JP2008531576A - Ｈｅｒ二量体化阻害剤を使用した、ガン患者における疾患の進行までの期間または生存の延長 - Google Patents

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Abstract

本出願は、パーツズマブなどのＨＥＲ二量体化阻害剤でガン患者を処置することにより、ガンがＨＥＲ活性化を示しているその患者における疾患の進行までの期間または生存を延長することを記載する。

Description

本出願は、２００５年２月２３日に提出された米国仮出願第６０／６５５，２７７号の利益を主張し、その開示全体は参照により本明細書に組み入れられる.
発明の分野
本発明は、パーツズマブなどのＨＥＲ二量体化阻害剤を用いてＨＥＲ活性化を示すガン患者を処置することにより、その患者における疾患の進行までの期間または生存を延長することに関するものである。
背景技術
ＨＥＲレセプターおよびそれに対する抗体
ＨＥＲファミリーのレセプターチロシンキナーゼは、細胞の成長、分化、および生存の重要な仲介物質である。このレセプターファミリーには、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、またはＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）を含めた四つの異なるメンバーがある。
ｅｒｂＢ１遺伝子によってコードされるＥＧＦＲは、ヒトの悪性疾患の原因となると関係づけられている。特に、ＥＧＦＲの発現増加が乳ガン、膀胱ガン、肺ガン、頭部ガン、頚部ガン、および胃ガン、ならびに神経膠芽腫で観察されている。レセプターＥＧＦＲの発現増加は、同じ腫瘍細胞によるＥＧＦＲリガンドであるトランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）の産生増加としばしば関連し、その結果として自己分泌刺激経路によるレセプター活性化が生じる。Baselga and Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64: 127-154 (1994)。ＥＧＦＲまたはそのリガンドであるＴＧＦ−αおよびＥＧＦに対するモノクローナル抗体は、当該悪性疾患の処置における治療薬として評価されている。例えば、Baselga and Mendelsohn、上記；Masui et al. Cancer Research 44: 1002-1007 (1984)；およびWu et al. J. Clin. Invest. 95: 1897-1905 (1995)を参照されたい。
ＨＥＲファミリーの第２のメンバーであるｐ１８５ｎｅｕは、化学処置されたラットの神経芽細胞腫由来のトランスフォーミング遺伝子産物としてもともと同定された。ｎｅｕプロトオンコジーンの活性化型は、コードされているタンパク質の膜貫通領域における（バリンからグルタミン酸への）点突然変異に起因する。ｎｅｕのヒトホモログの増幅は、乳ガンおよび卵巣ガンで観察され、予後不良と相関する（Slamon et al., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244: 707-712 (1989);および米国特許第４，９６８，６０３号）。これまで、ｎｅｕプロトオンコジーン中の点突然変異に類似した点突然変異は、ヒト腫瘍については報告されていない。ＨＥＲ２の過剰発現（遺伝子増幅が原因で頻繁であるが一様ではない）は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓、および膀胱のガン腫を含めたその他のガン腫でも観察されている。数ある中で、King et al., Science, 229: 974 (1985)；Yokota et al., Lancet 1: 765-767 (1986)；Fukushige et al., Mol Cell Biol., 6: 955-958 (1986)；Guerin et al., Oncogene Res., 3: 21-31 (1988)；Cohen et al., Oncogene, 4: 81-88 (1989)；Yonemura et al., Cancer Res., 51: 1034 (1991)；Borst et al., Gynecol. Oncol., 38: 364 (1990)；Weiner et al., Cancer Res., 50: 421-425 (1990)；Kern et al., Cancer Res., 50: 5184 (1990)；Park et al., Cancer Res., 49: 6605 (1989)；Zhau et al., Mol. Carcinog., 3: 254-257 (1990)；Aasland et al. Br. J. Cancer 57: 358-363 (1988)；Williams et al. Pathobiology 59: 46-52 (1991)；およびMcCann et al., Cancer, 65: 88-92 (1990)を参照されたい。ＨＥＲ２は前立腺ガンで過剰発現していることがある（Gu et al. Cancer Lett. 99: 185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol. 28: 827-33 (1997); Ross et al. Cancer 79: 2162-70 (1997);およびSadasivan et al. J. Urol. 150: 126-31 (1993)）。
ラットｐ１８５ｎｅｕおよびヒトＨＥＲ２タンパク質産物に対する抗体が記載されている。
Drebinおよび共同研究者らは、ラットｎｅｕ遺伝子産物であるｐ１８５ｎｅｕに対する抗体を産生させた。例えば、Drebin et al., Cell 41: 695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198: 277-290 (1991);およびＷＯ９４／２２４７８を参照されたい。Drebin et al. Oncogene 2: 273-277 (1988)は、ｐ１８５ｎｅｕの二つの異なる領域と反応する抗体の混合物が、ｎｅｕでトランスフォーメーションされヌードマウスに移植されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞に相乗的な抗腫瘍効果を招くと報告している。１９９８年１０月２０日に発行された米国特許第５，８２４，３１１号も参照されたい。
Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989)は、ヒト乳房腫瘍細胞系ＳＫ−ＢＲ−３を用いて特徴付けられたＨＥＲ２抗体の一団の発生を記載している。抗体に曝露した後に、７２時間後に単層をクリスタルバイオレットで染色することによって、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の相対的な細胞増殖が決定された。このアッセイを用いて、細胞増殖を５６％阻害した４Ｄ５と呼ばれる抗体で最大阻害が得られた。この一団のその他の抗体は、このアッセイではより少ない程度に細胞増殖を低減させた。この抗体４Ｄ５は、ＨＥＲ２を過剰発現している乳房腫瘍細胞系を、ＴＮＦ−αの細胞毒性作用に対して感作することがさらに見出された。１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号も参照されたい。Hudziakらに論じられたＨＥＲ２抗体は、Fendly et al. Cancer Research 50: 1550-1558 (1990)；Kotts et al. In Vitro 26(3): 59A (1990)；Sarup et al. Growth Regulation 1: 72-82 (1991)；Shepard et al. J. Clin. Immunol. 11(3): 117-127 (1991)；Kumar et al. Mol. Cell. Biol. 11(2): 979-986 (1991)；Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263 (1993)；Pietras et al. Oncogene 9: 1829-1838 (1994)；Vitetta et al. Cancer Research 54: 5301-5309 (1994)；Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994)；Scott et al. J. Biol. Chem. 266: 14300-5 (1991)；D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 7202-7206 (1994)；Lewis et al. Cancer Research 56: 1457-1465 (1996)；およびSchaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)にさらに特徴付けられている。
リコンビナントヒト化バージョンのマウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２、トラスツズマブ、またはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）；米国特許第５，８２１，３３７号）は、以前に大規模な抗ガン治療を受けた、ＨＥＲ２過剰発現転移性乳ガンを有する患者に臨床的に活性である（Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14: 737-744 (1996））。トラスツズマブは、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現している転移性乳ガン患者の処置に、１９９８年９月２５日に食品医薬品局から販売許可を受けた。
種々の特性を有するその他のＨＥＲ２抗体は、Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47: 933-937 (1991)；McKenzie et al. Oncogene 4: 543-548 (1989)；Maier et al. Cancer Res.51: 5361-5369 (1991)；Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3: 350-362 (1990)；Stancovski et al. PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991)；Bacus et al. Cancer Research 52:2580-2589 (1992)；Xu et al. Int. J. Cancer 53: 401-408 (1993)；ＷＯ９４／００１３６；Kasprzyk et al. Cancer Research 52: 2771-2776 (1992)；Hancock et al. Cancer Res.51: 4575-4580 (1991)；Shawver et al. Cancer Res. 54: 1367-1373 (1994)；Arteaga et al. Cancer Res. 54: 3758-3765 (1994)；Harwerth et al. J. Biol. Chem. 267: 15160-15167 (1992)；米国特許第５，７８３，１８６号；およびKlapper et al. Oncogene 14: 2099-2109 (1997)に記載されている。
ホモロジースクリーニングの結果として、レセプターＨＥＲファミリーの二つの他のメンバー、すなわちＨＥＲ３（米国特許第５，１８３，８８４号および第５，４８０，９６８号、ならびにKraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)）およびＨＥＲ４（ＥＰ特許出願第５９９，２７４号；Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993)；およびPlowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)）の同定が生じた。これらのレセプターの両方は、少なくとも一部の乳ガン細胞系上で増加した発現を示す。
これらのレセプターＨＥＲは、一般に、細胞に様々な組合せで見出され、ヘテロ二量体化は、多様なＨＥＲリガンドに対する細胞応答の多様性を増加させると考えられる（Earp et al. Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)）。ＥＧＦＲは、六つの異なるリガンド、すなわち上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン、およびエピレグリンによって結合される（Groenen et al. Growth Factors 11: 235-257 (1994)）。単一の遺伝子の選択的スプライシングに起因するヘレグリンタンパク質ファミリーは、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４に対するリガンドである。このヘレグリンファミリーには、アルファヘレグリン、ベータヘレグリン、およびガンマヘレグリン（Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992)；米国特許第５，６４１，８６９号；およびSchaefer et al., Oncogene 15: 1385-1394 (1997)）;ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、グリア成長因子（ＧＧＦ）；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）；ならびに感覚および運動神経細胞由来因子（ＳＭＤＦ）がある。総説については、Groenen et al. Growth Factors 11: 235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7: 247-262 (1996)、およびLee et al. Pharm. Rev. 47: 51-85 (1995)を参照されたい。最近、三つの追加のＨＥＲリガンドが同定された。それらは、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４のいずれかと結合することが報告されているニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）（Chang et al. Nature 387 509-512 (1997);およびCarraway et al. Nature 387: 512-516 (1997)）；ＨＥＲ４と結合するニューレグリン−３（Zhang et al. PNAS (USA) 94(18): 9562-7 (1997)）；およびＨＥＲ４と結合するニューレグリン−４（Harari et al. Oncogene 18: 2681-89 (1999)）である。ＨＢ−ＥＧＦ、ベータセルリン、およびエピレグリンもまたＨＥＲ４に結合する。
ＥＧＦおよびＴＧＦαはＨＥＲ２と結合しないが、ＥＧＦは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を刺激してヘテロ二量体を形成させ、このヘテロ二量体はＥＧＦＲを活性化して、その結果としてこのヘテロ二量体中のＨＥＲ２のリン酸基転移が生じる。二量体化および／またはリン酸基転移は、チロシンキナーゼＨＥＲ２を活性化するようである。Earpら、上記を参照されたい。同様に、ＨＥＲ３がＨＥＲ２と同時発現すると、活性なシグナル伝達複合体が形成し、ＨＥＲ２に対する抗体はこの複合体を破壊することができる（Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)）。追加的に、ＨＥＲ２と同時発現すると、ヘレグリン（ＨＲＧ）に対するＨＥＲ３の親和性はより高い親和性状態に増大する。ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体に関しては、Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995);およびLewis et al., Cancer Res., 56: 1457-1465 (1996)もまた参照されたい。ＨＥＲ３と同様に、ＨＥＲ４はＨＥＲ２と共に活性なシグナル伝達複合体を形成する（Carraway and Cantley, Cell 78: 5-8 (1994)）。
ＨＥＲ抗体に関する特許公報には、以下が挙げられる：
Figure 2008531576
診断
ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブで処置される患者を、ＨＥＲ２の過剰発現／増幅に基づいて治療のために選択する。例えばＷＯ９９／３１１４０（Paton et al.)、ＵＳ２００３／０１７０２３４Ａ１（Hellmann, S.）、およびＵＳ２００３／０１４７８８４（Paton et al.）；ならびにＷＯ０１／８９５６６、ＵＳ２００２／００６４７８５、およびＵＳ２００３／０１３４３４４（Mass et al.）を参照されたい。ＨＥＲ２の過剰発現および増幅を検出するための免疫組織化学法（ＩＨＣ）および蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に関するＣｏｈｅｎらのＵＳ２００３／０１５２９８７も参照されたい。
ＷＯ２００４／０５３４９７およびＵＳ２００４／０２４８１５Ａ１（Bacus et al.）、ならびにＵＳ２００３／０１９０６８９（Crosby and Smith）は、トラスツズマブ療法に対する応答を決定または予測することに言及している。ＵＳ２００４／０１３２９７Ａ１（Bacus et al.）は、ＥＧＦＲ抗体であるＡＢＸ０３０３の療法に対する応答を決定または予測することに関する。ＷＯ２００４／００００９４（Bacus et al.）は、小分子性ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤であるＧＷ５７２０１６に対する応答を決定することに関する。ＷＯ２００４／０６３７０９（Amler et al.）は、ＥＧＦＲ阻害剤であるエルロチニブＨＣｌに対する感受性を決定するためのバイオマーカーおよび方法に言及している。ＵＳ２００４／０２０９２９０（Cobleigh et al.）は、乳ガンの予後のための遺伝子発現マーカーに関するものである。ＨＥＲの活性化または二量体化に基づいて、パーツズマブで処置された患者を治療のために選択することができる。パーツズマブ、およびそれを用いた治療のための患者の選択に関する特許公報には、ＷＯ０１／００２４５（Adams et al.）；ＵＳ２００３／００８６９２４（Sliwkowski, M.）；ＵＳ２００４／００１３６６７Ａ１（Sliwkowski, M.）；ならびにＷＯ２００４／００８０９９Ａ２およびＵＳ２００４／０１０６１６１（Bossenmaier et al.）が挙げられる。
Cronin et al. Am. J. Path. 164(1): 35-42 (2004)は、保存用パラフィン包埋組織での遺伝子発現の測定について記載している。 Ma et al. Cancer Cell 5: 607-616 (2004)は、保存用初回生検から採取された腫瘍組織切片由来の単離されたＲＮＡを使用した、遺伝子オリゴヌクレオチドマイクロアレイによる遺伝子プロファイリングを記載している。
パーツズマブ（リコンビナントヒトモノクローナル抗体２Ｃ４；OMNITARG（商標）, Genentech, Inc, South San Franciscoとしても公知である）は、ＨＥＲ二量体化阻害剤（ＨＤＩ）として公知である新しいクラスの薬剤のうち最初のものに相当し、ＨＥＲ２が（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４などの）他のレセプターＨＥＲと活性なヘテロ二量体を形成する能力を阻害するように機能し、ＨＥＲ２の発現レベルに関係なく活性である。例えば、HarariおよびYarden Oncogene 19: 6102-14 (2000)；YardenおよびSliwkowski. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 127-37 (2001)；Sliwkowski Nat Struct Biol 10: 158-9 (2003)；Choら、Nature 421: 756-60 (2003)；およびMalikら、Pro Am Soc Cancer Res 44:176-7 (2003)を参照されたい。
パーツズマブによる、腫瘍細胞でのＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の形成遮断は、重大な細胞シグナル伝達を阻害し、それによって腫瘍の増殖および生存の低下が生じることが実証された（Agus et al. Cancer Cell 2:127-37 (2002)）。
パーツズマブは、進行ガンを有する患者において第Ｉａ相試験で、そして卵巣ガンを有する患者および乳ガンを有する患者、ならびに肺ガンを有する患者および前立腺ガンを有する患者において第ＩＩ相試験で、臨床において単剤としての試験を受けた。第Ｉ相試験では、不治性、局所進行性、再発性、または転移性固形腫瘍を有し、その腫瘍が標準的な治療の間または後に進行した患者が、３週間毎に静脈内投与したパーツズマブで処置された。パーツズマブは一般に耐容性良好であった。応答について評価可能であった患者２０人中３人で腫瘍の退縮が実現された。患者２人から部分応答が確認された。２．５か月を超えて持続する病態の安定が患者２１人中６人で観察された（Agus et al. Pro Am Soc Clin Oncol 22:192 (2003)）。用量２．０〜１５mg/kgでパーツズマブの薬物動態は直線的であり、平均クリアランスは２．６９〜３．７４mL/日/kgの範囲であり、平均最終消失半減期は１５．３から２７．６日の範囲であった。パーツズマブに対する抗体は検出されなかった（Allison et al. Pro Am Soc Clin Oncol 22:197 (2003)）。
発明の概要
本発明は、ＨＥＲ二量体化阻害剤であるパーツズマブで処置されたヒトガン患者からの臨床データを提供する。患者をＨＥＲ活性化について評価し、そのＨＥＲ活性化をホスホ−ＥＬＩＳＡバイオアッセイを使用して決定した。ＨＥＲ活性化を示す患者において、疾患の進行までの期間（ＴＴＰ）および生存により測定されたように、臨床的利益が観察された。
したがって、本発明は、ガン患者における疾患の進行までの期間（ＴＴＰ）または生存を延長するための方法を提供し、その方法は、ガンがＨＥＲ活性化を示す患者におけるＴＴＰまたは生存を延長する量のＨＥＲ二量体化阻害剤をその患者に投与することを含む。
本発明は、卵巣ガン、腹膜ガン、または卵管ガンを有する患者における疾患の進行までの期間（ＴＴＰ）または生存を延長するための方法にも関するものであり、その方法は、ガンがＨＥＲ２活性化を示す患者におけるＴＴＰまたは生存を延長する量のパーツズマブをその患者に投与することを含む。
好ましい態様の詳細な説明
Ｉ． 定義
本明細書において「疾患の進行までの期間」または「ＴＴＰ」は、週または月単位で一般に測定される、（例えばパーツズマブなどのＨＥＲ二量体化阻害剤を用いた）初回処置の時点からガンが進行または悪化するまでの期間を指す。熟練の臨床家はそのような進行を評価することができる。例えば卵巣ガンの場合、進行をＲＥＣＩＳＴにより評価することができる（例えばTherasse et al., J. Nat. Cancer Inst. 92(3): 205-216 (2000)を参照されたい）。
「ＴＴＰの延長」により、未処置の患者に対して（すなわちパーツズマブなどのＨＥＲ二量体化阻害剤で処置されていない患者に対して）、またはＨＥＲの活性化を示していない患者に対して、および／または（ガンが卵巣ガンの場合、トポテカンまたはリポソームドキソルビシンなどの）認可された抗腫瘍剤で処置された患者に対して、処置された患者における疾患の進行までの期間が増大することを意味する。
「生存」は、生き続けている患者を指し、生存には全生存および無増悪生存が含まれる。
「全生存」は、診断または処置の時点から、１年、５年などの確定した期間生き続けている患者を指す。
「無増悪生存」は、ガンが進行も悪化することもなしに生き続けている患者を指す。
「生存の延長」により、処置された患者における全生存または無増悪生存が、未処置の患者に対して（すなわちパーツズマブなどのＨＥＲ二量体化阻害剤で処置されていない患者に対して）、またはＨＥＲの活性化を示していない患者に対して、および／または（ガンが卵巣ガンの場合、トポテカンまたはリポソームドキソルビシンなどの）認可された抗腫瘍剤で処置された患者に対して増大することを意味する。
「奏効」は、完全奏効（ＣＲ）または部分奏効（ＰＲ）を含めた測定可能な応答を指す。
「完全奏効」または「ＣＲ」によって、処置に応答してガンの全ての徴候が消失したことを意味する。これは、そのガンが治癒したことを必ずしも意味しない。
「部分奏効」または「ＰＲ」は、処置に応答した、一つもしくは複数の腫瘍もしくは病変の大きさの減少、または体内のガンの程度の減少を指す。
「レセプターＨＥＲ」は、レセプターＨＥＲファミリーに属するレセプタータンパク質チロシンキナーゼであり、レセプターＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４を含む。レセプターＨＥＲは、ＨＥＲリガンドと結合し、かつ／または別のレセプターＨＥＲ分子と二量体化できる細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；およびリン酸化されうるいくつかのチロシン残基を保有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを一般に含むものである。レセプターＨＥＲは、「ネイティブな配列の」レセプターＨＥＲまたはその「アミノ酸配列変異体」でありうる。好ましくは、レセプターＨＥＲはネイティブな配列のヒトレセプターＨＥＲである。
用語「ＥｒｂＢ１」、「ＨＥＲ１」、「上皮成長因子レセプター」、および「ＥＧＦＲ」は本明細書において相互交換可能に使用され、例えばCarpenterら、Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)に開示されたＥＧＦＲを、その天然突然変異体形態（例えば、Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)にあるような欠失突然変異ＥＧＦＲ）を含めて指す。ｅｒｂＢ１はＥＧＦＲタンパク質産物をコードしている遺伝子を指す。
表現「ＥｒｂＢ２」および「ＨＥＲ２」は本明細書において相互交換可能に使用され、例えばSembaら、PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985)およびYamamotoら、Nature 319:230-234 (1986)に記載された（Genebankアクセッション番号Ｘ０３３６３）、ヒトＨＥＲ２タンパク質を指す。用語「ｅｒｂＢ２」はヒトＥｒｂＢ２をコードしている遺伝子を指し、「ｎｅｕ」は、ラットｐ１８５ｎｅｕをコードしている遺伝子を指す。好ましいＨＥＲ２はネイティブな配列のヒトＨＥＲ２である。
本明細書において、「ＨＥＲ２細胞外ドメイン」または「ＨＥＲ２ ＥＣＤ」は、細胞膜にアンカーされているか、または循環しているかのいずれかであるＨＥＲ２の細胞外側のドメインを、そのフラグメントを含めて指す。一態様では、ＨＥＲ２の細胞外ドメインは、四つのドメイン、すなわち「ドメインＩ」（アミノ酸残基約１〜１９５；配列番号：１９）、「ドメインＩＩ］（アミノ酸残基約１９６〜３１９；配列番号：２０）、「ドメインＩＩＩ」（アミノ酸残基約３２０〜４８８；配列番号：２１）、および「ドメインＩＶ」（アミノ酸残基約４８９〜６３０；配列番号：２２）（シグナルペプチドを除いて残基に付番）を含みうる。Garrettら、Mol. Cell. 11:495-505 (2003)、Choら、Nature 42l:756-760 (2003)、Franklinら、Cancer Cell 5:317-328 (2004)、およびPlowmanら、Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993)、ならびに本明細書の図１を参照されたい。
「ＥｒｂＢ３」および「ＨＥＲ３」は、例えば、米国特許第５，１８３，８８４号および第５，４８０，９６８号、ならびにKrausら、PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)に開示されたようなレセプターポリペプチドを指す。
本明細書における用語「ＥｒｂＢ４」および「ＨＥＲ４」は、例えば、ＥＰ特許出願第５９９，２７４号；Plowmanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993)；およびPlowmanら、Nature, 366: 473-475 (1993)に開示されたようなレセプターポリペプチドを、例えば、１９９９年４月２２日に公表されたＷＯ９９／１９４８８に開示されたようなそのアイソフォームを含めて指す。
「ＨＥＲリガンド」により、レセプターＨＥＲに結合し、かつ／またはそれを活性化するポリペプチドを意味する。本明細書において特に関心対象であるＨＥＲリガンドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）（Savage et al., J. Biol. Chem. 247: 7612-7621 (1972)）；トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）（Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)）；神経鞘腫またはケラチン細胞の自己分泌成長因子としても公知であるアンフィレグリン（Shoyab et al. Science 243: 1074-1076 (1989)；Kimura et al. Nature 348:257-260 (1990)；およびCook et al. Mol. Cell. Biol. 11: 2547-2557 (1991)）；ベータセルリン（Shing et al., Science 259: 1604-1607 (1993)；およびSasada et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190: 1173 (1993)）；ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（Higashiyama et al., Science 251: 936-939 (1991)）；エピレグリン（Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270: 7495-7500 (1995)；およびKomurasaki et al. Oncogene 15: 2841-2848 (1997)）；ヘレグリン（下記参照）；ニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）（Carraway et al., Nature 387: 512-516 (1997)）；ニューレグリン−３（ＮＲＧ−３）（Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 9562-9567 (1997)）；ニューレグリン−４（ＮＲＧ−４）（Harari et al. Oncogene 18: 2681-89 (1999)）；およびクリプト（cripto）（ＣＲ−１）（Kannan et al. J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335 (1997））などのネイティブな配列のヒトＨＥＲリガンドである。ＥＧＦＲと結合するＨＥＲリガンドには、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ベータセルリン、ＨＢ−ＥＧＦ、およびエピレグリンがある。ＨＥＲ３と結合するＨＥＲリガンドには、ヘレグリンがある。ＨＥＲ４と結合することができるＨＥＲリガンドには、ベータセルリン、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、ＮＲＧ−４、およびヘレグリンがある。
本明細書に使用される場合、「ヘレグリン」（ＨＲＧ）は、米国特許第５，６４１，８６９号またはMarchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)に開示されたようなヘレグリン遺伝子産物にコードされているポリペプチドを指す。ヘレグリンの例には、ヘレグリン−α、ヘレグリン−β１、ヘレグリン−β２、およびヘレグリン−β３（Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992)；および米国特許第５，６４１，８６９号）；ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）（Peles et al. Cell 69: 205-216 (1992)）；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）（Falls et al. Cell 72: 801-815 (1993)）；グリア細胞成長因子（ＧＧＦ）（Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)）；感覚および運動神経駆動因子（ＳＭＤＦ）（Ho et al. J. Biol. Chem. 270: 14523-14532 (1995)）；γ−ヘレグリン（Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)）がある。
本明細書における「ＨＥＲ二量体」は、少なくとも二つのレセプターＨＥＲを含む非共有的に会合した二量体である。このような複合体は、二つ以上のレセプターＨＥＲを発現している細胞がＨＥＲリガンドに曝露されたときに形成することがあり、この複合体を免疫沈降により単離して、例えばSliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)に記載されているようなＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析することができる。サイトカインレセプターサブユニット（例えばｇｐ１３０）などの他のタンパク質がこの二量体と会合していることがある。好ましくは、ＨＥＲ二量体はＨＥＲ２を含む。
本明細書における「ＨＥＲヘテロ二量体」は、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、またはＨＥＲ２−ＨＥＲ４ヘテロ二量体などの少なくとも二つの異なるレセプターＨＥＲを含む非共有結合的に会合したヘテロ二量体である。
「ＨＥＲ阻害剤」は、ＨＥＲの活性化または機能を妨害する薬剤である。ＨＥＲ阻害剤の例には、ＨＥＲ抗体（例えばＥＧＦＲ抗体、ＨＥＲ２抗体、ＨＥＲ３抗体、またはＨＥＲ４抗体）；ＥＧＦＲターゲット薬；小分子性ＨＥＲ拮抗薬；ＨＥＲチロシンキナーゼ阻害剤；ラパチニブ／ＧＷ５７２０１６などのＨＥＲ２およびＥＧＦＲの二重チロシンキナーゼ阻害剤；アンチセンス分子（例えば、ＷＯ２００４／８７２０７参照）；ならびに／またはＭＡＰＫもしくはＡｋｔなどの下流のシグナル伝達分子に結合するか、もしくはその機能を妨害する薬剤が挙げられる（図５参照）。好ましくは、ＨＥＲ阻害剤はレセプターＨＥＲに結合する抗体または小分子である。
