MX2007009889A

MX2007009889A - Alargar el tiempo hasta la progresion de la enfermedad o la supervivencia de los pacientes de cancer.

Info

Publication number: MX2007009889A
Application number: MX2007009889A
Authority: MX
Inventors: Mika K Derynck; Stephen M Kelsey
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2005-02-23
Filing date: 2006-02-21
Publication date: 2007-09-07
Also published as: SI1850874T1; JP2014240414A; JP2012211173A; CR9312A; WO2006091693A3; IL184884A0; RU2404806C2; DOP2006000052A; CL2015000428A1; TW200640488A; PL1850874T3; JP2018135369A; US20140186347A1; MY152164A; HK1112588A1; US20110165157A1; US20180236072A1; AU2006216732B2; CN101163503B; MA29331B1

Abstract

Esta solicitud describe como alargar el tiempo previo al progreso de la enfermedad o la supervivencia en pacientes de cancer con activacion de HER, tratando al paciente con un inhibidor de la dimerizacion de HER, como pertuzumab.

Description

ALARGAR EL TIEMPO HASTA LA PROGRESIÓN DE LA ENFERMEDAD O LA SUPERVIVENCIA DE LOS PACIENTES DE CÁNCER Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de EE.UU. con n° de serie 60/655.277, depositada el 23 de febrero de 2005, cuya divulgación completa está incorporada en la presente memoria descriptiva a modo de referencia .

Campo de la invención Esta invención trata de alargar el tiempo previo al progreso de la enfermedad o la supervivencia en pacientes de cáncer con activación de HER, tratando al paciente con un inhibidor de la dimerización de HER, como pertuzumab.

Antecedentes de la invención Receptores HER y anticuerpos contra estos La familia de los receptores tirosma quinasas HER es un grupo de importantes mediadores en el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia celular. La familia de receptores incluye cuatro miembros distintos: el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbBl o HERÍ), HER2 (ErbB2 o pl85neu) , HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4 o t?ro2).

El EGFR, codificado por el gen erbBl, es causa de tumores malignos en el ser humano. En particular, se ha observado un aumento de la expresión del EGFR en el cáncer de mama, vejiga, pulmón, cabeza, cuello y estómago, así como en los glioblastomas . El aumento de la expresión del EGFR se asocia a menudo con un aumento de la producción de su ligando, el factor alfa de crecimiento tumoral (TGF-a) , por parte de las propias células tumorales, propiciando que una ruta de estimulación autocrina active el receptor. Baselga y Mendelsohn, Pharmac . Ther. , 64:127-154 (1994). Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el EGFR o sus ligandos, el TGF-a y el EGF, se han evaluado como agentes terapéuticos en el tratamiento de tales tumores. Véanse, por e . , Baselga y Mendelsohn., supra; Masui et al . Cáncer Research 44:1002-1007 (1984); y Wu et al . J. Clin . Invest . 95:1897-1905 (1995). El segundo miembro de la familia de los HER, el pl85neu, se identifico originalmente como el producto del gen mutante de los neuroblastomas manifestados en ratas tratadas con sustancias químicas. La forma activada del protooncogén neu se produce por una mutación puntual (de valma a ácido glutámico) en la región transmembrana de la proteína codificada. La amplificación del homólogo humano del neu se observa en el cáncer de mama y ovario, con un nivel de prognosis muy bajo (Slamon et al . , Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al . , Science, 244:707-712 (1989) y la patente de EE.UU. No 4.968.603). Hasta la fecha, no se ha detectado que en los tumores humanos se haya producido alguna mutación puntual análoga a la del protooncogén neu. La sobreexpresión de HER2 (debida frecuente pero no uniformemente a la amplificación del gen) también se ha observado en otros carcinomas, incluyendo los de estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, hígado, colon, tiroides, páncreas y vejiga. Véanse, entre otros, King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al., Lancet: 1:765-767 (1986); Fukushige et al., Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Guerin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohén et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cáncer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner et al., Cáncer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cáncer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cáncer Res. , 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcínog., 3:254-257 (1990); Aasland et al. Br. J. Cáncer 57:358-363 (1988); Williams et al. Pathobiology 59:46-52 (1991); y McCann et al., Cáncer, 65:88-92 (1990). HER2 podria estar sobreexpresa en el cáncer de próstata (Gu et al. Cáncer Lett. 99:185-9 (1996); Ross et al. Hum. Pathol. 28:827-33 (1997); Ross et al. Cáncer 79:2162-70 (1997); y Sadasivan et al. J. Urol. 150:126-31 (1993)). Se han descrito anticuerpos dirigidos contra las proteínas pl85neu de las ratas y HER2 humana.

Drebin y otros han producido anticuerpos contra el producto del gen neu de la rata, pl85peu . Véase, por ejemplo, Drebin et al . , Cell 41:695-706 (1985); Myers et al . , Meth . Enzym . 198:277-290 (1991); y W094/22478. Drebin et al . Oncogene, 2:273-277 (1988) se menciona que las mezclas de anticuerpos reactivos con dos regiones distintas del pl85peu tienen efectos antitumorales sinérgicos en las células NIH-3T3 transformadas por el neu e implantadas en ratones. Véase también la patente de EE.UU. 5.824.311 concedida el 20 de octubre de 1998. Hudziak et al . , Mol . Cell . Biol . 9 ( 3) : 1165-1172 (1989) describe la generación del panel de anticuerpos HER2 caracterizados utilizando la línea celular SK-BR-3 del cáncer de mama humano. Se determinó una proliferación relativa de las células SK-BR-3 tras exposición a los anticuerpos por tinción de las monocapas de cristal violeta tras 72 horas. En este ensayo, la inhibición máxima se obtuvo con el anticuerpo llamado 4D5, que inhibió la proliferación celular en el 56%. Sin embargo, otros anticuerpos del panel redujeron la proliferación celular en menor grado. A continuación se utilizó el anticuerpo 4D5 para sensibilizar líneas celulares de cáncer de mama con sobreexpresión de HER2 a los efectos citotóxicos de TNF-a. Véase también la patente de los EE.UU. N° 5,677,171 concedida el 14 de octubre de 1997. Los anticuerpos HER2 discutidos en Hudziak et al. se caracterizan en más detalle en Fendly et al. Cáncer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et al. In Vitro 26(3) :59A (1990); Sarup et al. Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al. J. Clin. Immunol. 11(3) :117-127 (1991); Kumar et al. Mol. Cell. Biol. 11(2) :979-986 (1991); Le is et al. Cáncer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al. Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al. Cáncer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwko ski et al. J. Biol. Chem. 269 (20 ): 14661-14665 (1994); Scott et al. J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza et al. Proc. Nati. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994); Le is et al. Cáncer Research 56:1457-1465 (1996); y Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997). Una versión recombmante humanizada del anticuerpo murmo 4D5 contra HER2 (huMAb 4D5-8, rhuMAb HER2, trastuzumab o HERCEPTIN7; patente de EE.UU. N° 5.821.337) aparece clínicamente activa en pacientes con cáncer de mama metastásico con sobreexpresión de HER2 que han recibido una intensa terapia previa contra el cáncer (Baselga et al., J. Clin. Oncol., 14:737-744 (1996)). La Administración de Alimentos y Fármacos aprobó el 25 de septiembre de 1998 la comercialización del trastuzumab para el tratamiento.de pacientes con cáncer de mama metastásico con sobreexpresion de la proteína HER2. Otros anticuerpos contra el HER2 con distintas propiedades han sido descritos en Tagliabue et al. Int. J. Cáncer 47:933- 937 (1991); McKenzie et al. Oncogene 4:543-548 (1989); Maíer et al. Cáncer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al. Cáncer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al. Int. J. Cáncer 53:401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk et al. Cáncer Research 52:2771-2776 (1992) ; Hancock et al. Cáncer Res. 51:4575-4580 (1991); Sha ver et al. Cáncer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al. Cáncer Res. 54:3758-3765 (1994); Har erth et al. J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); Patente de los EE.UU. N° 5,783,186; y Klapper et al. Oncogene 14:2099-2109 (1997) . El screening homológico ha resultado en la identificación de dos otros miembros de la familia de receptores HER; HER3 (Patente de los EE.UU: Nos. 5,183,884 y 5,480,968 así como Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)) y HER4 (EP Sol de Pat N°. 599,274; Plo man et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); y Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)). Ambos receptores muestran un aumento de la expresión en al menos algunas líneas celulares de cáncer de mama. Los receptores HER, por lo general, se encuentran en las células en diversas combinaciones, y se cree que la heterodimerización aumenta la diversidad de las respuestas celulares a varios ligandos de HER (Earp et al. Breast Cáncer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). Al EGFR se unen seis ligandos diferentes: el factor de crecimiento epidérmico (EGF) , el factor alfa de crecimiento tumoral (TGF-a) , la anfirregulina, el factor de crecimiento epidérmico ligado a la heparina (HB-EGF) , la betacelulina y la epirregulina (Groenen et al . , Growth Factors 11:235-257 (1994)). Una familia de las proteínas heregulinas resultante del enlace alternativo de un solo gen actúa como ligando de HER3 y HER4. La familia de las proteínas heregulinas incluye heregulinas alfa, beta y gama (Holmes et al . , Science, 256:1205-1210 (1992); Patente de los EE.UU. N° 5,641,869; y Schaefer et al . Oncogene 15:1385-1394 (1997)); factores de diferenciación de neu (NDFs, por sus siglas en inglés), factores de crecimiento gliales (GGFs, por sus siglas en inglés); actividad inductiva del receptor de acetilcolina (ARIA) ; y factor derivado de neuronas sensoriales y motoras (SMDF) . Para reseñas al respecto, véanse Groenen et al . Growth Fa ctors, 11:235-257 (1994); Lemke, G. Molec . & Cell . Neurosci . , 7:247-262 (1996) y Lee et al . , Pharm . Rev. , 47:51-85 (1995). Recientemente se identificaron tres ligandos de HER adicionales; neuregulina-2 (NRG-2) que se ha descrito que se unen tanto HER3 como HER4 (Chang et al . Na ture 387 509-512 (1997); y Carraway et al Na ture 387:512-516 (1997)); neuregulina-3 que se une a HER4 (Zhang et al . PNAS (USA) 94 (18) : 9562-7 (1997)); y neuregulina-4 que liga HER4 (Harari et al . Oncogene 18:2681-89 (1999)) HB-EGF, betacelulina y epiregulina que también se unen a HER . Si bien el EGF y el TGFa no se unen a HER2, el EGF estimula el EGFR y HER2 para formar un heterodimero, que activa el EGFR y propicia la transfosforilación de HER2 en el heterodímero. La dimerización y/o la transfosforilación parecen activar la tirosina quinasa HER2. Veáse Earp et al . , supra .

