ES2643694T3 - Anticuerpos anti-HER3 humanos y sus usos - Google Patents

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Pueden hacerse modificaciones y cambios en la estructura de los anticuerpos de la presente invención, y en las secuencias de ADN que los codifican, y todavía se obtiene una molécula funcional que codifica un anticuerpo con características deseables.

Al hacer los cambios en las secuencias de aminoácidos, se puede considerar el índice hidropático de aminoácidos. La importancia del índice de aminoácidos hidropático en conferir función biológica interactiva a una proteína se entiende generalmente en la técnica. Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares. A cada uno de los aminoácidos se le ha asignado un índice hidropático sobre la base de sus características de hidrofobicidad y carga: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); isina (-3,9); y arginina (-4,5).

El presente texto también describe variantes conservadoras de la función de los anticuerpos de la presente invención.

"Variantes conservadoras de la función" son aquéllas en las que se ha cambiado un residuo aminoácido dado en una proteína o enzima sin alterar la conformación y la función globales del polipéptido, incluyendo, pero no limitándose al reemplazo de un aminoácido por uno que tenga un propiedades similares (tales como, por ejemplo, polaridad, potencial de enlace hidrógeno, carácter ácido, carácter básico, hidrofóbico, aromático y similares). Los aminoácidos distintos de los indicados como conservados pueden diferir en una proteína, de modo que el porcentaje de similitud de la secuencia de proteínas o aminoácidos entre cualesquiera dos proteínas de función similar puede variar y puede ser, por ejemplo, del 70% al 99% según se determina de acuerdo con un esquema de alineamiento, en el que la similitud se basa en el algoritmo MEGALIGN. Una "variante de función conservadora" también incluye un polipéptido que tiene una identidad de aminoácidos de al menos 60%, según se determina por el algoritmo BLAST o FASTA, preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 85%, todavía preferiblemente al menos 90% e incluso más preferiblemente al menos 95%, y que tiene las mismas propiedades o funciones sustancialmente similares que la proteína nativa o parental con la que se compara.

Dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando más del 80%, preferiblemente más del 85%, preferiblemente más del 90% de los aminoácidos son idénticos, o más de aproximadamente 90%, preferiblemente más de 95% son similares (funcionalmente idénticos) a lo largo de toda la longitud de la secuencia más corta. Preferiblemente, las secuencias similares u homólogas se identifican mediante alineamiento utilizando, por ejemplo, el programa de acumulación GCG (Genetics Computer Group, Manual de programa para el paquete GCG, Versión 7, Madison, Wisconsin), o cualquiera de los algoritmos de comparación de secuencias tales como BLAST, FASTA, etc.

Por ejemplo, determinados aminoácidos pueden estar sustituidos por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin pérdida apreciable de actividad. Dado que la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína definen la actividad funcional biológica de la proteína, pueden realizarse determinadas sustituciones de aminoácidos en una secuencia de proteínas y, por supuesto, en su secuencia que codifica el ADN, a la vez que, no obstante, se obtiene una proteína con propiedades similares. Se contempla, por lo tanto, que se pueden hacer diversos cambios en las secuencias de anticuerpos de la invención, o secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos anticuerpos, sin pérdida apreciable de su actividad biológica.

Se sabe en la técnica que determinados aminoácidos pueden estar sustituidos con otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y que todavía resultan en una proteína con actividad biológica similar, es decir, todavía se obtiene una proteína funcional biológicamente equivalente.

Como se ha indicado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de las cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Sustituciones a modo de ejemplo que tienen en consideración varias de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Otro tipo de modificación de aminoácidos del anticuerpo de la invención puede ser útil para alterar el patrón de glicosilación original del anticuerpo.

Por “alterar” se entiende suprimir uno o más restos hidrato de carbono encontrados en el anticuerpo y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.

imagen8

10

15

20

25

30

35

40

45

50

proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Compuestos bioluminiscentes que son útiles para el marcaje incluyen luciferina, luciferasa y aequorina.

Alternativamente, los inmunoconjugados anti-HER3 pueden marcarse de forma detectable enlazando un anticuerpo monoclonal anti-HER3 humano a una enzima. Cuando el conjugado enzimático anti-HER3 se incuba en presencia del sustrato apropiado, el resto enzimático reacciona con el sustrato para producir un resto químico que puede ser detectado, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Ejemplos de enzimas que pueden utilizarse para marcar de forma detectable inmunoconjugados poliespecíficos incluyen β-galactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa y fosfatasa alcalina.

Los expertos en la técnica sabrán de otros marcadores adecuados que se pueden emplear de acuerdo con la presente invención. La unión de restos marcadores a anticuerpos monoclonales anti-HER3 humanos se puede llevar a cabo utilizando técnicas estándares conocidas en la técnica. La metodología típica a este respecto se describe por Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70: 1, 1976; Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1, 1977; Shih et al., Int'l J. Cancer 46: 1101, 1990; Stein et al., Cancer Res. 50:1330, 1990; y Coligan, supra.

Además de ello, la conveniencia y versatilidad de la detección inmunoquímica puede ser potenciada utilizando anticuerpos monoclonales anti-HER3 humanos que han sido conjugados con avidina, estreptavidina y biotina. (Véase, p. ej., Wilchek et al. (comps.), "Avidin-Biotin Technology", Methods in Enzymology (Vol. 184) (Academic Press 1990), Bayer et al., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology" en Methods In Molecular Biology (Vol. 10) 149-162 (Manson, comp., The Humana Press, Inc., 1992).)

