CN113943371B - 一种抗her2/抗pd-l1双功能抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗HER2/抗PD‑L1双功能抗体及其应用。所述抗HER2/抗PD‑L1双功能抗体包括：单克隆抗体单元，其针对HER2并且包括2个重链和2个轻链；单链抗体单元，其针对PD‑L1并且包括2个单链抗体，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区通过连接肽连接，其中，所述2个单链抗体的N端或C端分别通过linker与所述单克隆抗体单元的2条重链的Fc片段的C端连接。本发明的抗HER2/抗PD‑L1双功能抗体可以与PD‑L1结合，同时也能够与HER2结合，为一种新型的抗肿瘤药物。

Description

一种抗HER2/抗PD-L1双功能抗体及其应用
技术领域
本发明属于分子免疫学技术领域，具体涉及一种抗HER2/抗PD-L1双功能抗体及其应用。
背景技术
HER2过表达已在多种实体瘤中检测到，包括乳腺癌(BC)、大肠癌(CRC)、胃和胃食管交界处(GEJ)癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胆道癌(BTC)和膀胱癌。曲妥珠单抗
Figure BDA0003331645630000011
是一种针对HER2的人源化单克隆抗体(mAb)，是针对HER2+肿瘤的有效疗法。通过使用靶向治疗剂，HER2+BC患者的治疗已得到明显改善。但是，只有50–80％的HER2+BC患者受益于靶向治疗剂，而20–50％的患者从治疗开始就无反应或在治疗后出现耐药性。近年来，免疫检查点抑制剂已成为多种癌症的主要治疗方式。靶向程序性细胞死亡-1(PD-1)或程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)的单克隆抗体是这些药物的主要类别。几项研究表明，免疫疗法可以提高放疗、化学疗法和/或其他靶向疗法的疗效。临床前和临床数据支持将派姆单抗、曲妥珠单抗和化学疗法联合用于治疗HER2阳性癌症。在曲妥珠单抗难治性HER2阳性转移性乳腺癌患者中，该组合可引起长期的临床反应。此外，曲妥珠单抗可在临床和临床前模型中增加PD-1和PD-L1的表达，可提高PD1/PD-L1靶向药物的疗效。
双特异性抗体(BsAb)能够同时结合两个不同的靶标或同一靶标上的两个不同的表位。当它们与两种不同的肿瘤表面抗原相互作用时，双特异性抗体可能会提供更高的结合特异性。假设双特异性抗体可能有助于避免耐药性的发展，因为在单个肿瘤细胞上靶向两种疾病调节剂可能会增加抗癌作用，从而避免耐药性的发展。Frameworkshuffling是Dall’Acqua等人发明的一种抗体人源化方法。目前，开发存在的双功能抗体形式已被证明有超过40余种，但是由于生产效率低和药代动力学性能差等问题，一直以来双特异性抗体的研发困难重重。目前，国内外尚没有一种抗HER2/抗PD-L1双功能抗体。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种抗HER2/抗PD-L1双功能抗体、其制备方法及其应用。
一方面，本发明提供了一种抗HER2/抗PD-L1双功能抗体，其包括：
单克隆抗体单元，其针对HER2并且包括2个重链和2个轻链；
单链抗体单元，其针对PD-L1并且包括2个单链抗体，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区通过连接肽连接；
其中，所述2个单链抗体的N端或C端分别通过linker与所述单克隆抗体单元的2条重链的Fc片段的C端连接。
在一个实施方式中，所述linker为SEQ ID NO.：8(GGGGSGGGGTGGGGS)。
在一个实施方式中，在所述单链抗体中的连接肽可为1-5个重复的GGGGS的序列，例如为3个重复的GGGGS的序列，如SEQ ID NO.：9(GGGGSGGGGSGGGGS)。
在一个实施方式中，所述单链抗体的重链可变区包括氨基酸序列为SEQ ID NO.：10的CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO.：11的CDR2、氨基酸序列为SEQ ID NO.：12的CDR3，以及所述单链抗体的轻链可变区包括氨基酸序列为SEQ ID NO.：13的CDR1、氨基酸序列为SEQID NO.：14的CDR2、氨基酸序列为SEQ ID NO.：15的CDR3。优选地，所述单链抗体的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：3或SEQ ID NO.：4所示。
在一个实施方式中，所述双功能抗体的轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：5所示，所述双功能抗体的重链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：6所示。
在一个实施方式中，所述双功能抗体的轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：5所示，所述双功能抗体的重链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：7所示。
另一方面，本发明还提供了一种编码所述抗HER2/抗PD-L1双功能抗体的多核苷酸。
再一方面，本发明还提供了一种表达载体，其包含编码所述抗HER2/抗PD-L1双功能抗体的多核苷酸。
另一方面，本发明提供一种所述抗HER2/抗PD-L1双功能抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)鼠源anti-PD-L1抗体的人源化改造
用人抗体基因的Germline基因作为模板采用Framework shuffling方法将鼠源anti-PD-L1抗体人源化并优化为scFv的形式，其中相应的VH和VL构架改组的文库都是通过重叠PCR的全体外合成生成的，然后构建scFv噬菌体文库的克隆，筛选和鉴定，最终得到在VH44和VL100位置处引入了半胱氨酸残基的抗PD-L1 scFv；
2)构建、表达和纯化抗HER2/抗PD-L1双功能抗体
曲妥珠单抗轻链和重链的氨基酸序列来自IMGT/mAb-DB，将步骤1)中得到PD-L1scFvs通过linker连接肽连接到曲妥珠单抗Fc片段的C末端，
在该步骤中，合成了对应的DNA序列，并将其亚克隆到pcDNA3.1载体中并在大肠杆菌中扩增，之后通过PEI将纯化的质粒转染到HEK293细胞中，然后将细胞悬浮在
Figure BDA0003331645630000031
FreeStyleTM293表达培养基中进行培养后，收集细胞培养上清液，并通过蛋白A柱纯化抗体，纯化的IgG1用磷酸盐缓冲液透析，速冻并保存。