Asimismo, cuando HER3 se expresa juntamente con HER2, se forma un complejo activo de señalización, y los anticuerpos dirigidos contra HER2 son capaces de desorganizar este complejo (Sliwkowski et al . , J. Bíol . Chem . , 269 (20) : 14661-14665 (1994)). Además, la afinidad de HER3 por la heregulina (HRG) aumenta cuando se expresa juntamente con HER2. Véanse también, Levi et al . , Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al . , Proc . Na ti . Acad . Sci . USA 92: 1431-1435 (1995); y Lewis et al . , Cáncer Res . , 56:1457-1465 (1996) para información acerca del complejo de proteínas HER2-HER3. HER4, al igual que HER3, forma un complejo activo de señalización con HER2 (Carraway y Cantley, Cell, 78:5-8 (1994)). Algunas publicaciones de patentes relacionadas a los anticuerpos de HER son: US 5,677,171, US 5,720,937, US ,720,954, US 5,725,856, US 5,770,195, US 5,772,997, US 6,165,464, US 6,387,371, US 6,399,063, US2002/0192211A1, US 6,015,567, US 6,333,169, US 4,968,603, US 5,821,337, US 6,054,297, US 6,407,213, US 6,719,971, US 6,800,738, US2004/0236078A1, US 5,648,237, US 6,267,958, US 6,685,940, US 6,821,515, W098/17797, US 6,127,526, US 6,333,398, US 6,797,814, US 6,339,142, US 6,417,335, US 6,489,447, WO99/31140, US2003/0147884A1 , US2003/0170234A1, US2005/0002928A1, US 6,573,043, US2003/0152987A1 , W099/48527, US2002/0141993A1, WO01/00245, US2003/0086924 , US2004/0013667A1, WO00/69460, WO01/00238, WO01/15730, US 6,627,196B1, US6, 632 , 979B1 , WO01/00244, US2002/0090662A1, WO01/89566, US2002/0064785, US2003/0134344 , WO 04/24866, US2004/0082047, US2003/0175845A1, WO03/087131, US2003/0228663, WO2004/008099A2, US2004/0106161, WO2004 /048525, US2004/0258685A1, US 5,985,553, US 5,747,261, US 4,935,341, US 5,401,638, US 5,604,107, WO 87/07646, WO 89/10412, WO 91/05264, EP 412,116 Bl, EP 494,135 Bl, US 5,824,311, EP 444,181 Bl, EP 1,006,194 A2, US 2002/0155527A1, WO 91/02062, US 5,571,894, US 5,939,531, EP 502,812 Bl, WO 93/03741, EP 554,441 Bl, EP 656,367 Al, US 5,288,477, US 5,514,554, US 5,587,458, WO 93/12220, WO 93/16185, US 5,877,305, WO 93/21319, WO 93/21232, US 5,856,089, WO 94/22478, US 5,910,486, US 6,028,059, WO 96/07321, US 5,804,396, US 5,846,749, EP 711,565, WO 96/16673, US 5,783,404, US 5,977,322, US 6,512,097, WO 97/00271, US 6,270,765, US 6,395,272, US 5,837,243, WO 96/40789, US 5,783,186, US 6,458,356, WO 97/20858, WO 97/38731, US 6,214,388, US 5,925,519, WO 98/02463, US 5,922,845, WO 98/18489, WO 98/33914, US 5,994,071, WO 98/45479, US 6,358,682 Bl, US 2003/0059790, WO 99/55367, WO 01/20033, US 2002/0076695 Al, WO 00/78347, WO 01/09187, WO 01/21192, WO 01/32155, WO 01/53354, WO 01/56604, WO 01/76630, WO02/05791, WO 02/11677, US 6,582,919, US2002/0192652A1, US 2003/0211530A1, WO 02/44413, US 2002/0142328, US 6,602,670 B2, WO 02/45653, WO 02/055106, US 2003/0152572, US 2003/0165840, WO 02/087619, WO 03/006509, WO03/012072, WO 03/028638, US 2003/0068318, WO 03/041736, EP 1,357,132, US 2003/0202973, US 2004/0138160, US 5,705,157, US 6,123,939, EP 616,812 Bl, US 2003/0103973, US 2003/0108545, US 6,403,630 Bl, WO 00/61145, WO 00/61185, US 6,333,348 Bl, WO 01/05425, WO 01/64246, US 2003/0022918, US 2002/0051785 Al, US 6,767,541, WO 01/76586, US 2003/0144252, WO 01/87336, US 2002/0031515 Al, WO 01/87334, WO 02/05791, WO 02/09754, US 2003/0157097, US 2002/0076408, WO 02/055106, WO 02/070008, WO 02/089842 y WO 03/86467. Diagnóstico Los pacientes tratados con el anticuerpo trastuzumab contra HER2 se seleccionan para una terapia basada en la sobreexpresión/amplificación de HER2. Véase, por ejemplo, los documentos WO99/31140 (Patón et al . ) , US2003/0170234A1 (Hellmann, S.) y US2003/0147884 (Patón et al . ) , asi como los documentos WO01/89566, US2002/0064785 y US2003/0134344 (Mass et al . ) . Véanse, también, el documento US2003/0152987, Cohén et al . , con relación a la inmunohistoquímica (IHC) y la hibridación in si tu con fluorescencia (FISH) para detectar la sobreexpresión y amplificación de HER2. WO2004/053497 y US2004/024815A1 (Bacus et al . ) , así como US 2003/0190689 (Crosby y Smith), trata del modo de determinar o pronosticar la respuesta a la terapia con trastuzumab. En el documento US2004/013297A1 (Bacus et al . ) se habla del modo de determinar o pronosticar la respuesta a la terapia con anticuerpos ABX0303 contra el EGFR. En el documento WO2004/000094 (Bacus et al . ) se trata de determinar la respuesta a la GW572016, una pequeña molécula inhibidora de la tirosina quinasa del EGFR-HER2. En el documento WO2004 /063709, Amler et al . , se hace referencia a los biomarcadores y procedimientos para determinar la sensibilidad al erlotinib HCl, un inhibidor del EGFR. En el documento US2004/0209290, Cobleigh et al . , se habla de los marcadores de expresión génica para la prognosis del cáncer de mama. Los pacientes tratados con pertuzumab pueden ser seleccionados para terapia basada en activación o dimerización de HER. Las publicaciones de patentes relativas al pertuzumab y la selección de pacientes para terapias con dicha sustancia incluyen: los documentos WO01/00245 (Adams et al . ) , US2003/0086924 (Sliwkowski, M.) y US2004/0013667A1 (Sliwkowski, M. ) , asi como los documentos WO2004/008099A2 y US2004 /0106161 (Bossenmaier et al . ) . En Cronin et al . , Am . J. Pa th . , 164(1): 35-42 (2004) se describe la medición de la expresión génica en muestras de archivo de tejidos embebidos en parafina. Ma et al . Cáncer Cell , 5:607-616 (2004) se describe la creación de perfiles de los genes mediante una micromatriz de oligonucleótidos y genes empleando ARN aislado de secciones de tejido tumoral tomadas de biopsias primarias archivadas. El pertuzumab (también conocido como anticuerpo monoclonal recombmante humano 2C4; OMNITARG™, Genentech, Ine, South San Francisco) es el primero de un nuevo tipo de agentes conocidos como inhibidores de la dimenzación de HER (HDI) e inhibe la capacidad de HER2 de crear heterodímeros activos con otros receptores HER (como EGFR/HER1, HER3 y HER ) y está activo sean cuales sean los niveles de expresión HER2 . See, for example, Harán and Yarden Oncogene 19:6102-14 (2000); Yarden and Sliwkowski. Na t Rev Mol Cell Biol 2:127-37 (2001); Sliwkowski JVat Struct Biol 10:158-9 (2003); Cho et al . Na ture 421:756-60 (2003); and Malik et al . Pro Am Soc Cáncer Res 44:176-7 (2003).

Se ha demostrado que el pertuzumab bloquea la formación de heterodímeros en células tumorales para inhibir señalización celular crítica, lo cual resulta en una disminución de la proliferación y supervivencia del tumor (Agus et al . Cáncer Celi 2:127-37 (2002) ) . Pertuzumab ha sido sometido a pruebas como agente único en la clínica con un ensayo fase la en pacientes con cáncer avanzado y ensayos fase lia en pacientes con cáncer de ovario y mama, así como cáncer de pulmón y próstata. En un estudio Fase I, los pacientes con tumores sólidos incurables, avanzados localmente, recurrentes o metastáticos que hayan progresado durante o con posterioridad a terapia estándar fueron tratados con pertuzumab administrado intravenosamente cada 3 semanas. En general, el pertuzumab fue bien tolerado. En 3 de los 20 pacientes cuya respuesta se pudo evaluar se consiguió regresión del tumor. Dos pacientes registraron respuestas parciales confirmadas. En 6 de 21 pacientes se observó una estabilidad de la enfermedad superior a 2,5 meses (Agus et al . Pro Am Soc Clin Oncol 22:192 (2003)). Con dosis de 2,0-15 mg/kg, la farmacocinética de pertuzumab era lineal, y la eliminación media varió de 2,69 a 3,74 mL/día/kg mientras que la eliminación final media varió entre 15,3 a 27,6 dias. No se detectaron anticuerpos contra pertuzumab (Allison et al . Pro Am Soc Clin Oncol 22:197 (2003)).

Suptanrio de la invención La presente invención ofrece datos clínicos de pacientes de cáncer humanos tratados con un inhibidor de la dimerización de HER, pertuzumab. Se evaluó la activación HER de los pacientes determinada utilizando un bioensayo fosfo-ELISA. Se observaron beneficios clínicos, medidos en tiempo hasta progresión de la enfermedad (TTP) y supervivencia, en los pacientes con activación HER. Consecuentemente, la invención proporciona un método para extender el tiempo hasta progresión de la enfermedad (TTP) o supervivencia en un paciente de cáncer que consiste en administrar un inhibidor de la dimerización de HER al paciente en una cantidad que alargue el TTP o la supervivencia del paciente, siempre y cuando el cáncer el paciente muestre activación de HER. La invención también supone un método para extender el tiempo hasta progresión de la enfermedad (TTP) o supervivencia en pacientes con cáncer de ovario, peritoneo o de trompa de falopio que consiste en administrar un inhibidor de la dimerización de HER al paciente en una cantidad que alargue el TTP o la supervivencia del paciente, siempre y cuando el cáncer el paciente muestre activación de HER2.

Breve descripción de los esquemas En la figura 1 se ofrece un esquema de la estructura de la proteína HER2, así como las secuencias de aminoácidos de los dominios I-IV ( identificadores de secuencia núms. 19-22, respectivamente) del dominio extracelular de las mismas. En las figuras 2A y 2B se representan las alineaciones de las secuencias de aminoácidos de los dominios variable ligero (VL) (figura 2A) y variable pesado (VH) (figura 2B) del anticuerpo murino monoclonal 2C4 (identificadores de secuencia núms. 1 y 2, respectivamente), los dominios VL y VH de la variante 574/pertuzumab (identificadores de secuencia núms. 3 y 4, respectivamente) y las estructuras de consenso del VL y VH humanos (?l humano, subgrupo kappa ligero I; humano III, subgrupo pesado III) (identificadores de secuencia núms. 5 y 6, respectivamente) . Los asteriscos identifican diferencias entre dominios variables de pertuzumab y el anticuerpo mupno monoclonal 2C4 o entre dominios variables de pertuzumab y la estructura humana. Las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) aparecen entre paréntesis. En las figuras 3A y 3B se muestran las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera (figura 3A, identificador de secuencia N° 13) y pesada (figura 3B, identificador de secuencia N° 14) del pertuzumab. Las CDRs se muestran en negrita. La masa molecular estimada de las cadenas ligera y pesada es de 23.526,22 Da y 49.216,56 Da (cisteinas en forma reducida) . El residuo glucidico está unido al Asn 299 de la cadena pesada.

En la figura 4 se representa, esquemáticamente, la unión del 2C4 en el punto de unión heterodimérica de HER2, evitando por tanto la heterodimerización con el EGFR o HER3 activados. En la figura 5 se representa la unión de HER2/HER3 a las rutas de MAPK y Akt. En la figura 6 se comparan diversas actividades del trastuzumab y el pertuzumab. En las figuras 7A y 7B se muestran las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera (figura 7A, identificador de secuencia N° 15) y pesada (figura 7B, identificador de secuencia N° 16), respectivamente, del trastuzumab. En las figuras 8A y 8B se representan secuencias variantes de las cadenas ligera (figura 8A, identificador de secuencia N° 17) y pesada (figura 8B, identificador de secuencia N° 18), respectivamente, del pertuzumab. La figura 9 ofrece datos demográficos baselina de los pacientes tratados en el Ejemplo 1. La figura 10 muestra todas las reacciones adversas de grado 3-4 (estuvieran relacionadas con el tratamiento o no) . La figura 11 muestra todos las reacciones adversas graves (estuvieran relacionadas con el tratamiento o no) . La figura 12 resume las reacciones adversas graves que los investigadores consideran que están relacionadas con el medicamento del estudio.

