特异性识别HER3蛋白的单克隆抗体、分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞；以及由所述的单克隆抗体经过人源化得到重组抗体；以及既能够识别人HER3蛋白，又能够具有人IL15功能的多功能重组抗体。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种单克隆抗体，所述单克隆抗体能够特异性识别HER3蛋白；所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
本发明通过用重组表达的人HER3-ECD蛋白对小鼠进行免疫，并制备、筛选合适的杂交瘤，得到能够有效结合HER3蛋白的鼠源单克隆抗体,命名为SPGA08-158。该抗体能够有效阻断NRG1结合HER3。通过生物学分析，所述单克隆抗体重链可变区编码118个氨基酸残基，轻链可变区编码107个氨基酸残基。
进一步地，本发明还要求保护一种重组抗体，所述重组抗体由所述的单克隆抗体SPGA08-158经过人源化得到，所述重组抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，所述重组抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
作为本发明的优选实施方式，所述重组抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，所述重组抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。
本发明发明人进一步分析得到所述鼠源单克隆抗体SPGA08-158的可变区序列，并对所述单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列进行分析，依据Kabat规则确定鼠源抗体的3个抗原互补决定区(CDR)和4个框架区(FR)。在Germline数据库中选取与各鼠源抗体FR区匹配最好的人源化模板，然后将鼠源抗体的CDR区移植到所选择的人源化模板上，替换人源模板的CDR区。重链可变区再与人IgG1恒定区(SEQ ID NO：15)重组，轻链可变区与人的kappa链恒定区(SEQ ID NO：16)重组，同时以该抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对各抗体的VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，最终获得上述人源化重组抗体，命名为huSPGA08-158。所述人源化重组抗体huSPGA08-158的重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列、重链氨基酸序、轻链氨基酸序列如上述所示。
进一步地，本发明还要求保护一种多功能重组抗体，所述多功能重组抗体的重链包括识别人HER3的抗体功能区、人IgG1恒定区功能域、IL15功能区，以及用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段；所述识别人HER3的抗体功能区的氨基酸序列包括所述重组抗体的重链可变区氨基酸序列。
所述IL15功能区为可识别人IL2/IL15β/γ受体的功能域。
本发明发明人进一步改造了上述得到的人源化抗体，将抗体重链序列与具有IL15功能的序列相连接，进一步得到既能够识别人HER3蛋白，又具有IL15功能的重组抗体。
作为本发明的优选实施方式，所述人IgG1恒定区功能域为人IgG1恒定区，氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
更优选地，所述人IgG1恒定区功能域为突变的人IgG1恒定区，所述突变的人IgG1恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示。
本发明发明人进一步改造了得到的多功能重组抗体，通过使用了含有突变的人IgG1恒定区的序列，得到的多功能重组抗体代谢周期更短，毒性更低，安全性更佳。
作为本发明的优选实施方式，所述IL15功能区的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。
更优选地，所述人IL15功能区的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。
所述优选IL15功能区的氨基酸序列为人IL15Rsushi与人IL15通过(GGGGS)6的linker连接形成单链IL15，即IL15sc。该linker在构建稳定、具有生物活性的融合蛋白中发挥着重要的作用，能够保证蛋白的正确折叠、保持生物活性以及提高蛋白产量等。