另一方面，本发明提供一种所述抗HER2/抗PD-L1双功能抗体在制备预防、诊断、治疗或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
在具体实施方式中，所述药物通过结合HER2、阻断HER2信号通路从而抑制肿瘤。
在具体实施方式中，所述药物通过结合PD-L1、阻断PD-1与PDL-1结合、激活T淋巴细胞的药物、提高T淋巴细胞中IL-2、IFN-γ表达，从而抑制肿瘤。
在具体实施方式，所述肿瘤选自肺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、肾瘤、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、大肠癌、鼻咽癌、脑肿瘤、宫颈癌、血癌、骨癌、淋巴癌、胰脏癌中的一种或多种。
本发明获得的有益效果如下：
本发明所用的方法是目前治疗肿瘤的一种新的前沿方法，肿瘤免疫治疗有望成为继手术、化疗、放疗、靶向治疗后肿瘤治疗领域的一场革新。本发明中的262-2#抗HER2/抗PD-L1双功能抗体可以与PD-L1结合，亲和力＜1pM。同时也能够与HER2结合，亲和力为6.36nM，成为一种新型的抗肿瘤药物。
附图说明
图1：本申请制备实施例中抗-PD-L1鼠源抗体单链抗体(scFv)改造及人源化热稳定性筛选噬菌体ELISA。a.1-100#；b.117-223#；c.224-285#。
图2：本申请制备实施例中抗-PD-L1鼠源抗体单链抗体(scFv)改造及人源化亲和力筛选噬菌体ELISA。
图3：本申请制备的抗HER2/抗PD-L1双功能抗体的结构图，其中a表示HER2/PD-L1(VL-VH)；b表示HER2/PD-L1(VH-VL)。
图4：本申请的双功能抗体热稳定性筛选ELISA。a.97-1#抗体热稳定性筛选ELISA；b.262-2#抗体热稳定性筛选ELISA；c.265-1#抗体热稳定性ELISA。
图5：本申请的双功能抗体光稳定性筛选ELISA。
图6：本申请的双功能抗体BLI亲和力检测图。
图7：本申请的双功能抗体种属交叉结合ELISA。a.262-2#抗体与各种属PD-L1抗原种属交叉结合ELISA；b.262-2#抗体与各种属ERRB2抗原种属交叉结合ELISA。
图8：本申请的双功能抗体PD-1/PD-L1通路阻断ELISA。
图9：本申请的双功能抗体Tm值测定(DSF)。
图10：本申请的双功能抗体SEC-HPLC纯度测定。
图11：本申请的双功能抗体诱导T细胞分泌IFN-γ。
图12：本申请的262-2#抗体克服PD-L1介导的T细胞活化抑制。
图13：本申请的双功能抗体抑制乳腺癌细胞系SKBR3的体外增殖。
图14：本申请的双功能抗体介导的抗体依赖的靶向，a.NCI-N87&b.HCC1954肿瘤细胞的杀伤效应(ADCC)。
图15：本申请的双功能抗体的体内抑瘤效果。a.实验终点时各实验组的肿瘤重量；b.实验终点时各实验组肿瘤大小对比图。
图16：本申请的双功能抗体的食蟹猴体内的血清稳定性(PK)。
具体实施方式
术语：
在本申请中，术语“单链抗体”可与单链可变片段(scFv)互换使用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
制备实施例
1.鼠源anti-PD-L1抗体的人源化改造
用人抗体基因的Germline基因作为模板采用Framework shuffling方法将鼠源anti-PD-L1抗体人源化并优化为scFv的形式。相应的VH和VL构架改组的文库都是通过重叠PCR的全体外合成生成的。然后构建scFv噬菌体文库的克隆，筛选和鉴定。
更准确地说，使用一步策略将鼠源anti-PD-L1抗体人源化及scFv的改造。从该亚文库中筛选出约1000个克隆，用ELISA方法对挑取的阳性克隆进行噬菌体水平热稳定性筛选，在高吸附力的96孔ELISA板中包被100nM huPD-L1抗原，将筛选的噬菌体过夜扩增后的上清经60℃、70℃加热处理，在相同的ELISA反应条件下，7#、35#、38#、57#、64#、69#、77#、89#、97#、120#、150#、201#、209#、224#、243#、244#、259#、262#、264#、265#、267#、268#、274#、281#、284#显示出较高的OD450读值，以及加热处理后读值变化较小(图1)。共检测285个克隆，ELISA检测仅有83个克隆有较好的OD450读值。
通过梯度降低huPD-L1抗原包被浓度，对热稳定性筛选出的25个克隆进行进一步亲和力的ELISA水平检测。在相同的ELISA反应条件下，64#，77#，97#，150#，265#显示出了较好的亲和力，在100nM和50nM的抗原检测浓度时OD450读值并未有较大的变化。262#和264#随着抗原浓度的降低OD450的读值有较大程度的降低，但是在100nM的抗原检测浓度时读值较好，显示出了在较高浓度是较好的结合能力，也被选择进一步研究(图2)
2.构建、表达和纯化抗HER2/抗PD-L1双功能抗体
抗PD-L1 scFvs在VH44和VL100位置处引入了半胱氨酸残基。曲妥珠单抗轻链和重链的氨基酸序列来自IMGT/mAb-DB(重链氨基酸序列为SEQ ID NO.：1；轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.：2)，并且抗PD-L1 scFvs(VH-VL和VL-VH)通过连接肽linker((SEQ ID NO.：8)连接到Fc片段的C末端(结构如图3A和3B所示)。合成了DNA序列，并将其亚克隆到pcDNA3.1载体中并在大肠杆菌中扩增。通过PEI将纯化的质粒转染到HEK293细胞中。然后将细胞悬浮在
Figure BDA0003331645630000061
FreeStyleTM293表达培养基中进行培养。培养6天后，收集细胞培养上清液，并通过蛋白A柱纯化抗体。纯化的IgG1用磷酸盐缓冲液(PBS)透析，速冻并保存在-80℃。根据以下表一的结果只有编号77-1#、77-2#、97-1#、97-2#、262-2#、265-1#纯化到了用于下游检测的抗体。双功能抗体77-1#的轻链氨基酸序列和重链氨基酸序列分别为SEQ ID NO.：5和SEQID NO.：6；262-2#的轻链氨基酸序列和重链氨基酸序列分别为SEQ ID NO.：5和SEQ IDNO.：7。
表一：HER2/PD-L1在HEK293中的产量
product yield(g/L)
HER2/PDL1 64-1# ---
HER2/PDL1 64-2# 1.35
HER2/PDL1 77-1# 4.6
HER2/PDL177-2# 4.5
HER2/PDL1 97-1# 66.815
HER2/PDL1 97-2# 9.207
HER2/PDL1 150-1# 0.9
HER2/PDL1 150-2# 0.9