La figura 13 ofrece información acerca de reacciones adversas seleccionadas. La figura 14 representa reacciones adversas cardíacas graves y las reacciones adversas sobre las que hay que informar urgentemente. La figura 15 resume los resultados de eficacia del estudio Fase II de pertuzumab en el Ejemplo 1. La figura 16 muestra la eficacia en tiempo hasta progresión de la enfermedad (TTP) en sujetos con cáncer de ovario evaluable tratados con una dosis baja (420mg) o alta (1050mg) de pertuzumab. La figura 17 muestra la eficacia de supervivencia general en sujetos con cáncer de ovario evaluable tratados con una dosis baja (420mg) o alta (1050mg) de pertuzumab. La supervivencia media histórica de los sujetos con cáncer de ovario tratados con topotecan fue 43 semanas, y con doxorrubicina liposomal, 36 semanas. La figura 18 muestra las respuestas CA-125 en sujetos con cáncer de ovario evaluable tratados con una dosis de 420mg o 1050mg de pertuzumab. La figura 19 muestra el estado fosfo-HER2 (pHER2), determinado por ELISA, en pacientes con cáncer de ovario tratadas con 420mg de pertuzumab.

La figura 20 muestra los resultados de eficacia clínica según estado HER2 , determinado por ELISA, en pacientes con cáncer de ovario tratadas con 420mg de pertuzumab. La figura 21 muestra el estado pHER2, determinado por ELISA, en pacientes con cáncer de ovario tratadas con 420mg de pertuzumab con muestras de actividad (respuesta parcial -PR- o enfermedad estable -SD- durante más de 18 semanas) . La sigla BSLD significa suma baselina del diámetro más largo. La figura 22 muestra la eficacia de TTP según estado pHER2. Las pacientes con cáncer de ovario fueron tratadas con 420mg de pertuzumab. El TTP general fue 6,6 semanas; el TTP en sujetos con pHER positivo fue de 20,9 semanas; el TTP en sujetos con pHER2 negativo fue de 6,0 semanas; y el TTP en sujetos con estado pHER2 desconocido fue de 9,1 semanas. La figura 23 muestra la supervivencia general según estado pHER2. Las pacientes con cáncer de ovario fueron tratadas con 420mg de pertuzumab. La supervivencia media histórica de los sujetos con cáncer de ovario tratados con topotecan fue 43 semanas, y con doxorrubicina liposomal, 36 semanas.

Descripción detallada de las realizaciones preferentes I . Def niciones En la presente memoria, el "tiempo hasta progresión de la enfermedad" o "TTP" se refieren al tiempo, generalmente calculado en semanas o meses (por e . con un inhibidor de la dimerizacion de HER, como el pertuzumab) , transcurrido hasta que el cáncer progresa o empeora. Esta progresión puede ser evaluada por un medico calificado. Por ejemplo, en el caso del cáncer de ovario, la progresión se puede evaluar con RECIST (véase, por ejemplo, Therasse et al . , J. Na t . Cáncer Inst . 92(3) : 205-216 (2000) ) . Con "extender TTP" nos referimos a incrementar el tiempo hasta la progresión de la enfermedad en un paciente tratado comparando con un paciente no tratado (es decir, comparando con un paciente que no reciba un tratamiento con un inhibidor de la dimerizacion de HER, como pertuzumab) , o en relación con un paciente que no muestre activación de HER, y/o comparando con un paciente tratado con un agente antitumoral aprobado (como topotecan o doxorrubicina liposomal, si el cáncer es cáncer de ovario) . La "supervivencia" se refiere al hecho de que el paciente siga vivo, e incluye tanto supervivencia general como supervivencia sin que el cáncer empeore. La "supervivencia general" se refiere al hecho de que el paciente siga vivo durante un periodo de tiempo definido, como 1 año, 5 años, etc., desde el momento del diagnóstico o el tratamiento . La "supervivencia sin progresión" se refiere al hecho de que el paciente siga vivo sin que el cáncer progrese ni empeore . Con "extender supervivencia" nos referimos a incrementarla supervivencia general o sin progresión de la enfermedad en un paciente tratado comparando con un paciente no tratado (es decir, comparando con un paciente que no reciba un tratamiento con un inhibidor de la dimerización de HER, como pertuzumab) , o en relación con un paciente que no muestre activación de HER, y/o comparando con un paciente tratado con un agente antitumoral aprobado (como topotecan o doxorrubicina liposomal, si el cáncer es cáncer de ovario) . Una "respuesta objetiva" se refiere a una respuesta medible, incluyendo una respuesta completa (CR) o parcial (PR) .

Por "respuesta completa" o "CR" se entiende la desaparición de todas las señales de cáncer en respuesta al tratamiento. Esto no siempre significa que el cáncer se haya curado . Una "respuesta parcial" o "PR" se refiere a la disminución del tamaño de uno o más tumores o lesiones, o de la extensión del cáncer en el cuerpo, en respuesta al tratamiento. Un "receptor HER" es una proteina tirosina quinasa receptora perteneciente a la familia de receptores HER, que incluye los receptores EGFR, HER2, HER3 y HER4. El receptor HER comprende por lo general un dominio extracelular, que puede unirse con un ligando de HER y/o dimerizarse con otra molécula receptora HER, un dominio de transmembrana lipófilo, un dominio de tirosina quinasa intracelular conservado y un dominio de señalización del extremo carboxilo terminal que alberga diversos residuos de tirosina que pueden fosforilarse . El receptor HER puede ser un receptor HER con "secuencia nativa" o una "variante de la secuencia de aminoácidos" del mismo. Preferentemente, el receptor HER es un receptor HER humano con secuencia nativa. Los términos "ErbBl," "HERÍ", "receptor del factor de crecimiento epidérmico" y "EGFR" se utilizan indistintamente en la presente memoria y se refieren a EGFR como se indica, por ejemplo, en Carpenter et al . Ann . Rev. Biochem . 56:881-914 (1987), incluyendo las formas mutantes de las mismas que se presentan naturalmente (por ej . una mutación de eliminación EGFR como en Humphrey et al . PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)). er£>Bl se refiere el gen que codifica el producto proteinico EGFR. Las expresiones "ErbB2" y "HER2" se utilizan en la presente memoria descriptiva indistintamente y hacen referencia a la proteína HER2 humana descrita, por ejemplo, en Semba et al . , PNAS (USA) , 82:6497-6501 (1985) y Yamamoto et al . Na ture 319:230-234 (1986) (entrada número X03363 del Genebank) . El término "errjB2" se refiere al gen que codifica la ErbB2 humana, y "neu" al gen que codifica la pl85peu de las ratas. La HER2 preferente es la HER2 humana con secuencia nativa. En la presente memoria, el "dominio extracelular HER2" o "HER2 ECD" se refiere a un dominio de HER2 que está situado fuera de una célula, ya sea anclada a una membrana celular o en circulación, incluyendo fragmentos de la misma. En una realización, el dominio extracelular de HER2 puede comprender cuatro dominios: "Dominio I" (residuos aminoácidos de unos 1-195; SEQ ID NO: 19), "Dominio II" (residuos aminoácidos de unos 196-319; SEQ ID NO:20), "Dominio III" (residuos aminoácidos de unos 320-488: SEQ ID NO:21), y "Dominio IV" (residuos aminoácidos de unos 489-630; SEQ ID NO:22) (la numerización de residuos incluye el péptido de señal) . Véase Garrett et al . Mol . Cell . . 11: 495-505 (2003), Cho et al . Na ture 421: 756-760 (2003), Frankiin et al . Cáncer Cell 5:317-328 (2004), y Plowman et al . Proc . Na ti . Acad. Sci . 90:1746-1750 (1993), asi como la figura 1 de la presente memoria. "ErbB3" y "HER3" se refieren al polipéptido receptor tal como se desvela, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. núms. 5.183.884 y 5.480.968, asi como Kraus et al . PNAS (EE. UU. ) 86:9193-9197 (1989) . Los términos "ErbB4" y "HER4" se refieren en la presente memoria descriptiva al polipéptido receptor tal como se desvela, por ejemplo, en la solicitud de patente europea N° 599.274, Plowman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:1746- 1750 (1993) y Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993), incluyendo isoformas del mismo, por ejemplo, como se desvela en el documento W099/19488, publicado el 22 de abril de 1999. Por "ligando de HER" se entiende un polipéptido que se une a, y/o activa, un receptor HER. El ligando de HER de especial interés para la presente memoria es un ligando de HER con secuencia nativa como factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)); factor alfa de crecimiento tumoral (TGF-a) (Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)); anfirregulina conocida como schwanoma o factor de crecimiento de la autocrina queratinocita (Shoyab et al. Oncogene 243:1074-1076 (1989); Maier et al. Nature 348:257- 260 (1990); y Cook et al. Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993); y Sasada et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)); factor de crecimiento epidérmico ligado a la heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991)); epirregulina (Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995); y Komurasaki et al. Oncogene 15:2841-2848 (1997)); una heregulina (ver a continuación); neurregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)); neurregulina-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 94:9562-9567 (1997)); neurregulina-4 (NRG-4) (Harari et al. Oncogene 18:2681-89 (1999)); y cripto (CR-1) (Kannan et al . J. Biol . Chem . 272 (6) : 3330-3335 (1997)). Los ligandos de HER que se unen al EGFR incluyen el EGF, el TGF-a, la anfirregulina, la betacelulina, el HB-EGF y la epirregulina . Los ligandos de HER que se unen a HER3 incluyen las heregulinas. Los ligandos de HER capaces de unirse a HER4 incluyen la betacelulina, la epirregulina, el HB-EGF, la NRG-2, la NRG-3, la NRG-4 y las heregulinas . "Heregulina" (HRG) , en el contexto de la presente memoria descriptiva, se refiere a un polipéptido codificado por el gen de la heregulina tal como se desvela en la patente de EE.UU. N° .641.869 o Marchionni et al . , Na ture, 362:312-318 (1993).

Ejemplos de heregulinas incluyen heregulina-a, heregulina-ßl, heregulina-ß2 y heregulina-ß3 (Holmes et al . , Science, 256:1205-1210 (1992); y patente de los EE.UU. N° 5,641,869); factor de diferenciación neu (NDF) (Peles et al . Cell 69: 205- 216 (1992)); actividad inductiva del receptor de acetilcolina (ARIA) (Falls et al . Cell 72:801-815 (1993)); factores de crecimiento gliales (GGFs) (Marchionni et al . , Na ture, 362:312-318 (1993)); factor derivado de neuronas sensoriales y motoras (SMDF) (Ho et al . J. Biol . Chem . 270:14523-14532 (1995)); ?-heregulma (Schaefer et al . Oncogene 15:1385-1394 (1997)). Un "dímero de HER" es, en la presente memoria descriptiva, un dímero asociado de forma no covalente que comprende al menos dos receptores HER. Estos complejos pueden formarse cuando una célula que expresa dos o más receptores HER se expone a un ligando de HER y puede aislarse por inmunoprecipitación y analizarse mediante SDS-PAGE tal como se describe, por ejemplo, en Sliwkowski et al . , J. Bíol . Chem . , 269 (20) : 14661-14665 (1994). Otras proteínas, como una subunidad receptora de citoquina (por ejemplo, gpl30) , pueden asociarse con el dímero. Preferiblemente, el dímero de HER incluye HER2. Un "heterodimero de HER" es, en la presente memoria descriptiva, un heterodímero asociado de forma no covalente que comprende al menos dos receptores HER distintos, como los heterodimeros EGFR-HER2, HER2-HER3 o HER2-HER4. Un "inhibidor de HER" es un agente que interfiere en la activación o función de HER. Los ejemplos de inhibidores de HER incluyen los anticuerpos contra HER (por ejemplo, los anticuerpos contra el EGFR, HER2, HER3 o HER4), los fármacos que actúan sobre el EGFR, los antagonistas de HER de molécula pequeña, los inhibidores de la tirosina quinasa HER, los inhibidores de la tirosina quinasa dual HER2 y EGFR como lapatinib/GW572016; las moléculas antisentido (véase, por ejemplo, el documento WO2004/87207 ) y/o los agentes que se unen a, o interfieren en la función de, las moléculas de señalización descendente, como MAPK o Akt (véase la figura 5) .