作为本发明的优选实施方式，所述多功能重组抗体中用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段为GGGGS重复。
更优选地，所述GGGGS重复为(GGGGS)3。
作为本发明的优选实施方式，所述多功能重组抗体的人IgG1恒定区功能域氨基酸序列如SEQ ID NO：15；所述多功能重组抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示；所述多功能重组抗体轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。
本发明制备了一种能够识别HER3并具有IL15功能的多功能抗体，命名为SPGL013。
更优选地，所述多功能重组抗体的人IgG1恒定区功能域为突变的人IgG1恒定区，所述突变的人IgG1恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；所述多功能重组抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示；所述多功能重组抗体轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。
利用所述优选的多功能重组抗体序列制备得到的多功能重组抗体包含突变的人IgG1恒定区的序列，命名为SPGL014；多功能重组抗体SPGL014不仅能够有效识别多种肿瘤细胞中的HER3，能有效抑制多种癌细胞生长，且半衰期更短，毒性更低，安全性好。
进一步地，本发明还要求保护编码所述单克隆抗体，或所述重组抗体，或所述多功能重组抗体的核苷酸序列。
根据提供所述单克隆抗体，或所述重组抗体，或所述多功能重组抗体的氨基酸序列可得到相应的编码基因的核苷酸序列。
作为本发明的优选实施方式，所述单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQID NO：5所示，所述单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
进一步地，本发明还要求保护包含所述的核苷酸序列的表达载体。
通过分子生物学的方法，可构建得到含有所述的核苷酸序列的表达载体。
进一步地，本发明还要求保护包含所述的表达载体的宿主细胞。
通过细胞生物学的方法，可利用所述表达载体构建得到能够有效表达所述抗体蛋白的宿主细胞。
进一步地，本发明还要求保护所述单克隆抗体，或所述重组抗体，或多功能重组抗体；或所述核苷酸序列，或所述表达载体，或所述宿主细胞在制备用于治疗肿瘤的生物制剂的应用。
进一步地，本发明还要求保护一种生物制剂，所述生物制剂包括所述单克隆抗体，或所述重组抗体，或所述多功能重组抗体；或所述核苷酸序列，或所述表达载体，或所述宿主细胞中的至少一种。
进一步地，本发明还提供了所述单克隆抗体或所述的重组抗体，或所述多功能重组抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过人工合成或分子生物学方法得到含所述单克隆抗体或重组抗体或多功能重组抗体的基因片段的表达载体；
(2)将所述表达载体转染至细胞进行蛋白表达；
(3)通过蛋白纯化得到所述单克隆抗体或重组抗体或多功能重组抗体。
通过分别构建含有将上述抗体的重链或轻链序列的表达载体，转染合适的细胞进行表达和纯化，即可获得相应的抗体。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(1)中，通过分子生物学制备含所述单克隆抗体或重组抗体或多功能重组抗体的基因片段的表达载体为：将所述抗体的重链或轻链核苷酸序列插入至pcDNA3.4表达载体。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(2)中，用于蛋白表达的细胞为Expi-293F细胞。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(3)中的蛋白纯化方法为通过Protein G纯化。
本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供了一种能够特异性识别人HER3蛋白的单克隆抗体，还提供了其人源化的重组抗体。以及在此基础上，发明人进一步利用HER3特异性重组抗体制备了既能够识别人HER3，又具有IL15功能的多功能重组抗体，能够有效增强原抗体对肿瘤细胞的杀伤作用。同时，本发明还通过引入突变的人IgG1恒定区，得到一种改构的特异性HER3单抗-IL15双功能分子，该双功能分子在保持体内抗肿瘤活性的同时，可有效缩短其代谢周期，从而其在体内的毒副作用，大大提高了安全性。本发明的多功能重组抗体能够识别多种肿瘤细胞内的HER3，具有巨大的应用前景。
附图说明
图1抗体SPGA08-158与人HER3结合的结果。