Métodos para realizar inmunoensayos están bien establecidos. (Véase, p. ej., Cook y Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application 180-208 (Ritter y Ladyman, comps., Cambridge University Press 1995), Perry, The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology", en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 107-120 (Birch y Lennox, comps., Wiley-Liss, Inc. 1995), Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996).)

En otro aspecto, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpo monoclonal anti-HER3 humano. Un "conjugado de anticuerpo monoclonal anti-HER3 humano", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-HER3 humano de acuerdo con la invención conjugado con un agente terapéutico. Tales conjugados de anticuerpo monoclonal anti-HER3 humano producen efectos clínicamente beneficiosos sobre células que expresan HER3 cuando se administran a un sujeto tal como, por ejemplo, un sujeto con un cáncer que expresa HER3, típicamente cuando se administra solo, pero también en combinación con otros agentes terapéuticos.

En realizaciones típicas, un anticuerpo monoclonal anti-HER3 humano se conjuga con un agente citotóxico, de modo que el conjugado anticuerpo-fármaco resultante ejerce un efecto citotóxico o citostático en una célula que expresa HER3 (p. ej., una célula cancerosa que expresa HER3) cuando es absorbida o internalizada por la célula. Restos particularmente adecuados para la conjugación con anticuerpos son agentes quimioterapéuticos, enzimas de conversión de profármacos, isótopos o compuestos radiactivos o toxinas. Por ejemplo, se puede conjugar un anticuerpo monoclonal anti-HER3 humano con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico o una toxina (p. ej., un agente citostático o citocida tal como, por ejemplo, abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o difteria toxina).

Clases útiles de agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, agentes antitubulina, auristatinas, ligantes de surco menor de ADN, inhibidores de la replicación de ADN, agentes alquilantes (p. ej., complejos de platino tales como cisplatino, mono(platino), bis(platino) y complejos de platino tri-nucleares y carboplatino), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas, etopósidos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureas, platinoles, compuestos de pre-conformación, antimetabolitos de purina, puromicinas, sensibilizadores de radiación, esteroides, taxanos, inhibidores de topoisomerasa, alcaloides de la vinca

o similares.

Agentes citotóxicos individuales incluyen, por ejemplo, un andrógeno, antramicina (AMC), asparaginasa, 5azacitidina, azatioprina, bleomicina, busulfán, butionina sulfoximina, camptotecina, carboplatino, carmustina (BSNU), CC-1065 (Li et al., Cancer Res. 42: 999-1004, 1982), clorambucil, cisplatino, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, citidina arabinósido, citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), daunorubicina, decarbazina, docetaxel, doxorubicina, un estrógeno, 5-fluordeoxiuridina, fosfato de etopósido (VP-16), 5fluorouracilo, gramicidina D, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina (CCNU), mecloroetamina, melfalan, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazol, paclitaxel, plicamicina, procarbizina, estreptozotocina, tenopósido (VM-26), 6-tioguanina, tioTEPA, topotecán, vinblastina, vincristina y vinorelbina.

imagen9

10

15

20

25

30

35

40

45

50

páncreas, tumores de células gliales tales como glioblastoma y neurofibromatosis, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, melanoma, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñón, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. En una realización particular, un cáncer diagnosticado utilizando los métodos descritos previamente es cáncer de mama o cáncer de ovario. En una realización preferida, los anticuerpos de la invención son útiles para diagnosticar cáncer de mama y de ovario.

En una realización preferida, anticuerpos de la invención pueden marcarse con una molécula o sustancia detectable tal como una molécula fluorescente, una molécula radiactiva o cualesquiera otros marcadores conocidos en la técnica como los arriba descritos. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede marcarse con una molécula radiactiva por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, moléculas radiactivas incluyen, pero no están limitadas al átomo radiactivo para estudios de centellografía tales como I123, I124, In111, Re186, Re188. Los anticuerpos de la invención pueden marcarse también con un marcador de spin para la formación de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como formación de imágenes por resonancia magnética, mri), tal como yodo-123, yodo-131, indio-III, flúor-19, carbono -13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Después de la administración del anticuerpo, se detecta la distribución del anticuerpo dentro del paciente. Métodos para detectar la distribución de cualquier marcador específico son conocidos por los expertos en la técnica y puede utilizarse cualquier método apropiado. Algunos ejemplos no limitativos incluyen, tomografía computarizada (TC), tomografía por emisión de posición (PET), formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), fluorescencia, quimioluminiscencia y ecografía.

Anticuerpos de la invención pueden ser útiles para la estadificación de enfermedades cancerosas asociadas con la expresión de HER3 (p. ej., en formación de radioimágenes). Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden ser útiles para estadificar un cáncer de mama o de ovario. Pueden utilizarse solos o en combinación con otros marcadores de cáncer de mama o de ovario, incluyendo, pero no limitados a HER2, CA1 25, HE4 y mesotelina.