Preferentemente, el inhibidor de HER es un anticuerpo o una pequeña molécula que se une a un receptor HER. Un "inhibidor de la dimerización de HER" es un agente que inhibe la formación de un dímero o heterodímero de HER. Preferentemente, el inhibidor de la dimerización de HER es un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo que se una a HER2 en el punto de unión heterodimérica del mismo. El inhibidor de la dimerización de HER más preferente en la presente memoria descriptiva es el pertuzumab o el MAb 2C4. La unión del 2C4 en el punto de unión heterodimérica de HER2 se ilustra en la figura 4. Otros ejemplos de inhibidores de la dimerización de HER serían los anticuerpos que se unen al EGFR e inhiben la dimerización del mismo con uno o más de los otros receptores HER (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 806 contra el EGFR, el MAb 806, que se une al EGFR activado o "desligado"; véase Johns et al . , J. Bíol . Chem . , 279 (29) : 30375-30384 (2004)), los anticuerpos que se unen a HER3 e inhiben la dimerización del mismo con uno o más de los otros receptores HER, los anticuerpos que se unen a HER4 e inhiben la dimerización del mismo con uno o más de los otros receptores HER, los inhibidores de la dimerización de péptidos (patente de EE.UU. N° 6.417.168), los inhibidores de la dimerización de antisentidos, etc. Un "inhibidor de la dimerización de HER2" es un agente que inhibe la formación de un dímero o heterodímero que contenga HER2. Un "anticuerpo de HER" es un anticuerpo que se une a un receptor HER. Opcionalmente, el anticuerpo de HER interfiere en la activación o función de HER. Preferiblemente, el anticuerpo de HER se une al receptor HER2. En la presente memoria descriptiva se presta especial interés al anticuerpo de HER2 pertuzumab. Otro ejemplo de un anticuerpo de HER2 es trastuzumab. Los anticuerpos de EGFR incluyen cetuximab y ABX0303. La "activación de HER" se refiere a la activación, o fosforilación, de uno o más receptores HER. Por lo general, la activación de HER resulta en la transducción de la señal (por ejemplo, la causada por un dominio intracelular de la quinasa de un receptor HER que fosforila residuos de tirosina en el receptor HER o un sustrato de polipéptidos) . En la activación de HER puede mediar el ligando de HER que se une a un dimero de HER que comprende el receptor HER de interés. El ligando de HER que se une a un dímero de HER puede activar un dominio de quinasa de uno o más de los receptores HER del dímero y, por tanto, resulta en la fosforilación de residuos de tirosina en uno o más de los receptores HER y/o la fosforilación de residuos de tirosina en sustratos adicionales de polipéptidos, como las quinasas Akt o MAPK intracelulares. Véase la figura 5, por ejemplo.