HER2/PDL1 262-1# 2.7
HER2/PDL1 262-2# 79.5
HER2/PDL1 264-1# ---
HER2/PDL1 264-2# ---
HER2/PDL1 265-1# 91.35
HER2/PDL1 265-2# ---
测试实施例
实施例1.热稳定性筛选
抗HER2/抗PD-L1双功能抗体的浓度调整为10mg/ml。分别在室温、60℃、70℃水浴孵育1h，然后，在结合ELISA中评估了抗HER2/抗PD-L1双功能抗体(下文也称为“HER2/PD-L1双功能抗体”或“双功能抗体(bsAb)”)对结合人源PD-L1和人源HER2抗原的效力。将96孔免疫板在4℃下用2μg/ml带有his标签的抗原包被过夜。将HER2/PD-L1双功能抗体和曲妥珠单抗的三倍系列稀释液加到孔中。孵育一小时后，结合辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG(H+L)检测结合的HER2/PD-L1双功能抗体，并用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺底物进行显影。然后用SpectraMaxM5e(MolecularDevices)酶标仪在450nm处检测。结果如图4所示，265-1#bsAb(双功能抗体)经加热处理后，与hu-PD-L1抗原的结合活性迅速降低；97-1#bsAb经60℃加热后与hu-PD-L1的结合EC50为0.06835nM，与未加热组的结合EC50值0.03374nM相近，但是经70℃加热后与hu-PD-L1的结合EC50值为184.1nM，比未处理组下降了10000倍；262-2#bsAb经60℃、70℃加热处理及未加热组与hu-PD-L1的结合EC50值分别为0.04634nM、0.1254nM、0.02127nM,都只有2-3倍的差别；根据结果分析认为262-2#bsAb的热稳定性是最好的。
实施例2.光照稳定性筛选
HER2/PD-L1双功能抗体的光降解按照ICH指南(Q1B，1997)在左城SHH-3SDT系列光稳定性试验箱(暴露1个周期-120万勒克斯小时的可见光(400-700nm)，200Wh/每平方米UVA光(320-400nm)测定。将黑暗对照组和暴露于光的样品都用橡皮塞压紧15ml玻璃小瓶后，保存在光稳定性室内。HER2/PD-L1双功能抗体的浓度为10mg/ml。然后，结合ELISA进行样品的活性测定。结果如图5所示，77-1#bsAb与hu-PD-L1在100nM抗体浓度时几乎检测不到结合活性；97-1#bsAb光照后与hu-PD-L1的结合EC50值为4.825nM与未处理组的EC50值0.2761nM比较，下降了17倍；262-2#bsAb经光照处理及未处理组与hu-PD-L1的结合EC50值分别为0.2124nM和0.7044nM，只有3倍的差别；根据结果分析认为，262-2#bsAb的光稳定性也是最好的。
实施例3.生物膜干涉技术(BLI)
将HER2/PD-L1双功能抗体在样品缓冲液(PBS中的0.02％吐温20和0.1％BSA)中稀释至10μg/ml，并将抗原hu-HER2和hu-PD-L1在样品缓冲液中稀释至100nM。通过BLI(forteBIO；Pall)分析HER2/PD-L1双功能抗体与特定hu-HER2和hu-PD-L1抗原的结合。所有测量均在室温下的样品缓冲液中进行。将bsAb(10μg/ml)固定在proteinA生物传感器上，并从100nM滴定抗原以获得速率常数和亲和力。KD值是通过使用供应商提供的软件应用1：1绑定等温线获得的。结果如图6所示，262-2#bsAb与hu-PD-L1的结合亲和力要强于阳性对照抗体Avelumab；262-2#bsAb与hu-HER2的结合亲和力与阳性对照抗体曲妥珠单抗一致。
实施例4.种属交叉反应
作为治疗型抗体为了可以在食蟹猴体内做毒性试验和药代动力学的实验，以及确认小鼠药效模型的可行性，检测bsAb与食蟹猴及小鼠靶抗原的种属交叉反应性，在此采用ELISA方法，检测了其分别对人源抗原、鼠源抗原及食蟹猴源抗原的结合活性。并与阳性对照抗体曲妥珠单抗及Avelumab进行比较，如图7所示。根据结果显示262-2#bsAb与小鼠来源的抗原没有结合活性，但是与人源和食蟹猴来源的抗原结合活性相近。这为262-2#bsAb在食蟹猴体内进行毒理研究提供了理论基础。
实施例5.PD-1/PD-L1通路阻断ELISA
在竞争性ELISA中评估了HER2/PD-L1双功能抗体阻止hu-PD-L1与hu-PD1结合的能力。将hu-PD-L1蛋白在96孔板中于4℃孵育过夜。在1μg/mLhu-PD1-生物素存在的情况下，将HER2/PD-L1双功能抗体和曲妥珠单抗的三倍系列稀释液应用于孔中。孵育一小时后，结合辣根过氧化物酶(HRP)的链霉亲和素检测结合的竞争性配体，并用TMB底物显影。通过Prism8.0软件确定抗体的IC50(半数最大抑制浓度)。结果如图8所示，结果显示262-2#bsAb与Avelumab均可以有效阻断hu-PD-L1与ms-PD-1和hu-PD-1的结合。与Avelumab相比，262-2#bsAb的阻断活性与其相近，IC50值在20nM左右。
实施例6.差示扫描荧光测定法(DSF)
DSF在实时荧光定量PCR仪器(Bioradcfx96，美国)中进行。每个样品一式三份测量。除非另有说明，否则BioradPCR试管每孔使用25μL样品。混合后所有浓度均为最终浓度。将bsAb在PBS中稀释至1mg/mL浓度。将SYPROOrange从5000x浓缩原液稀释到ddH2O中的工作染料溶液中1000倍，然后添加到样品中。为了防止漂白，将SYPRO橙的工作溶液加入反应中。结果如图9所示，曲妥珠单抗和262-2#bsAb的Tm值都为79.5℃，所以262-2#bsAb有较好的热稳定性。
实施例7.排阻色谱(SEC)
用SEC分析来评估HER2/PD-L1双功能抗体的聚集和降解情况。样品用1260HPLC系统(Agilent，SantaClara，CA)在ThermoMAbPacSEC-1上进行分析，5μm，(7.8×300mm)P/N088460所用的流动相是50mM磷酸钠，300mM氯化钠，pH6.8。通过监测25℃下280nm的吸光度记录SEC色谱图。流速：0.7mL/min。进样量：15ul。结果如图10所示，262-2#bsAb的纯度为97.9350％，曲妥珠单抗的纯度为91.0291％。262-2#bsAb经过一步纯化的纯度较高大于95％，为其开发成为治疗性抗体奠定了坚实的基础。
实施例8.混合淋巴细胞反应(MLR)