Típicamente, dichos métodos de diagnóstico implican el uso de una muestra biológica obtenida del paciente. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "muestra biológica" abarca una diversidad de tipos de muestras obtenidos de un sujeto y se puede utilizar en un ensayo de diagnóstico o monitorización. Muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido tales como una muestra de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de la misma y la progenie de la misma. Por ejemplo, las muestras biológicas incluyen células obtenidas de una muestra de tejido recogida de un individuo sospechoso de tener una enfermedad cancerosa asociada con la expresión de HER3, y en una realización preferida de mama u ovario. Por lo tanto, muestras biológicas abarcan muestras clínicas, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluido biológico, y muestras de tejidos.

En una realización particular, el presente texto describe un método para diagnosticar una enfermedad cancerosa asociada con la expresión de HER3 en un sujeto, detectando HER3 en células del sujeto utilizando el anticuerpo de la invención. En particular, dicho método de diagnóstico puede comprender las etapas que consisten en:

(a)

poner en contacto una muestra biológica de un sujeto susceptible de padecer una enfermedad cancerosa asociada con la expresión de HER3 con un anticuerpo de acuerdo con la invención en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con células de la muestra biológica que expresan HER3;

(b)

detectar y/o cuantificar dichos complejos, con lo que la detección de dichos complejos es indicativa de una enfermedad cancerosa asociada con la expresión de HER3.

Con el fin de monitorizar la enfermedad cancerosa, el método de diagnóstico previamente descrito puede repetirse a diferentes intervalos de tiempo, con el fin de determinar si la unión del anticuerpo a las muestras aumenta o disminuye, con lo que se determina si la enfermedad cancerosa progresa o retrocede.

Usos terapéuticos:

Anticuerpos, fragmentos o inmunoconjugados de la invención pueden ser útiles para tratar cualquier cáncer que exprese HER3. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse solos o en combinación con cualquier agente adecuado.

Ejemplos de cáncer que expresa HER3 incluyen, pero no se limitan a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, tumores de células gliales tales como glioblastoma y neurofibromatosis, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, melanoma, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar,

imagen10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Zentaris, Keryx, National Cancer Institute); AG-024322 (Pfizer); AZD-1152 (AstraZeneca); ON-01910Na (Onconova); y AZD-0530 (AstraZeneca).

Composiciones farmacéuticas:

Para la administración, el anticuerpo monoclonal anti-HER3 humano o el conjugado de anticuerpo-fármaco se formula como una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-HER3 humano o un conjugado de anticuerpo-fármaco puede formularse de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, en donde la molécula terapéutica se combina en una mezcla con un soporte farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es un "soporte farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. Solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de un soporte farmacéuticamente aceptable. Otros soportes adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. (Véase, p. ej., Gennaro (comp.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19ª edición, 1995).). Las formulaciones pueden incluir, además, uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes tampón, albúmina para evitar la pérdida de proteínas en las superficies de los viales, etc.

La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosificación y el régimen dependen naturalmente de la afección a tratar, de la gravedad de la enfermedad, de la edad, peso y sexo del paciente, etc.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse para una administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraocular y similares.

Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación capaz de ser inyectada. Éstas pueden ser, en particular, soluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares, o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente composiciones liofilizadas que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de soluciones inyectables.

Las dosis utilizadas para la administración pueden ser adaptadas en función de diversos parámetros y, en particular, en función del modo de administración utilizado, de la patología relevante, o alternativamente de la duración deseada del tratamiento.

Para preparar composiciones farmacéuticas, una cantidad eficaz del anticuerpo puede disolverse o dispersarse en un soporte o medio acuoso farmacéuticamente aceptable.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una facilidad de jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.

Disoluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Un anticuerpo de la invención puede formularse en una composición en forma neutra o de sal. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales por adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como los ácidos acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

El soporte puede ser también un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede ser provocada por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En

10

15

20

25

30

35

40

45

50

muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes arriba enumerados, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los arriba enumerados. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son técnicas de secado en vacío y liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una disolución filtrada previamente en condiciones estériles del mismo.

También se contempla la preparación de disoluciones más o altamente concentradas para la inyección directa, en las que se prevé el uso de DMSO como disolvente para dar lugar a una penetración extremadamente rápida, proporcionando concentraciones elevadas de los agentes activos a una zona tumoral pequeña.

Tras la formulación, las disoluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas de dosificación tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármaco y similares.

Para la administración parenteral en una disolución acuosa, por ejemplo, la disolución debe ser adecuadamente tamponada si es necesario y el diluyente líquido se hace primero isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que se pueden emplear serán conocidos por los expertos en la técnica a la vista de la presente descripción. Por ejemplo, se puede disolver una dosis en 1 ml de solución isotónica de NaCl y se añade a 1000 ml de fluido de hipodermocisis o se inyecta en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 15ª Edición, páginas 10351038 y 1570-1580). Necesariamente se producirá alguna variación en la dosificación dependiendo del estado del sujeto que se esté tratando. En cualquier caso, la persona responsable de la administración determinará la dosis apropiada para cada sujeto.

Los anticuerpos de la invención se pueden formular dentro de una mezcla terapéutica para que comprenda aproximadamente 0,0001 a 1,0 miligramos, o aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos, o aproximadamente 0,1 a 1,0 o incluso aproximadamente 10 miligramos por dosis o algo así. También se pueden administrar dosis múltiples.

Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tales como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, p. ej., comprimidos u otros sólidos para administración oral; cápsulas de liberación en el tiempo; y cualquier otra forma actualmente utilizada.

En determinadas realizaciones, se contempla el uso de liposomas y/o nanopartículas para la introducción de anticuerpos en células huéspedes. La formación y el uso de liposomas y/o nanopartículas son conocidos por los expertos en la técnica.