La "fosforilación" se refiere a la adición de uno o más grupos fosfato a una proteina, como un receptor HER, o un sustrato de la misma. Un anticuerpo que "inhibe la dimerización de HER" es un anticuerpo que inhibe o interfiere con la formación de un dimero de HER. Preferiblemente, un anticuerpo de estas características se une a un punto de unión heterodimérica de HER2. El anticuerpo inhibidor de la dimerización más preferente en la presente memoria descriptiva es el pertuzumab o el MAb 2C4. La unión del 2C4 en el punto de unión heterodimérica de HER2 se ilustra en la figura 4. Otros ejemplos de anticuerpos que inhiben la dimerización de HER serían los anticuerpos que se unen al EGFR e inhiben la dimerización del mismo con uno o más de los otros receptores HER (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 806 contra el EGFR, el MAb 806, que se une al EGFR activado o "desligado"; véase Johns et al . , J. Biol . Chem . , 279 (29) : 30375-30384 (2004)), los anticuerpos que se unen a HER3 e inhiben la dimerización del mismo con uno o más de los otros receptores HER, los anticuerpos que se unen a HER4 e inhiben la dimerización del mismo con uno o más de los otros receptores HER. Un anticuerpo que "bloquea la activación del ligando del receptor HER con mayor efectividad que el trastuzumab" es aquel que reduce o elimina la activación del ligando HER del receptor o receptores HER o del dímero o dímeros de HER con mayor efectividad (por ejemplo, al menos con el doble de efectividad) que el trastuzumab. Preferentemente, un anticuerpo de estas características bloquea la activación del ligando HER de un receptor HER al menos con la misma efectividad que el anticuerpo monoclonal murino 2C4 o un fragmento Fab del mismo, o como el pertuzumab o un fragmento Fab del mismo. Se puede evaluar la habilidad de un anticuerpo para bloquear la activación del ligando de un receptor HER estudiando directamente los dímeros de HER, evaluando la activación HER, o la señalización descendiente que resulta de la dimerización HER, y/o evaluando el punto de unión entre el anticuerpo y HER2, etc. Para ver ensayos para detectar anticuerpos con la capacidad de inhibir la activación del ligando de un receptor HER con más eficacia que el trastuzumab, véanse Agus et al . Cáncer Cell 2 : 127-137 (2002) y WO01/00245 (Adams et al . ) . Sólo como ejemplo, se puede hacer un ensayo para: la inhibición de la formación de dímero de HER (véase, por ej . Fig. 1A-B de Agus et al . Cáncer Cell 2 : 127-137 (2002); y WO01/00245); reducción en la activación del ligando HER de células que expresan dímeros de HER (WO01/00245 y Fig. 2A-B de Agus et al . Cáncer Cell 2 : 127-137 (2002), por ejemplo); bloqueo del ligando de HER que se une a células que expresan dímeros (WO01/00245, y Fig. 2E de Agus et al . Cáncer Cell 2 : 127-137 (2002), por ejemplo); inhibición del crecimiento de células cancerosas (por ej . células MCF7, MDA-MD-134, ZR-75-1, MD-MB-175, T-47D) que expresan dimeros en presencia (o ausencia) del ligando HER (WO01/00245 y las figuras 3A-D de Agus et al . Cáncer Cell 2 : 127-137 (2002), por ejemplo); inhibición de señalización descendiente (por ejemplo, inhibición de fosforilación AKT dependiente de HRG o inhibición de fosforilación MAPK dependiente de HRG- o TGFa-) (véase WO01/00245 y la figura 2C-D de Agus et al. Cáncer Cell 2 : 127-137 (2002), por ejemplo). También se puede evaluar si el anticuerpo inhibe la dimerización de HER estudiando el punto de unión entre el anticuerpo y HER2, por ejemplo, mediante un proceso de evaluación de una estructura o modelo, como una estructura cristalizada, de la unión del anticuerpo a HER2 (véase, por ejemplo, Frankiin et al . Cáncer Cell 5:317-328 (2004) ) . Un "punto de unión heterodimérica" en HER2 se refiere a una región del dominio extracelular de HER2 que contacta, o interactúa, con una región del dominio extracelular del EGFR, HER3 o HER4 ante la formación de un dímero del mismo. La región se encuentra en el dominio II de HER2. Frankiin et al . Cáncer Cell 5:317-328 (2004). El anticuerpo contra HER2 podria "inhibir fosforilación AKT dependiente de HRG" y/o inhibir "fosforilación MAPK dependiente HRG- o TGFa-" con más eficacia (por ejemplo, con al menos el doble de eficacia) que el trastuzumab (véase Agus et al . Cáncer Cell 2: 127-137 (2002) y WO01/00245, a modo de ejemplo) . El anticuerpo contra HER2 podria ser un anticuerpo que, al igual que el pertuzumab, "no inhibe la escisión de ectodominio de HER2" (Molina et al . Cáncer Res . 61:4744-4749(2001)). Por otro lado, el trastuzumab puede inhibir la escisión de ectodominio de HER2. Un anticuerpo contra HER2 que "se une a un punto de unión heterodimérica" de HER2 se une a residuos del dominio II (y opcionalmente también se une a residuos de los otros dominios del dominio extracelular de HER2, como los dominios I y III), y puede impedir estéricamente, al menos hasta cierto grado, la formación de un heterodímero de HER2-EGFR, HER2-HER3 o HER2-HER4. Frankiin et al . Cáncer Cell, 5:317-328 (2004) se caracteriza la estructura cristalizada del pertuzumab de HER2, depositada en el Banco de Datos sobre Proteínas RCSB (código de identificación IS78), ilustrando un ejemplo de anticuerpo que se une al punto de unión heterodimérica de HER2. Un anticuerpo que "se une al dominio II" de HER2 se une a residuos del dominio II y, opcionalmente, de otro(s) dominio (s) de HER2, como los dominios I y III. Preferentemente, el anticuerpo que se une al dominio II lo hace en el enlace entre los dominios I, II y III de HER2. La "expresión" de proteínas se refiere a la conversión de la información codificada en un gen primero en ARN mensajero (ARNm) y después en proteína. En la presente memoria descriptiva, una muestra o célula que "expresa" una proteína de interés (como un receptor HER o ligando de HER) es aquélla en que se determina la presencia del ARNm que codifica la proteina, o la propia proteína, incluidos fragmentos de la misma. La técnica de la "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR", en el contexto de la presente memoria descriptiva, se refiere por lo general a un procedimiento en que se amplifican pequeñas cantidades de un ácido nucleico específico, ARN y/o ADN, tal como se describe en la patente de EE.UU. N° 4.683.195 concedida el 28 de julio de 1987. Normalmente, la información sobre la secuencia obtenida en los extremos de la región de interés o más allá de esos puntos debe estar disponible, como por ejemplo que pueden diseñarse cebadores de oligonucleótidos, los cuales pueden ser idénticos o similares en su secuencia a las hebras complementarias del molde que debe amplificarse. Los nucleótidos terminales 5' de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La técnica PCR puede utilizarse para ampliar secuencias específicas de ARN, secuencias específicas de ADN de secuencias genómicas total de ADN, y ADNc transcrito a partir del ARN celular total, secuencias bacteriófagas o plasmídicas, etc. Véase por ej . Mullís et al . , Cold Spring Harbor Symp . Quan t . Biol . , 51: 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989) . Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, la PCR se considera un ejemplo, pero no el único, de un procedimiento de reacción de la polimerasa de un ácido nucleico para amplificar una muestra de prueba de ácido nucleico que comprende el uso de un ácido nucleico conocido (ADN o ARN) como cebador y emplea la polimerasa del ácido nucleico para amplificar o generar un ácido nucleico específico complementario de un ácido nucleico particular. La "reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real" (RT-PCR cuantitativa) se refiere a una forma de PCR en que la cantidad de producto que la reacción genera se mide en cada una de sus etapas. Esta técnica se ha descrito en varias publicaciones, incluyendo Cronin et al . , Am . J. Pa thol . 164(l):35-42 (2004); y Ma et al . , Cáncer Cell 5:607-616 (2004) . El término "micromatriz" hace referencia a una disposición ordenada de los elementos matriciales susceptibles de hibridación, preferentemente sondas de polinucleótidos, que haya en un sustrato. El término "polinucleótido", tanto en forma singular como plural, se refiere por lo general a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN sin modificar o modificado. De esta manera, por ejemplo, los polinucleótidos tal como se definen en la presente memoria descriptiva incluyen, sin limitación, ADN de hebra simple y doble, ADN con regiones de hebra simple y doble, ARN de hebra simple y doble, ARN con regiones de hebra simple y doble y moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de hebra simple o, más típicamente, doble o incluir regiones de hebra simple y doble. Además, el término "polinucleótido", en el contexto de la presente memoria descriptiva, también se refiere a regiones de hebra triple que comprenden ARN o ADN o ambos ácidos a la vez. Las hebras de estas regiones pueden ser de la misma o distintas moléculas. Las regiones pueden incluir todas las moléculas, una o más, pero normalmente sólo abarcan una región formada por algunas moléculas. Una de las moléculas de una región de hélice triple es a menudo un oligonucleótido. El término "polinucleótido" incluye específicamente el ADNc. El término engloba al ADN (incluido el ADNc) y el ARN con una o más bases modificadas. Así, el ADN y el ARN con columnas modificadas por razones de estabilidad u otras son "polinucleótidos" en el sentido que se pretende en la presente memoria descriptiva. Además, el ADN o ARN que comprende bases inusuales, como la inopina, o modificadas, como las tritiadas, se incluye dentro del término "polinucleótido" tal como se define en la presente memoria descriptiva. En general, el término "polinucleótido" abarca todas las formas química, enzimática y/o metabólicamente modificadas de los polinucleótidos no modificados, así como las formas químicas de ADN y ARN características de los virus y las células, incluidas células simples y complejas. El término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido relativamente corto, incluyendo, sin limitación, los desoxirribonucleótidos de hebra simple, los ribonucleótidos de hebra simple o doble, los híbridos de ARN: ADN y ADN de hebra doble. Los oligonucleótidos, como los oligonucléotidos de sonda de ADN de hebra simple, se sintetizan a menudo mediante procedimientos químicos, usando por ejemplo sintetizadores automatizados de oligonucleótidos disponibles en el mercado. De todos modos, los oligonucleótidos pueden obtenerse a través de otros procedimientos, incluyendo las técnicas in vitro de mediación del ADN recombinante o por expresión del ADN en células y organismos. La frase "amplificación génica" se refiere a un procedimiento por el cual se forman múltiples copias de un gen o fragmento de gen en una célula o línea celular en particular. La región duplicada (un tramo del ADN amplificado) recibe a menudo el nombre de "amplicón". Normalmente, la cantidad de ARN mensajero (ARNm) producida también aumenta en proporción a la cantidad de copias realizadas del gen particular expresado. Cualquier experto en la materia puede determinar rápidamente las "condiciones restrictivas" de las reacciones de hibridación, tratándose por lo general de un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sal. En general, para realizar correctamente una hibridación, las sondas más largas requieren temperaturas superiores, y viceversa. La hibridación depende habitualmente de la capacidad de rehibridación del ADN desnaturalizado ante la presencia de hebras complementarias en un entorno con temperatura inferior a su punto de fusión. Cuanto más elevado sea el grado deseado de homología entre la sonda y la secuencia susceptible de hibridación, más alta será la temperatura relativa que podrá emplearse. Como resultado, las temperaturas relativas más altas tenderán a perfilar unas condiciones de reacción más restrictivas, mientras que las más bajas desarrollarán unas condiciones restrictivas menores. Para más detalles y una explicación sobre las condiciones restrictivas de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) . Las "condiciones restrictivas" o "condiciones muy restrictivas", tal como se definen en la presente memoria descriptiva, típicamente: (1) emplean para el lavado una concentración iónica baja y temperaturas altas, por ejemplo, 0,015 M de cloruro sódico/0, 0015 M de citrato sódico/0, 1% de sulfato sódico de dodecilo a 50 °C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, como la formamida, por ejemplo, 50% (v/v) de formamida con 0,1% de albúmina de suero bovino/0, 1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/tampón de fosfato sódico 50 mM con un pH 6,5 y 750 mM de cloruro sódico, 75 mM de citrato sódico a 42°C; o (3) emplean 50% de formamida, SSC 5x (NaCl 0,75 M, 0,075 M de citrato sódico), 50 mM de fosfato sódico (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato sódico, solución de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 gr; g/ml), 0,1% de SDS y 10% de sulfato de dextrano a 42 °C, con lavados a 42 °C en SSC 0,2x (cloruro sódico/citrato sódico) y 50% de formamida a 55 °C, seguido de un lavado muy restrictivo compuesto por SSC 0,lx con EDTA a 55 °C. Las "condiciones moderadamente restrictivas" pueden identificarse tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labora tory Manual , New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de una solución de lavado y unas condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, concentración iónica y porcentaje de SDS) menos restrictivas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente restrictivas seria la incubación durante toda la noche a 37°C en una solución que comprenda: 20% de formamida, SSC x 5 (150 mM de NaCl, 15 mM citrato trisódico), 50 mM de fosfato sódico (pH 7,6), solución de Denhardt x 5, 10% de sulfato de dextrano, y 20 mg/ml de AND de esperma de salmón sonicado desnaturalizada, seguido de un lavado de los filtros en SSC x l a entre 37 y 50°C. Un experto sabrá como regular la temperatura, fuerza iónica, etc. como haga falta para adaptarse a factores como longitud de la sonda y similares. Un polipéptido con "secuencia nativa" es aquél que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido (por ejemplo, un receptor HER o ligando de HER) obtenido de la naturaleza, incluidas variantes que se presentan naturalmente o alélicas. Dichos polipéptidos con secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o producirse por medios sintéticos o de recombinación. Así, un polipéptido con secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos que se encuentra de forma natural en el polipéptido humano, murino o de cualquier otra especie de mamífero. En la presente memoria descriptiva el término "anticuerpo" se usa en el más amplio sentido y abarca específicamente los anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej . , anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos mientras muestren la actividad o función biológica deseada. El término "anticuerpo monoclonal", en el contexto de la presente memoria descriptiva, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto en él caso de posibles variantes que pudiesen surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, estando dichas variantes, por lo general, presentes en cantidades insignificantes. Dicho anticuerpo monoclonal incluye típicamente un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a una diana, en la que la secuencia polipeptídica de unión a dicha diana se obtuvo mediante un procedimiento que incluye la selección de una sola secuencia polipeptídica de unión a la diana a partir de muchas secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el procedimiento de selección puede ser una selección de un solo clon a partir de muchos clones, como un conjunto de clones de hibridoma, clones fágicos, y clones de ADN recombinante. Debe saberse que la secuencia de unión a la diana elegida puede alterarse adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a la diana, para mejorar su producción en cultivos celulares, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y un anticuerpo que comprenda la secuencia de unión a la diana alterada es además un anticuerpo monoclonal de esta invención. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido frente a un solo determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales tienen la ventaja de que no suelen estar contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" revela la característica del anticuerpo de que se ha obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse como una indicación de que sea necesario producir el anticuerpo por algún procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilicen de acuerdo con la presente invención pueden obtenerse a partir de una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, el método del hibridoma (p.ej., Kohier et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies : A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos recombinantes del ADN (véase, p.ej., Patente EE.UU. No. 4,816,567), tecnología de reproducción de imágenes de fago (véase, p.ej., Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2) : 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol . Biol .340 (5) :1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101 (34 ): 12467-12472 (2004); y Lee et al. J. Immunol. Methods 284 ( 1-2 ): 119-132 (2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o semejantes a los humanos en animales que tienen partes o de los loci inmunoglobulínicos humanos o secuencias de la inmunoglobulina humana que codifican genes (véase, p.ej., WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); Patentes EE.UU. Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (todas de GenPharm); Patente de los EE.UU. N° 5,545,807; WO 1997/17852; Patentes de los EE.UU. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995) ) . En la presente memoria descriptiva, los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente los anticuerpos "quiméricos" en los cuales una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de una especie en particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. N° 4.816.567 y Morrison et al . , Proc. Na ti . Acad. Scí . USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente memoria descriptiva incluyen los anticuerpos "primatizados", que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominios variables obtenidas de un primate no humano (por ejemplo, el mono del Viejo Mundo, el simio, etc.) y secuencias humanas de regiones constantes, así como anticuerpos "humanizados". Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en que los residuos de una región hipervariable del receptor son sustituidos por los residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) , como el ratón, la rata, el conejo o los primates no humanos, que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por sus correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentren en el anticuerpo receptor o donante. Estas modificaciones se llevan a cabo para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los dominios variables (o al menos uno, y típicamente dos) en que todos, o sustancialmente todos, los bucles hipervariables correspondan a los de una inmunoglobulina no humana y todas, o sustancialmente todas, las FR sean las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente humana. Para más detalles, véase Jones et al . , Na ture, 321:522-525 (1986), Riechmann et al . , Na ture, 332:323-329 (1988) y Presta, Curr . Op . Struct . Biol . , 2:593-596 (1992). Los anticuerpos contra HER2 humanizados incluyen el huMAb4D5-l, el huMAb4D5-2, el huMAb4D5-3, el huMAb4D5-4, el huMAb4D5-5, el huMAb4D5-6, el huMAb4D5-7 y el huMAb4D5-8 o trastuzumab (HERCEPTIN7 ) , tal como se describe en la tabla 3 de la patente de EE.UU. 5.821.337 expresamente incorporada en la presente memoria descriptiva por referencia, así como los anticuerpos humanizados 520C9 (documento W093/21319) y 2C4 como pertuzumab, tal como se describe en la presente memoria descriptiva . Para el objetivo de esta memoria descriptiva, "trastuzumab," "HERCEPTIN7, " y "huMAb4D5-8" se refieren a un anticuerpo que incluye las secuencias de cadena de aminoácidos ligeras y pesadas en SEQ ID Nos. 15 y 16, respectivamente. En la presente memoria descriptiva, "trastuzumab", y "OMNITARGJ" se refieren a un anticuerpo que incluye las secuencias de cadena de aminoácidos ligeras y pesadas en SEQ ID Nos. 13 y 14, respectivamente. Las diferencias entre las funciones del trastuzumab y las del pertuzumab se ilustran en la figura 6. En la presente memoria descriptiva, un "anticuerpo intacto" es aquél que comprende dos regiones de unión a antígeno y una región Fc . El anticuerpo intacto tiene preferentemente una región Fc funcional. Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que preferentemente comprende la región de unión a antígeno del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos serían los fragmentos Fab, Fab ' , F(ab')2 y Fv, los diacuerpos, los anticuerpos lineales, las moléculas anticuerpos de cadena única y los anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Los "anticuerpos nativos" son por lo general glicoproteínas heterotetraméricas con una masa atómica de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se enlaza a una pesada mediante un enlace covalente disulfuro, mientras que la cantidad de enlaces disulfuro varia entre las cadenas pesadas con distintos isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro separados regularmente dentro de la cadena. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de una cantidad de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) en un extremo y uno constante en el otro. El dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que ciertos residuos particulares de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y la pesada. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en sus secuencias de un anticuerpo a otro, y se utilizan para la unión y especificidad de cada anticuerpo en particular con relación a su antigeno particular. De todos modos, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos; se concentra en tres segmentos, denominados regiones hipervariables, de los dominios variables tanto de la cadena ligera como la pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se llaman regiones de estructura (FRs). Cada dominio variable de las cadenas pesada y ligera nativas comprende cuatro FRs que, en gran parte, adoptan una configuración de hoja-ß. Dichas FRs están conectadas por tres regiones hipervariables que crean bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de la hoja-ß. Las FRs mantienen unidas y en estrecha proximidad las regiones hipervariables de cada cadena, las cuales, junto con las de las otras, contribuyen a la formación del punto de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al . , Seguences of Proteins of Immunological In teres t, 5a edición, Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de la Salud, Bethesda, MD. (1991)) Los dominios constantes no participan directamente en el proceso de unión al antigeno de un anticuerpo, pero desarrollan diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) . El término "región hipervariable", en el contexto de la presente memoria descriptiva, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo responsables de la unión antígena.

La región hipervariable generalmente comprende residuos de aminoácidos de una "región de determinación de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, los residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) del dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (Hl), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) del dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological In terest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) del dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) del dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol . Biol . , 196:901-917 (1987)). Los residuos de una "región estructural" o "FR" son aquellos residuos de un dominio variable distintos de los de una región hipervariable, tal como se define en la presente memoria descriptiva. La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno de los cuales tiene un solo punto de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos puntos de unión a antígeno y todavía es capaz de establecer un enlace cruzado con el antigeno.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un punto completo de reconocimiento y unión a antígeno. Esta región está compuesta por un dímero de un domino variable de cadena pesada y otro de cadena ligera en una estrecha asociación no covalente. En esta configuración, las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un punto de unión a antigeno en la superficie del dimero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren al anticuerpo una especificidad de unión a antígeno. No obstante, incluso un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprenda únicamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer un antígeno y unirse a él, aunque con una afinidad inferior que el punto de unión completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CHl) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab= se diferencian de los Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de un anticuerpo. Fab'-SH es la designación que se da en la presente memoria descriptiva a los Fab' en que el (los) residuo (s) de cisteína de los dominios constantes presenta (n) al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 de anticuerpos se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' con cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros emparejamientos químicos de fragmentos de anticuerpos. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (K) y lambda (?) , sobre la base de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. En la presente memoria descriptiva se utiliza el término "región Fc" para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluidas regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variante. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de una cadena pesada IgG humana se suele definir como que se extiende a partir de un residuo aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el terminal carboxilo del mismo. La lisina terminal C (residuo 447 según el sistema de numeración de EU) de la región Fc puede ser eliminada, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo, o recombinando el ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Del mismo modo, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos K447 eliminados, poblaciones de anticuerpos sin residuos K447 eliminados, y poblaciones de anticuerpos con una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447.