「ＨＥＲ二量体化阻害剤」は、ＨＥＲ二量体またはＨＥＲヘテロ二量体の形成を阻害する薬剤である。好ましくは、ＨＥＲ二量体化阻害剤は、抗体、例えばＨＥＲ２にそのヘテロ二量体結合部位で結合する抗体である。本明細書における最も好ましいＨＥＲ二量体化阻害剤はパーツズマブまたはＭＡｂ ２Ｃ４である。ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位への２Ｃ４の結合を図４に示す。ＨＥＲ二量体化阻害剤のその他の例には、ＥＧＦＲに結合して、それと一つまたは複数のその他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害する抗体（例えば、活性化ＥＧＦＲまたは「繋ぎ止められていない（untethered）」ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６（ＭＡｂ８０６）；Johnsら、J. Biol. Chem. 279 (29):30375-30384 (2004)参照）；ＨＥＲ３に結合して、それと一つまたは複数のその他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害する抗体；ＨＥＲ４に結合して、それと一つまたは複数のその他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害する抗体；ペプチド二量体化阻害剤（米国特許第６，４１７，１６８号）;アンチセンス二量体化阻害剤などが挙げられる。
「ＨＥＲ二量体化阻害剤」は、ＨＥＲ２を含む二量体またはヘテロ二量体の形成を阻害する薬剤である。
「ＨＥＲ抗体」は、レセプターＨＥＲに結合する抗体である。場合により、ＨＥＲ抗体はＨＥＲの活性化または機能をさらに妨害する。好ましくは、ＨＥＲ抗体はレセプターＨＥＲ２に結合する。本明細書において特に関心対象であるＨＥＲ２抗体はパーツズマブである。ＨＥＲ２抗体の別の例はトラスツズマブである。ＥＧＦＲ抗体の例にはセツキシマブおよびＡＢＸ０３０３が挙げられる。
「ＨＥＲ活性化」は、任意の一つまたは複数のレセプターＨＥＲの活性化またはリン酸化を指す。一般に、ＨＥＲ活性化の結果として（例えばレセプターＨＥＲまたは基質ポリペプチドにおけるチロシン残基をリン酸化する、レセプターＨＥＲの細胞内キナーゼドメインにより引き起こされる）シグナル伝達を生じる。ＨＥＲの活性化は、対象となるレセプターＨＥＲを含むＨＥＲ二量体へのＨＥＲリガンドの結合により仲介されうる。ＨＥＲ二量体にＨＥＲリガンドが結合することにより、その二量体中の一つまたは複数のレセプターＨＥＲのキナーゼドメインが活性化することができ、その結果として、一つまたは複数のレセプターＨＥＲ中のチロシン残基のリン酸化および／またはＡｋｔもしくはＭＡＰＫ細胞内キナーゼなどの追加の基質ポリペプチドのチロシン残基のリン酸化が生じる。例えば、図５を参照。
「リン酸化」は、レセプターＨＥＲまたはその基質などのタンパク質に対する一つまたは複数のリン酸基の付加を指す。
「ＨＥＲの二量体化を阻害する」抗体は、ＨＥＲ二量体の形成を阻害するか、または妨害する抗体である。好ましくは、当該抗体はＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位でＨＥＲ２に結合する。本明細書における最も好ましい二量体化阻害抗体はパーツズマブまたはＭＡｂ ２Ｃ４である。ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位への２Ｃ４の結合は図４に例示されている。ＨＥＲの二量体化を阻害する抗体の他の例には、ＥＧＦＲに結合して、ＥＧＦＲと一つまたは複数のその他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害する抗体（例えば活性化ＥＧＦＲまたは「繋ぎ止められていない」ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６（ＭＡｂ８０６）；Johnsら、J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)参照）；ＨＥＲ３に結合して、ＨＥＲ３と一つまたは複数の他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害する抗体；およびＨＥＲ４に結合して、ＨＥＲ４と一つまたは複数のその他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害する抗体が挙げられる。
「トラスツズマブよりも効果的にレセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する」抗体は、トラスツズマブよりも効果的に（例えば少なくとも約２倍効果的に）レセプターＨＥＲまたはＨＥＲ二量体のＨＥＲリガンド活性化を低減または排除する抗体である。好ましくは、当該抗体は、少なくともマウスモノクローナル抗体２Ｃ４もしくはそのＦａｂフラグメント、またはパーツズマブもしくはそのＦａｂフラグメントとほぼ同様に効果的にレセプターＨＥＲのＨＥＲリガンド活性化を遮断する。ＨＥＲの二量体化を直接研究することにより、またはＨＥＲの二量体化を結果として生じるＨＥＲの活性化もしくは下流のシグナル伝達を評価することにより、および／または抗体−ＨＥＲ２結合部位を評価することなどにより、抗体がレセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する能力を評価することができる。トラスツズマブよりも効果的にレセプターＨＥＲのリガンド活性化を阻害する能力を有する抗体についてスクリーニングするためのアッセイは、Agusら、Cancer Cell 2:127-137 (2002)およびＷＯ０１／００２４５（Adams et al.）に記載されている。ほんの一例として、以下についてアッセイすることができる：ＨＥＲ二量体の形成阻害（例えばAgus et al. Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図１Ａ〜ＢおよびＷＯ０１／００２４５参照；ＨＥＲ二量体を発現している細胞へのＨＥＲリガンド活性化低減（例えばＷＯ０１／００２４５およびAgus et al. Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図２Ａ〜Ｂ参照）;ＨＥＲ二量体を発現する細胞へのＨＥＲリガンドの結合遮断（例えばＷＯ０１／００２４５およびAgus et al. Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図２Ｅ参照);ＨＥＲリガンドの存在下（または不在下）でＨＥＲ二量体を発現するガン細胞（例えばＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＤ−１３４、ＺＲ−７５−１、ＭＤ−ＭＢ−１７５、Ｔ−４７Ｄ細胞）の細胞成長阻害（例えば、ＷＯ０１／００２４５およびAgus et al. Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図３Ａ〜Ｄ）;下流のシグナル伝達阻害（例えば、ＨＲＧ依存性ＡＫＴリン酸化阻害またはＨＲＧ依存性もしくはＴＧＦα依存性ＭＡＰＫリン酸化阻害）（例えば、ＷＯ０１／００２４５およびAgus et al. Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図２Ｃ〜Ｄ参照）。抗体−ＨＥＲ２結合部位を研究することにより、例えばＨＥＲ２に結合する抗体の結晶構造などの構造またはモデルを評価することにより、その抗体がＨＥＲ二量体化を阻害するかどうかを評定することもできる（例えばFranklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)参照）。
ＨＥＲ２上の「ヘテロ二量体結合部位」は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４と二量体を形成するときにその細胞外ドメイン中の領域と接触または連結するＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域を指す。その領域はＨＥＲ２のドメインＩＩに見出される。Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)。
ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブよりも効果的に（例えば少なくとも２倍効果的に）「ＨＲＧ依存性ＡＫＴリン酸化を阻害」し、かつ／または「ＨＲＧ依存性もしくはＴＧＦα依存性のＭＡＰＫリン酸化」を阻害しうる（例としてAgus et al. Cancer Cell 2:127-137 (2002)およびＷＯ０１／００２４５を参照されたい）。
パーツズマブと同様にＨＥＲ２抗体は、「ＨＥＲ２エクトドメインの開裂を阻害しない」抗体でありうる（Molina et al. Cancer Res. 61:4744-4749(2001)）。他方では、トラスツズマブはＨＥＲ２エクトドメインの開裂を阻害することができる。
ＨＥＲ２の「ヘテロ二量体結合部位に結合する」ＨＥＲ２抗体は、ドメインＩＩの残基に結合し、（場合によりドメインＩおよびＩＩＩなどのＨＥＲ２細胞外ドメインの他のドメインの残基にも結合し、）ＨＥＲ２−ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、またはＨＥＲ２−ＨＥＲ４ヘテロ二量体の形成に少なくともある程度立体障害を与えることができる。Franklinら、Cancer Cell 5:317-328 (2004)は、ＰＳＣＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＩＤコードＩＳ７８）に寄託されたＨＥＲ２−パーツズマブの結晶構造を特徴付け、その構造はＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に結合する抗体の一例を示している。
ＨＥＲ２の「ドメインＩＩに結合する」抗体は、ドメインＩＩの残基、および場合によりドメインＩおよびドメインＩＩＩなどのＨＥＲ２のその他のドメインの残基に結合する。好ましくは、ドメインＩＩに結合する抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの間の接合部に結合する。
タンパク質の「発現」は、遺伝子にコードされている情報からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への、次にタンパク質への変換を指す。
本明細書において、関心対象のタンパク質（レセプターＨＥＲまたはＨＥＲリガンドなど）を「発現している」試料または細胞は、そのタンパク質をコードしているｍＲＮＡまたはそのタンパク質が、そのフラグメントを含めてその試料または細胞中に存在すると決定されたものである。
本明細書に使用される「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」という技法は、核酸、ＲＮＡ、および／またはＤＮＡの微量の特異的断片が、１９８７年７月２８日に発行された米国特許第４，６８３，１９５号に記載されたように増幅される手順を一般に指す。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計できるように関心対象の領域の末端からの、またはそれを超えた配列情報が入手できる必要がある。これらのプライマーは、鋳型に対向する増幅される鎖と配列が同一または類似しているものである。これら２本のプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅された物質の末端と一致しうる。ＰＣＲを使用して、特異的ＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特異的ＤＮＡ配列、および全細胞性ＲＮＡ、バクテリオファージ配列またはプラスミド配列などから転写されたｃＤＮＡを増幅することができる。一般に、Mullisら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987)；Erlich, ed., PCR Technology（Stockton Press, NY, 1989）を参照されたい。本明細書に使用されるＰＣＲは、プライマーとして公知の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の使用を含む、核酸被験試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の一例であるが、唯一の例ではないとみなされ、核酸の特異的断片を増幅もしくは生成するために、または特定の核酸に相補的な核酸の特異的断片を増幅もしくは生成するために核酸ポリメラーゼを利用する。
「定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応」または「ｑＲＴ−ＰＣＲ」は、ＰＣＲ産物の量がＰＣＲ反応の各段階で測定されるＰＣＲの一形態を指す。この技法は、Croninら、Am. J. Pathol. 164(1):35-42 (2004)およびMaら、Cancer Cell 5:607-616 (2004)を含めた様々な刊行物に記載されている。
用語「マイクロアレイ」は、基板上でのハイブリダイゼーション可能なアレイエレメント、好ましくはポリヌクレオチドプローブの規則正しい配列を指す。
用語「ポリヌクレオチド」は、単数形または複数形で使用される場合、一般に未改変ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または改変ＲＮＡもしくはＤＮＡでありうる任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。このように、例えば本明細書に定義されるポリヌクレオチドには、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖領域を含むＲＮＡ、ならびに一本鎖もしくはさらに典型的には二本鎖でありうるか、または一本鎖および二本鎖領域を含むＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるが、それに限定されるわけではない。加えて、本明細書に使用される用語「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。当該領域の鎖は、同じ分子または異なる分子由来のことがある。この領域に、一つまたは複数の分子の全てが含まれることがあるが、さらに典型的には分子の一部の領域だけが含まれる。三重らせん領域の分子の一つはオリゴヌクレオチドであることが多い。用語「ポリヌクレオチド」はｃＤＮＡを特異的に含む。この用語は、一つまたは複数の改変された塩基を有する（ｃＤＮＡを含めた）ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。このように、安定性または他の理由のために改変された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡは「ポリヌクレオチド」であり、これは、その用語が本明細書において意味する通りである。さらに、イノシンなどの異常な塩基またはトリチウムラベルされた塩基などの改変された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書に定義される用語「ポリヌクレオチド」に含まれる。一般に、用語「ポリヌクレオチド」は、全ての化学的、酵素的、および／または代謝的に改変された形態または未改変のポリヌクレオチド、ならびにウイルスと、単細胞および複合細胞を含めた細胞とに特徴的な化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。
用語「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡを非限定的に含めた相対的に短いポリヌクレオチドを指す。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、例えば市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用して化学法により合成されることが多い。しかし、ｉｎ ｖｉｔｒｏリコンビナントＤＮＡ介在性技法を含めた多様な他の方法により、ならびに細胞および生物でのＤＮＡ発現によりオリゴヌクレオチドを作成することができる。
句「遺伝子増幅」は、特定の細胞または細胞系で多コピーの遺伝子または遺伝子フラグメントが形成される工程を指す。複製された領域（増幅されたＤＮＡのストレッチ）は「アンプリコン」と称されることが多い。通常は、産生するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量も、発現される特定の遺伝子でできたコピーの数の割合で増加する。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定されることができ、一般にプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存して経験的に計算したものである。一般に、プローブが長いと適切なアニーリングに高温を要し、プローブが短いと低温が必要である。一般に、相補鎖がその融解温度未満の環境に存在する場合、ハイブリダイゼーションは変性したＤＮＡが再アニーリングする能力に依存する。プローブおよびハイブリダーゼーション可能な配列の間の所望の相同性の程度が高いほど、使用することのできる相対温度は高い。結果として、高い相対温度は反応条件をよりストリンジェントにする傾向にあり、一方で低温ではそうならないであろうということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの追加の詳細および説明については、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照されたい。
本明細書に定義される「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、典型的には：（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば０．０１５M塩化ナトリウム／０．００１５Mクエン酸ナトリウム／０．１%ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で採用するか；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドなどの変性剤、例えば、０．１%ウシ血清アルブミン／０．１%フィコール／０．１%ポリビニルピロリドン／５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を有する５０%（ｖ／ｖ）ホルムアミドを、７５０mM塩化ナトリウム、７５mMクエン酸ナトリウムと共に４２℃で採用するか；または（３）５０%ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５M ＮａＣｌ、０．０７５Mクエン酸ナトリウム)、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１%ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０&gr;g/ml)、０．１%ＳＤＳ、および１０%硫酸デキストランを４２℃で採用して、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃で、および５０%ホルムアミド中で５５℃で洗浄し、続いてＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を５５℃で行うものである。
「中程度のストリンジェントな条件」は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されたように確認することができ、この条件は、上記条件よりストリンジェントではない洗浄溶液およびハイブリダーゼーションの条件（例えば温度、イオン強度、および%ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェントな条件の例は、２０%ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０mM ＮａＣｌ、１５mMクエン酸三ナトリウム)、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０%硫酸デキストラン、および２０mg/ml変性破砕サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での３７℃で一晩のインキュベーションに続く、１×ＳＳＣ中の約３７〜５０℃でのフィルター洗浄である。当業者は、プローブ長などの要因を適応させるために、必要に応じて、温度、イオン強度などをどのように調整するかについて認識しているものである。
「ネイティブな配列」のポリペプチドは、天然変異体またはアレル変異体を含めて、天然から得られたポリペプチド（例えばレセプターＨＥＲまたはＨＥＲリガンド）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。当該ネイティブな配列のポリペプチドを自然界から単離することができるし、またリコンビナント手段もしくは合成手段により産生させることができる。このように、ネイティブな配列のポリペプチドは、天然ヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、またはその他の任意の哺乳動物種由来のポリペプチドのアミノ酸配列を有しうる。
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示す限りはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、および抗体フラグメントにわたる。
本明細書に使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、モノクローナル抗体の産生時に生じる可能性のある変異体を除いて、その集団を含む個別の抗体は同一であり、かつ／または同じエピトープと結合する。当該変異体は一般的に少量存在する。当該モノクローナル抗体には、典型的にはターゲットと結合するポリペプチド配列を含む抗体が含まれ、ここで、そのターゲットと結合するポリペプチドの配列は、複数のポリペプチド配列からの単一のターゲットと結合するポリペプチド配列を選択することを含む工程により得られたものである。例えば、その選択工程は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、またはリコンビナントＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンから独特なクローンを選択することでありうる。選択されたターゲット結合配列をさらに変更して、例えばターゲットに対する親和性を改善し、ターゲット結合配列をヒト化し、細胞培養でのその産生を改善し、それのｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性を低減し、多特異性抗体を生み出すことなどができること、およびその変更されたターゲット結合配列を含む抗体は本発明のモノクローナル抗体でもあることを了解すべきである。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロブリンが混入していない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるというその抗体の性質を表すものであり、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈してはならない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法（例えばKohler et al., Nature, 256:495 (1975)；Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas 563-681, (Elsevier, N. Y., 1981)）、リコンビナントＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号参照）、ファージディスプレイ技法（例えばClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)；Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；およびLee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照）、およびヒト免疫グロブリンローカスまたはヒト免疫グロブリン配列をコードしている遺伝子の部分または全部を有する動物においてヒト抗体またはヒト様抗体を産生させるための技法（例えばＷＯ１９９８／２４８９３；ＷＯ１９９６／３４０９６；ＷＯ１９９６／３３７３５；ＷＯ１９９１／１０７４１；Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits et al, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，５９１，６６９号（全てGenpharmの特許）；米国特許第５，５４５，８０７号；ＷＯ１９９７／１７８５２；米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号；Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)；Lonberg et al, Nature, 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)；およびLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)）を含めた多様な技法により作成することができる。
本明細書におけるモノクローナル抗体には、その抗体が所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種由来の抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、その鎖の残りが、別の種由来の抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに当該抗体のフラグメントが具体的に含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)）。本明細書において関心対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常部配列を含む「霊長類化（primatized）」抗体および「ヒト化抗体」がある。
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、げっ歯動物）抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、通例、レシピエントの超可変部由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変部由来の残基に置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。時には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク部（ＦＲ）の残基が、対応する非ヒト残基に置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見い出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、超可変ループの全てまたは実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のものであろう。ヒト化抗体は、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常部である免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）の少なくとも一部も場合により含むものである。さらなる詳細については、Jonesら、Nature 321:522-525 (1986)；Riechmannら、Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい。
ヒト化ＨＥＲ２抗体には、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７、および参照により本明細書に特に組み入れられる米国特許第５，８２１，３３７号の表３に記載されるｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８またはトラスツズマブ（HERCEPTIN（登録商標））；ヒト化５２０Ｃ９（ＷＯ９３／２１３１９）；および本明細書に記載されたパーツズマブなどのヒト化２Ｃ４抗体が挙げられる。
本明細書の目的で、「トラスツズマブ」、「ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）」、および「ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８」は、それぞれ配列番号１５および１６の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。
本明細書において、「パーツズマブ」および「ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標）」は、それぞれ配列番号１３および１４の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。
トラスツズマブおよびパーツズマブの間の機能の差を図６に示す。
本明細書における「インタクトな抗体」は、二つの抗原結合領域と一つのＦｃ部とを含む抗体である。好ましくは、インタクトな抗体は機能的なＦｃ部を有する。
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の部分を含み、その部分は好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二特異性抗体（diabody）；線状抗体（linear antibody）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。
「ネイティブな抗体」は、通常は２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合する一方で、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で多様である。各重鎖および軽鎖は、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）と、そのもう一方の末端に定常ドメインとを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられる。
用語「可変」は、可変ドメインのある部分が、抗体間で広範囲に配列が異なり、それぞれ特定の抗体の、その特定の抗原に対する結合および特異性に使用されるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたり均等に分布しているわけではない。可変性は、軽鎖および重鎖両方の可変ドメインにおける超可変部と呼ばれる三つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク部（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインそれぞれは、四つのＦＲを含み、それらのＦＲは大部分がβシート立体配置を採り、三つの超可変部により連結され、これらの超可変部は、βシート構造を連結するループを形成して、場合によりこのβシート構造の一部を形成する。各鎖中の超可変部は、ＦＲによって一緒に近接して保持されて、もう一方の鎖由来の超可変部と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照されたい）。定常ドメインは、抗原に抗体を結合させることに直接には関与していないが、抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
本明細書に使用される場合、用語「超可変部」は、抗原との結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変部は、一般的に「相補性決定部」すなわち「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、残基５０〜５６（Ｌ２）、および残基８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基３１〜３５（Ｈ１）、残基５０〜６５（Ｈ２）、および残基９５〜１０２（Ｈ３）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）ならびに／または「超可変ループ」由来の残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および残基９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｈ１）、残基５３〜５５（Ｈ２）および残基９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)）を含む。「フレームワーク部」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義されるような超可変部残基以外の可変ドメインの残基である。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる、それぞれ単一の抗原結合部位を有する２本の同一の抗原結合フラグメントと、名前が容易に結晶化できる能力を反映している残りの１「Ｆｃ」フラグメントとを産生する。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位を有するＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じ、このフラグメントは、依然として抗原と架橋できる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識抗原結合部位を有する、最小限の抗体フラグメントである。この領域は、密接に非共有的に会合した、一つの重鎖可変ドメインと一つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。各可変ドメインの三つの超可変部が相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定するのは、この立体配置である。まとめると、六つの超可変部は、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（すなわち抗原に対して特異的な三つの超可変部のみを含む、Ｆｖの半分）でさえも、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識してその抗原と結合する能力を有する。
Ｆａｂフラグメントもまた、軽鎖の定常ドメインと、重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とを有する。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体のヒンジ部由来の一つまたは複数のシステインを含む数残基が付加していることが、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を有するＦａｂ’についての呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメント対として本来産生された。抗体フラグメントのその他の化学的カップリングも公知である。