树突状细胞(DC)是通过使用500U/mL白介素4(IL-4)和250U/mLGM-CSF在体外用单核细胞纯化试剂盒(MiltenyiBiotec)从PBMC中分离的单核细胞培养7天而产生的(R&DSystems)。在试验开始时，在加或不加抗体的情况下，将CD4+T细胞(1×105)和同种异体DC(1×104)共培养。5天后，通过ELISA分析培养上清液中的IFNγ分泌。结果如图11所示，262-2#bsAb阻断PD-1/PD-L1通路增强IFN-γ释放的能力略强于Avelumab，尤其在较低浓度时，262-2#bsAb促进IFN-γ分泌的能力明显强于Avelumab，这可能是因为bsAb与hu-PD-L1的结合亲和力更强的原因。
实施例9.T细胞激活实验
将1ug/ml抗CD3(克隆HIT3a)、1ug/ml抗CD28(克隆CD28.2)和5ug/ml人PD-L1在4℃下于96孔细胞板(Corning，USA)中包被1小时。使用相同的方法，用单独的小鼠IgG2a同种型对照或用抗CD3、抗CD28包被对照孔。根据制造商的说明，使用DynabeadsTMCD4阳性分离试剂盒分离CD4+T细胞。将CD4+T细胞中加入抗体一起在预先包被的96孔板中以所示浓度在37℃下在补充有10％FBS的RPMI1640中培养4天。4天后，通过CCK8检测T细胞的计数。结果如图12所示，当PD-L1存在于细胞培养板上时，T细胞的增殖显著降低了，这证实了PD-L1提供了抑制信号。262-2#bsAb和Avelumab都能够抑制PD-L1的这种活性，加入相同浓度的262-2#bsAb和Avelumab的情况下，262-2#bsAb逆转促PD-L1抑制T细胞激活功能的能力Avelumab。T细胞增值率计算方式：(抗体组OD450值－CD3/CD28/PDL1组OD450值)/(CD3/CD28组OD450值－CD3/CD28/PDL1组OD450值)x 100％。
实施例10.SKBR3肿瘤细胞增殖抑制实验
用细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定细胞增殖。将细胞以10000个SKBR3细胞/孔接种到96孔板中。孵育过夜后，将HER2/PD-L1双功能抗体(262-2#bsAb)和曲妥珠单抗的系列稀释液加到孔中。将96孔板在37℃，5％CO2的潮湿箱中孵育96小时。加入CCK8试剂并放回培养箱中，直到未处理的对照细胞在450nm处的吸光度大于1.0。以相对于未处理细胞的生长百分比来测量生长抑制。从一式三份测定的平均值产生剂量-反应曲线，并使用PrismGraphPad软件计算IC50值。结果如图13所示，262-2#bsAb与曲妥珠单抗对SKBR3的增殖抑制作用相近，IC50值分别为0.196nM和0.8299nM。
实施例11.抗体依赖的细胞毒性试验(ADCC)
使用LDH细胞毒性检测试剂盒测定ADCC。人类PBMCs是用Ficoll梯度从leukopacks中纯化获得。通过使用阴性选择磁珠(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)从人PBMC中分离NK细胞。在试验开始时，在加或不加HER2/PD-L1双功能抗体(262-2#bsAb)的情况下，共培养NK细胞(3×10E6)和靶细胞(3×10E5)。18小时后，通过ELISA分析培养上清液中LDH的分泌。将细胞37℃孵育18小时后，收集细胞上清液，并用IFN-γELISA检测试剂盒测定上清液中IFN-γ的浓度。结果如图14所示，结果显示相同摩尔数的HER2/PD-L1(262-2#bsAb)的ADCC效应明显强于曲妥珠单抗，即使在HER2+PDL－胃癌细胞NCI-N87中也是如此。
实施例12.双功能抗体的体内药效研究
第0天，在35只NOG小鼠(28只小鼠，另加7只多余的小鼠)的右腹皮下接种5×10E6人乳腺癌HCC1954细胞。当肿瘤细胞接种7天(第7天)后平均肿瘤体积达到100mm3时，根据肿瘤体积平均分为5组。然后，将重悬于PBS中的1×10E7 PBMC注射到NOG小鼠的尾静脉中。给1-4组的小鼠进行腹膜内注射。样品管理：第一组，同型对照7.5mg/kg；第2组，7.5mg/kg赫赛汀(曲妥珠单抗)；第3组，7.5mg/kg赫赛汀和7.5mg/kg抗PD-L1单抗；第4组，10mg/kg 262-2#bsAb。在接种后的第14、17、21、24、28和31天分别给药，共6次。根据相对肿瘤体积(TGIRTV)，动物体重变化和死亡率，根据肿瘤生长抑制值评估疗效和安全性。结果如图15所示，结果显示在第42天实验终点时，HER2/PD-L1组的抑瘤效果与isotype组比较有极显著的差异P<0.0001；曲妥珠单抗与anti-PD-L1联合用药组的抑瘤效果与isotype组比较有显著性差异P＝0.0028；综上结果显示，262-2#bsAb组的抑瘤效果好于联合用药组合曲妥珠单抗用药组。
实施例13.食蟹猴体内的血清稳定性研究
在单剂量PK研究中，两只食蟹猴接受了一次静脉注射。10mg/kg262-2#bsAb。给药后-24h，1h，4h，8h，12h，24h，48h，96h，192h，264h，360h，504h采集全血。用ELISA绘制的标准曲线测定食蟹猴血清中262-2#HER2/PD-L1双功能抗体的浓度。通过ELISA检测食蟹猴血清中262-2#HER2/PD-L1双功能抗体的浓度。将hu-PD-L1-his在平板上包被过夜，然后洗涤并连续稀释血清孵育。然后，加入hu-HER2-生物素抗原。1小时后，加入HRP-链霉亲和素，TMB底物产生检测信号。最后，用硫酸终止反应，并在450nm下检测。反应的颜色密度与262-2#HER2/PD-L1双功能抗体的浓度有关。结果如图16所示，在第20天时还可以检测到体内有完整的bsAb的残留，且浓度-时间曲线显示bsAb在食蟹猴体内并没有快速清除，这为将262-2#bsAb开发为治疗性抗体奠定了基础。
从以上测试结果可以看出，本申请制备的双功能抗体可以与PD-L1结合，也能够与HER2结合，并且体内药学研究表明，其相较于
Figure BDA0003331645630000111
及anti-PD-L1或两者的联合显示出更为显著的抑瘤活性。
序列表
<110> 达石药业（广东）有限公司；上海迈石生物技术有限公司；深圳创石生物医药有限公司
<120> 一种抗HER2/抗PD-L1双功能抗体及其应用
<130> DI21-0184-XC03
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗的重链
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
    210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
                245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
            260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
        275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