图2抗体SPGA08-158抑制NRG1结合人HER3的效果。
图3抗体SPGA08-158与小鼠、食蟹猴HER3抗原结合的结果。
图4人源抗体huSPGA08-158与人HER3的结合的结果
图5人源抗体huSPGA08-158抑制NRG1结合人HER3的效果。
图6多功能重组抗体SPGL013、SPGL014与人HER3结合的结果。
图7多功能重组抗体SPGL013、SPGL014同时结合人HER3和CD122/132的结果。
图8多功能重组抗体SPGL013、SPGL014抑制NRG1结合HER3的结果。
图9多功能重组抗体SPGL013、SPGL014刺激CTLL2细胞增殖的结果。
图10多功能重组抗体SPGL014抑制小鼠结直肠癌细胞MC38移植瘤的结果。
图11多功能重组抗体SPGL014抑制人肺癌细胞HCC827移植瘤的结果。
图12多功能重组抗体SPGL014抑制人乳腺癌细胞JIMT-1移植瘤的结果。
图13多功能重组抗体SPGL013和SPGL014在huFcRn转基因小鼠体内代谢情况。
图14流式检测SPGL014与多种肿瘤细胞HER3结合的结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1单克隆抗体及杂交瘤的制备
1)抗原免疫小鼠：用重组表达的人HER3-ECD蛋白(购自北京百普赛斯公司，AcroBIOSYSTEMS)常规皮下免疫Balb/c小鼠。
第一天，将可溶性人HER3-ECD蛋白与弗氏完全佐剂(CFA，Sigma公司)乳化充分混匀后，对Balb/c小鼠进行皮下注射(50μg/鼠)；第14、36天，可溶性人HER3-ECD蛋白与弗氏不完全佐剂乳化(IFA，Sigma公司)充分混匀后，对Balb/c小鼠进行皮下加强免疫(50μg/鼠)；第50天，腹腔内注射人HER3-ECD蛋白50μg/鼠激发，注射3～4天后取小鼠脾脏进行融合实验。
2)杂交瘤的制备和筛选：
在小鼠末次冲击免疫后3～4天，使用常规的杂交瘤技术方案，将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0通过PEG(PEG1450，Sigma公司)法融合。融合后的细胞在完全培养基中悬浮均匀，完全培养基即将RPMI1640和DMEM F12培养基1：1混匀后加入1％的谷氨酰胺(Gibco公司)，1％丙酮酸钠(Gibco公司)，1％MEM-NEAA(最小基本培养基-非必需氨基酸溶液，Gibco公司)，1％青霉素-链霉素(Gibco公司)，50μM的β-巯基乙醇(Gibco公司)及20％FBS(Gibco公司)组成的培养基。按105个细胞/100μL/孔，分入96孔培养板中培养过夜。次日，每孔加入100μL含有2×HAT(Sigma公司)的完全培养基，使96孔板内培养液为200μL/孔(含1×HAT)。在7～12天后，收获上清液，通过间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)筛选人HER3-ECD蛋白结合活性阳性的杂交瘤孔。
其中，间接酶联免疫吸附测定法筛选人HER3-ECD蛋白活性阳性的杂交瘤孔的方法如下：将重组人HER3-ECD蛋白以包被液(50mM的碳酸盐包被缓冲液，pH 9.6)稀释至1μg/mL，100μL/孔加入酶标板，4℃包被过夜。PBST洗板3次，加入200μL/孔封闭液(2％BSA-PBST)，37℃放置1h后PBST洗板1次待用。将收取的杂交瘤上清液依次加入封闭后的酶标板，100μL/孔，37℃放置1h。PBST洗板3次，加入HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗(购自Abcam，货号ab6789)，37℃放置30min；PBST洗板5次后，在吸水纸上尽量拍干残留液滴，每孔加入100μL的TMB(KPL公司)，室温(20±5℃)避光放置5min；每孔加入50μL 2M H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析待测抗体与靶抗原人HER3-ECD蛋白结合能力。
在含血清完全培养基中扩增筛选获得的杂交瘤细胞株，离心换液至无血清培养液(SFM培养基)，使细胞密度为1～2×107个/mL，在5％ CO2，37℃条件下培养2周，离心获取培养上清，通过Protein G亲和层析进行纯化，获得鼠源抗人HER3-ECD蛋白单克隆抗体，命名为SPGA08-158。
实施例2 ELISA法测定SPGA08-158与人HER3的结合活性
间接酶联免疫吸附测定法测定鼠源抗体对人HER3-ECD蛋白的结合能力。