A no ser que se indique lo contrario, en la presente memoria descriptiva la numeración de los residuos en una cadena pesada de inmunoglobina es la del índice de EU tal como se describe en Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), expresamente incorporada a la presente memoria como referencia. El "índice de EU como en Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo humano IgGl EU. Una "región Fc funcional" tiene una "función efectora" de una región Fc de secuencia nativa. Algunos ejemplos de "funciones efectoras" incluyen unión Ciq; citotoxicidad dependiente del complemento; unión de receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiene de los anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación a la baja de receptores de superficie celular (por ej . receptor celular B; BCR), etc. Estas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ej . un dominio variable de anticuerpos) y se puede evaluar utilizando varios ensayos, tal y como se describe en esta memoria descriptiva, por ejemplo. Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácido idéntica a la secuencia de aminoácido de una región Fc que se puede encontrar en la naturaleza. Las regiones Fc humanas con secuencia nativa incluyen una región Fc IgGl humana con secuencia nativa (alotipos A y no A) ; región Fc IgG2 humana con secuencia nativa; región Fc IgG3 humana con secuencia nativa; y región Fc IgG4 humana con secuencia nativa, así como las variantes de las mismas que aparecen naturalmente. Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una secuencia de una región Fc nativa en al menos una modificación de aminoácidos, preferiblemente una sustitución de aminoácidos o más. Preferiblemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos comparando con una región Fc de secuencia nativa o a la región Fc de un polipéptido principal, por ej . entre una y diez sustituciones de aminoácidos, y preferiblemente entre una y cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido principal. La región Fc variante de la presente memoria descriptiva tendrá al menos un nivel de homología del 80% con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido principal, y preferiblemente al menos un nivel del 90% de homología con ella, y aún mejor si la homología con ella tiene un nivel de al menos el 95% . Según la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden asignarse a distintas "clases". Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden seguir dividiéndose en "subclases" (isotipos) , por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las distintas clases de anticuerpos se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las distintas clases de inmunoglobulinas son muy conocidas. "La citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuerpos y las siglas "ADCC" se refieren a una reacción con mediación celular en la cual las células citotóxicas no especificas que expresan receptores de Fc (FcRs) (por ejemplo, las células asesinas naturales (NK) , los neutrófilos y los macrófagos) reconocen el anticuerpo unido a una célula diana y posteriormente producen la lisis de la misma. Las principales células que median en la ADCC, las células NK, sólo expresan FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión del FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Immunol , 9:457-92 (1991). A fin de evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vi tro, como el que se describe en las patentes de EE.UU. núms. 5.500.362 ó 5.821.337. Entre las células efectoras útiles para estos ensayos se encontrarían las células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) y las asesinas naturales (NK) . Como alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar en vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el que se desvela en Clynes et al . , PNAS (EE . UU. ) 95:652-656 (1998). Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos el FcyRIII y realizan la función efectora de ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC serían las células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC), las células asesinas naturales (NK) , los monocitos, las células T citotóxicas y los neutrófilos, siendo las PBMC y las NK las células preferentes. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa de las mismas, por ejemplo, la sangre o las PBMC tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Los términos "receptor de Fc" o AFcR" se emplean para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferente es un FcR humano con secuencia nativa. Además, un FcR preferente es aquél que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gama) y pertenece a las subclases de receptores Fc?RI, FcyRII y Fcy RUI, incluyendo las variantes alélicas y las formas enlazadas alternativamente de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen el FcyRIIA (un "receptor activador") y el FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), los cuales tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos. El receptor activador FcyRIIA contiene en su dominio citoplásmico un motivo activador inmunorreceptor basado en la tirosina (ITAM). El receptor inhibidor FcyRIIB contiene en su dominio citoplásmico un motivo inhibidor inmunorreceptor basado en la tirosina (ITIM) (véase una reseña al respecto en Daéron, Annu . Rev. Inmuno 1 . , 15:203-234 (1997)). En Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Immunol , 9:457-92 (1991), Capel et al . , Immunomethods, 4:25-34 (1994) y de Haas et al . , J. Lab. Clin . Med. , 126:330-41 (1995) también se revisan los FcRs. Otros FcRs, incluyendo aquellos que se identifiquen en el futuro, se engloban bajo el término "FcR" empleado en la presente memoria descriptiva. Este término también incluye el receptor neonatal, FcRn, responsable de la transferencia de los IgGs maternos al feto (Guyer et al . , J. Immunol . , 117:587 (1976) y Kim et al . , J. Immunol . , 24:249 (1994)), y regula la homeostasis de las inmunoglobulinas . La "citoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula de producir la lisis de una sustancia objetivo en presencia del complemento. La ruta de activación del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del complemento (Ciq) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) que forme complejo con un antígeno cognado. A fin de evaluar la activación del complemento, se puede efectuar un ensayo de CDC, por ejemplo, tal como se describe en Gazzano-Santoro et al . , J. Immunol . Methods, 202:163 (1996). Los fragmentos "Fv de cadena simple" o "scFv" de un anticuerpo comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo presentes en una cadena simple de polipéptidos. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende también un enlazador de polipéptidos entre los dominios VH y V que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión antigena.

Para una reseña sobre los scFv, véase Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, volumen 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, páginas 269-315 (1994). 269-315 (1994). Los fragmentos scFv de los anticuerpos contra HER2 se describen en el documento W093/16185, la patente de EE.UU. N° 5.571.894 y la patente de EE.UU. N° 5.587.458. El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos puntos de unión a antígeno que comprenden un dominio variable pesado (VH) conectado a un dominio variable ligero (VL) en la misma cadena de polipéptidos (VH - VL) . Mediante el uso de un enlazador que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, estos dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos puntos de unión antigena. Los diacuerpos se describen con más detalle en, por ejemplo, la patente europea 404.097, el documento WO 93/11161 y Hollinger et al . , Proc. Na ti . Acad. Scí . USA, 90:6444-6448 (1993). Un "anticuerpo desnudo" es un anticuerpo que no se conjuga con una molécula heteróloga, como un segmento citotóxico o una etiqueta radiactiva. Un anticuerpo "aislado" es aquél que se ha identificado y separado, y/o recuperado, a partir de un componente de su entorno natural . Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir en el diagnóstico o los usos terapéuticos del anticuerpo, incluyendo enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos y no proteináceos. En las realizaciones preferentes, el anticuerpo se purificará (1) en más del 95% de su peso tal como se determina por el método de Lowry, y más preferentemente, en más del 99% de su peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia N terminal o interna de aminoácidos mediante un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta alcanzar la homogeneidad mediante SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras, empleando una tinción con azul de Coomassie o, preferentemente, plata. Los anticuerpos aislados incluyen el anticuerpo in si tu dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. De todas formas, normalmente, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación . Un anticuerpo con "maduración de afinidad" es aquél con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables del mismo que resultan en una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antigeno, en comparación con un anticuerpo padre que no posee dicha(s) alteración (es) . Los anticuerpos con maduración de afinidad preferentes tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares con el antigeno diana. Los anticuerpos con maduración de afinidad se producen mediante procedimientos bien conocidos en el sector. En Marks et al . , Bio/Technology, 10:779-783 (1992), se describe la maduración de afinidad a través de la eliminación de los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de la CDR y/o los residuos estructurales se describen en: Barbas et al . Proc Na t . Acad . Sci , EE . UU. 91:3809-3813 (1994); Schier et al . Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al . J. Im unol . 155:1994-2004 (1995); Jackson et al . , J. Immunol . 154 (7) : 3310-9 (1995); y Hawkins et al , J. Mol . Biol . 226:889-896 (1992) . En la presente memoria descriptiva, el término "anticuerpo principal de la especie" se refiere a la estructura de un anticuerpo en una composición que es la molécula de anticuerpo cuantitativamente predominante en la composición. En una realización, el anticuerpo principal de la especie es un anticuerpo contra HER2, como pueda ser un anticuerpo que se una al dominio II de HER2, un anticuerpo que inhiba la dimerización de HER con mayor eficacia que el trastuzumab y/o un anticuerpo que se una a un punto de unión heterodimérica de HER2. En la presente memoria descriptiva, la realización preferible del anticuerpo principal de la especie es uno que comprenda las secuencias aminoacídicas de variable ligera y pesada en Nos. 3 y 4, y más preferentemente que comprenda las secuencias aminoacídicas de cadena ligera y cadena pesada indicados en SEQ ID Nos. 13 y 14 (pertuzumab) . En la presente memoria descriptiva, un anticuerpo con "una variante de la secuencia de aminoácidos" es un anticuerpo con una secuencia de aminoácidos distinta a la de un anticuerpo principal de la especie. Normalmente, las variantes de las secuencias de aminoácidos poseerán al menos un nivel del 70% de homología con el anticuerpo principal de la especie y serán homologas de este preferentemente al menos en el 80%, aproximadamente, y aún más preferentemente al menos en el 90%, aproximadamente. Las variantes de las secuencias de aminoácidos poseen sustituciones, eliminaciones y/o adiciones en ciertas posiciones dentro de, o contiguas a, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo principal de la especie. En la presente memoria descriptiva, ejemplos de variantes de la secuencia de aminoácidos serian la variante acida (por ejemplo, la variante de un anticuerpo desamidado) , la variante básica, el anticuerpo con una extensión líder amino terminal (por ejemplo, VHS-) en una o dos cadenas ligeras del mismo, el anticuerpo con un residuo de lisina terminal-C en una o dos cadenas pesadas del mismo y las combinaciones de variantes de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y/o ligera. La variante de anticuerpo de particular interés en la presente memoria descriptiva es el anticuerpo que comprende una extensión líder amino terminal en una o dos cadenas ligeras del mismo y, opcionalmente, otras secuencias de aminoácidos y/o diferencias de glicosilación relativas al anticuerpo principal de la especie. En la presente memoria descriptiva, un anticuerpo con "variante de glicosilación" es aquel que tiene unidos uno o más residuos glucídicos y difiere de uno o más residuos glucídicos unidos al anticuerpo principal de la especie. Ejemplos de variantes de glicosilación serían en la presente memoria descriptiva el anticuerpo con una estructura de oligosacáridos Gl o G2, en lugar de la GO, unida a una región Fc del mismo, el anticuerpo con uno o dos residuos glucídicos unidos a una o dos cadenas ligeras del mismo, el anticuerpo sin glúcidos unidos a una o dos cadenas pesadas del mismo y las combinaciones de alteraciones de glicosilación. Si el anticuerpo tiene una región Fc, una estructura de oligosacáridos puede unirse a una o dos cadenas pesadas del anticuerpo, por ejemplo, en el residuo 299 (298 en la numeración europea de residuos). En el caso del pertuzumab, la GO era la estructura de oligosacáridos predominante, aunque también se encontraron en cantidades menores otras estructuras de oligosacáridos, como la GO-F, la G-1, la Man5, la Man6, la Gl-1, la Gl(l-6), la Gl(l-3) y la G2, en la composición del pertuzumab. A menos que se indique lo contrario, una Aestructura de oligosacáridos Gl" incluye en la presente memoria descriptiva las estructuras G-1, Gl-1, Gl(l-6) y Gl(l-3). En la presente memoria descriptiva, una "extensión líder amino terminal" se refiere a uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia lider amino terminal presentes en el extremo amino terminal de una o más cadenas pesadas o ligeras de un anticuerpo. Una extensión lider amino terminal comprende tres residuos de aminoácidos, VHS, presentes en una de las cadenas ligeras, o ambas, de la variante de un anticuerpo. Un anticuerpo "desamidado" es aquel en que uno o más residuos de asparragina del mismo han derivado, por ejemplo, en un ácido aspártico, una succinimida o un ácido isoaspártico.