任意の脊椎動物種由来抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる二つの明らかに別個の型のうちの一つに割り当てることができる。
本明細書における用語「Ｆｃ部」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用され、ネイティブな配列のＦｃ部および変異Ｆｃ部を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ部の境界は変動するおそれがあるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ部は、通常位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで伸展すると規定される。Ｆｃ部Ｃ末端のリシン（ＥＵ付番システムによると残基４４７）を、例えば抗体の産生もしくは精製の間に、またはその抗体重鎖をコードしている核酸をリコンビナント操作することにより除去することができる。したがって、インタクトな抗体の組成物は全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、およびＫ４４７残基を伴う抗体と伴わない抗体との混合物を有する抗体集団を含みうる。
別に示さない限り、本明細書において免疫グロブリン重鎖における残基の付番は、参照により特に本明細書に組み入れられるKabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスのものである。「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基付番を指す。
「機能的Ｆｃ部」は、ネイティブな配列のＦｃ部の「エフェクター機能」を有する。「エフェクター機能」の例には、Ｃ１ｑとの結合;補体依存性細胞傷害作用；Ｆｃレセプターとの結合；抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプターのダウンレギュレーション（例えばＢ細胞レセプター；ＢＣＲ）などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は、一般にＦｃ部が結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と組み合わされることを必要とし、例えば本明細書に開示した様々なアッセイでエフェクター機能を評定することができる。
「ネイティブな配列のＦｃ部」は、自然界で見出されるＦｃ部のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。ネイティブな配列のヒトＦｃ部には、ネイティブな配列のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部（非ＡアロタイプおよびＡアロタイプ）；ネイティブな配列のヒトＩｇＧ２ Ｆｃ部；ネイティブな配列のヒトＩｇＧ３ Ｆｃ部；およびネイティブな配列のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ部、ならびにその天然変異体が含まれる。
「変異Ｆｃ部」は、少なくとも一つのアミノ酸改変、好ましくは一つまたは複数のアミノ酸置換が、ネイティブな配列のＦｃ部とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異Ｆｃ部は、ネイティブな配列のＦｃ部または親ポリペプチドのＦｃ部に比べて少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、例えばネイティブな配列のＦｃ部または親ポリペプチドのＦｃ部に約１個から約１０個のアミノ酸置換、好ましくは約１個から約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書における変異Ｆｃ部は、好ましくはネイティブな配列のＦｃ部および／または親ポリペプチドのＦｃ部と少なくとも約８０%の相同性、最も好ましくは少なくとも約９０%の相同性、より好ましくは少なくとも約９５%の相同性を有するであろう。
重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、インタクトな抗体を異なる「クラス」に割り当てることができる。インタクトな抗体には五つの主要クラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかを「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
「抗体依存性細胞性細胞傷害作用」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）がターゲット細胞上に結合した抗体を認識して、その後にターゲット細胞の溶解を起こす細胞介在性反応を指す。ＡＤＣＣを仲介するためのプライマリー細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現を要約したものは、RavetchおよびKinet、Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の４６４頁の表３である。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されているようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを行うことができる。当該アッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。または、もしくは追加的に、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を、例えばClynesら、PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されたような動物モデルでｉｎ ｖｉｖｏ評定することができる。
「ヒトエフェクター細胞」は、一つまたは複数のＦｃＲを発現してエフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、これらの細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現してＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、および好中球があり、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然起源から、例えば本明細書に記載されたように血液またはＰＢＭＣから単離することができる。
用語「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ部に結合するレセプターを記述するために使用される。好ましいＦｃＲはネイティブな配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体と結合するもの（ガンマレセプター）であり、好ましいＦｃＲには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターが、これらのレセプターのアレル変異体および選択的スプライシングされた形態を含めて挙げられる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）があり、それらは、その細胞質ドメインが主に異なる類似したアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにＩＴＡＭ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）を含む。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにＩＴＩＭ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif）を含む（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)の総説Ｍを参照されたい）。ＦｃＲは、RavetchおよびKinet、Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capelら、Immunomethods 4:25-34 (1994);およびde Haasら、J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)に総説されている。将来同定されるものを含めたその他のＦｃＲは、本明細書において用語「ＦｃＲ」に包含される。この用語は、胎児への母体ＩｇＧの輸送を担い（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）、免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児レセプターＦｃＲｎも含む。
「補体依存性細胞傷害作用」または「ＣＤＣ」は、分子が補体の存在下でターゲットを溶解する能力を指す。補体活性化経路は、コグネイト抗原と複合体を形成した分子（例えば抗体）への補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）の結合により開始する。補体活性化を評定するために、例えば、Gazzano-Santoroら、J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているようなＣＤＣアッセイを行うことができる。
「一本鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、このＦｖポリペプチドは、このｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)を参照されたい。ＨＥＲ２抗体のｓｃＦｖフラグメントは、ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号に記載されている。
用語「二特異性抗体」は、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に連結した可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上のこれら二つのドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインに別の鎖の相補的ドメインと対形成することを強いて、二つの抗原結合部位を生み出す。二特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびHollingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に、さらに完全に記載されている。
「ネイキッドな抗体」は、細胞毒性部分または放射性ラベルなどの異種分子とコンジュゲーションしていない抗体である。
「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から同定されて、分離および／または回収された抗体である。その天然環境の混入構成要素は、その抗体についての診断的用途または治療的用途を妨害するであろう物質であり、それらには、酵素、ホルモン、およびその他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質が含まれうる。好ましい態様では、抗体は、（１）ローリー法によって決定したときに、抗体の９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで精製されるか、（２）スピニングカップ（spinning cup）シークエネーターの使用により、少なくとも１５残基のＮ末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に精製されるか、または（３）クマシーブルー染色もしくは好ましくは銀染色を用いた、還元条件もしくは非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製されるであろう。単離された抗体には、リコンビナント細胞内のｉｎ ｓｉｔｕ抗体が含まれる。それは、その抗体の天然環境の少なくとも一つの構成要素が存在しないものであるからである。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも１回の精製段階によって調製されるものである。
「親和性成熟した」抗体は、変更を有さない親抗体に比べて、抗原に対する抗体の親和性に改善を生じる一つまたは複数の変更を、その一つまたは複数の超可変部に有する抗体である。好ましい親和性成熟した抗体は、ターゲット抗原に対してナノモル濃度またはピコモル濃度の親和性さえ有するであろう。親和性成熟した抗体は、当技術分野で公知の手順によって産生される。Marksら、Bio/Technology 10: 779-783 (1992)は、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813 (1994)；Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995)；Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7): 3310-9 (1995);およびHawkins et al, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992)に記載されている。
本明細書における用語「主要種抗体」は、組成物中の量的に優占的な抗体分子である、その組成物中の抗体構造を指す。一態様において、主要種抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する抗体、ＨＥＲの二量体化をトラスツズマブよりも効果的に阻害する抗体、および／またはＨＥＲ２のヘテロ二量体性結合部位に結合する抗体などのＨＥＲ２抗体である。主要種抗体の本明細書における好ましい態様は、配列番号３および４の可変軽鎖および可変重鎖アミノ酸配列を含む抗体であり、最も好ましくは配列番号１３および１４の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体（パーツズマブ）である。
本明細書における「アミノ酸配列変異体」抗体は、主要種抗体と異なるアミノ酸配列を有する抗体である。通常、アミノ酸配列変異体は、主要種抗体と少なくとも約７０％の相同性を有するものであり、好ましくは、主要種抗体と少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％相同なものである。このアミノ酸配列変異体は、主要種抗体のアミノ酸配列内の、またはそれに隣接したある位置に置換、欠失、および／または付加を有する。本明細書におけるアミノ酸配列変異体の例には、酸性変異体（例えば、脱アミド化抗体変異体）、塩基性変異体、その一つまたは二つの軽鎖にアミノ末端リーダー伸長（例えば ＶＨＳ−）を有する抗体、その一つまたは二つの重鎖にＣ末端リシン残基を有する抗体などが挙げられ、重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列に対する変異の組み合わせが含まれる。本明細書において特に関心対象の抗体変異体は、その一つまたは二つの軽鎖にアミノ末端リーダー伸長を含み、場合により主要種抗体と比較してその他のアミノ酸配列および／またはグリコシル化の相違をさらに含む抗体である。
本明細書における「グリコシル化変異体」抗体は、主要種抗体に付着した一つまたは複数の糖質部分とは異なる一つまたは複数の糖質部分が付着した抗体である。本明細書におけるグリコシル化変異体の例には、Ｇ０オリゴ糖構造の代わりにＧ１またはＧ２オリゴ糖構造がＦｃ部に付着した抗体、一つまたは二つの糖質部分が一つまたは二つの軽鎖に付着した抗体、その抗体の一つまたは二つの重鎖に糖質が付着していない抗体など、およびグリコシル化変更の組み合わせが挙げられる。
抗体がＦｃ部を有する場合、オリゴ糖構造を抗体の一つまたは二つの重鎖に、例えば残基２９９（Ｅｕの残基付番では２９８）に付着させることができる。パーツズマブについてはＧ０が主要なオリゴ糖構造であり、Ｇ０−Ｆ、Ｇ−１、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｇ１−１、Ｇ１（１−６）、Ｇ１（１−３）、およびＧ２などのその他のオリゴ糖構造は、パーツズマブ組成物中にさらに少量みられた。
別に示さない限り、本明細書における「Ｇ１オリゴ糖構造」には、Ｇ−１、Ｇ１−１、Ｇ１（１−６）、およびＧ１（１−３）構造が含まれる。
本明細書における「アミノ末端リーダー伸長」は、抗体の任意の一つまたは複数の重鎖または軽鎖のアミノ末端に存在するアミノ末端リーダー配列の一つまたは複数のアミノ酸残基を指す。アミノ末端リーダー伸長の例は、抗体変異体の一方もしくは両方の軽鎖に存在する三つのアミノ酸残基ＶＨＳを含むか、またはそれからなる。
「脱アミド化」抗体は、その抗体の一つまたは複数のアスパラギン残基が、例えばアスパラギン酸、スクシンイミド、またはイソアスパラギン酸に誘導体化された抗体である。
用語「ガン」および「ガン性」は、無秩序な細胞成長によって典型的には特徴付けられる、哺乳類における生理的状態を指すか、または記載する。ガンの例には、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫（髄芽腫および網膜芽腫を含む）、肉腫（脂肪肉腫および滑膜細胞肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリノーマ、および膵島細胞ガンを含む）、中皮腫、神経鞘腫（聴神経腫を含む）、髄膜腫、腺ガン、黒色腫、および白血病またはリンパ系悪性疾患が挙げられるが、それに限定されるわけではない。当該ガンのさらに特別な例には、扁平上皮ガン（例えば上皮扁平上皮ガン）；小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）、肺腺ガンおよび肺扁平上皮ガンを含む肺ガン；腹膜ガン；肝細胞ガン；消化管ガンを含む胃ガン；膵臓ガン；神経膠芽腫；子宮頚がん；卵巣ガン；肝ガン；膀胱ガン；ヘパトーマ；乳ガン（転移性乳ガンを含む）；結腸ガン；直腸ガン；直腸結腸ガン；子宮内膜ガンまたは子宮ガン；唾液腺ガン；腎ガン；前立腺がん；外陰部ガン；甲状腺ガン；肝ガン；肛門ガン；陰茎ガン；精巣ガン；食道ガン；胆道腫瘍；ならびに頭頚部ガンが挙げられる。
「進行性の」ガンは、本来の部位または器官の外側に、局所浸潤または転移のいずれかにより広がったガンである。
「抗療性の」ガンは、化学療法剤などの抗腫瘍剤がそのガン患者に投与されているにもかかわらず進行するガンである。抗療性のガンの例は、プラチナ抗療性のガンである。
「再発性の」ガンは、初回治療に応答後に、当初の部位または遠隔部位のいずれかで再成長したガンである。
本明細書において、「患者」はヒト患者である。患者は「ガン患者」、すなわちガンの一つまたは複数の症状に苦しむか、またはそのリスクのある患者である。
本明細書における「腫瘍試料」は、患者の腫瘍由来の試料であるか、またはその腫瘍由来の腫瘍細胞を含む試料である。本明細書における腫瘍試料の例には、腫瘍生検、循環している腫瘍細胞、循環している血漿タンパク質、腹水、腫瘍由来の、または腫瘍様性質を示す初代細胞培養物または細胞系、およびホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料または凍結腫瘍試料などの保存処理された腫瘍試料があるが、それらに限定されるわけではない。
「固定」腫瘍試料は、固定剤を用いて組織学的に保存処理された試料である。
「ホルマリン固定」腫瘍試料は、固定剤としてホルムアルデヒドを用いて保存処理された試料である。
「包埋」腫瘍試料は、パラフィン、ろう、セロイジン、または樹脂などの堅固で一般的に硬い媒質により囲まれた試料である。包埋は、顕微鏡検査用または組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）作成用の薄切片を切り出すことを可能にする。
「パラフィン包埋」腫瘍試料は、石油由来固体炭化水素の精製混合物に囲まれた試料である。
本明細書において、「凍結」腫瘍試料は、凍結しているか、または凍結された腫瘍試料を指す。
「ＨＥＲの発現、増幅、または活性化を示す」ガンまたは生体試料は、診断検査において（過剰発現を含めて）レセプターＨＥＲを発現し、ＨＥＲ遺伝子を増幅しており、かつ／またはその他の方法でレセプターＨＥＲの活性化もしくはリン酸化を示すものである。
「ＨＥＲの活性化を示す」ガンまたは生体試料は、診断検査においてレセプターＨＥＲの活性化またはリン酸化を示すものである。当該活性化を、（例えばＥＬＩＳＡによりＨＥＲのリン酸化を測定することによって）直接または（本明細書に記載された遺伝子発現プロファイリングによって、またはＨＥＲのヘテロ二量体を検出することによって）間接的に決定することができる。
本明細書において、「遺伝子発現プロファイリング」は、ＨＥＲのリン酸化を直接決定するための代理として一つまたは複数の遺伝子の発現を評価することを指す。
本明細書における「ホスホ−ＥＬＩＳＡアッセイ」は、試薬、通常抗体を使用した酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で一つまたは複数のレセプターＨＥＲ、特にＨＥＲ２のリン酸化を評価し、リン酸化されたレセプターＨＥＲ、基質、または下流のシグナル伝達分子を検出するアッセイである。好ましくは、リン酸化ＨＥＲ２を検出する抗体が使用される。好ましくは新鮮生体試料または凍結生体試料由来の細胞溶解液を用いてこのアッセイを行うことができる。
「レセプターＨＥＲの過剰発現または増幅」を伴うガン細胞は、同じ組織型の非ガン性細胞に比べて、有意に高レベルのレセプターＨＥＲタンパク質または遺伝子を有するガン細胞である。当該過剰発現は、遺伝子増幅によって、または転写もしくは翻訳の増加によって引き起こすことができる。レセプターＨＥＲの過剰発現または増幅を、細胞表面に存在するＨＥＲタンパク質のレベル増加を評価することによって、診断または予後アッセイで（例えば免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）により）決定することができる。または、もしくは追加的に、例えば、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開されたＷＯ９８／４５４７９参照）、サザンブロット、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法（定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）など）によって、細胞中のＨＥＲをコードしている核酸のレベルを測定することができる。血清などの生体液中のシェディングされた抗原（例えばＨＥＲ細胞外ドメイン）を測定することによって、レセプターＨＥＲの過剰発現または増幅を研究することもできる（例えば、１９９０年６月１２日に発行された米国特許第４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日に公開されたＷＯ９１／０５２６４；１９９５年３月２８日に発行された米国特許第５，４０１，６３８号；およびSias et al. J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)を参照されたい）。上記アッセイの他に、様々なｉｎ ｖｉｖｏアッセイが当業者に利用できる。例えば検出可能なラベル、例えば放射性同位体で場合によりラベルされた抗体に、患者の体内の細胞を曝露して、例えば放射能を外部スキャンすることにより、またはその抗体に予め曝露された患者から採取した生検を分析することにより、その患者の細胞に対する抗体の結合を評価することができる。
逆に、「レセプターＨＥＲを過剰発現も増幅もしない」ガンは、同じ組織型の非ガン性細胞に比べて正常レベルよりも高いレセプターＨＥＲタンパク質も遺伝子も有さないガンである。パーツズマブなどのＨＥＲ二量体化を阻害する抗体を使用して、レセプターＨＥＲ２を過剰発現も増幅もしないガンを処置することができる。
本明細書において、「抗腫瘍剤」は、ガンを処置するために使用される薬物を指す。本明細書における抗腫瘍剤の非限定的な例には、化学療法剤、ＨＥＲ二量体化阻害剤、ＨＥＲ抗体、腫瘍関連抗原に対する抗体、抗ホルモン化合物、サイトカイン、ＥＧＦＲターゲット薬、抗血管形成剤、チロシンキナーゼ阻害剤、成長阻害剤および成長阻害抗体、細胞毒性薬、アポトーシスを誘導する抗体、ＣＯＸ阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ガン胎児タンパク質ＣＡ１２５と結合する抗体、ＨＥＲ２ワクチン、Ｒａｆ阻害剤またはｒａｓ阻害剤、リポソームドキソルビシン、トポテカン、タキサン、二重チロシンキナーゼ阻害剤、ＴＬＫ２８６、ＥＭＤ−７２００、パーツズマブ、トラスツズマブ、エルロチニブ、およびベバシズマブが挙げられる。
「認可された抗腫瘍剤」は、食品医薬品局（ＦＤＡ）または外国の同等機関などの監督機関により販売許可を与えられた、ガンを処置するために使用される薬物である。
ＨＥＲ二量体化阻害剤が「単一抗腫瘍剤」として投与される場合、その阻害剤はそのガンを処置するために投与される唯一の抗腫瘍剤であり、すなわちその阻害剤は化学療法剤などの別の抗腫瘍剤と組み合わせて投与されない。
本明細書における「診療標準（standard of care）」によって、特定の形態のガンを処置するために日常的に使用される抗腫瘍剤が意味される。例えば、プラチナ耐性卵巣ガンについて、診療基準はトポテカンまたはリポソームドキソルビシンである。
本明細書に使用される場合の「成長阻害剤」は、細胞、特にＨＥＲ発現ガン細胞の成長をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで阻害する化合物または組成物を指す。このように、成長阻害剤は、Ｓ期のＨＥＲ発現細胞の率を有意に低減する薬剤でありうる。成長阻害剤の例には、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤などの、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）遮断する薬剤がある。古典的Ｍ期遮断薬には、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなどのトポＩＩ阻害剤がある。Ｇ１で停止させる薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤は、Ｓ期停止にも波及する。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds.の、Murakamiらによる「Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs」(WB Saunders: Philadelphia, 1995)という標題の第１章、特に１３頁に見出すことができる。
「成長阻害」抗体の例は、ＨＥＲ２に結合し、ＨＥＲ２を過剰発現しているガン細胞の成長を阻害する抗体である。好ましい成長阻害ＨＥＲ２抗体は、約０．５から３０μg/mlの抗体濃度で、細胞培養でのＳＫ−ＢＲ−３乳房腫瘍細胞の成長を２０％よりも大きく、好ましくは５０％よりも大きく（例えば、約５０％から約１００％）阻害する。ここで、抗体にＳＫ−ＢＲ−３細胞を曝露した６日間後に、この成長阻害は決定される（１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号を参照されたい）。このＳＫ−ＢＲ−３細胞成長阻害アッセイは、その特許および本明細書の下記にさらに詳細に記載されている。好ましい成長阻害抗体は、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５のヒト化変異体、例えばトラスツズマブである。
「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡのフラグメント化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞のフラグメント化、および／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成によって決定されるようなプログラム細胞死を誘導する抗体である。この細胞は、通常、レセプターＨＥＲ２を過剰発現する細胞である。好ましくは、この細胞は、腫瘍細胞、例えば、乳房細胞、卵巣細胞、胃細胞、子宮内膜細胞、唾液腺細胞、肺細胞、腎臓細胞、結腸細胞、甲状腺細胞、膵臓細胞、または膀胱細胞である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、この細胞は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＢＴ４７４細胞、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞、またはＳＫＯＶ３細胞でありうる。アポトーシスに関連する細胞事象を評価するために様々な方法が利用できる。例えば、アネキシンの結合によってホスファチジルセリン（ＰＳ）の移行を測定でき；ＤＮＡラダー生成によってＤＮＡのフラグメント化を評価することができ；低二倍体細胞の任意の増加によってＤＮＡのフラグメント化と同時に核／クロマチンの凝縮を評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体は、ＢＴ４７４細胞を用いたアネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞と比較して約２から５０倍、好ましくは約５から５０倍、最も好ましくは約１０から５０倍のアネキシン結合の誘導を招く抗体である（以下参照）。アポトーシスを誘導するＨＥＲ２抗体の例は、７Ｃ２および７Ｆ３である。
「エピトープ２Ｃ４」は、抗体２Ｃ４が結合する、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。好ましくは、この抗体は、ＨＥＲ２に対する２Ｃ４の結合を約５０％以上遮断する。または、 エピトープマッピングを行って、その抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープに結合するかどうかを評定することができる。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中のドメインＩＩ由来残基を含む。２Ｃ４およびパーツズマブは、ドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの結合部でＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004)。
「エピトープ４Ｄ５」は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０４６３）およびトラスツズマブが結合する領域である。このエピトープはＨＥＲ２の膜貫通ドメインに近接しており、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内に存在する。４Ｄ５エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane(1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。または、エピトープマッピングを行って、その抗体がＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープ（例えば、ＨＥＲ２ ＥＣＤの約５２９番残基から約６２５番残基まで、両端の残基を含めた領域における任意の一つまたは複数の残基、残基の付番にシグナルペプチドを含める）に結合するかどうかを評定することができる。
「エピトープ７Ｃ２／７Ｆ３」は、７Ｃ２抗体および／または７Ｆ３抗体（それぞれＡＴＣＣに寄託、以下参照）が結合する、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩ内のＮ末端の領域である。７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane(1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。または、その抗体がＨＥＲ２上の７Ｃ２／７Ｆ３エピトープ（例えば、ＨＥＲ２ ＥＣＤの約２２番残基から約５３番残基までの領域中の任意の一つまたは複数の残基、残基の付番にシグナルペプチドを含める）に結合するかどうかを確認するために、エピトープマッピングを行うことができる。
「処置」は、治療的処置および予防措置または阻止措置の両方を指す。処置を必要とする者には、すでにそのガンを有する者およびそのガンが予防されるべき者が含まれる。したがって、本明細書において処置されるガンは、ガンを有すると診断されたことがあるか、または、ガンの素因があるか、もしくはガンに感受性であることもできる。
用語「有効量」は、患者におけるガンを処置するために有効な薬物の量を指す。その薬物の有効量は、ガン細胞数を減少させ；腫瘍の大きさを低減し；末梢器官へのガン細胞の浸潤を阻害し（すなわちある程度減速させて、好ましくは停止させ）；腫瘍の転移を阻害し（すなわちある程度減速させて、好ましくは停止させ）；腫瘍の成長をある程度阻害し；かつ／またはガンに関連した一つもしくは複数の症状をある程度軽減することができる。薬物が成長を阻止して、かつ／または現存しているガン細胞を殺滅できる程度に、有効量は細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性でありうる。有効量は、（例えば固形腫瘍効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）またはＣＡ−１２５の変化によって測定されるような）無増悪生存を延長し、（部分奏効（ＰＲ）または完全奏効（ＣＲ）を含めた）奏効を招き、全生存を増大させ、かつ／または（ＦＯＳＩによって評定されるような）ガンの一つもしくは複数の症状を改善することができる。
本明細書で使用される用語「細胞毒性薬」は、細胞の機能を阻害もしくは阻止し、かつ／または細胞の破壊を起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、および細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素などの毒素を、そのフラグメントおよび／または変異体を含めて含むことを意味する。