实验步骤：预先包被人HER3-ECD蛋白，以包被液(50mM的碳酸盐包被缓冲液，pH9.6)稀释至2μg/mL包板，4℃过夜；再用5％的脱脂奶粉封闭，37℃，2小时；PBST洗板3次，将以1％BSA-PBST梯度稀释的待测抗体依次加入封闭后的酶标板，100μL/孔，37℃放置1h。PBST洗板3次，加入HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗(Millipore公司)，37℃放置30min；PBST洗板3次后，在吸水纸上尽量拍干残留液滴，每孔加入100μL的TMB(KPL公司)，室温(20±5℃)避光放置5min；每孔加入50μL 2M H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析待测抗体与靶抗原人HER3-ECD蛋白的结合能力。
实验结果如图1。由图1可得，抗体SPGA08-158结合HER3-ECD的EC50为20.35ng/mL，即0.14nM；说明抗体SPGA08-158与HER3-ECD有很好的结合活性。
实施例3抗体SPGA08-158抑制NRG1结合人HER3-ECD
实验步骤：预先包被人HER3-ECD蛋白，以包被液(50mM的碳酸盐包被缓冲液，pH9.6)稀释至2μg/mL包板，4℃，过夜；再用5％的脱脂奶粉封闭，37℃，2小时；PBST洗板3次，再用5％的脱脂奶粉封闭，37℃，2小时。PBST洗板3次，将以1％BSA梯度稀释的待测抗体SPGA08-158依次加入封闭后的酶标板，100μL/孔，37℃放置1h。PBST洗板3次，加入稀释至200ng/mL的生物素标记的NRG1(北京百普赛斯公司，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)，37℃放置1h；PBST洗板3次后，在吸水纸上尽量拍干残留液滴，每孔加入100μL的稀释的SA-HRP(THERMO公司)，37℃放置30分钟，PBST洗板3次后，100μL/孔加入TMB，室温(20±5℃)避光放置5min；每孔加入50μL 2M H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析待测抗体阻断NRG1结合HER3的能力。
实验结果如图2。NRG1可以通过结合HER3发挥生物学功能。由图2可得，IC50为361.6ng/mL，即2.41nM；说明抗体SPGA08-158可以有效阻断NRG1结合HER3。
实施例4抗体SPGA08-158与小鼠、食蟹猴HER3抗原的交叉活性测定
实验方法与实施例2相似，将其中的人HER3分别替换为小鼠HER3-ECD(北京百普赛斯公司，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)和食蟹猴HER3-ECD(北京义翘神州公司，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)，测定抗体SPGA08-158与小鼠、食蟹猴HER3抗原的结合能力。
实验结果如图3。由图3可得，抗体SPGA08-158能很好的结合食蟹猴HER3-ECD蛋白，EC50为19.49ng/mL，即0.13nM，与人HER3-ECD的结合相当(EC50为0.14nM)；但不结合小鼠HER3-ECD。
实施例5人源化抗体huSPGA08-158的制备
通过Trizol提取SPGA08-158杂交瘤细胞的RNA并进行mRNA反转录获取cDNA，随后以cDNA为模板，分别用鼠源抗体的重链和轻链简并引物(《Antibody Engineering》Volume1，Edited by Roland Kontermann and Stefan Dübel，组合引物的序列来自第323页)进行PCR，对所获得的PCR产物进行测序并通过kabat数据库分析，确定所获得的序列为鼠源抗体的可变区序列。相关序列信息如下：
SPGA08-158抗体重链可变区基因序列，全长为354bp，编码118个氨基酸残基，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；SPGA08-158抗体轻链可变区基因序列全长321bp，编码107个氨基酸残基，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
对SPGA08-158抗体轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列进行分析，依据Kabat规则确定鼠源抗体的3个抗原互补决定区(CDR)和4个框架区(FR)。SPGA08-158重链互补决定区的氨基酸序列为HCDR1：GYTFTNYYIY(SEQ ID NO：9)、HCDR2：INPSNGGT(SEQ ID NO：10)、HCDR3：TRDLGYYAMDY(SEQ ID NO：11)，轻链互补决定区的氨基酸序列为LCDR1：QDIKNYLN(SEQ ID NO：12)、LCDR2：YTSRLQS(SEQ ID NO：13)和LCDR3：QQGETLPWT(SEQ ID NO：14)。