Los términos "cáncer" y "canceroso" describen o se refieren al estado fisiológico de los mamíferos típicamente caracterizado por un crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer serían, entre otros, el carcinoma, el linfoma, el blastoma (incluyendo el meduloblastoma y el retinoblastoma), el sarcoma (incluyendo el liposarcoma y el sarcoma de células sinoviales), los tumores neuroendocrinos (incluyendo los tumores carcinoides, el gastrinoma y el cáncer de células isleta), el mesotelioma, el schwanoma (incluyendo el neuroma acústico) , el meningioma, el adenocarcinoma, el melanoma y la leucemia o tumores linfoides. Ejemplos más particulares de estas clases de cáncer serian el cáncer de células escamosas (por ejemplo, el cáncer de células escamosas epiteliales), el cáncer de pulmón (incluyendo el cáncer de células pulmonares pequeñas (SCLC) , el cáncer de células pulmonares no pequeñas (NSCLC) , el adenocarninoma pulmonar y el carcinoma pulmonar escamoso) , el cáncer de peritoneo, el cáncer hepatocelular, el cáncer gástrico o estomacal (incluyendo el cáncer gastrointestinal), el cáncer pancreático, el glioblastoma, el cáncer cervical, el cáncer de ovario, el cáncer de riñon, el cáncer de vejiga, el hematoma, el cáncer de mama (incluyendo el cáncer de mama metastásico) , el cáncer de colon, el cáncer rectal, el cáncer colorrectal, el carcinoma endometrial o uterino, el carcinoma de las glándulas salivares, el cáncer de higado o renal, el cáncer de próstata, el cáncer vulval, el cáncer de tiroides, el carcinoma hepático, el carcinoma anal, el carcinoma de pene, el cáncer testicular, el cáncer esofágico, los tumores del tracto biliar y el cáncer de cabeza y cuello. Un cáncer "avanzado" es aquel que se ha propagado más allá del lugar u órgano de origen, ya sea por invasión local o metástasis . Un cáncer "refractario" es aquel que progresa aunque al paciente de cáncer se le esté administrando un agente antitumoral, como un agente quimioterapéutico. Un ejemplo de cáncer refractario es el cáncer refractario al platino. Un cáncer "recurrente" es aquel que ha reaparecido, ya sea en su ubicación original o en otra, después de responder a la terapia inicial. En la presente memoria descriptiva, un "paciente" es un paciente humano. El paciente puede ser "paciente de cáncer," es decir, la persona que sufre o corre el riesgo de sufrir de uno o más síntomas de cáncer. En la presente memoria descriptiva, una "muestra de un tumor" es una muestra que se ha obtenido, o comprende células tumorales, del tumor de una paciente. En la presente memoria descriptiva, ejemplos de muestras de tumor serían, entre otras, las biopsias de tumores, las células tumorales en circulación, las proteínas del plasma en circulación, el fluido ascítico, los cultivos de células primarias o las líneas celulares obtenidas de tumores o con propiedades similares a las de un tumor, asi como las muestras de tumor conservadas, como las fijadas en formol, embebidas en parafina o congeladas. Una muestra de tumor "fijada" es aquella que se ha conservado histológicamente empleando un fijador. Una muestra de tumor "fijada en formol" es aquella que se ha conservado empleando formaldehido como fijador. Una muestra de tumor "embebida" es aquella que está rodeada por un medio firme y generalmente duro como la parafina, la cera, la celoidina o una resina. Embeber una muestra permite cortar secciones muy finas para examinarlas al microscopio o generar micromatrices tisulares (TMAs) . Una muestra de tumor "embebida en parafina" es aquella que está rodeada por una mezcla purificada de hidrocarburos sólidos obtenidos del petróleo. En la presente memoria descriptiva, una muestra de tumor "congelada" se refiere a una que está congelada, o se ha congelado . Un cáncer o muestra biológica que "muestra expresión, amplificación o activación de HER" es aquel que, en una prueba diagnóstica, expresa (o sobreexpresa) un receptor HER, ha amplificado gen HER y/o demuestra activación o fosforilación de un receptor HER de algún modo.

Un cáncer o muestra biológica que "muestra activación de HER" es aquella en la cual una prueba diagnóstica demuestra activación o fosforilación de un receptor HER. Esta activación puede determinarse directamente (por ejemplo, midiendo la fosforilación HER con ELISA) o indirectamente (por ej . , creando perfiles de expresión génica o detectando heterodímeros de HER, tal como se describe en la presente memoria descriptiva) . En la presente memoria descriptiva, "crear perfiles de expresión génica" se refiere a la evaluación de la expresión de uno o más genes como surrogados para determinar directamente la fosforilación de HER. En la presente memoria descriptiva, un "ensayo fosfo- ELISA" es aquel en el cual se evalúa la fosforilación de un receptor HER o más, especialmente HER2, en un ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) empleando un reagente, normalmente un anticuerpo, para detectar receptor de HER fosforilado, sustrato o molécula de señalización descendiente.

Preferiblemente, se utiliza un anticuerpo que detecta HER2 fosforilado. El ensayo se puede realizar en lisados celulares, preferiblemente procedentes de muestras biológicas frescas o congeladas . Una célula cancerosa con "sobreexpresión o amplificación de un receptor HER" es aquella que tiene unos niveles de proteínas o genes de los receptores HER significativamente superiores en comparación con una célula no cancerosa de la misma clase tisular. Dicha sobreexpresión puede estar causada por una amplificación génica o un aumento de la transcripción o de la traducción. La sobreexpresión o amplificación de un receptor HER puede determinarse en un ensayo de diagnóstico o prognosis evaluando el aumento de los niveles de proteínas HER presentes en la superficie de una célula (por ejemplo, mediante un ensayo inmunohistoquimico, IHC) . Como alternativa, o adicionalmente, se pueden medir los niveles del ácido nucleico que codifica la HER en la célula, por ejemplo, a través de la hibridación in si tu con fluorescencia (FISH, véase el documento W098/45479 publicado en octubre de 1998), el método de hibridación tipo Southern o las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , como la PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR cuantitativa). También se puede estudiar la sobreexpresión o amplificación del receptor HER midiendo el antigeno vertido (por ejemplo, del dominio extracelular de la HER) en un fluido biológico como el suero (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 4.933.294 concedida el 12 de junio de 1990, el documento WO91/05264 publicado el 18 de abril de 1991, la patente de EE.UU. N° 5.401.638 concedida el 28 de marzo de 1995 y Sias et al . , J. Immunol . Methods, 132: 73-80 (1990)). Aparte de los anteriores ensayos, el experto en la materia también dispone de diversos ensayos in vivo . Por ejemplo, se puede exponer células del cuerpo del paciente a un anticuerpo que este opcionalmente etiquetado con una etiqueta detectable, por ejemplo un isótopo radiactivo, y evaluar la unión del anticuerpo a dichas células, por ejemplo mediante la exploración externa por radiactividad o analizando una biopsia tomada de un paciente previamente expuesto al anticuerpo. En cambio, un cáncer que "no sobreexpresa o amplifica un receptor HER2" es aquel que no tiene unos niveles de proteínas o de genes de los receptores HER mayores que los normales en comparación con una célula no cancerosa de la misma clase tisular. Los anticuerpos que inhiben la dimerizacion de HER, como el pertuzumab, pueden utilizarse para tratar cáncer que no sobreexprese o amplifique el receptor HER2. En la presente memoria descriptiva, un "agente antitumoral" se refiere a un fármaco utilizado para tratar el cáncer. En la presente memoria descriptiva los ejemplos de agentes antitumorales incluyen, entre otros, agentes quimioterapeuticos, inhibidores de la dimepzación de HER, anticuerpos contra HER, anticuerpos dirigidos contra antigenos asociados al tumor, compuestos antihormonales, citoqumas, fármacos que actúan sobre el EGFR, agentes antiangiogénico, inhibidores de la tirosina quinasa, agentes y anticuerpos inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, anticuerpos que inducen apoptosis, inhibidores de la COX, inhibidores de la farnesil transferasa, anticuerpo que une la proteína antifetal CA 125, vacunas contra el HER2, inhibidores de Raf o ras, doxorrubicma liposomal, topotecan, taxano, inhibidores de la tirosma quinasa dual, TLK286, EMD-7200, pertuzumab, trastuzumab, erlotinib y bevacizumab. Un "agente antitumoral adecuado" es un fármaco que se utiliza para tratar cáncer que ha recibido la autorización de comercialización de una autoridad como la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) o un equivalente extranjero de la misma. Si se administra un inhibidor de la dimepzación de HER como "agente antitumoral único", es el único agente antitumoral que se administra para tratar el cáncer, es decir, que no se administra en combinación con otro agente antitumoral como quimioterapia. En la presente memoria descriptiva, el "cuidado estándar" se refiere al agente o agentes antitumoral (es) que se administran rutinariamente para tratar una determinada forma de cáncer. Por ejemplo, para el cáncer de ovario resistente al platino el cuidado estándar es topotecan o doxorrubicma liposomal . Un "agente inhibidor del crecimiento" se refiere, en el contexto de la presente memoria descriptiva, a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula cancerosa que exprese HER, tanto in vi tro como en vivo . Así, el agente inhibidor del crecimiento puede reducir significativamente el porcentaje de células que expresen HER en la fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento serian los agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un punto distinto de la fase S) , como los agentes que inducen la detención de la Gl y la fase M. Entre los bloqueadores clásicos de la fase M se incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), los taxanos y los inhibidores de la topo II como la doxorrubicina, la epirrubicina, la daunorrubicina, el etopósido y la bleomicina. Esos agentes que detienen la Gl también se desbordan en la detención de la fase S, por ejemplo, los agentes de alquilación del ADN como el tamoxifeno, la prednisona, la dacarbacina, la mecloretamina, el cisplatino, el metotrexato, el 5-fluorouracilo y la ara-C. Puede encontrarse más información al respecto en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn and Israel, eds., capitulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" ["Regulación del anillo celular, oncogenes y fármacos antineoplásicos"] por Murakami et al . (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13. Ejemplos de anticuerpos "inhibidores del crecimiento" son aquellos que se unen a HER2 e inhiben el crecimiento de las células cancerosas con sobreexpresión de HER2. Los anticuerpos contra HER2 inhibidores del crecimiento preferentes inhiben el crecimiento de las células SK-BR-3 del tumor de mama en cultivo en un porcentaje superior al 20%, y preferentemente superior al 50% (por ejemplo, entre el 50% y el 100%) en una concentración de anticuerpos de entre 0,5 y 30 µg/ml, en que la inhibición del crecimiento se determina seis días después de la exposición de las células SK-BR-3 al anticuerpo (véase la patente de EE.UU. N° 5.677.171 concedida el 14 de octubre de 1997). El ensayo de inhibición del crecimiento de las células SK-BR-3 se describe con mayor detalle en esa patente y seguidamente en la presente memoria descriptiva. El anticuerpo de inhibición del crecimiento preferente es una variante humanizada del anticuerpo monoclonal murino 4D5, por ejemplo, el trastuzumab.