「化学療法剤」は、ガンの処置に有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミド（CYTOXAN（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）、およびウレドーパ（uredopa）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロールメラミン（trimethylolomelamine）を含めたエチレンイミンおよびメチルメラミン（methylamelamine）；ＴＬＫ２８６（TELCYTA（商標））；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン（bullatacinone））；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、MARINOL（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログであるトポテカン（HYCAMTIN（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、CAMPTOSAR（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（scopolectin）、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（合成アナログＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ranimnustine）などのニトロソ尿素；クロドロネートなどのビスホスホン酸塩；エンジイン抗生物質など（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)参照））およびアンナマイシンなどのアントラサイクリン、ＡＤ３２、アルカルビシン（alcarubicin）、ダウノルビシン、デキストラゾキサン（dexrazoxane）、ＤＸ−５２−１、エピルビシン、ＧＰＸ−１００、イダルビシン、ＫＲＮ５５００、メノガリル、ジネマイシン（ジネマイシンＡを含む）、エスペラマイシン、ネオカルジノスタチン発色団および関係する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含めた）ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（ドキソルビシン）、エソルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシンなどの抗生物質；デノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジンなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、およびトリロスタンなどの抗副腎剤（anti-adrenal）；ホリニン酸（ロイコボリン）などの葉酸補給剤；アセグラトン；ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）（ＬＹ２３１５１４、ペメトレキセド）、メトトレキサートなどのジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗物質およびＵＦＴなどのそのプロドラッグ、Ｓ１およびカペシタビン、ならびにラルチトレキセド（TOMUDEX（商標）、ＴＤＸ）などのチミジル酸シンターゼ阻害剤およびグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ阻害剤などの抗葉酸抗腫瘍剤；エニルウラシルなどのジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ阻害剤；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デホファミン（defofamine）；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, OR）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリン（verracurin）Ａ、ロリジンＡ、およびアングイジン（anguidine））；ウレタン；ビンデシン（ELDISINE（登録商標）、FILDESIN（登録商標））：ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；パクリタキセル（TAXOL（登録商標））(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、パクリタキセルの無Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒアルブミン加工ナノ粒子製剤であるＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois）、およびドセタキセル（TAXOTERE（登録商標））（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）などのタキソイドおよびタキサン；クロランブシル；ゲムシタビン（GEMZAR（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；プラチナ；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなどの、プラチナアナログ又はプラチナベースアナログ；ビンブラスチン（VELBAN（登録商標））；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ONCOVIN（登録商標））；ビンカアルカロイド；ビノレルビン（NAVELBINE（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；前記いずれかの薬学的に許容されうる塩、酸、または誘導体；ならびにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法についての略語）およびＦＯＬＦＯＸ（オキサリプラチン（ELOXATIN（商標））を５−ＦＵおよびロイコボリンと組合せて用いた処置方式についての略語）がある。
腫瘍に及ぼすホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も本定義に含まれる。それらには、例えば、タモキシフェン（タモキシフェン（NOLVADEX（登録商標））を含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（FARESTON（登録商標））を含めた抗エストロゲンおよび選択的エストロゲンレセプターモデュレーター（ＳＥＲＭ）；例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（MEGASE（登録商標））、エキセメスタン（AROMASIN（登録商標））、ホルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール（RIVISOR（登録商標））、レトロゾール（FEMARA（登録商標））、およびアナストロゾール（ARIMIDEX（登録商標））などの、副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびにトロキサシタビン（troxacitabine）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）などの、接着性細胞増殖に関係づけられているシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド；遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ならびに前記いずれかの薬学的に許容されうる塩、酸、または誘導体がある。「代謝拮抗化学療法剤」は、代謝物に構造的に類似しているが、生産的方法で身体によって使用されることができない薬剤である。多くの代謝拮抗化学療法剤は、核酸、すなわちＲＮＡおよびＤＮＡの産生を妨害する。代謝拮抗化学療法剤の例には、ゲムシタビン(GEMZAR（登録商標）)、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（XELODA（商標））、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、６−チオグアニン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アラビノシルシトシン（ＡＲＡ−Ｃ、シタラビン）（CYTOSAR-U（登録商標））、ダカルバジン（DITC-DOME（登録商標））、アゾシトシン（azocytosine）、デオキシシトシン、ピリドミデン（pyridmidene）、フルダラビン（FLUDARA（登録商標））、クラドラビン、２−デオキシ−Ｄ−グルコースなどが挙げられる。好ましい代謝拮抗化学療法剤は、ゲムシタビンである。
「ゲムシタビン」すなわち「２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン一塩酸塩（ｂ−異性体）」は、抗腫瘍活性を示すヌクレオシドアナログである。ゲムシタビンＨＣｌの実験式はＣ９Ｈ１１Ｆ２Ｎ３Ｏ４・ＨＣｌである。ゲムシタビンＨＣｌは、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）の商標でＥｌｉ Ｌｉｌｌｙにより販売されている。
「プラチナ系化学療法剤」は、分子の構成部分としてプラチナを含有する有機化合物を含む。プラチナ系化学療法剤の例には、カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチンが挙げられる。
「プラチナ系化学療法」により、一つまたは複数のプラチナ系化学療法剤を、場合により一つまたは複数のその他の化学療法剤と併用した治療を意味する。
「化学療法耐性」ガンにより、化学療法方式を受けている間に、そのガン患者が進行した（すなわち、そのガン患者は「化学療法抗療性」である）か、またはその患者が化学療法方式を完了した１２か月以内（例えば６か月以内）に進行したことを意味する。
「プラチナ耐性」ガンにより、プラチナ系化学療法を受けている間に、そのガン患者が進行した（すなわち、その患者は「プラチナ抗療性」である）か、またはその患者がプラチナ系化学療法方式を完了した後１２か月以内（例えば、６か月以内）に進行したことを意味する。
「抗血管形成剤」は、血管の発生をある程度遮断または妨害する化合物を指す。抗血管形成因子は、例えば、血管形成の促進に関与する成長因子または成長因子レセプターに結合する小分子または抗体でありうる。本明細書における好ましい抗血管形成因子は、ベバシズマブ（AVASTIN（登録商標））などの、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体である。
用語「サイトカイン」は、ある細胞集団によって放出され、細胞間仲介物質として別の細胞に作用するタンパク質についての総称である。当該サイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。これらのサイトカインの中に含まれるのは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β；ミュラー管抑制物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）など）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含めたその他のポリペプチド因子である。本明細書に使用される用語サイトカインには、天然起源由来またはリコンビナント細胞培養物由来のタンパク質、およびネイティブな配列のサイトカインの生物学的活性等価物が含まれる。
本明細書において使用される用語「ＥＧＦＲターゲット薬」は、ＥＧＦＲに結合して、場合によりＥＧＦＲの活性化を阻害する治療剤を指す。当該薬剤の例には、ＥＧＦＲに結合する抗体および小分子が挙げられる。ＥＧＦＲに結合する抗体の例には、ＭＡｂ５７９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０６）、ＭＡｂ４５５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ２２５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８５０８）、ＭＡｂ５２８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８５０９）（米国特許第４，９４３，５３３号、Mendelsohn et al.参照）、ならびにキメラ化２２５（Ｃ２２５またはセツキシマブ；ERBUTIX（登録商標））および再形状化ヒト２２５（Ｈ２２５）（ＷＯ９６／４０２１０、Imclone Systems Inc.参照）などのその変異体；ＩＭＣ−１１Ｆ８、完全ヒトＥＧＦＲターゲット抗体（Imclone）、ＩＩ型突然変異ＥＧＦＲと結合する抗体（米国特許第５，２１２，２９０号）；米国特許第５，８９１，９９６号に記載された、ＥＧＦＲと結合するヒト化抗体およびキメラ抗体；ＡＢＸ−ＥＧＦなどの、ＥＧＦＲと結合するヒト抗体（ＷＯ９８／５０４３３、Abgenix参照）；ＥＭＤ５５９００（Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)）;ＥＧＦＲとの結合についてＥＧＦおよびＴＧＦ−αの両方と競合する、ＥＧＦＲに対するヒト化ＥＧＦＲ抗体であるＥＭＤ７２００（マツズマブ）；ならびにｍＡｂ８０６またはヒト化ｍＡｂ８０６（Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)）が挙げられる。抗ＥＧＦＲ抗体を細胞毒性薬とコンジュゲーションすることにより、免疫コンジュゲートを発生させることができる（例えば、ＥＰ６５９，４３９Ａ２、Merck Patent GmbH参照）。ＥＧＦＲに結合する小分子の例には、ＺＤ１８３９すなわちゲフィチニブ（IRESSA（商標）；AstraZeneca）、ＣＰ−３５８７７４すなわちエルロチニブ（TARCEVA（商標）；Genentech/OSI)、およびＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Sugen）、ＥＭＤ−７２００が挙げられる。
「チロシンキナーゼ阻害剤」は、レセプターＨＥＲなどのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性を阻害する分子である。当該阻害剤の例には、前項で言及したＥＧＦＲターゲット薬；武田から入手可能なＴＡＫ１６５などの小分子ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤；ＥｒｂＢ２レセプターチロシンキナーゼの経口選択的阻害剤であるＣＰ−７２４，７１４（PfizerおよびOSI）；選好的にＥＧＦＲと結合するが、ＨＥＲ２を過剰発現している細胞およびＥＧＦＲを過剰発現している細胞の両方を阻害するＥＫＢ−５６９（Wyethから入手できる）などの二重ＨＥＲ阻害剤；経口ＨＥＲ２およびＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であるＧＷ５７２０１６（Glaxoから入手できる）；ＰＫＩ−１６６（Novartisから入手できる）；カネルチニブ（ＣＩ−１０３３；Pharmacia）などの汎ＨＥＲ阻害剤；Ｒａｆ−１シグナル伝達を阻害する、ＩＳＩＳ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから入手できるアンチセンス剤ＩＳＩＳ−５１３２などのＲａｆ−１阻害剤；Ｇｌａｘｏから入手できるメシル酸イマチニブ（Gleevac（商標））などの非ＨＥＲターゲットＴＫ阻害剤；ＭＡＰＫ細胞外調節キナーゼＩ阻害剤ＣＩ−１０４０（Pharmaciaから入手できる）；ＰＤ１５３０３５、４−（３−クロロアニリノ）キナゾリンなどのキナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；ＣＧＰ５９３２６、ＣＧＰ６０２６１、およびＣＧＰ６２７０６などのピロロピリミジン；ピラゾロピリミジン、４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン；クルクミン（ジフェルロイルメタン、４，５−ビス（４−フルオロアニリノ）フタルイミド）；ニトロチオフェン部分含有チルホスチン；ＰＤ−０１８３８０５（Warner-Lamber）；アンチセンス分子（例えば、ＨＥＲをコードしている核酸に結合するもの）；キノキサリン（米国特許第５，８０４，３９６号）；トリホスチン（tryphostin）（米国特許第５，８０４，３９６号）；ＺＤ６４７４（Astra Zeneca）；ＰＴＫ−７８７（Novartis/Schering AG）；ＣＩ−１０３３（Pfizer）などの汎ＨＥＲ阻害剤；アフィニタック（ＩＳＩＳ３５２１；Isis/Lilly）；メシル酸イマチニブ（Gleevac； Novartis）；ＰＫＩ１６６（Novartis）；ＧＷ２０１６（Glaxo SmithKline）；ＣＩ−１０３３（Pfizer）；ＥＫＢ−５６９（Wyeth）；セマキシニブ（Sugen）；ＺＤ６４７４（AstraZeneca）；ＰＴＫ−７８７（Novartis/Schering AG）；ＩＮＣ−１Ｃ１１（Imclone）；または以下の特許公報のいずれかに記載されるもの：米国特許第５，８０４，３９６号；ＷＯ９９／０９０１６（American Cyanimid）；ＷＯ９８／４３９６０（American Cyanamid）；ＷＯ９７／３８９８３（Warner Lambert）；ＷＯ９９／０６３７８（Warner Lambert）；ＷＯ９９／０６３９６（Warner Lambert）；ＷＯ９６／３０３４７（Pfizer, Inc）；ＷＯ９６／３３９７８（Zeneca）；ＷＯ９６／３３９７（Zeneca）；およびＷＯ９６／３３９８０（Zeneca）が挙げられる。
本明細書における「一定」または「均一」用量の治療剤は、患者の体重（ＷＴ）または体表面積（ＢＳＡ）を考慮せずにヒト患者に投与される用量を指す。したがって、一定用量または均一用量はmg/kg用量としても、mg/m2用量としても提供されず、治療剤の絶対量として提供される。
本明細書における「ローディング」投与は、一般に患者に与えられる初回投与の治療剤を含み、これにその治療剤の１回または複数回の維持投与が続く。一般に単回のローディング投与が与えられるが、多回のローディング投与も本明細書において考えられている。通常は、維持投与で実現することができるよりも早期に治療剤の所望の定常状態濃度を実現するために、投与されるローディング用量は、投与される維持用量を超え、かつ／またはそのローディング投与は維持投与よりも頻繁に投与される。
本明細書における「維持」投与は、処置期間にわたり患者に与えられる治療剤の１回または複数回の投与を指す。通常は、ほぼ毎週、ほぼ隔週、ほぼ３週間毎、またはほぼ４週間毎などの処置間隔で投与される。
ＩＩ． 抗体の産生
好ましい態様では、ＨＥＲ二量体化阻害剤は抗体であるため、本発明により使用されるＨＥＲ抗体の産生についての例示的な技法に関して以下に説明する。抗体の産生に使用されるＨＥＲ抗原は、例えば、所望のエピトープを含む、レセプターＨＥＲの可溶型細胞外ドメインまたはその一部分でありうる。または、細胞表面にＨＥＲを発現している細胞（例えば、ＨＥＲ２を過剰発現するようにトランスフォーメーションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞；またはＳＫ−ＢＲ−３細胞などのガン細胞系、Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)参照）を使用して抗体を作成することができる。抗体の発生に有用な他の形態のレセプターＨＥＲは、当業者に明らかなものである。
（ｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物に産生される。二官能剤または誘導化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を使用して、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤などの、免疫処置される種に免疫原性であるタンパク質と関連抗原をコンジュゲーションすることが有用なことがある。
例えば、（それぞれウサギまたはマウスに対して）１００μgまたは５μgのタンパク質またはコンジュゲートを３倍量のフロイント完全アジュバントと混合し、複数の部位にその溶液を皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して動物を免疫処置する。１か月後、フロイント完全アジュバントに入れた初回量の１／５から１／１０のペプチドまたはコンジュゲートを用いて複数の部位で皮下注射することにより、その動物に追加免疫する。７日から１４日後、その動物から採血し、そしてその血清の抗体力価をアッセイする。力価がプラトーになるまで動物に追加免疫する。好ましくは、同抗原のコンジュゲートであるが、異なるタンパク質と、および／または異なる架橋試薬を介してコンジュゲーションしたものを用いて、その動物を追加免疫する。タンパク質融合体としてリコンビナント細胞培養でコンジュゲートを作成することもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤を適切に使用して、免疫応答を増強させる。
（ｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を作成するための様々な方法を当技術分野で利用することができる。例えば、Kohlerら、Nature, 256: 495 (1975)に最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して、リコンビナントＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によりモノクローナル抗体を作成することができる。
ハイブリドーマ法では、マウス、またはハムスターなどのその他の適切な宿主動物を、本明細書の前述のように免疫処置して、免疫処置のために使用されたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するか、または産生できるリンパ球を誘発させる。または、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫処置することができる。次に、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する一つまたは複数の物質を好ましくは含有する適切な培地に接種し、成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠如しているならば、ハイブリドーマ用の培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むものであり（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの産生を支持し、かつＨＡＴ培地などの培地に感受性の細胞である。これらのうち好ましい骨髄腫細胞系は、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来の細胞系、ならびにAmerican Type Culture Collection, Rockville, Maryland USAから入手できるＳＰ−２細胞またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞などのマウス骨髄腫系である。ヒト骨髄腫細胞系およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系も、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984);およびBrodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
その抗原に対するモノクローナル抗体の産生について、ハイブリドーマ細胞が中で成長している培地をアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降により、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにより決定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)のスキャッチャード解析によって決定することができる。
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後で、限界希釈手順によりそのクローンをサブクローニングして、標準的な方法により成長させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的に適切な培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地がある。さらに、このハイブリドーマ細胞を、動物における腹水腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで成長させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の抗体精製手順によって培地、腹水、または血清から適切に分離する。
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離されて、配列解析される。ハイブリドーマ細胞は、当該ＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、そのＤＮＡを発現ベクターの中に配置することができ、次にＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他の状況では抗体タンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にその発現ベクターをトランスフェクションして、リコンビナント宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードしているＤＮＡを細菌にリコンビナント発現させることに関する総説論文には、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993)およびPluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)がある。
さらなる態様では、モノクローナル抗体または抗体フラグメントを、McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)に記載されている技法を使用して作成された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用した、それぞれマウス抗体およびヒト抗体の単離を記載している。その後の刊行物は、鎖シャッフリング（chain shuffling）（Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)）による高親和性（nM範囲）ヒト抗体の産生ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびｉｎ ｖｉｖｏリコンビネーション（Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)）について記載している。このように、これらの技法は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法に対する実行可能な代替法である。
例えば、相同マウス配列に代わり、ヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインについてのコード配列に置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)）、または免疫グロブリンのコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てもしくは一部を共有結合的に繋ぐことによっても、ＤＮＡを改変することができる。
典型的には、抗体の定常ドメインの代わりに当該非免疫グロブリンポリペプチドに置換するか、または、抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりにそれらに置換して、抗原に対する特異性を有する一つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を生み出す。
（ｉｉｉ）ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野で記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである起源からその抗体に導入された一つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入（import）」残基と称される。この残基は、典型的には「輸入」可変ドメインから取り入れられる。ヒト化は、ヒト抗体の対応配列の代わりに超可変部配列に置換することによって、Winterおよび共同研究者らの方法（Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)）に従って本質的に行うことができる。したがって、当該「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に小さな配列が非ヒト種由来の対応する配列に置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際にはヒト化抗体は、典型的には一部の超可変部残基と、可能性があることには一部のＦＲ残基とが、げっ歯動物抗体の類似部位由来の残基に置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体を作成する際に使用される、軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法により、げっ歯動物抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に、そのげっ歯動物の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体についてのヒトフレームワーク部（ＦＲ）として受け入れる（Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)）。別の方法は、特定亜群の軽鎖または重鎖の全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク部を使用する。同フレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)）。
抗体が抗原に対する高い親和性およびその他の好都合な生物学的性質を保持してヒト化されることは、さらに重要である。この目標を実現するために、好ましい方法により、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列および様々な概念上のヒト化産物の分析プロセスによりヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルが、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元コンフォメーション構造を図解して表示するコンピュータプログラムを利用することができる。これらの表示の調査により、候補免疫グロブリン配列の機能発揮にこれらの残基が果たしそうな役割を分析すること、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響する残基を分析することが可能になる。このように、ＦＲ残基を、レシピエント配列および輸入配列より選択して組合せることができ、それにより、ターゲット抗原に対する親和性増大などの所望の抗体特性が実現される。一般に、超可変部残基は、抗原結合に影響することに直接的かつ最も実質的に関与している。
ＷＯ０１／００２４５は、ＨＥＲ２と結合してリガンドによるレセプターＨＥＲの活性化を遮断する例示的なヒト化ＨＥＲ２抗体の産生を記載している。本明細書において特に関心対象のヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４（またはそのＦａｂフラグメント）と本質的に同様に効果的に、ＥＧＦ、ＴＧＦ−αおよび／もしくはＨＲＧが介在するＭＡＰＫ活性化を遮断し、かつ／またはマウスモノクローナル抗体２Ｃ４（もしくはそのＦａｂフラグメント）と本質的に同様に効果的にＨＥＲ２と結合する。本明細書におけるヒト化抗体は、例えば、ヒト可変重鎖ドメインに組み込まれた非ヒト超可変部残基を含むことがあり、さらにKabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に述べられた可変ドメイン付番システムを利用して、６９Ｈ、７１Ｈ、および７３Ｈからなる群より選択される位置にフレームワーク部（ＦＲ）置換を含むことがある。一態様では、ヒト化抗体は、位置６９Ｈ、７１Ｈおよび７３Ｈの二つまたは全てにＦＲ置換を含む。
本明細書において関心対象の例示的なヒト化抗体は、重鎖可変ドメイン相補性決定部残基ＧＦＴＦＴＤＹＴＭＸ（Ｘは好ましくはＤまたはＳ）（配列番号：７）；ＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧ（配列番号：８）；および／またはＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹ（配列番号：９）を含み、場合により、それらのＣＤＲ残基にアミノ酸改変を含む（例えばその改変がその抗体の親和性を本質的に維持または改善する場合）。例えば、関心対象の抗体変異体は、約１個から約７個または約５個のアミノ酸置換を上記重鎖可変ＣＤＲ配列に有することがある。例えば下記のような親和性成熟によって、当該抗体変異体を調製することができる。最も好ましいヒト化抗体は、配列番号：４の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
ヒト化抗体は、例えば前節の可変重鎖ドメインＣＤＲ残基に追加して、軽鎖可変ドメイン相補性決定残基 ＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡ（配列番号：１０）；ＳＡＳＹＸ１Ｘ２Ｘ３（Ｘ１は好ましくはＲもしくはＬ、Ｘ２は好ましくはＹもしくはＥ、Ｘ３は好ましくはＴもしくはＳである）（配列番号：１１）；および／またはＱＱＹＹＩＹＰＹＴ（配列番号：１２）を含むことができる。当該ヒト化抗体は、場合により、上記ＣＤＲ残基のアミノ酸改変を含む（例えばその改変がその抗体の親和性を本質的に維持または改善する場合）。例えば、関心対象の抗体変異体は、約１個から約７個または約５個のアミノ酸置換を上記可変軽鎖ＣＤＲ配列に有することがある。例えば下記のような親和性成熟によって、当該抗体変異体を調製することができる。最も好ましいヒト化抗体は、配列番号：３の可変軽鎖ドメインアミノ酸配列を含む。
本出願は、ＨＥＲ２と結合して、リガンドによるレセプターＨＥＲの活性化を遮断する、親和性成熟した抗体も考えている。親抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体、例えばそれぞれ配列番号３および４の可変軽鎖配列および／または可変重鎖配列をそれぞれ含む（すなわちパーツズマブのＶＬおよび／またはＶＨを含む）抗体でありうる。親和性成熟した抗体は、マウス２Ｃ４またはパーツズマブよりも優れた親和性で（例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ＥＬＩＳＡを用いて評定するとき、例えば約２または約４倍から約１００倍または約１０００倍向上した親和性で）レセプターＨＥＲ２に好ましくは結合する。置換のための例示的な可変重鎖ＣＤＲ残基には、Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ３４、Ｈ３５、Ｈ６４、Ｈ９６、Ｈ９９、または二つ以上の組み合わせ（例えば、これらの残基の２、３、４、５、６、または７個）がある。変更のための可変軽鎖ＣＤＲ残基の例には、Ｌ２８、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ５６、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、Ｌ９６、Ｌ９７、または二つ以上の組み合わせ（例えば、これらの残基の２から３、４、５、または最大約１０個）がある。