在Germline数据库中选取与上述各鼠源抗体FR区匹配最好的人源化模板。然后将鼠源抗体的CDR区移植到所选择的人源化模板上，替换人源模板的CDR区，重链可变区再与人IgG1恒定区(SEQ ID NO：15)重组，轻链可变区与人的kappa链恒定区(SEQ ID NO：16)重组，同时以该抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对各抗体的VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，最终获得人源化抗体huSPGA08-158。
所述人源化抗体huSPGA08-158的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。
分别构建人源化抗体huSPGA08-158的重链和轻链至pcDNA3.4表达载体，转染Expi-293F细胞，通过Protein G纯化获得人源化抗体huSPGA08-158。通过SDS-PAGE电泳及SEC-HPLC确定各抗体分子量大小正确，且纯度>95％。
实施例6ELISA法测定人源化抗体huSPGA08-158与人HER3的结合活性
实验方法参考实施例2，测定人源化抗体huSPGA08-158与人HER3的结合活性，实验结果如图4所示。
由图4可得，人源化抗体huSPGA08-158与HER3结合的EC50为4.779ng/mL，即0.03nM，明显低于抗体SPGA08-158(其EC50为20.35ng/mL，即0.14nM，参考实施例2)，说明人源化抗体huSPGA08-158与HER3具有良好的结合活性。
实施例7人源化抗体huSPGA08-158抑制NRG1结合HER3
实验方法参考实施例3，测定人源化抗体huSPGA08-158抑制NRG1结合HER3的效果，实验结果如图5所示。
由图5可得，人源化抗体huSPGA08-158的IC50为430.1ng/mL，即2.87nM，活性与鼠源单抗SPGA08-158相当(IC50为2.41nM)，说明人源化抗体huSPGA08-158可以有效抑制NRG1结合HER3。
实施例8多功能重组抗体的制备
1.识别人IL15的抗体功能区：将人IL15Rsushi(氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示)与人IL15(氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示)通过(GGGGS)6连接形成单链IL15，即IL15sc，其氨基酸序列SEQ ID NO：23所示。
2.识别人HER3的抗体功能区：
①SPGL013的重链：将huSPGA08-158重链序列(氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示)与人IL15sc序列通过(GGGGS)3拼接，形成SPGL013的重链(氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示)；
②SPGL014的重链：huSPGA08-158重链VH序列(氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示)与突变的人IgG1恒定区(氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示)连接，形成huSPGA08-158mu重链(氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示)；将huSPGA08-158mu的重链与人IL15sc序列通过(GGGGS)3拼接，形成SPGL014的重链(氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示)。
③轻链同huSPGA08-158的轻链序列(氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示)。
3.多功能重组抗体的制备
将SPGL014的重链、轻链(或SPGL013的重链、轻链)共转染转染至Expi-293F细胞，通过Protein G纯化可获得多功能重组抗体SPGL014(或多功能重组抗体SPGL013)。通过SDS-PAGE电泳及SEC-HPLC确定所表达各抗体分子量正确，且抗体纯度>95％。制备好的多功能抗体定量后分装，并冻存于-80℃备用。
实施例9多功能重组抗体SPGL014结合HER3-ECD
实验方法参考实施例2，测定多功能重组抗体SPGL013、SPGL014分别与人HER3的结合活性，实验结果如图6所示。