Generalmente, las nanocápsulas pueden atrapar compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, tales partículas ultrafinas (de un tamaño de alrededor de 0,1 μm) se diseñan generalmente utilizando polímeros que pueden degradarse in vivo. Se contemplan nanopartículas de cianoacrilato de polialquilo biodegradables que cumplen estos requisitos para uso en la presente invención, y tales partículas pueden ser fácilmente fabricadas.

Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas bicapa concéntricas multilamelares (a las que también se denomina vesículas multilamelares (MLV)). Las MLVs tienen generalmente diámetros de 25 nm a 4 μm. La sonicación de MLVs da lugar a la formación de pequeñas vesículas unilamelares (SUVs) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 Å, que contienen una disolución acuosa en el núcleo. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes.

Kits:

Finalmente, el presente texto también describe kits que comprenden al menos un anticuerpo de la invención. Los kits que contienen anticuerpos de la invención encuentran uso en la detección de la expresión de HER3, o en ensayos terapéuticos o diagnósticos. Los kits pueden contener un anticuerpo acoplado a un soporte sólido, p. ej., una placa

imagen11

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La Figura 15 muestra el posicionamiento de los Residuos Contribuyentes de la Puntualización reconocidos por los mAbs 16D3-C1 y 9F7-F11 sobre la estructura cristalográfica del receptor HER3 no ligado (pdb 1M6B) (lado izquierdo) y la superposición sobre este epítopo sobre la estructura cristalográfica del receptor HER2 unido a pertuzumab (pdb 1S78) (lado derecho).

La Figura 16 muestra la inhibición de la progresión del tumor por los mAbs 16D3-C1 y 9F7-F11 en ratones inmunodeficientes xenoinjertados con células de cáncer epidermoide A431 adictas a HRG, no amplificadas con HER2/PIK3CAwt/p53-mut (A), y la correspondiente curva de supervivencia de Kaplan-Meier (B).

La Figura 17 muestra la inhibición de la progresión del tumor por parte de los mAbs 9F7-F11 y 16D3-C1 en ratones desnudos xenoinjertados con células pancreáticas cancerosas BxPC3, no amplificadas con HER2/PIK3CA-wt/p53-wt

(A) y la correspondiente curva de supervivencia de Kaplan-Meier (B).

La Fig.18 muestra el nivel de fosforilación de Y1289-HER3 y la expresión total de HER3 en xenoinjertos BxPC3 extraídos de ratones tratados con vehículo o 16D3-C1.

La Figura 19 muestra la inhibición de la progresión del tumor por parte del mAb 16D3-C1 específico para HER3, utilizado solo o en combinación con trastuzumab, en células cancerosas adictas a HRG, A431 HER2bajo epidermoides (A) y A549 (B) de pulmón.

EJEMPLO1: GENERACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES DE RATÓN POR INMUNIZACIÓN

Inmunización de Balb/c y Generación de Hibridomas.

Anticuerpos monoclonales contra HER3 se desarrollaron por inmunización secuencial de ratones Balb/c. La proteína HER3-Fc (R&D system) se utilizó como antígeno. Se inyectaron por vía subcutánea a un primer grupo de 5 ratones Balb/c 10 μg de HER3-Fc soluble el día 0, el día 14 y el día 28 en presencia de adyuvante, completo o incompleto de Freund. A un segundo grupo de 5 ratones Balb/c se inyectó por vía intraperitoneal una línea de células NIH 3T3 transfectada con HER2/HER3 (alrededor de 2 x 106 células), previamente estimulada con heregulina (HRG) para fomentar la formación de heterodímeros HER2/HER3. Para monitorizar la respuesta de anticuerpos, se midieron los títulos de anticuerpos mediante ELISA o citometría de flujo. Células del bazo de ratones inmunizados se fusionaron de acuerdo con el protocolo ya descrito (Salhi et al., Biochem., J. 2004) utilizando el mieloma PX63Ag8.653. 105 células fusionadas por pocillo se cultivaron en placas con medio HAT para la selección de hibridomas. Después de 12 días post-fusión, se realizó el rastreo del sobrenadante de hibridoma mediante ELISA utilizando la proteína HER3-Fc como antígeno. En control, los rastreos se harán simultáneamente con los antígenos discriminantes HER2-Fc y el fragmento Fc solo.

Tal como se muestra en la Figura 1A, se seleccionaron trece anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos para HER3. Son específicos para el HER3-Fc soluble y no reconocen el resto Fc. Se seleccionaron cuatro anti-HER3 de ratón Balb/c inmunizado con HER3-Fc y se seleccionaron 9 anti-HER3 de ratones Balb/c inmunizados con células 3T3 transfectadas con HER2/HER3 estimuladas con heregulina. No se observó unión con el antígeno HER2-Fc.

Los anticuerpos anti-HER3 seleccionados se compararon con otros dos anticuerpos Ab6 anti-HER3 (Merrimack Pharmaceuticals) y U1-59 (Amgen/U3 Pharma-Daiichi Sankyo). U1-59 y Ab6 fueron construidos en base a la descripción de las secuencias en las patentes US2008/0124345A1 y US2009/0291085A1, respectivamente.