    290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
                325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
            340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
        355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
    370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
                405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
            420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440                 445
Gly Lys
    450
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗的轻链
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210> 3
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<212> PRT
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<220>
<223> scFv (77-1#)
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Thr Tyr
            20                  25                  30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu
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Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln
        115                 120                 125
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
    130                 135                 140
Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Phe Gly Val His Trp Val Arg
145                 150                 155                 160
Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Trp Pro Gly
                165                 170                 175
Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Val Thr Ile Thr
            180                 185                 190
Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg
        195                 200                 205
Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Gly Arg
    210                 215                 220
Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
225                 230                 235
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<213> 人工序列
<220>
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe
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Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Trp Pro Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
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Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Glu Asn Tyr Gly Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
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Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
145                 150                 155                 160
Ile Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
                165                 170                 175
Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser
            180                 185                 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
        195                 200                 205
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His
    210                 215                 220
Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225                 230                 235
<210> 5
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 双功能抗体的轻链
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210> 6
<211> 704
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 双功能抗体的重链 (77-1#)
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
    210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
                245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
            260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
        275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
    290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
                325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
            340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
        355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
    370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
                405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
            420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440                 445
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly
    450                 455                 460
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
465                 470                 475                 480
Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Thr
                485                 490                 495
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
            500                 505                 510
Ile Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
        515                 520                 525
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu
    530                 535                 540
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro
545                 550                 555                 560
Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
                565                 570                 575
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
            580                 585                 590
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser
        595                 600                 605
Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Phe Gly Val His Trp Val
    610                 615                 620
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Trp Pro
625                 630                 635                 640
Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Val Thr Ile
                645                 650                 655
Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
            660                 665                 670
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Tyr Gly
        675                 680                 685
Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    690                 695                 700