様々な形態のヒト化抗体または親和性成熟した抗体が考えられている。例えば、ヒト化抗体または親和性成熟した抗体は、Ｆａｂなどの抗体フラグメントでありうるが、このフラグメントは、免疫コンジュゲートを発生させるために、１つまたは複数の細胞毒性薬と場合によりコンジュゲーションしている。または、ヒト化抗体もしくは親和性成熟した抗体は、インタクトなＩｇＧ１抗体などのインタクトな抗体でありうる。好ましいインタクトなＩｇＧ１抗体は、配列番号１３の軽鎖配列および配列番号１４の重鎖配列を含む。
（ｉｖ）ヒト抗体
ヒト化の代替として、ヒト抗体を作成することができる。例えば、免疫処置した際に、内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生み出すことが今や可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系突然変異マウスにおける抗体重鎖Ｊ部（ＪＨ）遺伝子の同型接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を招くことが記載されている。当該生殖細胞系突然変異マウスにヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを導入する結果として、抗原による攻撃に応答したヒト抗体の産生が生じるであろう。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993)；Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)；ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５８９，３６９号,および第５，５４５，８０７号を参照されたい。または、ファージディスプレイ技法（McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)）を使用して、免疫処置されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体およびヒト抗体フラグメントをｉｎ ｖｉｔｒｏ産生することができる。この技法によると、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージの主または副コートタンパク質遺伝子のいずれかのフレーム内にクローニングして、ファージ粒子の表面上に機能的な抗体フラグメントとして提示させる。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを有することから、その抗体の機能的性質に基づく選択は、それらの性質を示す抗体をコードしている遺伝子の選択も招く。このように、そのファージは、Ｂ細胞の性質の一部を模倣している。ファージディスプレイを様々な形式で行うことができる；それらの総説については、例えばJohnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993)を参照されたい。いくつかの起源のＶ遺伝子セグメントをファージディスプレイのために使用することができる。Clacksonら、Nature, 352: 624-628 (1991)は、免疫処置されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫処置されていないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、（自己抗原を含む）多様なアレイの抗原に対する抗体を、Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)、またはGriffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)によって記載されている技法に本質的に従って単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号も参照されたい。
上記のように、ヒト抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化したＢ細胞により作成することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号参照）。
ヒトＨＥＲ２抗体は、１９９８年６月３０日に発行された米国特許第５，７７２，９９７号および１９９７年１月３日に公開されたＷＯ９７／００２７１に記載されている。
（ｖ）抗体フラグメント
種々の技法が、一つまたは複数の抗原結合領域を含む抗体フラグメントの産生のために開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)；およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照されたい）。しかし、これらのフラグメントを、今やリコンビナント宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、その抗体フラグメントを、上記の抗体ファージライブラリーから単離することができる。または、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収して、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成させることができる（Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)）。別のアプローチにより、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、リコンビナント宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントの産生のためのその他の技法は、当業者に明白であろう。他の態様では、選択された抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。この抗体フラグメントは、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に例えば記載された「線状抗体」でもありうる。当該線状抗体フラグメントは、単一特異性または二重特異性でありうる。
（ｖｉ）二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＨＥＲ２タンパク質の二つの異なるエピトープに結合することができる。その他の当該抗体は、ＨＥＲ２結合部位と、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、および／またはＨＥＲ４に対する結合部位とを組合せることができる。または、細胞防御メカニズムをＨＥＲ２発現細胞に集中させるために、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２もしくはＣＤ３）のような、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などの、ＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）のような、白血球上のトリガー分子に結合するアームとＨＥＲ２アームを組合せることができる。ＨＥＲ２を発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるために、二重特異性抗体を使用することもできる。これらの抗体は、ＨＥＲ２結合アームと、細胞毒性薬（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシン（ricin）Ａ鎖、メトトレキサート、または放射性同位体ハプテン）と結合するアームとを有する。二重特異性抗体を、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
ＷＯ９６／１６６７３は、二重特異性ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載し、米国特許第５，８３７，２３４号は、二重特異性ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩ抗体ＩＤＭ１（Osidem）を開示している。二重特異性ＨＥＲ２／Ｆｃα抗体は、ＷＯ９８／０２４６３に示されている。米国特許第５，８２１，３３７号は、二重特異性ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を教示している。ＭＤＸ−２１０は、二重特異性ＨＥＲ２−ＦｃγＲＩＩＩ Ａｂである。
二重特異性抗体を作成するための方法は、当技術分野において公知である。全長二重特異性抗体の従来の産生は、二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づく。ここで、その二つの鎖は異なる特異性を有する（Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな取り合わせが原因で、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、そのうち、一つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、普通はアフィニティークロマトグラフィー工程によってなされるが、かなり煩雑であり、その産物の収率は低い。類似の手順がＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)に開示されている。
異なるアプローチにより、所望の結合特異性（抗体−抗原の結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。この融合体は、好ましくは、ヒンジ部の少なくとも一部、ＣＨ２部、およびＣＨ３部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有する。軽鎖の結合に必要な部位を有する第一重鎖定常部（ＣＨ１）を、これら融合体の少なくとも一つに存在させることが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードしているＤＮＡと、所望ならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡとを、別々の発現ベクターに挿入して、適切な宿主生物に同時トランスフェクションする。これは、構築に使用される等しくない比率の３本のポリペプチド鎖が最適な収率を提供する態様において、それら３本のポリペプチドフラグメントの相互比率の調整に大きな柔軟性を提供する。しかし、少なくとも２本のポリペプチド鎖が等しい比で発現することが高収率を招く場合、またはその比が特に重要ではない場合に、２本または３本全てのポリペプチド鎖についてのコード配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチの好ましい態様では、二重特異性抗体は、一方のアームでの第１結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームでのハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２結合特異性を提供する）とから構成される。この非対称構造は、望まれていない免疫グロブリン鎖の組合せから所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。それは、二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することが、分離の容易な方法に備えるからである。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を作成するさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)を参照されたい。
米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている別のアプローチによると、抗体分子対の間の界面を加工して、リコンビナント細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の率を最大にすることができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含む。この方法では、第１抗体分子の界面由来の一つまたは複数の小型アミノ酸側鎖を、より小型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に交換する。その大型側鎖に同一または類似の大きさの代償的な「空洞」は、大型アミノ酸側鎖をより小型のアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）に交換することによって、第２抗体分子の界面に生み出される。これは、ホモ二量体などのその他の望まれない最終産物に比べてヘテロ二量体の収率を増加させるためのメカニズムを提供する。
二重特異性抗体には、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうちの一方をアビジンと、他方をビオチンと結合させることができる。当該抗体は、例えば、望まれていない細胞に免疫系細胞をターゲティングするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、およびＥＰ０３０８９）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体を、任意の好都合な架橋方法を用いて作成することができる。適切な架橋剤は当技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に、いくつかの架橋技法と共に開示されている。
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作成するための技法は、文献にも記載されている。例えば、化学的結合を用いて二重特異性抗体を調製することができる。Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)は、インタクトな抗体がタンパク質分解的に開裂されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを発生する手順を記載している。これらのフラグメントを、ジチオール錯化剤である亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化して、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次に、発生したＦａｂ’フラグメントをチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次に、メルカプトエチルアミンを用いた還元により、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量のその他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成させる。産生した二重特異性抗体を、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
最近の進歩により、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＦａｂ’−ＳＨフラグメントを直接回収することが容易になった。このＦａｂ’−ＳＨフラグメントを、化学的に結合させて、二重特異性抗体を形成させることができる。Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各々のＦａｂ’フラグメントが、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ定方向化学的結合に供されて、二重特異性抗体を形成した。このように形成した二重特異性抗体は、レセプターＨＥＲ２を過剰発現している細胞および正常なヒトＴ細胞に結合することができ、かつヒト乳房腫瘍ターゲットに対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性をトリガーすることができた。
リコンビナント細胞培養物から二重特異性抗体フラグメントを直接作成して単離するための様々な技法も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生された。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって二つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。その抗体ホモ二量体は、ヒンジ部で還元されて単量体を形成し、次に、再び酸化されて抗体へテロ二量体を形成した。この方法を、抗体ホモ二量体産生のためにも利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)によって記載された「二特異性抗体」技法は、二重特異性抗体フラグメントを作成するための代替メカニズムを提供した。このフラグメントは、同じ鎖上の二つのドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、一つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対形成することを強いられ、それによって、二つの抗原結合部位を形成する。二重特異性抗体フラグメントを単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって作成するための別の戦略も報告されている。Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)を参照されたい。
二つを超える結合価を有する抗体が考えられている。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)。
（ｖｉｉ）その他のアミノ酸配列の改変
本明細書に記載された抗体のアミノ酸配列の改変が考えられている。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的性質を改善することが望ましいことがある。適切なヌクレオチド変化を抗体の核酸に導入することにより、またはペプチド合成により、抗体のアミノ酸配列変異体を調製する。当該改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／またはそれへの挿入および／またはその置換がある。欠失、挿入、および置換の任意の組合せは、最終構築物に達するように作成されるが、但し、その最終構築物は所望の性質を有する。そのアミノ酸変化は、グリコシル化部位の数または位置を変化させることなどの、抗体の翻訳後プロセスを変更することもできる。
突然変異誘発についての好ましい位置である、抗体のある残基または領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)に記載された「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、複数のターゲット残基の中から一つの残基または基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電した残基）が同定され、中性または陰性に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）に交換されて、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を与える。次に、置換に対する機能的感受性を実証しているアミノ酸位置を、置換部位に、または置換部位の代わりにさらなる変異体またはその他の変異体を導入することによって精密化する。このように、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されているが、その突然変異自体の性質は予め決定されている必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発が、ターゲットコドンまたはターゲット領域に施され、発現した抗体変異体が所望の活性についてスクリーニングされる。
アミノ酸配列挿入には、長さが１個の残基から１００個以上の残基を有するポリペプチドまでの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合体、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入体がある。末端挿入体の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、または細胞毒性ポリペプチドに融合した抗体がある。抗体分子のその他の挿入変異体には、抗体のＮ末端またはＣ末端と酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ用）との、または抗体の血清半減期を増大させるポリペプチドとの融合体がある。
別の型の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子中の少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基に交換されている。置換突然変異誘発について最も関心対象の部位には超可変部があるが、ＦＲの変更も考えられている。保存的置換を、「好ましい置換」の見出しの下に表１に示す。当該置換が生物学的活性の変化を招くならば、表１に「例示的置換」と称するか、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載される、より実質的な変化を導入し、その産物をスクリーニングすることができる。
Figure 2008531576
抗体の生物学的性質における実質的な改変は、（ａ）例えばシートまたはヘリックスコンフォメーションなどの、置換領域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）ターゲット部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さを維持することに及ぼす効果が有意に異なる置換を選択することによって実現される。アミノ酸を、側鎖の性質の類似性により以下のような群に分けることができる（A. L. Lehninger, Biochemistry, second ed., pp.73-75, Worth Publishers, New York (1975)）：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）無荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。
または、天然に存在する残基を、共通の側鎖の性質に基づいて以下の群に分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうち、一つのメンバーを別のクラスのものに交換することを必要とするものである。
抗体の適切なコンフォメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基を、一般にセリンに置換して、その分子の酸化に対する安定性を改善して、異常な架橋を阻止することもできる。逆に、システイン結合をその抗体に付加して、（特に、その抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）その安定性を改善することができる。
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の一つまたは複数の超可変部残基を置換することを伴う。一般的に、さらなる開発のために選択された、結果として生じた変異体は、それらの変異体が作成された元の親抗体に比べて、改善された生物学的性質を有するであろう。当該置換変異体を作成するための簡便法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を伴う。簡潔には、いくつかの超可変部部位（例えば、６から７個の部位）を突然変異させて全ての可能なアミノ置換を各部位に作成する。このように作成された抗体変異体は、糸状ファージ粒子から一価の様式で、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として提示される。次に、ファージディスプレイされた変異体を、本明細書に開示されたように、それらの生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための候補となる超可変部部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を行って、抗原結合に重大に寄与する超可変部残基を同定することができる。または、もしくは追加的に、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体とヒトＨＥＲ２との間の接触点を同定することが有益でありうる。そのような接触残基および隣接する残基は、本明細書に詳細に述べられた技法による置換のための候補である。当該変異体がいったん発生すると、一団の変異体を本明細書に記載されたスクリーニングに供し、一つまたは複数の関連するアッセイで優れた性質を有する抗体を、さらなる開発のために選択することができる。
この抗体の別の型のアミノ酸変異体は、この抗体の本来のグリコシル化パターンを変更したものである。変更によって、抗体に見出される一つもしくは複数の糖質部分を欠失させること、および／またはその抗体には存在しない一つもしくは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ−結合またはＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合は、アスパラギン残基の側鎖に糖質部分が付着していることを指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に糖質部分を酵素的に付着させるための認識配列である。このように、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在することで、潜在的なグリコシル化部位が生み出される。Ｏ−結合型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの一つがヒドロキシアミノ酸に付着していることを指し、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用されうるが、そのヒドロキシアミノ酸は最も一般的にはセリンまたはトレオニンである。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、好都合には、アミノ酸配列を変更することにより、そのアミノ酸配列が（Ｎ−結合型グリコシル化部位のための）上記の一つまたは複数のトリペプチド配列を有するようにすることによって実現される。本来の抗体の配列に（Ｏ−結合型グリコシル化部位のための）一つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基を付加するか、またはこれらに置換することによっても変更を行うことができる。
抗体がＦｃ部を含む場合、それに付着している糖質を変更することができる。例えば、抗体のＦｃ部に付着したフコースを欠如した成熟糖質構造を有する抗体が米国特許出願ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１、Presta, L.に記載されている。ＵＳ２００４／００９３６２１Ａ１（Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd）も参照されたい。糖質中の二分岐型Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が抗体のＦｃ部に付着した抗体がＷＯ０３／０１１８７８、Jean-Mairetらおよび米国特許第６，６０２，６８４号、Umanaらに参照されている。オリゴ糖中の少なくとも一つのガラクトース残基が抗体のＦｃ部に付着した抗体がＷＯ９７／３００８７、Patelらに報告されている。変更された糖質がＦｃ部に付着した抗体に関するＷＯ９８／５８９６４（Raju, S.）およびＷＯ９９／２２７６４（Raju, S.）も参照されたい。
例えば、抗体の抗原依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を増強するためのエフェクター機能に関して、本発明の抗体を改変することが望ましいことがある。これは、抗体のＦｃ部に一つまたは複数のアミノ酸置換を導入することによって実現することができる。または、もしくは追加的に、システイン残基をＦｃ部に導入することによって、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させることができる。このように作成されたホモ二量体抗体は、改善したインターナリゼーション能ならびに／または増大した補体介在性細胞殺滅および抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を有することがある。Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)およびShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体を、Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。または、二つのＦｃ部を有する抗体を加工することができ、それによって、その抗体は増強した補体溶解およびＡＤＣＣ能を有しうる。Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
ＷＯ００／４２０７２（Presta, L.）は、ヒトエフェクター細胞の存在下で改善したＡＤＣＣ機能を有する抗体を記載しており、ここで、その抗体はそのＦｃ部にアミノ酸置換を含む。好ましくは、改善したＡＤＣＣを有する抗体は、Ｆｃ部の位置２９８、３３３、および／または３３４に置換を含む（ＥＵの残基の番号付け）。好ましくは、変更されたＦｃ部は、これらの位置の一つ、二つもしくは三つに置換を含むか、または、その置換からなるヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部である。当該置換は、場合によりＣ１ｑの結合および／またはＣＤＣを増加させる置換と組み合わされる。
変更されたＣ１ｑ結合性および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を有する抗体は、ＷＯ９９／５１６４２、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号、米国特許第６，２４２，１９５Ｂ１号、米国特許第６，５２８，６２４Ｂ１号、および米国特許第６，５３８，１２４号（Idusogie et al.）に記載されている。この抗体は、そのＦｃ部のアミノ酸位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３１３、３３３、および／または３３４（残基のＥｕ付番）のうち一つまたは複数にアミノ酸置換を含む。
抗体の血清半減期を増大させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように、サルベージレセプター結合エピトープを抗体（特に抗体フラグメント）に組み込むことができる。本明細書中で使用される用語「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期の増大を担う、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ部のエピトープを指す。
新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）との結合性が改善し、半減期が増大した抗体は、ＷＯ００／４２０７２（Presta, L.）およびＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Hinton et al.）に記載されている。これらの抗体は、その中にＦｃ部とＦｃＲｎとの結合性を改善する一つまたは複数の置換を有するＦｃ部を含む。例えば、Ｆｃ部は位置２３８、２５０、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１４、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、４２８または４３４のうち一つまたは複数に置換を有しうる（残基のＥｕ付番）。ＦｃＲｎとの改善した結合性を有する好ましいＦｃ部含有抗体変異体は、そのＦｃ部の位置３０７、３８０、および４３４のうち一つ、二つ、または三つにアミノ酸置換を含む（残基のＥｕ付番）。
三つ以上（好ましくは四つ）の機能的抗原結合部位を有する加工された抗体も考えられている（米国出願番号ＵＳ２００２／０００４５８７Ａ１、Miller et al.）。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は、当技術分野で公知の様々な方法により調製される。これらの方法には、天然起源からの単離（天然アミノ酸配列変異体の場合）または初期調製変異体もしくは非変異体バージョンの抗体のオリゴヌクレオチド介在性（もしくは部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発による調製があるが、それに限定されるわけではない。
（ｖｉｉｉ）所望の性質を有する抗体についてのスクリーニング
抗体を発生させるための技法は、上に記載されている。所望に応じ、特定の生物学的特性を有する抗体をさらに選択することができる。
レセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する抗体を同定するために、その抗体が、（例えば、別のレセプターＨＥＲとコンジュゲーションして、それと共に関心対象のレセプターＨＥＲがＨＥＲヘテロオリゴマーを形成する）レセプターＨＥＲを発現している細胞へのＨＥＲリガンドの結合を遮断する能力を決定することができる。例えば、ＨＥＲヘテロオリゴマーのレセプターＨＥＲを自然発現しているか、またはそれを発現するようにトランスフェクションされた細胞を、その抗体と共にインキュベーションして、次にラベルしたＨＥＲリガンドに曝露することができる。その抗体が、ＨＥＲヘテロオリゴマー中のレセプターＨＥＲへのリガンドの結合を遮断する能力を、次に評価することができる。
例えば、ＨＥＲ２抗体によるＭＣＦ７乳房腫瘍細胞系へのＨＲＧの結合阻害を、本質的にＷＯ０１／００２４５に記載されたように２４ウェルプレート形式での氷冷単層ＭＣＦ７培養物を使用して行うことができる。ＨＥＲ２モノクローナル抗体を各ウェルに加え、３０分間インキュベーションすることができる。１２５ＩラベルｒＨＲＧβ１１７７−２２４(２５pm)を次に加え、インキュベーションを４から１６時間続けることができる。用量反応曲線を準備することができ、関心対象の抗体についてＩＣ５０値を算出することができる。一態様では、レセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する抗体は、このアッセイで約５０nM以下の、より好ましくは約１０nM以下の、ＭＣＦ７細胞に対するＨＲＧ結合阻害についてのＩＣ５０を有するであろう。抗体が、Ｆａｂフラグメントなどの抗体フラグメントである場合、このアッセイにおけるＭＣＦ７細胞に対するＨＲＧの結合阻害についてのＩＣ５０は、例えば約１００nM以下、より好ましくは５０nM以下でありうる。