La reactividad cruzada con el receptor HER3 de ratón se evaluó mediante un ensayo ELISA comparativo con HER3-Fc humano inmovilizado y HER3-Fc de ratón (quimera ErbB3/HER3 Fc de dominio extracelular recombinante de ratón, R & D Systems) revestidos a razón de 250 ng/ml. La mayoría de los clones de la invención, a una concentración de 1 μg/ml, no reaccionó de forma cruzada con HER3 de ratón (Fig. 1B), mientras que el anticuerpo Ab6 reconoció a HER3 de ratón y humano. Los clones 9F7-F11 y 16D3-C1 fueron los mejores aglutinantes. El anticuerpo de control Px irrelevante no se unió a receptores HER3 humanos ni de ratón.

Unión ELISA a HER3

Se revistieron placas de inmunoensayo enzimático de noventa y seis pocillos (Nunc, Paisley, Reino Unido) durante la noche a 4ºC con antígeno HER3-Fc a una concentración de 250 ng/ml en PBS 160 mM pH 7,2. Después de cuatro lavados en PBS 160 mM pH 7,2, que contenían Tween 20 al 0,1% (PBS-T), las placas se saturaron con una disolución al 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en tampón PBS-T durante 60 min a 37ºC. Se añadieron diluciones en serie doble de mAbs purificados específicos para HER3 después de cuatro lavados en PBS-T y las placas se incubaron a 37ºC durante 2 h. Después de cuatro lavados en PBS-T, se añadieron 100 μl de un anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con peroxidasa (Sigma) a cada uno de los pocillos. El conjugado se utilizó a una dilución 1:2000 en PBS-T-BSA al 1%. Las placas se incubaron a 37ºC durante 60 min y después se lavaron cuatro veces en

imagen12

10

15

20

25

30

35

40

45

50

con PBS-BSA al 1%, se añadieron mAbs anti-HER3, a la concentración que daba la unión máxima al 50%, a cada uno de los pocillos durante 1 h sobre hielo. En algunos experimentos, ligando HRG y anticuerpos anti-HER3 fueron co-incubados durante 2 h en hielo. Después se lavaron las células y se incubaron adicionalmente con una dilución

1:60 de anticuerpo secundario conjugado con FITC (Sigma) durante 45 minutos en hielo, antes del análisis de citometría en un aparato Quanta (Beckman-Coulter). Los experimentos de competición por FACS demostraron que el anticuerpo 9F7-F11 no competía con heregulina, lo que sugiere que este anticuerpo no se unió al sitio de unión de HRG (Fig.5). La unión del anticuerpo 9F7-F11 se aumentó incluso cuando se añadió HRG, mientras que la unión del anticuerpo control A positivo no se modificó mediante la incubación de HRG. En contraposición, los anticuerpos 12H8-B11 y 16D3-C1, así como los anticuerpos B y C de control positivo, mostraron una disminución de la unión dependiente de HRG al receptor HER3, demostrando que los epítopos reconocidos por estos anticuerpos están cerrados o localizados en el sitio de unión de HRG, o podría estar impedido estéricamente para la unión del anticuerpo cuando HRG induce la transconformación del receptor HER3 activo para la dimerización (Fig. 5). La concentración inhibidora que condujo al 50% de unión varió en torno a 2,5 nM de ligando HRG para los anticuerpos 12H8-B11 y 16D3-C1. Se obtuvieron resultados similares por secuenciación o co-incubación de HRG con anticuerpos.

EJEMPLO 2 INHIBICIÓN DE LA FOSFORILACIÓN DE HER2 Y HER3 POR ANTICUERPOS ANTI-HER3 DE LA INVENCIÓN

Estimulación con HRG de fibroblastos NIH 3T3 transfectados

Un total de 8x104 células NIH 3T3 transfectadas con ErB2/HER3 se cultivaron en placas de 6 pocillos durante 72 h en RPMI-FCS al 5% y durante 24 h más en RPMI-FCS al 1%. Las células se incubaron luego con mAbs de ratón específicos para HER3 a una concentración de 20 μg/ml en RPMI-FCS al 1% durante 1 h a 37ºC. Después de retirar los anticuerpos, la estimulación del ligando se realizó incubando las células tratadas con anticuerpo con una disolución de HRG 100 ng/ml durante 10 min a 37ºC. Después del lavado en Dulbecco-PBS (D-PBS) frío, las células se rasparon dos veces de platos de plástico utilizando un polímero de caucho en 0,5 ml de D-PBS frío. Después de centrifugación durante 1 min a 11.000 g, los sedimentos celulares se lisaron en 50 µl de tampón de lisis que contenía Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 1% (v/v), glicerol al 10% (v/v), fluoruro sódico 100 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,1 mM, ortovanadato de sodio 1 mM (Sigma) y una tableta de mezcla completa de inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics, Meylan, Francia). Después de incubación de 30 minutos, las muestras se eliminaron de la fracción insoluble por centrifugación y las concentraciones de proteína en lisados celulares se determinaron por reacción colorimétrica de Bradford.

Medición por ELISA de la fosforilación total de HER2 y HER3 en fibroblastos 3T3 transfectados con HER2/HER3

HER2 y HER3 fosforilados con tirosina en lisados celulares se cuantificaron utilizando ELISA en sándwich DuoSetR (RD Systems, Minneapolis, MN), según lo descrito por el fabricante. Tal como se muestra en la Figura 6 y la Figura 7, los mAbs 16D3-C1 y 9B4-D6 inhibieron la fosforilación total de HER2 y HER3, al igual que trastuzumab control. Los mAbs 9F7-F11 y 24E3-C10 bloquearon la fosforilación de HER2.