由如图6可得，多功能重组抗体SPGL014和SPGL013结合人HER3-ECD的EC50分别为4.359ng/mL和4.981ng/mL，即0.023nM和0.026nM，与huSPGA08-158一致(EC50为0.032nM)，说明huSPGA08-158与IL15形成多功能重组抗体不影响其与HER3的结合，而且多功能重组抗体SPGL014中IgG1的突变也不影响其与HER3的结合。
实施例10多功能重组抗体SPGL014同时结合HER3-ECD和CD122/132
实验方法：人HER3-ECD蛋白以包被液(50mM的碳酸盐包被缓冲液，pH9.6)稀释至2μg/mL，100μL/孔加入酶标板，4℃，过夜包被；再用5％的脱脂奶粉200μL/孔封闭，37℃，2小时；PBST洗板3次，将以1％BSA-PBST梯度稀释待测抗体至1μg/mL，加入封闭后的酶标板，100μL/孔，37℃放置1h。PBST洗板3次，加入梯度稀释的生物素标记的CD122/132(购自北京百普赛斯公司)，37℃，1小时，PBST洗板3次后加入稀释的HRP标记的SA(Pierce公司)，37℃放置30min；PBST洗板3次后，在吸水纸上尽量拍干残留液滴，每孔加入100μL的TMB(KPL公司)，室温(20±5℃)避光放置5min；每孔加入50μL2M H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析待测抗体与人CD122/132的结合能力。
实验结果如图7。如图7可得，在本实验条件下，抗体SPGL014和SPGL013结合人CD122/132蛋白的EC50分别为19.04ng/mL和18.49ng/mL，即0.10nM和0.10nM；说明多功能重组抗体SPGL014和SPGL013均有同时结合HER3和CD122/132的良好活性；相对的，对照组的huSPGA08-158抗体虽然能够结合HER3，但不能结合CD122/132。
实施例11多功能重组抗体SPGL013、SPGL014抑制NRG1结合HER3
实验方法参考实施例3，测定多功能重组抗体SPGL014和SPGL013抑制NRG1结合HER3的效果。实验结果如图8所示。
由图8可得，抗体SPGL014和SPGL013抑制NRG1结合HER3的IC50分别为437.3ng/mL和440ng/mL，即2.28nM和2.29nM；说明SPGL014和SPGL013阻断活性与SPGA08-158相当(IC50为2.41nM)。
实施例12多功能重组抗体SPGL013、SPGL014刺激CTLL2细胞增殖
实验方法：CTLL2细胞以含10％FBS的1640培养液稀释至5×104/mL，100μL/孔加入细胞培养板。将IL2以含10％FBS的1640培养液稀释至30ng/mL，后3倍比稀释共8个梯度后分别加入上述含CTLL2细胞的培养板；将SPGL014和SPGL013以含10％FBS的1640培养液稀释至5000ng/mL，后3倍比稀释共8个梯度后分别加入上述含CTLL2细胞的培养板；CO2细胞培养箱培养72小时后，以CCK8测定各孔的相对细胞数，并计算EC50，判定样品的活性。实验结果如图9所示。
由图9可得，多功能重组抗体SPGL014和SPGL013均可以刺激CTLL2细胞的增殖，EC50分别为43.55ng/mL和39.83ng/mL，即0.23nM和0.21nM，说明SPGL014具有与SPGL013一致的生物学活性。作为对照，IL2的EC50为0.9475ng/mL，即0.059nM。
实施例13多功能重组抗体SPGL014较SPGL013在小鼠体内的毒性明显下降
实验方法：多功能重组抗体SPGL014和SPGL013于第1天、第3天和第5天，腹腔注射C57BL/6小鼠(维通利华公司)共3次，注射体积为0.2mL/次，SPGL014和SPGL013均按0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg和4mg/kg剂量给药，每天观察实验小鼠的死亡情况，对照组给药同体积的PBS。结果如表1所示。
表1各剂量组实验动物存活率
样品 0.5mg/kg 1.0mg/kg 2.0mg/kg 4.0mg/kg
SPGL013 100％ 70％ 20％ 10％
SPGL014 100％ 100％ 100％ 30％
如表1所示，在实验第10天，SPGL013样品4.0mg/kg、2.0mg/kg、1.0mg/kg、0.5mg/kg组的实验动物存活率分别为10％、20％、70％和100％；SPGL014样品4.0mg/kg、2.0mg/kg、1.0mg/kg、0.5mg/kg组实验动物存活率分别为30％、100％、100％和100％；这些结果说明，Fc突变后，SPGL014对实验小鼠的毒性较SPGL013明显下降。
实施例14多功能重组抗体SPGL014抑制小鼠结直肠癌细胞MC38移植瘤生长