または、もしくは追加的に、抗体が、ＨＥＲヘテロオリゴマーに存在するレセプターＨＥＲのＨＥＲリガンド刺激性チロシンリン酸化を遮断する能力を評定することができる。例えば、レセプターＨＥＲを内因性発現しているか、またはそれらを発現するようにトランスフェクションされた細胞を、抗体と共にインキュベーションして、次に、ＨＥＲリガンド依存性チロシンリン酸化活性について抗ホスホチロシンモノクローナル抗体(場合により検出可能なラベルとコンジュゲーションされたもの)を用いてアッセイすることができる。米国特許第５，７６６，８６３号に記載されているキナーゼレセプター活性化アッセイも、レセプターＨＥＲの活性化と抗体によるその活性の遮断とを決定するために利用できる。
一態様では、本質的にＷＯ０１／００２４５に記載されたように、ＭＣＦ７細胞でのＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化の刺激を阻害する抗体についてスクリーニングすることができる。例えば、ＭＣＦ７細胞を２４ウェルプレートに蒔き、ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体を各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベーションし、次に最終濃度０．２nMまでｒＨＲＧβ１１７７−２４４を各ウェルに加えることができ、インキュベーションを８分間続けることができる。培地を各ウェルから吸引し、ＳＤＳ試料バッファー(５%ＳＤＳ、２５mM ＤＴＴ、および２５mMトリス-ＨＣｌ、ｐＨ６．８)１００μlを加えることによって反応を停止させることができる。各試料（２５μl）を、４〜１２%の勾配ゲル（Novex）で電気泳動して、次にポリビニリデンジフルオリド膜に電気泳動的に移行させることができる。抗ホスホチロシン（１μg/ml）免疫ブロットを発色させて、Ｍｒ約１８００００での顕著な反応性バンドの強度を反射率デンシトメトリーにより定量することができる。選択された抗体は、好ましくはこのアッセイの対照の約０〜３５%まで、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化刺激を有意に阻害するであろう。反射率デンシトメトリーによって決定された、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化刺激を阻害することについての用量反応曲線を準備することができ、関心対象の抗体についてのＩＣ５０を算出することができる。一態様では、レセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する抗体は、このアッセイにおいてＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化刺激を阻害することについて、約５０nM以下の、より好ましくは約１０nM以下のＩＣ５０を有するであろう。抗体が、Ｆａｂフラグメントなどの抗体フラグメントである場合、このアッセイにおいて、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化刺激を阻害することについてのＩＣ５０は、例えば約１００nM以下、より好ましくは５０nM以下でありうる。
例えば、本質的にSchaeferら、Oncogene 15:1385-1394 (1997)に記載されているように、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞に及ぼす抗体の成長阻害効果を評定することもできる。このアッセイによると、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞を、ＨＥＲ２モノクローナル抗体（１０μg/mL）で４日間処理して、クリスタルバイオレットで染色することができる。ＨＥＲ２抗体とのインキュベーションにより、モノクローナル抗体２Ｃ４によって示される効果に類似した、この細胞系に及ぼす成長阻害効果が示されうる。さらなる態様では、外因性ＨＲＧはこの阻害を有意に逆転しないであろう。好ましくは、この抗体は、外因性ＨＲＧの存在下および不在下の両方で、モノクローナル抗体４Ｄ５よりも高い程度（および場合によりモノクローナル抗体７Ｆ３よりも高い程度）までＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の細胞増殖を阻害することができるであろう。
一態様では、関心対象のＨＥＲ２抗体は、モノクローナル抗体４Ｄ５よりも実質的に効果的に、好ましくはモノクローナル抗体７Ｆ３よりも実質的に効果的に、ＷＯ０１／００２４５に記載された実験などの共免疫沈降実験で決定されたように、ＭＣＦ７細胞およびＳＫ-ＢＲ-３細胞の両方においてＨＥＲ２とＨＥＲ３とのヘレグリン依存性会合を遮断することができる。
成長阻害ＨＥＲ２抗体を同定するために、ＨＥＲ２を過剰発現しているガン細胞の成長を阻害する抗体についてスクリーニングすることができる。一態様では、えり抜きの成長阻害抗体は、細胞培養において約０．５から３０μg/mlの抗体濃度で約２０〜１００%、好ましくは約５０〜１００%、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の成長を阻害することができる。当該抗体を同定するために、米国特許第５，６７７，１７１号に記載されているＳＫ−ＢＲ−３アッセイを行うことができる。このアッセイによると、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１０%ウシ胎仔血清、グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＦ１２とＤＭＥＭ培地との１：１混合物中で成長させる。ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、３５mmの細胞培養皿に細胞２００００個で（２ml／３５mmの皿）で蒔く。皿１枚あたり０．５から３０μg/mlのＨＥＲ２抗体を添加する。６日後に、未処理の細胞と比較した細胞数を、電子ＣＯＵＬＴＥＲ（商標）細胞計数機を用いて計数する。ＳＫ−ＢＲ−３細胞の成長を約２０〜１００%または約５０〜１００%阻害する抗体を、成長阻害抗体として選択することができる。４Ｄ５および３Ｅ８などの成長阻害抗体についてスクリーニングするアッセイに関しては、米国特許第５，６７７，１７１号を参照されたい。
アポトーシスを誘導する抗体を選択するために、ＢＴ４７４細胞を用いたアネキシン結合アッセイを利用できる。ＢＴ４７４細胞を培養して、前項に論じたように皿に接種する。次に、培地を取り除き、新鮮培地培地単独または１０μg/mlのモノクローナル抗体を含有する培地に交換する。３日間のインキュベーション期間の後に、単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理により剥離する。次に、細胞を遠心分離して、Ｃａ２＋結合バッファーに再懸濁して、細胞死アッセイについて上に論じたように試験管に分取する。次に、試験管にラベル化アネキシン（例えばアネキシンＶ-ＦＴＩＣ）（１μg/ml）を入れる。ＦＡＣＳＣＡＮ（商標）フローサイトメータおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Becton Dickinson）を使用して試料を分析できる。対照に比べて統計的に有意なレベルのアネキシン結合を誘導する抗体を、アポトーシス誘導抗体として選択する。アネキシン結合アッセイに追加して、ＢＴ４７４細胞を用いたＤＮＡ染色アッセイを利用できる。このアッセイを行うために、前の二項に記載したように関心対象の抗体で処理したＢＴ４７４細胞を、３７℃で２時間、９μg/mlのＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２（商標）と共にインキュベーションし、次に、ＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ（商標）フローサイトメータ（Coulter Corporation）でＭＯＤＦＩＴ ＬＴ（商標）ソフトウェア（Verity Software House）を使用して分析する。このアッセイを使用して、未処理細胞(最大１００%のアポトーシス細胞)よりも２倍以上（好ましくは３倍以上）というアポトーシス細胞率の変化を誘導する抗体を、アポトーシス促進性抗体として選択することができる。７Ｃ２および７Ｆ３などの、アポトーシスを誘導する抗体についてスクリーニングするためのアッセイに関してはＷＯ９８／１７７９７を参照されたい。
関心対象の抗体によって結合されるＨＥＲ２上のエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行って、その抗体が２Ｃ４またはパーツズマブなどの抗体がＨＥＲ２に結合するのを交差遮断するかどうかを評定することができる。または、もしくは追加的に、当技術分野で公知の方法によって、エピトープマッピングを行うことができ、かつ／または抗体−ＨＥＲ２構造を研究して（Franklin et al., Cancer Cell 5:317-328 (2004)）ＨＥＲ２のどのドメインがその抗体によって結合されるかを知ることができる。
（ｉｘ） パーツズマブ組成物
ＨＥＲ２抗体組成物の一態様では、その組成物は主要種パーツズマブ抗体とその一つまたは複数の変異体との混合物を含む。本明細書におけるパーツズマブ主要種抗体の好ましい態様は、配列番号３および４の可変軽鎖および可変重鎖アミノ酸配列を含む抗体であり、最も好ましくは配列番号１３および１７より選択される軽鎖アミノ酸配列と、配列番号１４および１８より選択される重鎖アミノ酸配列（これらの配列の脱アミド化および／または酸化変異体を含む）とを含む抗体である。一態様では、この組成物は主要種パーツズマブ抗体と、アミノ末端リーダー伸長を含むそのアミノ酸配列変異体との混合物を含む。好ましくは、アミノ末端リーダー伸長は抗体変異体の軽鎖上（例えば抗体変異体の１本または２本の軽鎖上）に存在する。主要種ＨＥＲ２抗体または抗体変異体は全長抗体または抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２フラグメントのＦａｂ）のことがあるが、好ましくは両方が全長抗体である。本明細書における抗体変異体は、その任意の一つまたは複数の重鎖または軽鎖上にアミノ末端リーダー伸長を含むことがある。好ましくは、アミノ末端リーダー伸長は、抗体の１本または２本の軽鎖上に存在する。アミノ末端リーダー伸長は、好ましくはＶＨＳ−を含むか、またはそれからなる。非限定的にＮ末端配列解析、電荷不均一性についてのアッセイ（例えば陽イオン交換クロマトグラフィーまたはキャピラリーゾーン電気泳動）、質量分析などを含めた様々な分析技法により、組成物中のアミノ末端リーダー伸長の存在を検出することができる。組成物中の抗体変異体の量は、一般的にその変異体を検出するために使用される任意のアッセイ（好ましくはＮ末端配列解析）の検出限界を構成する量から、主要種抗体の量未満の量までの範囲である。一般的に、組成物中の抗体分子の約２０%以下（例えば約１%から約１５%、例えば５%から約１５%）は、アミノ末端リーダー伸長を含む。そのようなパーセント量は、好ましくは定量的Ｎ末端配列解析または陽イオン交換分析を使用して（好ましくは、ＰＲＯＰＡＣ ＷＣＸ−１０（商標）陽イオン交換カラムなどの高分解能弱陽イオン交換カラムを使用して）決定される。アミノ末端リーダー伸長変異体の他に、主要種抗体および／または変異体のさらなるアミノ酸配列の変更が考えられており、それらには一つまたは両方の重鎖にＣ末端リシン残基を含む抗体、脱アミド化抗体変異体などが非限定的に含まれる。
さらに、主要種抗体または変異体は、さらにグリコシル化変異を含むことがあり、その非限定的な例には、Ｆｃ部に付着したＧ１もしくはＧ２オリゴ糖構造を含む抗体、軽鎖に付着した糖質部分（例えば、抗体の１本もしくは２本の軽鎖に付着した、例えば一つもしくは複数のリシン残基に付着したグルコースもしくはガラクトースなどの一つもしくは二つの糖質部分）を含む抗体、１本もしくは２本の非グリコシル化重鎖を含む抗体、または１本もしくは２本の重鎖に付着したシアリデート化（sialidated）オリゴ糖を含む抗体などが挙げられる。
この組成物を、遺伝子操作された細胞系、例えばＨＥＲ２抗体を発現しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系から回収することができ、またペプチド合成により調製することができる。
（ｘ）免疫コンジュゲート
本発明は、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素であって、そのフラグメントおよび／または変異体を含む）、または放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）などの細胞毒性薬にコンジュゲーションした抗体を含む免疫コンジュゲートにも関するものである。
当該免疫コンジュゲートの発生に有用な化学療法剤は上に記載されている。抗体と、カリケアミシン、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテン（trichothene）、およびＣＣ１０６５などの一つまたは複数の小分子毒素とのコンジュゲートも本明細書において考えられている。
本発明の好ましい一態様では、抗体は、一つまたは複数のメイタンシン分子（例えば、抗体１分子あたり約１から約１０個のメイタンシン分子）とコンジュゲーションしている。メイタンシンを、例えばＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換でき、それをＭａｙ−ＳＨ３に還元して改変抗体と反応させ（Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)）、メイタンシノイド−抗体免疫コンジュゲートを発生させることができる。
関心対象の別の免疫コンジュゲートは、一つまたは複数のカリケアミシン分子とコンジュゲーションしている抗体を含む。カリケアミシンファミリーの抗生物質は、サブピコモル濃度で、２本鎖ＤＮＡ切断を産生することができる。使用されうるカリケアミシンの構造アナログには、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１ Ｉ、ＰＳＡＧ、およびθＩ １（Hinman et al. Cancer Research 53:3336-3342 (1993)およびLode et al. Cancer Research 58:2925-2928 (1998)）が挙げられるが、それに限定されるわけではない。参照により本明細書に特に組み入れられる米国特許第５，７１４，５８６号；第５，７１２，３７４号；第５，２６４，５８６号；および第５，７７３，００１号も参照されたい。
使用することができる酵素活性毒素およびそのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Pseudomonas aeruginosa由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（modeccin）Ａ鎖、アルファ−サルシン（sarcin）、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ-Ｓ）、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、およびトリコテセンが挙げられる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。
本発明は、抗体と核分解活性を有する化合物（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）などのリボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考えている。
放射性コンジュゲーションしたＨＥＲ２抗体の産生に種々の放射性同位体を利用することができる。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。
抗体と細胞毒性薬とのコンジュゲートを、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシインイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジポイミデートＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン（tolyene）−２，６−ジイソシアネートなど）、および二活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）のような多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作成することができる。例えば、Vitetta et al. Science 238:1098 (1987)に記載されているように、リシン免疫毒素を調製することができる。炭素１４ラベル１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲーションするための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」でありうる。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)）を使用することができる。
または、抗体および細胞毒性薬を含む融合タンパク質を、例えばリコンビナント技法またはペプチド合成によって作成することができる。
その他の免疫コンジュゲートが本明細書において考えられている。例えば、多様な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーのうちの一つに抗体を連結することができる。例えばコアセルベーション技法もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセル、およびポリメタクリル酸メチルマイクロカプセル）に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル)に、またはマクロエマルションに、抗体を捕捉することもできる。このような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示されている。
本明細書において開示された抗体を、免疫リポソームとして処方することもできる。抗体を含有するリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびに１９９７年１０月２３日に公開されたＷＯ９７／３８７３１に記載されているように、当技術分野において公知の方法により調製される。循環時間が高まったリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって発生させることができる。所定の孔径のフィルターを通してリポソームを押出して、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントを、ジスルフィド交換反応を介して、Martin et al. J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)に記載されているようにリポソームにコンジュゲーションすることができる。場合により、化学療法剤がリポソーム内に包含される。Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989)を参照されたい。
ＩＩＩ． 治療のための患者の選択
本明細書における患者は、場合により治療前に診断検査に供される。例えば、診断検査はＨＥＲ（例えばＨＥＲ２またはＥＧＦＲ）の発現（過剰発現を含む）、増幅、および／または活性化（リン酸化または二量体化を含む）を評価することができる。
一般に、診断検査が行われるとすれば、治療を必要とする患者から試料を得ることができる。対象がガンを有する場合、試料は一般に腫瘍試料である。好ましい態様では、腫瘍試料は、卵巣ガン、腹膜ガン、卵管ガン、転移性乳ガン（ＭＢＣ）、非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）、前立腺ガン、または結腸直腸ガンの腫瘍試料である。
本明細書における生体試料は、固定試料、例えばホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、または凍結試料でありうる。
本発明の一態様によると、治療のために選択された患者は、ＨＥＲ（好ましくはＨＥＲ２）の活性化を示している腫瘍を有する。一態様では、ガン細胞におけるＨＥＲ（またはＨＥＲ２）の活性化の程度は、同組織型の非ガン性細胞におけるレセプターの活性化レベルを有意に上回る。そのような過度の活性化は、レセプターＨＥＲの過剰発現、および／またはガン細胞におけるこのレセプターＨＥＲの活性化に利用できるＨＥＲリガンドのレベルが正常よりも高いことに起因しうる。そのような過度の活性化は、ガン細胞の悪性状態を引き起こし、かつ／またはそれに引き起こされうる。いくつかの態様では、そのガンは、診断または予後アッセイに供されて、レセプターＨＥＲのそのような過度の活性化を招くレセプターＨＥＲの増幅および／または過剰発現が生じているかどうかが決定されるであろう。または、もしくは追加的に、そのガンは、診断または予後アッセイに供されて、このレセプターの過度の活性化の原因となるＨＥＲリガンドの増幅および／または過剰発現がそのガンにおいて生じているかどうかが決定されうる。当該ガンのサブセットでは、レセプターの過度の活性化は、自己分泌刺激経路に起因しうる。ＨＥＲ活性化を決定するための様々なアッセイを下にさらに詳細に説明する。ＨＥＲ活性化を決定するための好ましい方法は、ＨＥＲ二量体またはヘテロ二量体の存在の検出、ＨＥＲまたはＨＥＲ２のリン酸化の評価、および遺伝子発現プロファイリングである。
（ｉ）ＨＥＲ二量体
ＨＥＲまたはＨＥＲ２活性化を示しているＨＥＲ二量体の存在について腫瘍試料を評定することができる。当技術分野において公知の任意の方法を使用して、腫瘍におけるＥＧＦＲ−ＨＥＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３などのＨＥＲ２二量体を検出することができる。いくつかの好ましい方法を下に説明する。これらの方法は、非共有タンパク質−タンパク質相互作用を検出するか、または、さもなければ関心対象のタンパク質同士が近接していることを示す。
免疫沈降またはＥＬＩＳＡなどの免疫親和性に基づく方法を使用してＨＥＲ二量体を検出することができる。一態様では、ＨＥＲ２抗体を使用して、ＨＥＲ２を含む複合体を腫瘍細胞から免疫沈降させ、次に、免疫ブロットによりＥＧＦＲまたはＨＥＲ３の存在について、結果として生じた免疫沈殿剤を探査する。別の態様では、免疫沈降段階のためにＥＧＦＲ抗体またはＨＥＲ３抗体を使用することができ、次に、ＨＥＲ２抗体を用いて免疫沈殿剤を探査する。さらなる態様では、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２複合体またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３複合体に特異的なＨＥＲリガンドを使用して、複合体を沈殿させることができ、次に、ＨＥＲ２の存在についてその複合体を探査する。例えば、リガンドをアビジンとコンジュゲーションして、複合体をビオチンカラムで精製することができる。
ＥＬＩＳＡアッセイまたは抗体「サンドイッチ」型アッセイなどの他の態様では、ＨＥＲ２に対する抗体を固体支持体上に固定化して、腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解物と接触させ、洗浄し、次にＥＧＦＲまたはＨＥＲ３に対する抗体に曝露する。後者の抗体の結合は、直接検出できるか、または検出可能なラベルにコンジュゲーションした二次抗体によって検出できるが、ヘテロ二量体の存在を示す。ある態様では、ＥＧＦＲ抗体またはＨＥＲ３抗体を固定化して、ＨＥＲ２抗体を検出段階に使用する。他の態様では、ＨＥＲリガンドをＨＥＲ抗体の代わりに、またはＨＥＲ抗体と組み合わせて使用することができる。
化学架橋またはＵＶ架橋を使用して、生きた細胞の表面に二量体を共有結合的に繋ぐこともできる。化学架橋剤の例には、ジチオビス（スクシンイミジル）プロピオネート（ＤＳＰ）および３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジル）プロピオネート（ＤＴＳＳＰ）が挙げられる。一態様では、化学架橋した腫瘍細胞由来の細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ３に対する抗体を用いて免疫ブロットする。ＨＥＲ２がＥＧＦＲおよびＨＥＲ３に好ましい二量体化パートナーであることから、適切な分子量のスーパーシフトしたバンドは、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体を十中八九表していると思われる。この結果を、ＨＥＲ２抗体を用いたその後の免疫ブロットにより確認することができる。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体を検出することもできる。ＦＲＥＴは、ドナーフルオロホアからアクセプターフルオロホアへのエネルギー移動に基づいてタンパク質のコンフォメーション変化およびタンパク質−タンパク質相互作用をｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで検出する。Selvin, Nat. Struct. Biol., 7:730-34 (2000)。ドナーフルオロホアがアクセプターフルオロホアに十分近接している場合に限り、エネルギー移動が起こる。典型的なＦＲＥＴ実験では、二つのタンパク質または単一タンパク質の二つの部位を異なる蛍光プローブでラベルする。一方のプローブであるドナープローブは、特異的な波長の入射光によって高いエネルギー状態に励起する。次に、ドナープローブはそのエネルギーを第２のプローブであるアクセプタープローブに伝播し、その結果、ドナー蛍光強度の減少とアクセプター蛍光発光の増加とを生じる。エネルギー移動の程度を測定するために、ドナープローブおよびアクセプタープローブでラベルした試料でのドナーの強度を、ドナープローブのみでラベルした試料でのドナーの強度と比較する。場合により、アクセプターの強度をドナー／アクセプター試料およびアクセプターのみの試料で比較する。適切なプローブは当技術分野で公知であり、それには、例えば、フルオレセインおよびローダミンなどの膜透過性色素、シアニン色素などの有機色素、ならびにランタニド原子が挙げられる。エネルギー移動を検出および測定するための方法および計装もまた、当技術分野で公知である。
個別の細胞におけるタンパク質−タンパク質相互作用を検出および測定するために適した、ＦＲＥＴに基づく技法も当技術分野で公知である。例えば、ドナー光退色蛍光共鳴エネルギー移動（ｐｂＦＲＥＴ）顕微鏡観察および蛍光寿命イメージング顕微鏡観察（ＦＬＩＭ）を使用して、細胞表面レセプターの二量体化を検出することができる。Gadella & Jovin, J. Cell Biol., 129:1543-58 (1995)。一態様では、Nagyら、Cytometry, 32:120-131 (1998)に記載されているように「懸濁液中」または「ｉｎ ｓｉｔｕ」のいずれかで細胞に対してｐｂＦＲＥＴを使用して、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体の形成を検出および測定する。これらの技法は、エネルギー移動が原因のドナーの蛍光寿命の減少を測定する。特定の態様では、Nagyら、上記およびBrockhoffら、Cytometry, 44:338-48 (2001)に記載されているように、フローサイトメトリーＦｏｅｒｓｔｅｒ型ＦＲＥＴ技法（ＦＣＥＴ）を使用してＥＧＦＲ−ＨＥＲ２およびＨＥＲ２−ＨＥＲ３の二量体化を研究することができる。
ＦＲＥＴは、好ましくは標準的な免疫組織化学ラベル技法と共に使用される。Kenworthy, Methods, 24:289-96 (2001)。例えば、適切な蛍光色素とコンジュゲーションした抗体を、二つの異なるタンパク質をラベルするためのプローブとして使用することができる。タンパク質が相互に近接しているならば、それらの蛍光色素はＦＲＥＴのためのドナーおよびアクセプターとして作用する。標準的な手段によってエネルギー移動を検出する。フローサイトメトリー手段によって、または電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラと接続した共焦点顕微鏡観察もしくは広視野蛍光顕微鏡観察などのデジタル顕微鏡観察システムによってエネルギー移動を検出することができる。
本発明の一態様では、例えば、Nagyら、上記に記載されているように、ＨＥＲ２抗体と、ＥＧＦＲ抗体またはＨＥＲ３抗体のいずれかとを二つの異なるフルオロホアで直接ラベルする。腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解物を、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体の存在下でＦＲＥＴのためのドナーおよびアクセプターとして作用する、ディファレンシャルにラベルした抗体と接触させる。または、ＨＥＲ２に対する未ラベル抗体と、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３のいずれかに対する未ラベル抗体とを、ドナーおよびアクセプターとして働くディファレンシャルにラベルした二次抗体と一緒に使用する。例えば、Brockhoffら、上記を参照されたい。エネルギー移動を検出して、それらのラベルが近接していることが見出されたならば、二量体の存在が決定される。
他の態様では、ＨＥＲ２に特異的なレセプターＨＥＲのリガンドと、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３のいずれかに特異的なレセプターＨＥＲのリガンドとを蛍光ラベルして、ＦＲＥＴ研究に使用する。
本発明のなお他の態様では、腫瘍細胞表面上に二量体が存在することを、標準的な直接または間接免疫蛍光技法および共焦点レーザ走査顕微鏡観察を使用して、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３のいずれかとのＨＥＲ２の共局在によって実証する。または、Zuckら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:11122-27 (1999)に記載されているように、レーザ走査イメージング（ＬＳＩ）を使用して、マイクロウェルプレートなどの高スループット形式で、抗体結合およびＥＧＦＲまたはＨＥＲ３のいずれかとのＨＥＲ２の共局在を検出する。
さらなる態様では、二量体構成要素の近接に依存した酵素活性を確認することによって、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２および／またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体の存在を決定する。ＨＥＲ２抗体をある酵素とコンジュゲーションさせ、ＥＧＦＲ抗体またはＨＥＲ３抗体を第２酵素とコンジュゲーションさせる。第１酵素に対する第１基質を加えると、その反応は第２酵素に対する第２基質を産生する。これにより、別の分子と反応して色素などの検出可能な化合物の産生がもたらされる。別の化学物質が存在すると、第２基質が分解し、その結果、第１および第２酵素が、よって二つの抗体が近接していない限り、第２酵素との反応は阻止される。特定の態様では、グルコースオキシダーゼとコンジュゲーションしたＨＥＲ２抗体、およびホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲーションしたＨＥＲ３抗体またはＥＧＦＲ抗体と、腫瘍細胞または細胞溶解物を接触させる。ＤＡＢおよびカタラーゼなどの色素前駆体と共にグルコースを反応物に加える。ＤＡＢについて染色したときの発色によって、二量体の存在を決定する。
例えば、２００１年１２月６日に公表された、両方共にその全体が参照により特に組み入れられる米国特許出願２００１／００４９１０５に記載されているようなｅＴａｇ（商標）アッセイシステム（Aclara Bio Sciences, Mountain View, CA）に基づく方法を使用しても、二量体を検出することができる。ｅＴａｇ（商標）または「電気泳動タグ」は、蛍光基などの検出可能なレポーター部分を含む。それは、独特の電気泳動移動度を有する部分から本質的になる「移動度改変物質」も含みうる。これらの部分は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）などの確定した電気泳動条件で複合体混合物からｅＴａｇ（商標）の分離および検出を可能にする。レポーター部分と、場合により移動度改変物質とを含有するｅＴａｇ（商標）の一部を、開裂可能な連結基によって第１ターゲット結合部分に連結させて、第１結合化合物を産生する。この第１ターゲット結合部分は、核酸またはタンパク質などの特定の第１ターゲットを特異的に認識する。第１ターゲット結合部分は、いかなる方法にも限定されず、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドでありうる。好ましくは、第１ターゲット結合部分は、抗体または抗体フラグメントである。または、第１ターゲット結合部分は、レセプターＨＥＲのリガンドまたはその結合適格フラグメントでありうる。
連結基は、酵素基質などの開裂可能な部分、または確定した条件で開裂できる任意の化学結合を好ましくは含む。第１ターゲット結合部分がそのターゲットに結合すると、開裂剤が導入および／または活性化され、連結基が開裂し、それによってレポーター部分および移動度改変物質を有するｅＴａｇ（商標）の一部が放出される。このように、「遊離の」ｅＴａｇ（商標）の存在は、ターゲットへのターゲット結合部分の結合を示す。
好ましくは、第２結合化合物は、開裂剤と、第２ターゲットを特異的に認識する第２ターゲット結合部分とを含む。第２ターゲット結合部分もまた、どのようにも限定されず、例えば抗体もしくは抗体フラグメントまたはレセプターＨＥＲのリガンドまたは結合適格リガンドフラグメントでありうる。第１結合化合物および第２結合化合物が近接しているならば、開裂剤は、第１結合化合物の連結基を開裂するだけであろう。
本発明の態様では、第１結合化合物は、ＨＥＲ２に対する抗体が第１ターゲット結合部分として働くｅＴａｇ（商標）を含む。第２結合化合物は、ｅＴａｇ（商標）の連結基を開裂できる開裂剤と繋がった、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３に対する抗体を含む。連結基を開裂できるためには、好ましくは開裂剤は活性化していなければならない。ＨＥＲ２に結合するｅＴａｇ（商標）、および細胞表面のＥＧＦＲまたはＨＥＲ３に結合する改変ＥＧＦＲ抗体またはＨＥＲ３抗体と、腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解物を接触させる。未結合の結合化合物を好ましくは取り除き、開裂剤を必要に応じて活性化させる。ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３二量体が存在するならば、開裂剤は連結基を開裂し、開裂剤が連結基と近接していることが原因でｅＴａｇ（商標）を放出するであろう。次に、キャピラリー電気泳動などの当技術分野で公知の任意の方法によって、遊離のｅＴａｇ（商標）を検出できる。
一態様では、開裂剤は、連結基に作用する活性化可能な化学種である。例えば、開裂剤は、試料を露光することにより活性化することができる。
別の態様では、第１ターゲット結合部分としてＥＧＦＲまたはＨＥＲ３に対する抗体を使用してｅＴａｇ（商標）を構築し、第２結合化合物をＨＥＲ２に対する抗体から構築する。
なお別の態様では、ＨＥＲ二量体におけるいずれかのレセプターＨＥＲに対する結合に比較して、ＨＥＲ二量体に特異的または優先的に結合する抗体または他の試薬を使用して、ＨＥＲ二量体を検出する。
（ｉｉ）ＨＥＲ２のリン酸化