<210> 7
<211> 704
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 双功能抗体的重链 (262-2#)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
    210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
                245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
            260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
        275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
    290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
                325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
            340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
        355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
    370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
                405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
            420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440                 445
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly
    450                 455                 460
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
465                 470                 475                 480
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr
                485                 490                 495
Phe Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp
            500                 505                 510
Met Gly Ile Ile Trp Pro Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu
        515                 520                 525
Met Ser Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
    530                 535                 540
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
545                 550                 555                 560
Ala Arg Glu Asn Tyr Gly Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
                565                 570                 575
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
            580                 585                 590
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
        595                 600                 605
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
    610                 615                 620
Ser Ile Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
625                 630                 635                 640
Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro
                645                 650                 655
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
            660                 665                 670
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly
        675                 680                 685
His Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
    690                 695                 700
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> linker
<400> 8
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接肽
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv重链的CDR1
<400> 10
Thr Phe Gly Val His
1               5
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv重链的CDR2
<400> 11
Ile Ile Trp Pro Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser
1               5                   10                  15
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv重链的CDR3
<400> 12
Glu Asn Tyr Gly Arg Ala Leu Asp Tyr
1               5
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv轻链的CDR1
<400> 13
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Thr Tyr Leu His
1               5                   10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv轻链的CDR2
<400> 14
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1               5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv轻链的CDR3
<400> 15
Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu Thr
1               5

Claims (12)

1.一种抗HER2/抗PD-L1双功能抗体，其包括：
单克隆抗体单元，其针对HER2并且包括2个重链和2个轻链；
单链抗体单元，其针对PD-L1并且包括2个单链抗体，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区通过连接肽连接；
其中，所述2个单链抗体的N端或C端分别通过linker与所述单克隆抗体单元的2条重链的Fc片段的C端连接，
其中，所述单链抗体的重链可变区包括氨基酸序列为SEQ ID NO.：10的CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO.：11的CDR2、氨基酸序列为SEQ ID NO.：12的CDR3，以及所述单链抗体的轻链可变区包括氨基酸序列为SEQ ID NO.：13的CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO.：14的CDR2、氨基酸序列为SEQ ID NO.：15的CDR3。
2. 根据权利要求1所述的抗HER2/抗PD-L1双功能抗体，其中，所述linker的序列如SEQID NO.：8所示。
3.根据权利要求1所述的抗HER2/抗PD-L1双功能抗体，其中，在所述单链抗体中的连接肽为1-5个重复的GGGGS的序列。
4. 根据权利要求1所述的抗HER2/抗PD-L1双功能抗体，其中，所述连接肽的序列如SEQID NO.：9所示。
5. 根据权利要求1所述的抗HER2/抗PD-L1双功能抗体，其中，所述单链抗体的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：3或SEQ ID NO.：4所示。
6. 根据权利要求1所述的抗HER2/抗PD-L1双功能抗体，其中，所述双功能抗体的轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：5所示，以及所述双功能抗体的重链全长氨基酸序列如SEQID NO.：6所示。
7. 根据权利要求1所述的抗HER2/抗PD-L1双功能抗体，其中，所述双功能抗体的轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：5所示，以及所述双功能抗体的重链全长氨基酸序列如SEQID NO.：7所示。
8.一种编码如权利要求1至7中任一项所述的抗HER2/抗PD-L1双功能抗体的多核苷酸。
9.一种表达载体，其包含如权利要求8所述的多核苷酸。
10.如权利要求1至7中任一项所述的抗HER2/抗PD-L1双功能抗体在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其中，所述治疗为辅助治疗。
12.根据权利要求10所述的应用，其中，所述肿瘤选自肺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、肾瘤、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、大肠癌、鼻咽癌、脑肿瘤、宫颈癌、骨癌、淋巴癌、胰脏癌中的一种或多种。
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EP3455257B1 (en) * 2016-05-09 2021-09-22 IGM Biosciences Inc. Anti-pd-l1 antibodies
GB201611530D0 (en) * 2016-07-01 2016-08-17 Alligator Bioscience Ab Novel polypeptides
CN110790840A (zh) * 2018-08-01 2020-02-14 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合人her2的抗体、其制备方法和用途
CN111196856A (zh) * 2018-11-19 2020-05-26 三生国健药业（上海）股份有限公司 抗her2/pd1双特异性抗体
CN109776683B (zh) * 2019-03-19 2020-04-07 益科思特(北京)医药科技发展有限公司 一种双特异性抗体及其制备方法与应用
CN113754775A (zh) * 2020-06-02 2021-12-07 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抗pd-l1和her2的双特异性抗体
CN113289029B (zh) * 2021-05-20 2023-09-05 上海赛金生物医药有限公司 一种单克隆抗体-细胞因子融合蛋白制剂
CN113943371B (zh) * 2021-11-01 2023-05-05 达石药业(广东)有限公司 一种抗her2/抗pd-l1双功能抗体及其应用

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