实验方法：收集体外培养的小鼠结肠癌MC38细胞，将细胞悬液浓度调整为1×107/mL。在无菌条件下，接种100μL MC38细胞悬液于C57BL/6小鼠右侧肋部皮下。小鼠皮下移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待平均肿瘤体积生长至100-200mm3后将动物随机分组，6只/组。SPGL014按1.0mg/kg、0.5mg/kg给药，SPGL013按0.5mg/kg、0.25mg/kg给药，对照组给等量PBS，每周腹腔注射给药3次，给药体积0.2mL/次，连续给药2周。整个实验过程中，每周3次测量移植瘤直径，同时称小鼠体重。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为(其中，a、b分别表示长、宽)：
TV＝1/2×a×b2。
根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为(其中，V0为分组给药时测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积)：
RTV＝Vt/V0。
抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下(其中，TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV)：
T/C(％)＝(TRTV/CRTV)×100；
抑瘤率TGI(％)＝100-T/C(％)。
测定结果如图10所示。由图10可得，SPGL014和SPGL013均体现了较强的抗肿瘤活性，SPGL013在0.5mg/kg和0.25mg/kg剂量下，TGI分别为69.0％和52.5％，SPGL014在1.0和0.5mg/kg剂量下，TGI分别为71.2％、58.6％。
参考实施例13，SPGL013在1.0mg/kg剂量下体现致死毒性，SPGL014在4.0mg/kg剂量下才体现致死毒性，说明含有Fc突变的SPGL014在不影响体内抗肿瘤活性的同时，安全性明显提高。
实施例15多功能重组抗体SPGL014抑制人肺癌细胞HCC827移植瘤在裸小鼠体内的生长
实验方法：收集体外培养的人肺癌HCC827细胞，将细胞悬液浓度调整为8×107/mL。在无菌条件下，接种100μL细胞悬液于裸小鼠右侧肋部皮下。待肿瘤细胞在小鼠皮下形成实体肿瘤，用游标卡尺测量移植瘤直径，待平均肿瘤体积生长至100-200mm3后将动物随机分组。SPGL014按1.0mg/kg、0.5mg/kg给药，SPGL013按0.5mg/kg、0.25mg/kg给药，每周腹腔给药3次，共给药6次。整个实验过程中，每周2次测量移植瘤直径，同时称量小鼠体重。其余同实施例14。结果如图11所示。
由图11可得，SPGL014和SPGL013在人肺癌细胞中均体现了较强的抗肿瘤活性，SPGL013在0.5mg/kg和0.25mg/kg剂量下，TGI分别为82.3％和43.2％，SPGL014在1.0和0.5mg/kg剂量下，TGI分别为84.2％、71.1％。说明Fc突变的SPGL014维持抗肿瘤活性，同时，体内安全性明显提高。
实施例16多功能重组抗体SPGL014抑制人乳腺癌细胞JIMT-1移植瘤在裸小鼠体内的生长
实验方法：收集体外培养的人乳腺癌JIMT-1细胞，将细胞悬液浓度调整为8×107/mL。在无菌条件下，接种100μL细胞悬液于裸小鼠右侧肋部皮下。待肿瘤细胞在小鼠皮下形成实体肿瘤，用游标卡尺测量移植瘤直径，待平均肿瘤体积生长至50-100mm3后将动物随机分组。SPGL014按1.0mg/kg、0.5mg/kg给药，SPGL013按0.5mg/kg、0.25mg/kg给药，每周腹腔给药3次，共给药6次。整个实验过程中，每周2次测量移植瘤直径，同时称量小鼠体重。其余同实施例14。结果如12所示。
由图12可得，SPGL014和SPGL013在人乳腺癌细胞中均体现了较强的抗肿瘤活性，SPGL013在0.5mg/kg和0.25mg/kg剂量下，TGI分别为51.5％和32％，SPGL014在1.0和0.5mg/kg剂量下，TGI分别为59％、52.1％。说明Fc突变的SPGL014维持抗肿瘤活性，同时，体内安全性明显提高。
实施例17多功能重组抗体SPGL013和SPGL014在huFcRn转基因小鼠体内代谢
实验方法：采用人FcRn转基因小鼠测定SPGL013和SPGL014的药代动力学。8只小鼠分两组，分别按1mg/kg剂量，腹腔注射SPGL013和SPGL014，2小时、6小时、24小时、48小时和72小时后取血，获取血清。血清作适当稀释后，采用ELISA法测定血药浓度，方法基本同实施例11。结果如图13所示。
由图13可得，Fc突变的SPGL014较Fc野生型的SPGL013在人FcRn转基因小鼠体内的代谢明显加快，半衰期分别为11小时和35小时，相差显著。