PAGE-SDS y análisis de transferencia western de la fosforilación de HER2 en Y1112 e Y1196 frente a la fosforilación de HER3 en Y1262 e Y1289 en fibroblastos 3T3 transfectados con HER2/HER3

Después de la electroforesis en SDS-PAGE al 7% en condiciones reductoras, los lisados celulares se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore, Molsheim, Francia) que se saturaron en Tris 25 mM pH 7,4, tampón NaCl 150 mM que contenía Tween 20 (TNT) al 0,1% y 5% de leche desnatada en polvo durante 1 h a temperatura ambiente. Una disolución de 1 μg/ml en TNT-BSA al 5% de anticuerpos dirigidos a Y1112 (Millipore) o Y1196 (RD Systems) fosforilados con HER2 y dirigidos a Y1262 (RD Systems) o Y1289 (Cell Signalling Technology) fosforilados con HER3 se incubaron durante 18 horas a 4ºC. Después de cinco lavados en TNT, los borrones de transferencia se incubaron con anticuerpos específicos para ratón conjugados con peroxidasa (1/2000) o específicos para conejos (1/10000) (Sigma) según sea apropiado, durante 1 h en TNT-5% de leche en polvo desnatada a temperatura ambiente. Después de 5 lavados en TNT, las manchas se visualizaron utilizando un sustrato quimioluminiscente (Western Lightning Plus-ECL, Perkin Elmer). Tal como se indica mediante transferencia western en las Figuras 8A y 8B, los mAbs 16D3-C1 y 9B4-D6 bloquearon la fosforilación de HER2 en Y1196 y Y1112, y la fosforilación de HER3 en Y1262 y Y1289, al igual que trastuzumab de control.

Inhibición de la fosforilación e internalización del receptor HER3 en células de carcinoma pancreático BxPC3

Se añadieron mil quinientas células tumorales BxPC3 a cada uno de los pocillos de una placa de cultivo de 6 pocillos durante 24 h a 37ºC. Después de una inanición de suero durante 16 h en un medio RPMI completo con FCS al 1% y lavado adicional, las células se pre-incubaron con una concentración de anticuerpos 16D3-C1 y 9F7-F11 de 50

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

µg/ml o anticuerpo de control negativo durante 15 min a 37ºC, antes del lavado y la posterior estimulación o no con una dilución de 100 ng/ml de heregulina. Las células fueron después lavadas, raspadas y lisadas con tampón que contenía Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, EDTA 1 mM, Triton al 1%, glicerol al 10%, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,1 mM, fluoruro de sodio 100 mM, ortovanadato sódico 1 mM (Sigma-Aldrich) y un comprimido completo de mezcla de inhibidores de proteasas (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Después de un tiempo de incubación de 30 min, se eliminaron las muestras de la fracción insoluble por centrifugación y se determinaron las concentraciones de proteína en lisados celulares mediante el ensayo de Bradford. Estos lisados proteicos se mezclaron directamente con tampón Laemmli (1-20 µg de proteínas totales dependiendo de la diana y líneas celulares) y se calentaron a 95ºC durante 5 minutos. Después de la electroforesis en SDS-PAGE al 7% en condiciones reductoras, las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore) que luego se saturaron en tampón TNT (Tris 25 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween al 0,1%) que contenía 5% de leche en polvo desnatada durante 1 h a 25ºC. Los anticuerpos primarios, dirigidos a receptores de quinasa o quinasas de señalización, y sus formas fosforiladas, se incubaron en tampón TNT-BSA al 5% durante 18 h a 4ºC. Después de cinco lavados en tampón TNT, se añadieron anticuerpos policlonales de conejo, cabra o ratón conjugados con peroxidasa (Sigma-Aldrich) en tampón TNT que contenía 5% de leche en polvo desnatada durante 1 h a 25ºC. Después de cinco lavados en tampón TNT, los borrones se visualizaron utilizando un sustrato quimioluminiscente (Western lightning Plus-ECL, Perkin Elmer).

Sorprendentemente, los anticuerpos 16D3-C1 y 9F7-F11 bloquearon la fosforilación inducida por ligando sobre los residuos HER3 en Y1289 e Y1262 (Fig. 9); siendo el anticuerpo 9F7-F11 el más eficaz. La inhibición de la fosforilación de Akt en Ser473 y Thr308 se demostró concomitantemente después de un tratamiento de corta duración de 15 minutos de los anticuerpos 16D3-C1 y 9F7-F11 en células BxPC3. La fosforilación de la señalización aguas abajo activada por AKT también se vio afectada por los anticuerpos seleccionados, es decir, la inhibición de la fosforilación de la proteína ribosómica fosfo-S6 que reduce la síntesis de proteínas, el bloqueo de la fosforilación de FoxO1a que favorece la transcripción nuclear del gen conduce a la apoptosis y a la detención del ciclo celular. la disminución de fosfo-MDM2 que impide la degradación de p53 y la inhibición de fosfo-GSK3α/β que bloquea el ciclo celular y favorece la apoptosis (Fig.9).