レセプターＨＥＲのリン酸化を、レセプターＨＥＲ２などの一つまたは複数のレセプターＨＥＲの免疫沈降、および免疫沈降したレセプター中のリン酸化チロシン残基の分析により評定することができる。例えば、免疫沈降したレセプターＨＥＲ中のリン酸化チロシン残基を検出する抗ホスホチロシン抗体を使用して、ゲル上のホスホ−ＨＥＲ２バンドの存在により陽性を決定する。抗ホスホチロシン抗体は、Invitrogen, Chemicon International Inc.（Temecula, CA）の子会社であるPan Vera（Madison, WI）、またはUpstate Biotechnology（Lake Placid, NY）から市販されている。バンドの不在により陰性を決定する。ウエスタンブロット分析、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡなどを含めた、リン酸化タンパク質を検出するための様々なアッセイ形式が考えられている。
一態様では、レセプターＨＥＲ２(ＨＥＲ２)のリン酸化を、ホスホ特異的ＨＥＲ２抗体（クローンＰＮ２Ａ;Thor et al., J. Clin. Oncol., 18(18):3230-3239 (2000)）を使用した免疫組織化学検査により評定する。
レセプターＨＥＲのリン酸化を検出するための他の方法には、ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡ （米国特許第５，７６６，８６３号；第５，８９１，６５０号；第５，９１４，２３７号；第６，０２５，１４５号；および第６，２８７，７８４号）、質量分析（リン酸化ＨＥＲ２と非リン酸化ＨＥＲ２とのサイズを比較）、およびＨＥＲ（例えばＨＥＲ２）抗体とホスホ特異的抗体またはホスホチロシン特異的抗体との両方を用いたｅ−ｔａｇ近接アッセイ（例えばAclara BioSciences（Mountain View, CA）から入手できるｅＴａｇ（商標）アッセイキットを使用）が挙げられるが、それに限定されるわけではない。ｅＴａｇアッセイの詳細を本明細書に上記する。
細胞アレイにホスホ特異的抗体を使用して、細胞試料中のシグナル伝達タンパク質のリン酸化状態を検出することもできる（ＵＳ２００３／０１９０６８９）。
下記実施例２は、ホスホ−ＨＥＲ２のＥＬＩＳＡによりＨＥＲ２リン酸化を決定するための好ましい方法を記載したものである。
（ｉｉｉ）遺伝子発現プロファイリング
一態様では、遺伝子発現プロファイリングは、ＨＥＲリン酸化を直接測定するための代理として役立ちうる。これは、ＨＥＲリン酸化を高い信頼性で定量することが困難でありうる、試料が固定試料（例えばパラフィン包埋、ホルマリン固定腫瘍試料）の場合に特に有用である。例えば、試料中の二つ以上のレセプターＨＥＲおよび一つまたは複数のＨＥＲリガンドの発現が評価され、ここで、この二つ以上のレセプターＨＥＲおよび一つまたは複数のＨＥＲリガンドの発現は、試料中のＨＥＲ活性化が陽性であることを示す。または、もしくは追加的に、試料中のベータセルリンおよび／またはアンフィレグリンの発現を測定することができ、ここで、ベータセルリンおよび／またはアンフィレグリンの発現は試料中のＨＥＲ活性化が陽性であることを示す。
ＨＥＲ２活性化を評価するための遺伝子発現プロファイリングの好ましい態様によると、（好ましくはＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３から選択される）二つ以上のレセプターＨＥＲおよび（好ましくはベータセルリン、アンフィレグリン、エピレグリン、およびＴＧＦ−αから選択され、最も好ましくはベータセルリンまたはアンフィレグリンである）一つまたは複数のＨＥＲリガンドの発現について患者由来の試料を試験する。例えば、二つ以上のレセプターＨＥＲは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、またはＨＥＲ２およびＨＥＲ３のことがあり、一つまたは複数のＨＥＲリガンドはベータセルリンまたはアンフィレグリンのことがある。好ましくは、ＨＥＲ２とＥＧＦＲまたはＨＥＲ３との発現、およびベータセルリンまたはアンフィレグリンの発現を決定する。ベータセルリンもしくはアンフィレグリン単独の発現について、または二つ以上のレセプターＨＥＲの発現についての試験と共に、試料を試験することができる。同定された遺伝子の発現陽性は、その患者がパーツズマブなどのＨＥＲ二量体化阻害剤を用いた治療の候補であることを示す。さらに、遺伝子の発現陽性は、当該発現陽性を有さない患者に比べてその患者がＨＥＲ二量体化阻害剤を用いた治療に好都合に応答する見込みであることを示す。
ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定するための様々な方法には、遺伝子発現プロファイリング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を含む）、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ法（serial analysis of gene expression）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、ＭＰＳＳ法（Massively Parallel Signature Sequencing）による遺伝子発現解析、プロテオミクス、免疫組織化学法（ＩＨＣ）などが挙げられるが、それに限定されるわけではない。好ましくはｍＲＮＡが定量される。当該ｍＲＮＡ分析は、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技法を使用して、またはマイクロアレイ分析により行われる。ＰＣＲが採用される場合、好ましい形態のＰＣＲは定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。一態様では、一つまたは複数の上記遺伝子の発現が、例えば同一腫瘍型の他の試料に比べて中央値以上であれば、その発現は発現陽性とみなされる。中央値の発現レベルは、本質的に遺伝子発現の測定と同時発生的に決定することができるし、また予め決定されていることもある。
固定パラフィン包埋組織をＲＮＡ起源として使用した、遺伝子発現をプロファイリングするための、ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー伸長、および増幅を含めた代表的なプロトコールの段階は、様々な公表された雑誌文献（例えば、Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2:84-91 (2000)；Specht et al., Am. J. Pathol. 158:419-29 (2001)）に示されている。簡潔には、代表的な工程は、パラフィン包埋腫瘍組織試料の約１０μg厚の切片を切り出すことに始まる。次に、ＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度を分析した後に、ＲＮＡの修復および／または増幅段階を必要ならば含めることができ、遺伝子特異的プロモータを使用してＲＮＡを逆転写し、続いてＰＣＲを行う。最後に、データを解析して、検査された腫瘍試料で同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づいて患者に利用できる最良の処置選択肢を同定する。
本明細書の実施例３は遺伝子発現プロファイリングによりＨＥＲ２活性化を決定するための好ましい方法を記載する。
（ｉｖ）ＨＥＲの発現および増幅
ガンにおけるＨＥＲ発現または増幅を決定するために、様々な診断／予後アッセイを利用できる。一態様では、ＨＥＲの過剰発現を、例えばＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標）（Dako）を使用したＩＨＣにより分析できる。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイに供して、以下の通りＨＥＲ２タンパク質染色強度基準にあてはめることができる：
スコア０ 染色が観察されないか、または腫瘍細胞の１０%未満に膜染色が観察される。
スコア１＋ 腫瘍細胞の１０%超にかすか／わずかに認知できる膜染色が検出される。これらの細胞は膜の一部だけが染色される。
スコア２＋ 腫瘍細胞の１０%超に膜全体の弱から中度の染色が観察される。
スコア３＋ 腫瘍細胞の１０%超に膜全体の中から強度の染色が観察される。
ＨＥＲ２の過剰発現評定についてスコア０または１＋を有する腫瘍を、ＨＥＲ２を過剰発現していないと特徴づけることができ、一方、スコア２＋または３＋を有する腫瘍を、ＨＥＲ２を過剰発現していると特徴づけることができる。
ＨＥＲ２を過剰発現している腫瘍を、細胞１個あたりに発現したＨＥＲ２分子のコピー数に対応する免疫組織化学スコアによって採点することができ、生化学的に決定することができる：
０＝０〜１００００コピー／細胞、
１＋＝少なくとも約２０００００コピー／細胞、
２＋＝少なくとも約５０００００コピー／細胞、
３＋＝少なくとも約２００００００コピー／細胞。
チロシンキナーゼのリガンド非依存的活性化を誘導する３＋レベルでのＨＥＲ２の過剰発現（Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7159-7163 (1987)）は、乳ガンの約３０%に生じ、これらの患者では無再発生存数および全生存数は減少する（Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989)；Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987)）。
または、もしくは追加的に、ＩＮＦＯＲＭ（商標）（Ventana, Arizonaが販売）またはＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（商標）（Vysis, Illinois）などのＦＩＳＨアッセイを、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織に対して行って、（もしあれば）腫瘍におけるＨＥＲ２の増幅の程度を決定することができる。
一態様では、ガンはＥＧＦＲを発現する（かつ過剰発現しうる）ガンであろうし、当該発現を、上に言及したようなＨＥＲ２の発現を評価するための方法に関して評価することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏ診断アッセイを使用して、例えば検出する分子と結合し、検出可能なラベル（例えば放射性同位体）でタグを付けた（抗体などの）分子を投与して、そのラベルの局在について患者を外部からスキャンすることによって、レセプターＨＥＲまたはＨＥＲリガンドの過剰発現または増幅を評価することもできる。
ＩＶ． 薬学的製剤
本発明により使用されるＨＥＲ二量体化阻害剤の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を、随意の薬学的に許容されうる担体、賦形剤、または安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）と共に、一般に凍結乾燥製剤または水溶液の形態で混合することによって、保存用に調製される。抗体の結晶も考えられている（米国特許出願２００２／０１３６７１９参照）。許容されうる担体、賦形剤、または安定化剤は、採用される投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、これらには、リン酸塩、クエン酸塩、およびその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール、もしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；（約１０残基未満の）低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖類、二糖類、およびその他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤が挙げられる。凍結乾燥抗体製剤は、参照により本明細書に特に組み入れられるＷＯ９７／０４８０１に記載されている。
治療用途に好ましいパーツズマブ製剤は、２０mM酢酸ヒスチジン、１２０mMスクロース、０．０２%ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）中に３０mg/mLパーツズマブを含む。代替のパーツズマブ製剤は、２５mg/mLパーツズマブ、１０mMヒスチジンＨＣｌ緩衝液、２４０mMスクロース、０．０２%ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）を含む。
本明細書における製剤は、処置される特定の適応に必要な一つを超える活性化合物、好ましくは相互に有害な影響を及ぼさない相補的活性を有する化合物も含有することがある。ＨＥＲ二量体化阻害剤と組み合わせることのできる様々な薬物は、下記の方法の節に記載されている。そのような分子は、好適には、意図された目的に有効な量で組み合わされて存在する。
例えばコアセルベーション技法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリメタクリル酸メチルマイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルションに、活性成分を捕捉することもできる。このような技法はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed.,(1980)に開示されている。
持続性放出製剤を調製することができる。持続性放出製剤の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスがあり、このマトリックスは、造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続性放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、またはポリビニルアルコール、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）などの分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用される製剤は無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通して濾過することにより容易に実現される。
Ｖ． ＨＥＲ二量体化阻害剤を用いた処置
本発明は、ガンがＨＥＲの活性化を示しているガン患者におけるＴＴＰまたは生存を延長するための方法を提供し、その方法は、その患者のＴＴＰまたは生存を延長する量のＨＥＲ二量体化阻害剤をその患者に投与することを含む。好ましくは、ＨＥＲ二量体化阻害剤はＨＥＲ２二量体化阻害剤であり、かつ／またはＨＥＲのヘテロ二量体化を阻害する。
一態様では、患者のガンは、ＨＥＲ２のリン酸化を含めたＨＥＲ２の活性化を示す。好ましくは、ＨＥＲ２のリン酸化はホスホ−ＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価される。または、ＨＥＲ２の活性化を遺伝子発現プロファイリングにより、またはＨＥＲ二量体またはＨＥＲヘテロ二量体を検出することにより評価することができる。
ＨＥＲ二量体化阻害剤で処置することのできる様々なガンの例を、上記の定義の節に挙げる。好ましいガンの適応には、卵巣ガン、腹膜ガン、卵管ガン；転移性乳ガン（ＭＢＣ）を含めた乳ガン、非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）を含めた肺ガン、前立腺ガン、および結腸直腸ガンが挙げられる。一態様では、処置されるガンは進行性、抗療性、再発性、化学療法耐性、および／またはプラチナ耐性のガンである。
ＨＥＲ二量体化阻害剤を用いた治療は、ＴＴＰおよび／または生存を延長する。一態様では、ＨＥＲ二量体化阻害剤を用いた治療は、認可された抗腫瘍剤を投与することによって、または処置されるガンについての診療基準によって実現されるＴＴＰまたは生存よりも、ＴＴＰおよび／または生存を少なくとも約２０%延長する。
好ましい態様では、本発明は、卵巣ガン、腹膜ガン、または卵管ガンを有し、そのガンがＨＥＲ２活性化を示している患者における疾患の進行までの期間（ＴＴＰ）または生存を延長するための方法を提供し、その方法は、患者のＴＴＰまたは生存を延長する量のパーツズマブをその患者に投与することを含む。患者は、進行性、抗療性、再発性、化学療法耐性、および／またはプラチナ耐性の卵巣ガン、腹膜ガン、または卵管ガンを有しうる。患者へのパーツズマブの投与は、例えば当該患者にトポテカンまたはリポソームドキソルビシンを投与することによって実現されるＴＴＰまたは生存よりも少なくとも約２０%大きくＴＴＰまたは生存を延長しうる。
ＨＥＲ二量体化阻害剤を、例えばボーラスとしての、もしくはある時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、鞘内、経口、局所、または吸入経路などの公知の方法により、ヒト患者に投与する。抗体の静脈内投与が好ましい
ガンの予防または処置のためのＨＥＲ二量体化阻害剤の用量は、上に定義したような処置されるガンの種類、ガンの重症度および経過、その抗体が予防目的、それとも治療目的のために投与されるか、以前の治療、患者の臨床歴およびその抗体に対する応答、ならびに担当の医師の判断力に依存するものである。
一態様では、一定用量のＨＥＲ二量体化阻害剤が投与される。この一定用量は、好適には１回で、または連続した処置で患者に投与されうる。一定用量が投与される場合、好ましくはその一定用量は約２０mgから約２０００mgのＨＥＲ二量体化阻害剤の範囲である。例えば、その一定用量は約４２０mg、約５２５mg、約８４０mg、または約１０５０mgのＨＥＲ二量体化阻害剤、例えばパーツズマブでありうる。
連続した投与が行われる場合、これらは、例えばおよそ毎週、およそ隔週、およそ３週間毎、またはおよそ４週間毎に投与されうるが、好ましくはおよそ３週間毎に投与される。例えば疾患が進行するまで、有害事象まで、または医師によって決定されるその他の時点まで、この固定用量を投与し続けることができる。例えば、約２、３、または４から最大約１７回以上の固定用量を投与することができる。
一態様では、１回または複数回の抗体のローディング用量に続いて、１回または複数回のその抗体の維持用量を投与する。別の態様では、患者に同用量を複数回投与する。
本発明の好ましい一態様によると、固定用量約８４０mg（ローディング用量）のＨＥＲ二量体化阻害剤 (例えば パーツズマブ)の投与に続き、その抗体約４２０mg（維持用量）の１回または複数回の投与を行う。維持用量は、好ましくはおよそ３週間毎に、合計して少なくとも２回から最大１７回以上投与される。
本発明の別の好ましい態様によると、固定用量約１０５０mgのＨＥＲ二量体化阻害剤（例えば パーツズマブ）が１回または複数回、例えば３週間毎に投与される。この態様によると、１回、２回、またはそれを超える固定用量が、例えば所望により最大１年間（１７サイクル）以上投与される。
別の態様では、ローディング用量として固定用量約１０５０mgのＨＥＲ二量体化阻害剤（例えばパーツズマブ）に続き、１回または複数回の維持用量約５２５mgが投与される。本態様によると、約１、２、またはそれを超える維持用量が、３週間毎に患者に投与されうる。
ＨＥＲ二量体化阻害剤を単一抗腫瘍剤として投与することができるが、患者は場合によりＨＥＲ二量体化阻害剤と、一つまたは複数の化学療法剤との組み合わせで処置される。好ましくは少なくとも一つの化学療法剤は、ゲムシタビンなどの代謝拮抗化学療法剤である。組み合わせ投与には、別々の製剤または単一の薬学的製剤を使用した同時投与または併行投与、およびいずれかの順序の連続投与があり、ここで、好ましくは両方の（または全ての）活性薬剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮する期間が存在する。このように、ＨＥＲ二量体化阻害剤の投与前または投与後に代謝拮抗化学療法剤を投与することができる。本態様では、代謝拮抗化学療法剤の少なくとも１回の投与と、ＨＥＲ二量体化阻害剤の少なくとも１回の投与との間のタイミングは、好ましくは約１か月以下であり、最も好ましくは約２週間以下である。または、代謝拮抗化学療法剤およびＨＥＲ二量体化阻害剤は、単一の製剤または別々の製剤の形で患者に同時投与される。化学療法剤（例えばゲムシタビンなどの代謝拮抗化学療法剤）とＨＥＲ二量体化阻害剤（例えばパーツズマブ）との組み合わせを用いた処置により、患者に対して相乗的な、すなわち相加的よりも大きな治療上の利益が生じうる。
代謝拮抗化学療法剤は、投与されるならば、それについての公知の投薬量で通常投与されるか、または代謝拮抗化学療法剤の投与に原因があるとされる薬物の組み合わせ作用または負の副作用が原因で場合により減量される。当該化学療法剤のための製剤および投薬スケジュールを製造業者の説明書により、または当業者により経験的に決定されたように使用することができる。代謝拮抗化学療法剤がゲムシタビンである場合、好ましくは、ゲムシタビンは約６００mg/m2から１２５０mg/m2の間（例えば約１０００mg/m2）の用量で、例えば３週間サイクルの１日目および８日目に投与される。
ＨＥＲ阻害剤および代謝拮抗化学療法剤の他に、他の治療方式をそれに組み合わせることができる。例えば、第２(第３、第４など)の化学療法剤を投与することができ、ここで、第２の化学療法剤は、別の異なる代謝拮抗化学療法剤または代謝拮抗物質ではない化学療法剤のいずれかである。例えば、第２の化学療法剤は、(パクリタキセルもしくはドセタキセルなどの)タキサン、カペシタビン、またはプラチナ系化学療法剤（カルボプラチン、シスプラチン、またはオキサリプラチンなど）、アントラサイクリン（リポソームドキソルビシンを含めたドキソルビシンなど）、トポテカン、ペメトレキセド、ビンカアルカロイド（ビノレルビンなど）、およびＴＬＫ２８６でありうる。異なる化学療法剤の「カクテル」を投与してもよい。
ＨＥＲ二量体化阻害剤と組み合わせることができるその他の治療剤には、第２の異なるＨＥＲ二量体化阻害剤（例えば、トラスツズマブなどの成長阻害性ＨＥＲ２抗体、またはＨＥＲ２過剰発現細胞のアポトーシスを誘導する、７Ｃ２、７Ｆ３、もしくはそのヒト化変異体などのＨＥＲ２抗体）；ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４などの異なる腫瘍関連抗原に対する抗体；抗ホルモン化合物、例えばタモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物、またはアロマターゼ阻害剤；（治療に関連する任意の心筋機能不全を阻止または低減するための）心臓保護剤；サイトカイン；ＥＧＦＲターゲット薬（TARCEVA（登録商標）、IRESSA（登録商標）、またはセツキシマブなど）；抗血管形成剤(特にAVASTIN（商標）の商標でGenentechによって販売されているベバシズマブ)；チロシンキナーゼ阻害剤；ＣＯＸ阻害剤（例えばＣＯＸ−１阻害剤またはＣＯＸ−２阻害剤）；非ステロイド系抗炎症薬であるセレコキシブ（CELEBREX（登録商標））；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、Johnson and Johnsonから入手できるチピファルニブ（Tipifarnib）／ZARNESTRA（登録商標）Ｒ１１５７７７、またはSchering-Ploughから入手できるロナファルニブ（Lonafarnib）ＳＣＨ６６３３６）；オレゴボマブ（Oregovomab）（ＭｏＡｂ Ｂ４３．１３）などの、ガン胎児タンパク質ＣＡ１２５と結合する抗体；ＨＥＲ２ワクチン（PharmexiaからのＨＥＲ２ AutoVacワクチン、またはDendreonからのＡＰＣ８０２４タンパク質ワクチン、またはGSK/CorixaからのＨＥＲ２ペプチドワクチン）；別のＨＥＲターゲティング療法（例えば、トラスツズマブ、セツキシマブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＥＭＤ７２００、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ＣＰ７２４７１４、ＣＩ１０３３、ＧＷ５７２０１６、ＩＭＣ−１１Ｆ８、ＴＡＫ１６５など）；Ｒａｆ阻害剤および／またはｒａｓ阻害剤（例えばＷＯ２００３／８６４６７参照）；ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤（DOXIL（登録商標））；トポテカンなどのトポイソメラーゼＩ阻害剤；タキサン；ラパチニブ／ＧＷ５７２０１６などのＨＥＲ２およびＥＧＦＲの二重チロシンキナーゼ阻害剤：ＴＬＫ２８６（TELCYTA（登録商標））；ＥＭＤ−７２００；セロトニン拮抗薬、ステロイド、またはベンゾジアゼピンなどの悪心を処置する薬；局所または経口抗生物質を含めた皮疹を予防もしくは処置する薬または標準的なざ瘡治療法；下痢を処置または予防する薬；アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、またはメペリジンなどの解熱薬；造血成長因子などのうち任意の一つまたは複数が含まれる。
同時投与された任意の上記薬剤についての適切な投薬量は、現在使用されている投薬量であり、その薬剤およびＨＥＲ二量体化阻害剤の組み合わせ作用（相乗作用）が原因でその投薬量を減量することができる。
上記治療方式以外に、ガン細胞の外科的除去および／または放射線療法に患者を供することができる。
その阻害剤が抗体である場合、好ましくは、投与される抗体はネイキッドな抗体である。しかし、投与される阻害剤を、細胞毒性薬とコンジュゲーションすることができる。好ましくは、その細胞毒性薬が結合しているコンジュゲーションした阻害剤および／または抗原は、細胞によってインターナリゼーションされ、それが結合するガン細胞の殺滅に果たすそのコンジュゲートの治療有効性の増加を招く。好ましい態様では、細胞毒性薬はガン細胞中の核酸をターゲティングまたは妨害する。当該細胞毒性薬の例には、メイタンシノイド、カリケアミシン、リボヌクレアーゼ、およびＤＮＡエンドヌクレアーゼがある。
本出願は、遺伝子療法によるＨＥＲ二量体化阻害剤の投与を考えている。例えば、１９９６年３月１４日に公表された、細胞内抗体を発生させるための遺伝子療法の使用に関するＷＯ９６／０７３２１を参照されたい。
（場合によりベクターに含まれる）核酸を患者の細胞内にｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで至らせるために、二つの主なアプローチがある。ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために、患者に直接、通常はその抗体が必要とされる部位に核酸を注射する。ｅｘ ｖｉｖｏ処置のために、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入して、改変された細胞を患者に直接投与するか、または例えば多孔性膜内に封入して、その多孔性膜を患者に植込む（例えば米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号参照）。生存可能な細胞に核酸を導入するために利用できる様々な技法がある。これらの技法は、核酸が培養細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで導入されるか、それとも意図された宿主の細胞にｉｎ ｖｉｖｏで導入されるか応じて変動する。哺乳動物細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸を導入するのに適した技法には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などが挙げられる。遺伝子のｅｘ ｖｉｖｏ送達に通常使用されているベクターはレトロウイルスである。
現在好ましいｉｎ ｖｉｖｏ核酸導入技法には、（アデノウイルス、Herpes simplex Iウイルス、またはアデノ随伴ウイルスなどの）ウイルスベクターおよび脂質に基づく系を用いたトランスフェクションが挙げられる（遺伝子の脂質介在性導入に有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−Ｃｈｏｌである）。ある状況では、核酸の入手源に、細胞表面膜タンパク質またはターゲット細胞に特異的な抗体、ターゲット細胞上のレセプターに対するリガンドなどのような、ターゲット細胞をターゲティングする薬剤を提供することが理想的である。リポソームが採用された場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型に親和性のキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、循環中にインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、および細胞内局在をターゲティングして細胞内半減期を増大するタンパク質を、ターゲティングに、および／または取込みを促進するために使用することができる。レセプター介在性エンドサイトーシスの技法は、例えば、Wuら、J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)；およびWagnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)に記載されている。現在公知の遺伝子マーカー作成および遺伝子治療プロトコールの総説については、Andersonら、Science 256:808-813 (1992)を参照されたい。ＷＯ９３／２５６７３および本明細書に引用した参考文献も参照されたい。
ＶＩ． 材料の寄託
以下のハイブリドーマ細胞系は、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA（ＡＴＣＣ）に寄託された:
抗体の名称 ＡＴＣＣ番号 寄託日
７Ｃ２ ＡＴＣＣ ＨＢ−１２２１５ １９９６年１０月１７日
７Ｆ３ ＡＴＣＣ ＨＢ−１２２１６ １９９６年１０月１７日
４Ｄ５ ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４６３ １９９０年５月２４日
２Ｃ４ ＡＴＣＣ ＨＢ−１２６９７ １９９９年４月８日
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な実施例によって例示される。明細書における全ての引用の開示は、参照により特に本明細書に組み入れられる。
実施例１
進行性、抗療性、または再発性の卵巣ガンにおけるパーツズマブの臨床活性およびＨＥＲ２の活性化状態の役割
この実施例は、卵巣ガン患者の単群（single arm）、非盲検、多施設第ＩＩ相臨床試験に関するものである。進行性、抗療性、または再発性の卵巣ガンを有する患者を、ヒト化ＨＥＲ２抗体であるパーツズマブで処置した。パーツズマブは、ＨＥＲ２と、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４との二量体化を阻害し、ＭＡＰおよびＰ１３キナーゼを介したシグナル伝達を阻害するＨＥＲ二量体化阻害剤（ＨＤＩ）と呼ばれる新しいクラスのターゲット薬に相当する。
再発性卵巣ガンを有する患者６５人を登録し、６１人に「低用量」単剤パーツズマブを用いた治療を受けさせた。パーツズマブを８４０mgのローディングに続いて３週間毎に４２０mg静脈内（ＩＶ）投与した。
第２のコホートの患者を、単剤として投与した「高用量」パーツズマブ、すなわち１０５０mgで３週間毎に処置した。このコホートでは６４人の対象を登録し、６２人の対象を処置した。
２、４、６、８、１２、および１６サイクル後に腫瘍の評定を得た。
ＲＥＣＩＳＴによる奏功率（ＲＲ）がプライマリーエンドポイントであった。下記実施例２に記載したｐＨＥＲ２酵素結合免疫吸着法を使用してＨＥＲ２のリン酸化（ｐＨＥＲ２）状態をアッセイするために、新鮮な腫瘍生検が必須であった。コホート１の対象についてｐＨＥＲ２を評定した。安全性および耐容性をさらに評価した。
セカンダリーエンドポイントは、ＴＴＰ、奏効期間、生存期間、薬物動態（ＰＫ）、およびＦＯＳＩ（コホート２）であった。
結果
患者の背景（baseline demographics）を図９に提供する。年齢の中央値は５７歳（３５〜８３歳の範囲）であり、ＥＣＯＧ ＰＳの中央値は２であった。以前の化学療法方式の中央値は５であった。
図１０〜１４は、処置された患者における有害事象を全て示す。パーツズマブは耐容性良好であった。下痢（グレード１〜３）が６１%の患者で経験された。５%の患者で駆出率が５０%未満まで降下した。
有効性の結果を図１５にまとめる。４%の患者が部分奏効（ＰＲ）となった。３９%の患者が安定（ＳＤ）となった。図１６に示すように、パーツズマブ４２０mgで処置した患者についてのＴＴＰの中央値は７週間であり、パーツズマブ１０５０mgで処置した患者については６．６週間であった。図１７は低用量または高用量のパーツズマブで処置された患者についての全生存を提供するものである。生存期間中央値は４０週間であった。ＣＡ−１２５の応答を図１８に提供する。パーツズマブはＣＡ−１２５レベルの低減に効果的であった。当該低減は、卵巣ガンにおける治療有効性の指標である。
パーツズマブ４２０mgで処置されたコホート１における患者のＨＥＲ２の活性化状態を評価した。結果を図１９〜２３に示す。約３０%の卵巣ガン対象がｐＨＥＲ２陽性であった（腫瘍の３０%超、実施例２に記載したようにＥＬＩＳＡを実施）。有効性およびｐＨＥＲ２のデータについて評価することができる対象のうち、２６%がｐＨＥＲ２陽性であった。図１９を参照されたい。
ｐＨＥＲ２陰性患者の６週間、およびｐＨＥＲ２状態未知の患者の９週間に比べて、ｐＨＥＲ２陽性の患者についてのＴＴＰ中央値は２１週間であった（図２０および２２）。
コホート１の患者６１人中１４人がパーツズマブ活性の証拠を示した。部分奏効（ＰＲ）を有した唯一の患者はホスホ−ＨＥＲ２陽性であった。図２１を参照されたい。
患者の全生存も評価した。図２３に示すように、パーツズマブで処置されたｐＨＥＲ２陽性患者の全生存は、トポテカン（生存期間中央値４３週間）またはリポソームドキソルビシン（３６週間）で実現される生存期間に勝るようであった。
結論
単剤として、パーツズマブは耐容性良好である。パーツズマブの毒性および有効性は用量には関連しないようだ。パーツズマブは、進行性、抗療性、または再発性の卵巣ガンに活性を有する。ｐＨＥＲ２状態陽性の対象は、ｐＨＥＲ２状態陰性の対象に比べてＴＴＰおよび生存の有効性の増大を示した。ＨＥＲ２活性化を示している患者における、ＴＴＰまたは生存により測定したパーツズマブの有効性は、進行性、抗療性、または再発性卵巣ガンを有する患者を処置するために現在使用されている薬剤であるトポテカンまたはリポソームドキソルビシンを使用して実現された有効性に勝るようであった。
実施例２
ＨＥＲ２活性化を決定するためのホスホ−ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡ
上記実施例１は、進行性、抗療性、または再発性の卵巣ガンを有する対象におけるパーツズマブの有効性を評価した臨床試験を記載している。この実施例は、実施例１で処置した患者におけるＨＥＲ２活性化を決定するために使用したアッセイの開発について記載する。
ヒト卵巣腫瘍組織溶解液中のＨＥＲ２関連チロシンリン酸化（ＨＥＲ２／ｐＴｙｒ）の濃度を測定するために、ホスホ−ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡを開発した。試料体積が限られているため、このアッセイはＣＯＳＴＡＲ（商標）９６ウェルハーフエリアマイクロタイタープレートを利用している。コート抗体は、親和性精製されたヤギ抗ＨＥＲ２ ＥＣＤ抗体であり、二次抗体は、ホスホチロシンに特異的なビオチン化マウスモノクローナル抗体（クローン４Ｇ１０）である。参照標準は、アッセイ範囲１３２U/mLのＳＫ−ＢＲ−３細胞溶解液である。１ユニットは全ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡにより決定された２７７pgの全ＨＥＲ２を含むＳＫ−ＢＲ−３細胞溶解液で測定されたリン酸化チロシン量に等しい（全ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡ）。このＥＬＩＳＡは、検出のためにＡＭＤＥＸ（商標）ストレプトアビジン−ＨＲＰと、基質としてＴＭＢとを使用する。