实施例18SPGL014检测多种肿瘤细胞HER3的表达
通过流式细胞荧光分选技术(Fluorescence activated Cell Sorting，FACS)的方法测定SPGL014对人乳腺癌细胞MCF-7的结合亲和力。
本实验以人乳腺癌细胞MCF-7作为靶细胞，将100μL浓度为2000ng/mL的SPGL014作为一抗，分别与悬浮于100μL RPMI-1640无血清培养基(购自Gibco公司，货号22400089)中的1×105个MCF-7细胞于4℃孵育1h，PBS洗涤细胞两次以去除未结合的SPGL014，再将细胞与100μL、2μg/mL、Alexa Fluor 488标记的抗人IgG荧光二抗(购自Thermo，invitrogen公司，货号A11013)于4℃孵育30min，PBS洗涤细胞两次以去除未结合的二抗，最后将细胞重悬在100μL PBS中，通过流式细胞仪测定SPGL014对该细胞的结合亲和力，所得MFI数值，与对照组(未孵育SPGL014)MFI值比较，比值取对数值表示SPGL014的结合强度。
如上述实验方法，检测SPGL014与其他肿瘤细胞的结合亲和力，包括人乳腺癌细胞JIMT-1，人皮肤癌细胞A375，人卵巢癌细胞SKOV3，人结直肠癌细胞HT-29，人肺癌细胞H1975和HCC827。结果如图14所示。
由图14可得，SPGL014能够不同程度结合各种肿瘤细胞，其中JIMT-1、A375、HCC827和MCF-7结合良好，H1975和HT-29次之，SKOV3细胞最弱。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体能够特异性识别HER3蛋白；所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
2.一种重组抗体，其特征在于，所述重组抗体由权利要求1所述的单克隆抗体经过人源化得到，所述重组抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，所述重组抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
3.一种多功能重组抗体，其特征在于，所述多功能重组抗体的重链包括识别人HER3的抗体功能区、人IgG1恒定区功能域、人IL15的功能区，以及用于连接各功能区的非功能性氨基酸片段；所述识别人HER3的抗体功能区的氨基酸序列包括如权利要求2所述重组抗体的重链可变区氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的多功能重组抗体，其特征在于，所述人IgG1恒定区功能域为突变的人IgG1恒定区，所述突变的人IgG1恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；所述多功能重组抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示；所述多功能重组抗体轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。
5.编码如权利要求1所述单克隆抗体，或如权利要求2所述重组抗体，或如权利要求3或4所述多功能重组抗体的核苷酸序列。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求5所述的核苷酸序列。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求6所述的表达载体。
8.如权利要求1所述单克隆抗体，或如权利要求2所述重组抗体，或如权利要求3或4所述多功能重组抗体；或如权利要求5所述的核苷酸序列，或如权利要求6所述的表达载体，或如权利要求7所述的宿主细胞在制备用于治疗肿瘤的生物制剂的应用。
9.一种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包括如权利要求1所述单克隆抗体，或如权利要求2所述重组抗体，或如权利要求3或4所述多功能重组抗体；或如权利要求5所述的核苷酸序列，或如权利要求6所述的表达载体，或如权利要求7所述的宿主细胞中的至少一种。
10.如权利要求1所述单克隆抗体或如权利要求2所述的重组抗体，或如权利要求3或4所述多功能重组抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过人工合成或分子生物学方法得到含所述单克隆抗体或重组抗体或多功能重组抗体的基因片段的表达载体；
(2)将所述表达载体转染细胞进行蛋白表达；
(3)通过蛋白纯化得到所述单克隆抗体或重组抗体或多功能重组抗体。
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