Las células BxPC3 se analizaron para determinar la expresión de la superficie celular del receptor HER3 después de la exposición a anticuerpos 9F7-F11 y 16D3-C1 para diferentes tiempos y temperaturas. Tal como se muestra en la Figura 10A, una incubación de anticuerpo durante 2h de células BxPC3 a 37ºC redujo fuertemente la expresión de la superficie celular HER3. Dicha regulación negativa de HER3 inducida por anticuerpos se anuló cuando las células se trataron a 4ºC, demostrando así que los anticuerpos 9F7-F11 y 16D3-C1 específicos para HER3 inducían la internalización de HER3. En contraposición, la internalización de HER3 era menor cuando se trataron células BxPC3 con anticuerpo Ab6 (Fig.10A). La cuantificación de la internalización de HER3 confirmó que los anticuerpos 16D3-C1 y 9F7-F11 son más eficientes que Ab6 para inducir la internalización de HER3 (Fig.10B). Un tratamiento con anticuerpo durante 2 h indujo una internalización de HER3 del 73% y 78% con anticuerpos 16D3-C1 y 9F7-F11 respectivamente, y sólo un 42% de internalización para el anticuerpo Ab6 (Fig.10B).

EJEMPLO 3: INHIBICIÓN DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR

Se cultivó un total de 104 fibroblastos NIH 3T3 transfectados con HER2/HER3 en placas de 96 pocillos durante 24 h en medio DMEM completo. Las células se incubaron luego con anticuerpos anti-HER3 a una concentración final de 100 μg/ml durante 5 días a 37ºC. La proliferación se midió añadiendo 40 μl/pocillo de una disolución que contenía el compuesto de tetrazolio MTS [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio] y el reactivo de acoplamiento de electrones PMS (metosulfato de fenazina). El MTS se reduce mediante células en un producto formazano que es soluble en medio de cultivo tisular. La absorbancia del formazano a 490 nm se puede medir utilizando un espectrofotómetro. Tal como se muestra en la Figura 11, los mAbs 16D3-C1 y 9F7-F11 inhibieron 23,7% y 32,0% de la proliferación de fibroblastos NIH 3T3 transfectados con HER2/HER3, respectivamente. No se observó inhibición significativa de NIH 3T3 transfectados con HER2/HER3 con los otros anticuerpos específicos para HER3. Además, 16D3-C1 y 9F7-F11 inhibieron la proliferación de carcinoma epidermoide A431, línea celular de cáncer de mama MCF7 y MDA-MB361, tumores ováricos epiteliales de ascitis primaria 1 (clon A5) y 2 (clon C9), metástasis 2815 y OVCAR3 y SKOV3. La proliferación de la línea celular T47D de cáncer de mama, y carcinoma de pulmón A549 fue inhibida por el mAb 9F7-F11 únicamente.

EJEMPLO 4: MEDICIÓN DE LA INHIBICIÓN INDUCIDA POR ANTICUERPOS DE LA HETERODIMERIZACIÓN DE HER2/HER3 POR TRANSFERENCIA DE ENERGÍA POR ESONANCIA DE FLUORESCENCIA REUSLETA EN EL TIEMPO (TR-FRET)

El ensayo se realizó en células adherentes utilizando un anti-HER2 (FRP5) y un anti-HER3 (15D4-F2), marcados respectivamente con criptato de Lumi4-terbio y el colorante aceptor D2 (Cisbio Bioassays). Estos mAbs se eligieron debido a sus epítopos diana diferentes de los mAbs estudiados de interés. Células NIH 3T3 transfectadas con HER2/HER3 se sembraron en placas durante 24 h a razón de 3 x 105 por pocillo en microplacas negras estériles de 96 pocillos en medio DMEM (sin rojo fenol) complementado con suero de ternero fetal al 10%. Se trataron con

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

diversas concentraciones de mAbs murinos especıficos para HER3 durante 30 min a 37ºC. Después de lavar en tampón KREBS, las células se fijaron después durante 2 min en formalina al 10% (Sigma-Aldrich) y se lavaron una vez con KREBS. Después de la incubación con anticuerpos marcados (5 nM cada uno) diluidos en KREBS durante 6 horas a 37ºC, las células se lavaron 4 veces con tampón KREBS. La fluorescencia de Lumi4-terbio y D2 se midieron respectivamente a 620 y 665 nm (60 μs de demora, 400 μs de integración) tras excitación a 337 nm en un instrumento Pherastar FS. Las diluciones en serie de los anticuerpos marcados con Lumi4-terbio en KREBS se midieron simultáneamente en la misma placa de microtitulación y la emisión a 665 nm se representó frente a la emisión a 620 nm. La curva resultante se utilizó para computar la contribución a 665 nm a partir del terbio (E665Tb) utilizando la emisión a 620 nm (E620) de las muestras. La señal TR-FRET se expresó como Δ665 (%) = Δ665/665Tb, con Δ665 = E665c -E665Tb; las emisiones a 665 nm y 620 nm de las muestras se corrigieron desde el fondo como E665c = E665muestra -E665fondo y E620c = E620muestra -E620fondo. La E665fondo y la E620fondo se miden en un blanco que contiene solamente el tampón de lectura. La señal de TR-FRET expresada como Δ665 (%) representa la cantidad de dímero HER2/HER3. La emisión de fluorescencia resuelta en el tiempo a 620 nm se correlaciona con la cantidad de HER2. Al mismo tiempo, se midió la fluorescencia inmediata de D2 a 670 nm con excitación a 620 nm para cuantificar los receptores HER3. Para cada una de las muestras, se obtuvieron controles realizando el mismo experimento con células no tratadas o con células tratadas con anticuerpo irrelevante, trastuzumab y pertuzumab. Tal como se muestra en la Figura 12, los mAbs 16D3-C1, 24E3-C10 y 9F7-F11 indujeron una inhibición dependiente de la dosis de la heterodimerización de HER2/HER3, mientras que los otros anticuerpos (y particularmente 12H8-B11) no. No se observó un bloqueo con anticuerpos irrelevantes. Pertuzumab, así como trastuzumab inducían fuertemente la inhibición del dímero.