材料
１．標準物質、ＳＫ−ＢＲ−３細胞溶解液１０５６U/mL ＨＥＲ２／ｐＴｙｒ
２．対照の入手源， ＳＫ−ＢＲ−３細胞溶解液１０５６U/mL
３．コート抗体、ヤギ抗ＨＥＲ２ ＥＣＤ ９．６mg/mL
４．二次抗体、ビオチン化マウス抗ホスホチロシン抗体、クローン４Ｇ１０、９７１μg/mL(Upstate Biotech Cat#16-103)
５．ＨＲＰにコンジュゲーションしたストレプトアビジン（ＳＡ−ＨＲＰ）であるＡＭＤＥＸ（商標）（Amersham Biosciences Catalog No. RPN4401）
６．基質、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質（Kirkegaard & Perry Labs [KPL] Catalog No. 50-76-01）
７．コート緩衝液、０．０５M炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）
８．アッセイ希釈液、ＰＢＳ／０．５%ＢＳＡ／０．０５%ポリソルベート２０／０．０５%ＰＲＯＣＬＩＮ３００（商標）（ｐＨ７．４）
９．溶解緩衝液:塩基性溶解緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１５０mM ＮａＣｌ／５mM ＥＤＴＡ／１% ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（商標）／１：１０プロテアーゼ阻害剤カクテル／１：１００ホスファターゼ阻害剤カクテルＩ／１：１００ホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩ／５０mMフッ化ナトリウム／２mMオルトバナジン酸ナトリウム（ｐＨ８．１）
１０．試料、標準、および対照用希釈液:溶解緩衝液
１１．ＭＤＡ−４６８（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１３２）。ＨＥＲ２の発現レベル：ゼロ。組織：ヒト乳腺、乳房、腺ガン
１２．ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２２）。ＨＥＲ２発現レベル：０（ＨＥＲ２の発現レベル正常。組織：ヒト乳腺；乳房；上皮；転移部位：胸水腺ガン
１３．ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−３０, Manassas, VA）。ＨＥＲ２発現レベル：３（高レベルのＨＥＲ２の過剰発現）。組織：ヒト乳腺；乳房；転移部位：胸水腺ガン
１４．ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２０, Manassas, VA)。ＨＥＲ２の発現レベル：３(高レベルのＨＥＲ２過剰発現）
組織：ヒト乳腺；乳房；腺管；腺管ガン
１５．ＢＴ−４７４腫瘍溶解液。マウスにＢＴ−４７４を接種した。２週間後に腫瘍を採取した。採取した腫瘍をホモジナイズして腫瘍溶解液を産生した。
材料の調製
標準物質／原液：ホスホＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡの標準原液はニートな標準物質である。８０%から９０%集密のＳＫ−ＢＲ−３（ＳＫＢＲ３）細胞を含む３枚の２４５×２４５mm細胞培養トレーから溶解液を収集することにより、この標準物質を調製した。遠心分離により細胞溶解液を清澄にし、上清を収集した。この上清を標準物質として使用する。
アッセイのレポート範囲の最小値が１U/mLになるように、この標準物質を濃度１０５６U/mLに割付けた。１ユニットは、総ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡにより決定された総ＨＥＲ２、２７７pgを含有するＳＫ−ＢＲ−３細胞溶解液で測定されたリン酸化チロシンの量と定義する。
細胞溶解液対照：標準物質から細胞溶解液対照を調製した。標準物質を溶解緩衝液に希釈して、アッセイ標準曲線の低域、中域、および高域に相当するＨＥＲ２／ｐＴｙｒレベルを得た。
組織溶解液対照：ＢＴ４７４腫瘍溶解液から組織溶解液対照を調製した。ＢＴ４７４腫瘍溶解液を溶解緩衝液に希釈して、アッセイ標準曲線の高域に相当するＨＥＲ２／ｐＴｙｒレベルを得た。
コート源：原料（９．６mg/mL）をＰＢＳに希釈して１００μg/mLにすることにより、ヤギ抗ＨＥＲ２ ＥＣＤ原液Ｉを調製した。
ビオチン化コンジュゲート：ビオチン化マウス抗ホスホチロシン抗体（１μg/mL）をUpstate Biotechから購入した。この抗体は、ＫＬＨに結合したホスホチラミンに対するビオチン化、プロテインＡ精製モノクローナルＩｇＧ２ｂ−カッパ抗体である。このビオチン化モノクローナル抗ホスホチロシン抗体（クローン４Ｇ１０、Cat#05-321）は、ホスホチロシンに特異的であり、ホスホセリンともホスホトレオニンとも交差反応しない。
ヤギ抗ＨＥＲ２ ＥＣＤの特異性：ＨＥＲ２のレセプター活性化は、ファミリーの他のメンバーとのレセプター二量体化が起こったときに開始する。シグナル伝達は厳密にＨＥＲ２のホモ二量体化によるが、活性な腫瘍内にはＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、および／またはＨＥＲ４が発現していなければならない。これらのレセプターのそれぞれが卵巣組織溶解液試料中に存在することがあり、これらのレセプターがコート抗体と交差反応するならば、ＨＥＲ２関連チロシンリン酸化（ＨＥＲ２／ｐＴｙｒ）を正確に測定することを妨害するおそれがある。
表面プラズモン共鳴解析（BIACORE 3000（登録商標）, BIACORE（登録商標） International AB, Neuchatel, Switzerland）によりヤギ抗ＨＥＲ２ ＥＣＤ抗体の特異性を決定した。アミンカップリング化学反応を使用してＣＭ５センサーチップ上にヤギ抗ＨＥＲ２ ＥＣＤ抗体を固定化した。１Mエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）でこのセンサーチップをブロッキングし、１０mM ＨＣｌでコンディショニングした。固定化ヤギ抗ＨＥＲ２抗体の上に可溶性リコンビナントＥＧＦＲ（ｓＥＧＦＲ）（Research Diagnostics, Inc., Flanders, NJ）およびリコンビナントヒトＨＥＲ２ ＥＣＤ／ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質を注入することにより特異性を決定した。融合タンパク質は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４のＥＣＤがペプチドリンカー（R&D Systems, Minneapolis, MN）を介してカルボキシル末端に６個のヒスチジンタグが付いたヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部と融合したものからなった。
ｓＥＧＦＲ、ＨＥＲ３−Ｆｃ、およびＨＥＲ４−Ｆｃについての参照を減算した相対応答は、それぞれ−４１RU、０．３RU、および２．５RUであった。ｓＥＧＦＲについて得られた負の相対応答は、移動相（ＨＢＳ−ＥＰ）と試料賦形剤との間の屈折率の変化が原因であった。ＨＥＲ２−Ｆｃについての相対応答は３７４RUであった。
方法
ホスホＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡは、０．５M炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の４μg/mLのヤギ抗ＨＥＲ２ ＥＣＤでコートし、２〜８℃で１８〜７２時間インキュベーションしたＣＯＳＴＡＲ（商標）ハーフエリア（Ａ／２）プレートを利用する。約１５０μL/ウェルのアッセイ希釈液でウェルを１〜２時間ブロッキングし、次に５０μL/ウェルの標準、対照、および試料を添加する。卵巣腫瘍組織溶解液の最小希釈倍率は、溶解緩衝液中に４０倍である。この標準、対照、および試料を振盪しながら周囲温度で２時間インキュベーションする。ＰＢＳ／０．０５ ＴＷＥＥＮ２０（商標）でウェルを洗浄し、２５０ng/mLのビオチン化抗ホスホチロシンを添加する。２時間後にウェルを洗浄し、ＡＭＤＥＸ（商標）ストレプトアビジン−ＨＲＰを加える。ＡＭＤＥＸ（商標）ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＳＡ−ＨＲＰ）は多数の酵素ラベルがストレプトアビジンに連結したポリマーコンジュゲートである。１５分後にウェルを洗浄し、テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ）を加え、１５分間発色させてから、１Ｍリン酸で発色を止める。ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（商標）プレートリーダー（Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA）を使用して、４５０nmのフィルターと６５０nmの参照フィルターを用いて吸光度を測定する。７点の標準曲線の非線形４変数ロジスティックフィットと比較して試料濃度を計算する（Marquardt, D. J. Soc. Indust. Appl Math. 431-441 (1963)）。ＥＬＩＳＡのアッセイ範囲は１から３２U/mLである。このユニットは任意のユニットであり、１Uは総ＨＥＲ２を２７７pg含有するＳＫ−ＢＲ−３細胞溶解液で測定したリン酸化チロシンの量に等しい。アッセイの下限を１U/mLに設定し、この下限を検出下限と定義した。
標準物質の濃度を再割り付けした後にホスホＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡの精度を再評価した。ＳＫＢＲ３細胞溶解液中の三つの異なるレベルのＨＥＲ２／ｐＴｙｒの変動係数（ＣＶ）を決定することにより、アッセイ内およびアッセイ間精度を評価した。ＳＫＢＲ３細胞溶解液を希釈して、アッセイ標準曲線の低域、中域、高域に相当するＨＥＲ２レベルを得た。標準物質の濃度を再割り付けした後で、高対照はアッセイ標準曲線の高域内に入らなかった。したがって、ＢＴ４７４組織溶解液対照を高域内に入るように希釈した。アッセイ対照として行われた溶解液を２回の繰り返しで５日間分析した。ＳＴＡＴＶＩＥＷ ｆｏｒ ＡＮＯＶＡ（商標）分析に対照データをインポートし、アッセイ内およびアッセイ間標準偏差を決定した。
ＣＶを以下のように計算した：
１００×（標準偏差）／（対照値平均）
アッセイ内精度のＣＶは、ＢＴ４７４、高対照、中対照、および低対照についてそれぞれ４%、４%、３%、および１１%であった。アッセイ間精度のＣＶは、ＢＴ４７４、高対照、中対照、および低対照についてそれぞれ５%、６%、５%、および１４%であった。
ホスホＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡを開発する間に、ＳＫＢＲ３細胞溶解液をニートなＭＤＡ４６８溶解液に希釈して２２．９、６．３９、および１．７１U/mLにした。試料を、ＳＫＢＲ３ ＨＥＲ２／ｐＴｙｒを含有する溶解緩衝液に希釈して、ＨＥＲ２／ｐＴｙｒのレベルを希釈系列全体にわたり一定に保つ一方でマトリックスの効果を希釈した。ホスホＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡで希釈系列を分析し、ＭＤＡ４６８不在下でのＳＫＢＲ３ ＨＥＲ２／ｐＴｙｒと比較して回収率を決定した。回収率（%）を次式により計算した：
Figure 2008531576
ＭＤＡ４６８細胞溶解液の存在下の３レベルでのＳＫＢＲ３ ＨＥＲ２／ｐＴｙｒの回収率の結果から、１．７１U/mLレベルではマトリックスがニートから１６倍の間の試料希釈倍率で回収率を有意に高め、ＨＥＲ２／ｐＴｙｒの回収率が１２０%から１２７%の間であることが明らかとなった。他のどのレベルでもマトリックスの干渉は観察されなかった。溶解緩衝液中で１６倍の試料希釈倍率で開始する各レベルにおいて８０%から１２０%の間の回収率が実証されている。
溶解緩衝液に卵巣溶解液およびＢＴ４７４腫瘍溶解液を２倍系列希釈し、ホスホＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡで分析した。開発中に分析したＢＴ４７４試料についての初発希釈倍率は２０倍であった。標準物質濃度を再割り付けした後で卵巣溶解液を分析した。卵巣溶解液についての初発希釈は予想されるＨＥＲ２／ｐＴｙｒ濃度に応じて変動した。
試料希釈の直線性の指標である希釈系列に関する差の率（%）を次式により計算した：
Figure 2008531576
卵巣組織溶解液ＨＦ８１９８についての差の率（%）を、８０、１６０、または３２０いずれかの希釈倍率で開始して計算した。卵巣腫瘍溶解液ＨＦ７９４５についての差の率（%）を、３２０、６４０、または１２８０のいずれかの希釈倍率で開始して計算した。残りの卵巣組織溶解液についての差の率（%）を、２０または４０のいずれかの希釈倍率から開始して計算し、最小希釈倍率を決定し、希釈の直線性を評定した。
ＢＴ４７４の希釈系列についての差は−９%から１２%の範囲であった。１０倍希釈で始まるＨＦ７９３０およびＨＦ７９３４の希釈系列についての差は、それぞれ４３%および３８%であった。ＨＦ８１９７についての差は、３２０、１６０、および１２８０倍で始まる希釈系列についてそれぞれ２%、８%、および５%であった。ＨＦ８１９８についての差は、８０、１６０、および３２０倍で開始する希釈系列についてそれぞれ７２%、３４%、および３%であった。
標準物質濃度を変えた後でホスホＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡで１８個の異なる卵巣組織溶解液を分析した。２０倍から開始して１６０倍まで試料を２倍希釈した。一つの試料は２０倍希釈でＬＴＲであった。１０個の試料は４０倍希釈でＬＴＲであった。７個の試料は２０および４０倍希釈で測定可能なレベルのＨＥＲ２／ｐＴｙｒを有し、一つの試料は８０倍希釈までは測定可能なレベルのＨＥＲ２／ｐＴｙｒを有した。２０および４０倍希釈で測定可能なレベルのＨＥＲ２／ｐＴｙｒを有した試料についての差は１６%から３４%の範囲であり、７個の試料のうち３個は２０%未満の差を有した。８０倍希釈まで測定可能なレベルのＨＥＲ２／ｐＴｙｒを有した一つの試料は、２０および４０倍から出発する希釈系列についてそれぞれ１６%および４%の差を有した。
ホスホＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡでパーツズマブおよびトラスツズマブを分析し、これらの治療薬が妨害するかどうかを決定した。９８．４８U/mLのＨＥＲ２／ｐＴｙｒを含有する、ヘレグリンで刺激したＭＣＦ７（ＭＣＦ７＋）細胞溶解液中に抗体を１．５から１００００ng/mLの範囲の濃度に希釈した。
開発中に、細胞および組織溶解液を４サイクルの冷凍−解凍に供し、温度循環の効果を決定した。凍結ＳＫＢＲ３細胞溶解液およびＢＴ４７４腫瘍溶解液を周囲温度で解凍した。各溶解液から１０μLを取り出し、アッセイ希釈液で希釈した。残りの溶解液をドライアイスおよびメタノールの混合物中で急速冷凍し、再び解凍した。被験試料をもう一度取り出し、アッセイ希釈液に希釈した（第１回の凍結／解凍サイクル、１×）。急速冷凍、解凍、および試料収集の手順を２回繰り返し、２回目および３回目の冷凍／解凍サイクルから試料を得た（それぞれ２×、３×）。
希釈した試料をホスホＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡでアッセイし、「新鮮」試料に関するＨＥＲ２／ｐＴｙｒの回収率を決定した。「新鮮」試料は、初回の解凍から採取された試料である。
１×、２×、および３×試料についてのＳＫＢＲ３ ＨＥＲ２／ｐＴｙｒの回収率は、それぞれ１０４%、１０９%、および１１３%であった。試料３１４ＡにおけるＢＴ４７４ ＨＥＲ２／ｐＴｙｒの回収率は、１×、２×、および３×試料についてそれぞれ９９%、１０３%、および９９%であった。試料３６５におけるＢＴ４７４ ＨＥＲ２／ｐＴｙｒの回収率は、１×、２×、および３×試料についてそれぞれ１１１%、９６%、および９９%であった。
定量下限（ＬＬＯＱ）を低対照の平均濃度１．３５U/mLに設定した。各実験の中に低対照が含まれることから、低対照は試料がその値まで正確に測定される下限の信頼できる指標である。したがって、ホスホＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡにおける定量可能な最小濃度は、ＬＬＯＱに最小の試料希釈倍率（４０）を乗じたもの、すなわち５４U/mLである。
結論
腫瘍組織溶解液中のＨＥＲ２関連チロシンリン酸化（ＨＥＲ２／ｐＴｙｒ）を測定するために、高感度で正確なＥＬＩＳＡを開発した。このホスホＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡは、定量可能な最小濃度５４U/mLで１．３５U/mLまでの感度を示したが、ここで、１Uは、２７７pgの総ＨＥＲ２を含有するＳＫ−ＢＲ−３細胞溶解液で測定されたリン酸化チロシンの量に等しい。ホスホ−ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡは四つのレベルで良好な精度を示した。アッセイ内精度のＣＶは、ＢＴ４７４組織溶解液対照、ならびに高、中、および低ＳＫＢＲ３細胞溶解液対照についてそれぞれ４%、３%、３%、および１１%であった。アッセイ間精度のＣＶはＢＴ４７４組織溶解液対照ならびに高、中、および低ＳＫＢＲ３細胞溶解液対照についてそれぞれ５%、６%、５%、および１４%であった。
ホスホＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡはＭＤＡ４６８細胞溶解液の存在下でＨＥＲ２／ｐＴｙｒの良好な回収を示した。１６倍希釈で開始して回収率は８８%から１２０%の範囲であった。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３−ＩｇＧ Ｆｃ、およびＨＥＲ４−ＩｇＧ Ｆｃがアッセイコートと交差反応しないことから、ＥＬＩＳＡは高い特異性を示した。
ヒト卵巣腫瘍およびＢＴ４７４マウス異種移植腫瘍組織溶解液を使用して、希釈および最小試料希釈の直線性を分析した。ＢＴ４７４腫瘍溶解液についての希釈補正値の差は、−９%から１２%の範囲であった。２０および４０倍希釈で測定可能なレベルのＨＥＲ２／ｐＴｙｒレベルを有した７個の卵巣溶解液のうち、３個だけが２０%未満の差を有し、一方７個中６個が２３%以下の差を有した。８０までの希釈倍率で測定可能なレベルのＨＥＲ２／ｐＴｙｒを有した一試料である試料ＨＦ７９３１は、４０倍で開始する希釈系列について４%の差を有した。上記試料の全てが最小希釈倍率２０で≦２０%の基準に合致しなかったため、最小試料希釈倍率は４０であろう。
ＢＴ４７４組織溶解液およびヒト卵巣組織溶解試料であるＨＦ８１９７およびＨＦ８１９８は測定可能な高レベルのＨＥＲ２／ｐＴｙｒを有し、アッセイの定量範囲に入るには、８０から３２０の間の希釈倍率を必要とした。ヒト卵巣腫瘍組織サブセットのうち測定された最高ＨＥＲ２／ｐＴｙｒ濃度を有したＢＴ４７４試料および試料ＨＦ８１９７は、全アッセイ範囲にわたり直線的に希釈された。対照的に、希釈について補正されたものとしての試料ＨＦ８１９８は非直線的に希釈された。ＨＥＲ２／ｐＴｙｒ濃度はアッセイ範囲にわたり増加を続け、３２０倍希釈でプラトーに見える。
３回の凍結／解凍サイクルに供されたＳＫＢＲ３細胞溶解液は非常に良好な回収率を示した。同じ新鮮解凍された試料に関してＨＥＲ２／ｐＴｙｒの回収率は１０４%から１１３%の範囲であった。
二つのＢＴ４７４腫瘍溶解液も３回の凍結／解凍サイクルに供した。ＢＴ４７４ホスホＨＥＲ２の回収率は９９%から１０３%の範囲であった。ＢＴ４７４からのＨＥＲ２／ｐＴｙｒの回収率は９６%から１１１%の範囲であった。したがって、温度循環はホスホＨＥＲ２の活性に影響しないようであった。
ホスホＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡはパーツズマブからの妨害もトラスツズマブからの妨害も全く示さなかった。
実施例３
ＨＥＲ２活性化を決定するための遺伝子発現プロファイリング
この実施例は、ＨＥＲ２リン酸化を直接決定する代わりとして遺伝子発現プロファイルを決定することにより、どのようにＨＥＲ２活性化を評価できるかを示す。このプロファイリングは、新鮮検体、凍結検体、またはホルマリン固定パラフィン包埋卵巣腫瘍検体で行うことができるが、好ましくは後者で行う。
製造業者の説明書通りに行ったＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）マイクロアレイ分析を使用して、遺伝子発現について、パーツズマブで処置された卵巣ガン検体のプロファイリングを行った。マクロアレイの発現データを分析して、ＨＥＲ２のリン酸化状態と関連しているであろう遺伝子パターンを同定した。顕著には、相対的に高レベルのＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲリガンドであるベータセルリンの発現を有する腫瘍がＨＥＲ２のリン酸化についても陽性であるパターンが出現した。この相関は６個のＨＥＲ２リン酸化陽性例のうち６個で陽性であり、ＨＥＲ２リン酸化陰性例のうちアルゴリズムを基準とするマイクロアレイ発現データを使用して陽性と予測されたものは全く存在しなかった。
２番目の分析では、ＨＥＲ２リン酸化状態の予測は、単一遺伝子のみ、すなわちベータセルリンを使用することにより実現された。これもまたマイクロアレイ発現データを使用して、６個のＨＥＲ２リン酸化陽性腫瘍の全てが中央値を超えるベータセルリンの発現を有した。
遺伝子発現を定量するための２番目の方法である定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）がマイクロアレイデータを確認するために使用され、マイクロアレイデータと比較された。ｑＲＴ−ＰＣＲは臨床的設定で入手できる典型的な患者試料での遺伝子発現を測定するための好ましい方法であろう。この方法に関して診断技法のプラットフォームがすでに確立されている。Croninら、Am. J. Pathol. 164(1):35-42 (2004)；およびMaら、Cancer Cell 5:607-616 (2004)に記載されているようにｑＲＴ−ＰＣＲを行った。Qiagen, Valencia, Californiaから市販されている試薬を使用して、凍結卵巣腫瘍からＲＮＡを抽出した。ＴＡＱＭＡＮ（商標）ｑＲＴ−ＰＣＲ分析用のプライマーおよびプローブを設計して、約１００塩基以下のアンプリコン長を得た。ＴＡＱＭＡＮ（商標）装置（Applied BioSystems）を使用したｑＲＴ−ＰＣＲにより転写体を定量し、被験遺伝子の発現レベルを参照遺伝子の発現レベルに対して基準化した。「ハウスキーピング」遺伝子であるＧＵＳは変動が小さく発現が高いことから、ＧＵＳを対照遺伝子として選択した。
上に言及した実験に基づき、ＥＬＩＳＡにより公知のＨＥＲ２リン酸化状態を有する腫瘍の遺伝子発現プロファイリングの日付に基づき、アルゴリズムを開発した。ベータセルリンまたはアンフィレグリンと、ＨＥＲ２の発現とを中央値以上で有し、かつ／またはＥＧＦＲおよび／もしくはＨＥＲ３の発現を中央値以上で有する腫瘍を、ＨＥＲ２リン酸化に関連する遺伝子発現プロファイリング陽性とみなす。または、ベータセルリンまたはアンフィレグリン単独の発現をｑＲＴ−ＰＣＲにより測定して、予測されたＨＥＲ２リン酸化を有する腫瘍を同定することができる。
ＨＥＲ２タンパク質の構造の概略図およびその細胞外ドメインのドメインＩ〜ＩＶについてのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１９〜２２）を提供する図である。 マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）（図２Ａ）および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）（図２Ｂ）（それぞれ配列番号１および２）；変異体５７４／パーツズマブのＶＬおよびＶＨドメイン（それぞれ配列番号３および４）、ならびにヒトＶＬおよびＶＨコンセンサスフレームワーク（ｈｕｍ κ１、軽鎖カッパ亜群Ｉ；ｈｕｍＩＩＩ、重鎖亜群ＩＩＩ）（それぞれ配列番号５および６）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。星印により、パーツズマブとマウスモノクローナル抗体２Ｃ４との可変ドメインの間に、またはパーツズマブとヒトフレームワークとの可変ドメインの間に差があることを明らかにする。相補性決定部（ＣＤＲ）に括弧を付す。 マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）（図２Ａ）および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）（図２Ｂ）（それぞれ配列番号１および２）；変異体５７４／パーツズマブのＶＬおよびＶＨドメイン（それぞれ配列番号３および４）、ならびにヒトＶＬおよびＶＨコンセンサスフレームワーク（ｈｕｍ κ１、軽鎖カッパ亜群Ｉ；ｈｕｍＩＩＩ、重鎖亜群ＩＩＩ）（それぞれ配列番号５および６）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。星印により、パーツズマブとマウスモノクローナル抗体２Ｃ４との可変ドメインの間に、またはパーツズマブとヒトフレームワークとの可変ドメインの間に差があることを明らかにする。相補性決定部（ＣＤＲ）に括弧を付す。 パーツズマブ軽鎖（図３Ａ、配列番号１３）および重鎖（図３Ｂ、配列番号１４）のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲを太字で示す。軽鎖および重鎖の分子量の計算値は、２３５２６．２２Daおよび４９２１６．５６Da（システインは還元型）である。糖質部分は重鎖のＡｓｎ２９９に付着している。 パーツズマブ軽鎖（図３Ａ、配列番号１３）および重鎖（図３Ｂ、配列番号１４）のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲを太字で示す。軽鎖および重鎖の分子量の計算値は、２３５２６．２２Daおよび４９２１６．５６Da（システインは還元型）である。糖質部分は重鎖のＡｓｎ２９９に付着している。 ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に２Ｃ４が結合することによって活性化ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３とのヘテロ二量体化を阻止することを概略的に示す図である。 ＭＡＰＫ経路およびＡｋｔ経路とのＨＥＲ２／ＨＥＲ３の共役を示す図である。 トラスツズマブおよびパーツズマブの様々な活性を比較する図である。 トラスツズマブの軽鎖（図７Ａ；配列番号１５）および重鎖（図７Ｂ；配列番号１６）のアミノ酸配列をそれぞれ示す図である。 トラスツズマブの軽鎖（図７Ａ；配列番号１５）および重鎖（図７Ｂ；配列番号１６）のアミノ酸配列をそれぞれ示す図である。 変異体パーツズマブの軽鎖配列（図８Ａ；配列番号１７）および変異体パーツズマブの重鎖配列（図８Ｂ；配列番号１８）をそれぞれ示す図である。 変異体パーツズマブの軽鎖配列（図８Ａ；配列番号１７）および変異体パーツズマブの重鎖配列（図８Ｂ；配列番号１８）をそれぞれ示す図である。 実施例１で処置された患者の背景を提供する図である。 （処置との関係性にかかわらず）グレード３〜４の有害事象を全て示す図である。 （処置との関係性にかかわらず）重篤な有害事象を示す図である。 研究者によって被験薬に関係すると判断された重篤な有害事象をまとめた図である。 選択された有害事象に関する情報を提供する図である。 重篤な心臓有害事象および早急な報告を必要とする有害事象を示す図である。 実施例１におけるパーツズマブの第ＩＩ相試験に関する有効性の結果をまとめた図である。 低用量（４２０mg）または高用量（１０５０mg）いずれかのパーツズマブで処置された評価可能な卵巣ガン対象についての疾患の進行までの期間（ＴＴＰ）への有効性を示す図である。 低用量（４２０mg）または高用量（１０５０mg）いずれかのパーツズマブで処置された評価可能な卵巣ガン対象についての全生存の有効性を示す図である。トポテカンで処置された卵巣ガン対象についての歴史的生存期間中央値は４３週間であり、リポソームドキソルビシンについては３６週間であった。 ４２０mgまたは１０５０mgいずれかのパーツズマブで処置された卵巣ガン対象についてのＣＡ−１２５の応答を提供する図である。 パーツズマブ４２０mgで処置された卵巣ガン対象についてＥＬＩＳＡにより決定されたホスホ−ＨＥＲ２（ｐＨＥＲ２）の状態を提供する図である。 パーツズマブ４２０mgで処置された卵巣ガン対象についてＥＬＩＳＡにより決定されたｐＨＥＲ２の状態による臨床有効性の結果を提供する図である。 活性の根拠（１８週間を超えて部分奏効ＰＲまたは安定ＳＤ）を示している、パーツズマブ４２０mgで処置された卵巣患者について、ＥＬＩＳＡにより決定されたｐＨＥＲ２状態を提供する図である。ＢＳＬＤは最長直径のベースラインの合計を表す。 ｐＨＥＲ２状態によるＴＴＰへの有効性を示す図である。卵巣ガン対象をパーツズマブ４２０mgで処置した。全ＴＴＰは６．６週間であった。ｐＨＥＲ陽性対象におけるＴＴＰは２０．９週間であり、ｐＨＥＲ２陰性対照におけるＴＴＰは６．０週間であり、未知のｐＨＥＲ２状態を有する対象におけるＴＴＰは９．１週間であった。 ｐＨＥＲ２状態による全生存を示す図である。卵巣ガン対象をパーツズマブ４２０mgで処置した。トポテカンで処置された卵巣ガン対象についての歴史的生存期間中央値は４３週間であり、リポソームドキソルビシンについては３６週間であった。

Claims (37)

  1. ガン患者における疾患の進行までの期間（ＴＴＰ）または生存を延長する量のＨＥＲ二量体化阻害剤を該患者に投与することを含む、該患者におけるＴＴＰまたは生存を延長する方法であって、該患者のガンがＨＥＲ活性化を示す方法。
  2. ＨＥＲ二量体化阻害剤がＨＥＲ２二量体化阻害剤である、請求項１記載の方法。
  3. ＨＥＲ二量体化阻害剤がＨＥＲのヘテロ二量体化を阻害する、請求項１または２記載の方法。
  4. 患者のガンがＨＥＲ２活性化を示す、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
  5. 患者のガンがＨＥＲ２リン酸化を示す、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
  6. 患者のガンが、ホスホ−ＥＬＩＳＡアッセイで評価されたＨＥＲ２リン酸化を示す、請求項５記載の方法。
  7. 患者のガンが、遺伝子発現プロファイリングにより評価されたＨＥＲ２活性化を示す、前記請求項のいずれか１項記載の方法。
  8. ＨＥＲ二量体化阻害剤が抗体である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
  9. 抗体が、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３からなる群より選択されるレセプターＨＥＲに結合する、請求項８記載の方法。
  10. 抗体がＨＥＲ２に結合する、請求項９記載の方法。
  11. ＨＥＲ２抗体がＨＥＲ２細胞外ドメインのドメインＩＩに結合する、請求項１０記載の方法。
  12. 抗体がＨＥＲ２細胞外ドメインのドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの間の接合部に結合する、請求項１１記載の方法。
  13. ＨＥＲ抗体が、それぞれ配列番号３および４の可変軽鎖アミノ酸配列および可変重鎖アミノ酸配列を含む、請求項１２記載の方法。
  14. ＨＥＲ二量体化阻害剤がパーツズマブである、請求項１３記載の方法。
  15. ＨＥＲ抗体がネイキッドな抗体である、請求項８〜１４のいずれか１項記載の方法。
  16. ＨＥＲ抗体がインタクトな抗体である、請求項８〜１５のいずれか１項記載の方法。
  17. ＨＥＲ抗体が、抗原結合領域を含む抗体フラグメントである、請求項８〜１５のいずれか１項記載の方法。
  18. ガンが、卵巣ガン、腹膜ガン、卵管ガン、転移性乳ガン（ＭＢＣ）、非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）、前立腺ガン、および結腸直腸ガンからなる群より選択される、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
  19. ガンが卵巣ガン、腹膜ガン、または卵管ガンである、請求項１８記載の方法。
  20. ガンが進行性、抗療性、または再発性の卵巣ガンである、請求項１８記載の方法。
  21. ＨＥＲ二量体化阻害剤が単一抗腫瘍剤として投与される、請求項１〜２０のいずれか１項記載の方法。
  22. 患者に第２の治療剤を投与することを含む、請求項１〜２０のいずれか１項記載の方法。
  23. 第２の治療剤が、化学療法剤、ＨＥＲ抗体、腫瘍関連抗原に対する抗体、抗ホルモン化合物、心臓保護剤、サイトカイン、ＥＧＦＲターゲット薬、抗血管形成剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＯＸ阻害剤、非ステロイド系抗炎症薬、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ガン胎児タンパク質ＣＡ１２５と結合する抗体、ＨＥＲ２ワクチン、ＨＥＲターゲティング療法、Ｒａｆ阻害剤またはｒａｓ阻害剤、リポソームドキソルビシン、トポテカン、タキサン、二重チロシンキナーゼ阻害剤、ＴＬＫ２８６、ＥＭＤ−７２００、悪心を処置する薬、皮疹を予防もしくは処置する薬または標準的なざ瘡治療法、下痢を処置または予防する薬、解熱薬、および造血成長因子からなる群より選択される、請求項２２記載の方法。
  24. 第２の治療剤が化学療法剤である、請求項２３記載の方法。
  25. 化学療法剤が代謝拮抗化学療法剤である、請求項２４記載の方法。
  26. 代謝拮抗化学療法剤がゲムシタビンである、請求項２５記載の方法。
  27. 第２の治療剤が、トラスツズマブ、エルロチニブ、またはベバシズマブである、請求項２２記載の方法。
  28. ＴＴＰが延長される、請求項１〜２７のいずれか１項記載の方法。
  29. 生存が延長される、請求項１〜２９のいずれか１項記載の方法。
  30. ＨＥＲ二量体化阻害剤の投与が、認可された抗腫瘍剤をガン患者に投与することにより実現されるＴＴＰまたは生存よりも少なくとも約２０%大きくＴＴＰまたは生存を延長する、請求項１〜２９のいずれか１項記載の方法。
  31. 卵巣ガン、腹膜ガン、または卵管ガンを有する患者における疾患の進行までの期間（ＴＴＰ）または生存を延長する量のパーツズマブを該患者に投与することを含む、該患者におけるＴＴＰまたは生存を延長するための方法であって、該患者のガンがＨＥＲ２の活性化を示す方法。
  32. 患者が卵巣ガンを有する、請求項３１記載の方法。
  33. 患者が進行性、抗療性、または再発性のガンを有する、請求項３１または３２記載の方法。
  34. 患者へのパーツズマブの投与が、該患者にトポテカンまたはリポソームドキソルビシンを投与することにより実現されるＴＴＰまたは生存よりも少なくとも約２０%大きくＴＴＰまたは生存を延長する、請求項３１〜３３のいずれか１項記載の方法。
  35. 患者に化学療法剤を投与することをさらに含む、請求項３１〜３４のいずれか１項記載の方法。
  36. 化学療法剤が代謝拮抗化学療法剤である、請求項３５記載の方法。
  37. 代謝拮抗化学療法剤がゲムシタビンである、請求項３６記載の方法。
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