EJEMPLO 5: MAPEADO EPITÓPICO DE ANTICUERPOS ANTI-HER3

Las membranas se obtuvieron de Abimed (Langenfeld, Alemania). Los aminoácidos Fmoc y N-hidroxibenzotriazol se obtuvieron de Novabiochem (Läufelfingen, Suiza). El robot ASP222 (Abimed) se utilizó para las etapas de acoplamiento. Se sintetizaron en membranas de celulosa doscientos trece fotogramas de dodecapéptidos solapantes por residuo, que representa el dominio extracelular del receptor HER3. Todos los péptidos se acetilaron en su extremo N. Después de ensamblar las secuencias peptídicas, los grupos protectores de la cadena lateral se eliminaron mediante tratamiento con ácido trifluoroacético. Después de tres lavados en tampón TBS (NaCl 137 mM, KCl 2,68 mM, Tris 50 mM), la membrana se saturó con tampón TBS que contenía Tween 20 al 0,1% (TBS-T) y leche semidesnatada al 2% durante 18 h a 4ºC. Después de un lavado en TBS-T, se añadió a la membrana una disolución de 1 μg/ml de los mAbs anti-HER3 16D3-Cl y 9F7-F11 durante 1h30 a 37ºC. El anticuerpo unido se detectó por incubación de la membrana a 37ºC durante 1 h en una dilución 1:2000 de una IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa (Sigma, St Louis, MO) y posterior revelado electroquimioluminiscente. El mAb 16D3-C1 reconocía la región 111-129 (Fig.13A), mientras que el mAb 9F7-F11 se unía a la región 35-53 (Fig.14A); situándose estas dos regiones en el dominio D1 del receptor HER3.

Para identificar con precisión los epítopos reconocidos por estos anticuerpos, se realizó análisis de escaneo de alanina Spot. Doce pentadecapéptidos que corresponden a secuencias de aminoácidos inmunorreactivos de anticuerpo previamente identificados en las Figuras 13A y 13B, y los quince análogos de alanina de cada uno de los péptidos se sintetizaron mediante el método Spot. La reactividad de los anticuerpos de péptidos unidos a celulosa se ensayó de forma similar a la arriba descrita. La reactividad de las manchas se evaluó escaneando la membrana y midiendo las intensidades de los puntos con el software Image J 1.44 (http://rsbweb.nih.gov/ij). Se identificaron restos contribuyentes de manchas (SCR), pertenecientes a los epitopos HER3 reconocidos por los mAbs 16D3-C1 y 9F7-F11, en base a una capacidad de unión a anticuerpos disminuida igual o superior al 20% de la secuencia peptídica no modificada. El estudio de los cinco pentadecapéptidos 111ALRQLRLTQLTEILS125 (SEQ ID NO: 1), 112LRQLRLTQLTEILSG126 (SEQ ID NO: 2), 113RQLRLTQLTEILSGG127 (SEQ ID NO: 3), 114QLRLTQLTEILSGGV 128 (SEQ ID NO: 4) y 115LRLTQLTEILSGGVY129 (SEQ ID NO: 5) del dominio HER3/D1 (Fig.13B) identificó 112L-LT-LTEILS122 (SEQ ID NO: 6) como el motivo de unión para el mAb 16D3-C1, siendo Leu120, Glu122, Ile123 y Leu124 los SCRs principales (Fig. 13C). El anticuerpo anti-HER3 9F7-F11 reconoció el motivo 44LEIVL48 (SEQ ID NO: 7) en el dominio HER3/D1 (Fig.14B), en que los residuos Leu44, Ile46 y Leu48 se identificaron como SCR (Fig. 14C).

Los autores de la invención realizaron la colocación de SCRs de los motivos de unión de los anticuerpos 16D3-C1 y 9F7-F11 sobre la estructura cristalográfica del receptor HER3 sin ligando (pdb 1M6B) (Fig.15, izquierda). El epítopo 9F7-F11 44LEIVL48 se superponía en una de las cadenas β prominentes al inicio del dominio 1, enfrentándose al dominio 3 a una distancia de 60 Å y sobresaliendo del dominio D2. El motivo de unión 16D3-C1 se encontraba más profundamente dentro de la estructura de la cadena β del dominio D1. En la actualidad, no se ha descrito ninguna estructura cristalina del receptor HER3 unida a un ligando. Por homología de secuencia, los epítopos reconocidos por los anticuerpos 16D3-C1 y 9F7-F11 específicos para HER3 se superpusieron a la estructura cristalográfica del receptor HER2 unido a pertuzumab (pdb 1S78) (Fig. 15, derecha).

EJEMPLO 6: ESTUDIOS DE TUMOR DE XENOINJERTO

imagen13

Claims (1)

1. imagen1