Un anticuerpo que "induce la apoptosis" es aquel que induce la muerte celular programada tal como se determina mediante la unión de anexina V, la fragmentación del ADN, la contracción de las células, la dilatación del retículo endoplásmico, la fragmentación celular y/o la formación de vesículas en la membrana (llamadas cuerpos apoptóticos) . La célula es una que normalmente sobreexpresa el receptor HER2. Preferentemente, la célula es una célula tumoral, por ejemplo, una célula del seno, del ovario, del estómago, del endometrio, de la glándula salivar, del pulmón, del hígado, del colon, del tiroides, el páncreas o de la vejiga. In vi tro, la célula puede ser una célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SK0V3. Existen diversos procedimientos para evaluar los sucesos celulares asociados a la apoptosis. Por ejemplo, la translocación de la fosfatidil serina (PS) puede medirse mediante la unión de anexina, la fragmentación del ADN puede evaluarse a través de su escalonamiento y la condensación nuclear/de la cromatina que se produce junto con la fragmentación del ADN puede evaluarse por cualquier aumento de las células hipodiploides . Preferentemente, el anticuerpo que induce la apoptosis es aquel que desarrolla un nivel de inducción de la unión de anexina superior entre 2 y 50 veces, preferentemente entre 5 y 50 veces, y más preferentemente entre 10 y 50 veces, en comparación con las células no tratadas en un ensayo de unión de anexina realizado con células BT474 (véase a continuación) . Ejemplos de anticuerpos contra el HER2 que inducen la apoptosis son el 7C2 y el 7F3. El "epitopo 2C4" es la región del dominio extracelular de HER2 a la cual se une el anticuerpo 2C4. A fin de examinar los anticuerpos que se unen al epitopo 2C4, se puede llevar a cabo un ensayo rutinario de bloqueo cruzado como el descrito en Antibodies , A Labora tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988). Preferentemente, el anticuerpo bloquea la unión del 2C4 al HER2 en el 50% o más. Como alternativa, puede efectuarse un mapeo de epítopos para evaluar si el anticuerpo se une al epítopo 2C4 de HER2. El epítopo 2C4 comprende los residuos del dominio II del dominio extracelular del HER2. El 2C4 y el pertuzumab se unen al dominio extracelular de HER2 en el enlace de los dominios I, II y III. Frankiin et al . Cáncer Cell 5:317-328 (2004). El "epitopo 4D5" es la región del dominio extracelular de HER2 a la cual se unen el anticuerpo 4D5 (ATCC CRL 10463) y el trastuzumab. Este epítopo se encuentra cerca del dominio transmembrana de HER2 y dentro de su dominio IV. A fin de examinar los anticuerpos que se unen al epitopo 4D5, se puede llevar a cabo un ensayo rutinario de bloqueo cruzado como el descrito en An tibodies , A Labora tory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988) . Como alternativa, puede efectuarse un mapeo de epitopos para evaluar si el anticuerpo se une al epitopo 4D5 de HER2 (por ejemplo, uno o más residuos de la región que va, aproximadamente, del residuo 529 al 625, inclusive, del HER2 ECD; la numeración de residuos incluye el péptido de señal) . El "epitopo 7C2/7F3" es la región N terminal, dentro del dominio I, del dominio extracelular de HER2 a la cual se unen los anticuerpos 7C2 y/o 7F3 (cada uno de ellos depositado en la ATCC, véase más adelante) . A fin de examinar los anticuerpos que se unen al epitopo 7C2/7F3, se puede llevar a cabo un ensayo rutinario de bloqueo cruzado como el descrito en Antibodies , A Labora tory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988). Como alternativa, puede efectuarse un mapeo de epítopos para establecer si el anticuerpo se une al epitopo 7C2/7F3 del HER2 (por ejemplo, uno o más residuos de la región que va, aproximadamente, del residuo 22 al 53 del HER2 ECD; la numeración de residuos incluye el péptido de señal). El "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Entre las personas que necesitan tratamiento se incluyen tanto aquellas que ya tienen cáncer asi como las que deben tomar medidas para prevenirlo. Por tanto, el paciente que se quiere tratar, en la presente memoria descriptiva, puede haber recibido el diagnóstico de que tiene cáncer o estar predispuesto o ser susceptible a la enfermedad. El término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar el cáncer del paciente. La cantidad eficaz del fármaco puede reducir la población de células cancerosas o el tamaño del tumor, inhibir (es decir, aminorar hasta cierto grado y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos, la metástasis tumoral y, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados al cáncer. Con relación a su capacidad para evitar el crecimiento y/o eliminar las células cancerosas existentes, el fármaco puede ser citostático y/o citotóxico. La cantidad eficaz puede ampliar el grado de supervivencia sin progresión (por ejemplo, tal como lo miden los Criterios de evaluación de la respuesta de tumores sólidos (RECIST) o los cambios CA-125), resultar en una respuesta objetiva (incluyendo una respuesta parcial, PR, o completa, CR) , aumentar el tiempo de supervivencia general y/o mejorar uno o más de los síntomas del cáncer (por ejemplo, tal como evalúa FOSI). El término "agente citotóxico", en el contexto de la presente memoria descriptiva, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o causa su destrucción. El término pretende incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 y los isótopos radiactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos y toxinas como las de molécula pequeña o las enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo los fragmentos y/o las variantes de las mismas. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos serian los agentes de alquilación como la tiotepa y la ciclofosfamida CYTOXAN®, los sulfonatos de alquilo como el busulfán, el improsulfán y el piposulfán, las aziridinas como la benzodopa, la carboquona, la meturedopa y la uredopa, las etiloniminas y metilamelaminas incluyendo la altretamina, la trietilenomelamina, la trietilenofosforamida, la trietilenotiofosforamida y la trimetilolomelamina, el TLK 286 (TELCYTAMR) , los acetogeninos (en especial, el bullatacin y la bullatacinona) , el delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®) , la beta-lapachona, el lapachol, las colchicinas, el ácido botulínico, una camptotecina (incluyendo el topotecán análogo sintético (HYCAMTIN®) , el CPT-ll (irinotecán, CAMPTOSAR®) , la acetilcamptotecina, la escopolectina y la 9-aminocamptotecina) , la briostatina, la callistatina, el CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adocelesina, carcelesina y bicelesina) , la podofilotoxina, el ácido podofilínico, la teniposida, las criptoficinas (particularmente la criptoficina 1 y la 8), la dolastatina, la duocarmicina (incluidos los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1), la eleuterobina, la pancratistatina, una sarcodictina, la espongistatina, los gases de nitrógeno como el clorambucil, la clornafacina, la colofosfamida, la estramustina, la ifosfamida, la mecloretamina, el clorhidrato de óxido de mecloretamina, el melfalán, la novembichina, la fenesterina, la prednimustina, la trofosfamida y la uramustina, las nitrosureas como la carmustina, la clorozotocina, la fotemustina, la lomustina, la nimustina y la ranimustina, los bisfosfonatos como el clodronato, los antibióticos como los de enedina (por ejemplo, la calicheamicina, especialmente la calicheamicina gamma II y la calicheamicina omega II (véase, por ejemplo, Agnew, Chem In tl . Ed. Engl . , 33: 183-186 (1994)) y las antraciclinas como la anamicina, la AD 32, la alcarrubicina, la daunorrubicina, el dexrazoxano, la DX-52-1, la epirrubicina, la GPX-100, la idarrubicina, la KRN5500, el menogaril, la dinemicina, incluyendo la dinemicina A, una esperamicina, el cromóforo de neocarcinostatina y los cromóforos antibióticos de enedina cromoproteína relacionados, las aclacinomisinas, la actinomicina, la autramicina, la azaserina, las bleomicinas, la cactinomicina, la carabicina, la carminomicina, la carcinofilina, las cromomicinas, la dactinomicina, la detorrubicina, la 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, la doxorrubicina ADRIAMYCIN® (incluidas la morfolino-doxorrubicina, la cianomorfolino-doxorrubicina, la 2-pirrolino-doxorrubicina, la doxorrubicina liposomal y la desoxidoxorrubicina) , la esorrubicina, la marcelomicina, las mitomicinas como la mitomicina C, el ácido micofenólico, la nogalamicina, las olivomicinas, la peplomicina, la potfiromicina, la puromicina, la quelamicina, la rodorrubicina, la estreptonigrina, la estreptozocina, la tubercidina, el ubenimex, la cinostatina y la zorrubicina, los análogos del ácido fólico como la denopterina, la pteropterina y el trimetrexato, los análogos de la purina como la fludarabina, la 6-mercaptopurina, la tiamiprina y la tioguanina, los análogos de la pirimidina como la ancitabina, la azacitidina, la 6-azauridina, el carmofur, la citarabina, la didesoxiuridina, la doxifluridina, la enocitabina y la floxuridina, los andrógenos como la calusterona, el propionato de dromostanolona, el epitiostanol, el mepitiostano y la testolactona, los antiadrenales como la aminoglutetimida, el mitotano y el trilostano, un reabastecedor del ácido fólico como el ácido folínico (leucovorina) , la aceglatona, agentes antineoplásicos antifolatos como el ALIMTA®, el LY231514 pemetrexed, los inhibidores de la reductasa dihidrofolato como el metotrexato, los antimetabolitos como el 5-fluorouracilo (5-FU) y sus profármacos como el UFT, el S-1 y la capecitabina, y los inhibidores del timidilato sintasa y la glicinamida ribonucleótida formiltransferasa como el raltitrexed (TOMUDEX", TDX) , los inhibidores de la dihidropirimidina deshidrogenasa como el eniluracilo, el glucósido aldofosfamida, el ácido aminolevulínico, la amsacrina, el bestrabucil, el bisantreno, el edatraxato, la defofamina, la demecolcina, la diaziquona, la elfornitina, el acetato de eliptinio, una epotilona, el etoglúcido, el nitrato de galio, la hidroxiurea, el lentinán, la lonidainina, los maitansinoides como la maitansina y las ansamitocinas, la mitoguazona, la mitoxantrona, el mopidanmol, la nitraerina, el pentostatin, el fenamet, la pirarrubicina, la losoxantrona, la 2-etilhidracida, la procarbacina, el complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) , el razoxano, la rizoxina, el sizofirán, el espirogermanio, el ácido tenuazónico, la triaciquona, la 2,2',2"-triclorotrietilamina, los tricotecenos (especialmente la toxina T-2, el verracurín A, el roridín A y la anguidina) , el uretano, la vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) , la dacarbacina, la manomustina, el mitobronitol, el mitolactol, el pipobromán, la gacitosina, la arabinosida ("Ara-C"), la ciclofosfamida, la tiotepa, los taxoides y los taxanos, por ejemplo, el TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), el ABRAXANE™ sin cremofor, la formulación de nanoparticulas de paclitaxel mediante ingeniería de albúmina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) y el TAXOTERE® docetaxel (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia) , el clorambucil, la gemcitabina (GEMZAR®), la 6-tioguanina, la mercaptopurina, el platino, los análogos de platino o los análogos basados en platino como el cisplatino, el oxaliplatino y el carboplatino, la vinblastina (VELBAN®) , el etopósido (VP-16) , la ifosfamida, la mitoxantrona, la vincristina (ONCOVIN®) , el alcaloide de la vinca, la vinorrelbina (NAVELBINE®) , la novantrona, el edatrexato, la daunomicina, la aminopterina, la xeioda, el ibandronato, el inhibidor RFS 2000 de la topoisomerasa, la difluorometilornitina (DMFO), los retinoides como el ácido retinoico, las sales, los ácidos o los derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias anteriores, así como las combinaciones de una o más de las sustancias anteriores como la CHOP, la abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona, y el FOLFOX, la abreviatura de un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina. En esta definición también se incluyen los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en los tumores como los antiestrógenos y los moduladores selectivos de receptores de estrógenos (SERMs), incluyendo, por ejemplo, el tamoxifeno (incluido el tamoxifeno NOLVADEX®) , el raloxifeno, el droloxifeno, el 4-hidroxitamoxifeno, el trioxifeno, el keoxifeno, el LY117018, la onapristona y el toremifeno FARESTON®, los inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, encargada de regular la producción de estrógenos en las glándulas adrenales, como, por ejemplo, los 4 (5 ) -imidazoles, la aminoglutetimida, el acetato de megestrol MEGASE®, el exemestano AROMASIN®, la formestania, la fadrozola, la vorozola RIVISOR®, la letrozola FEMARA® y la anastrozola ARIMIDEX®, y antiandrógenos como la flutamida, la nilutamida, la bicalutamida, la leuprolida y la goserelina, asi como la troxacitabina (un análogo del nucleósido citosinal, 3-dioxolano) , los oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión génica en rutas de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, como, por ejemplo, el PKC-alfa, el Raf, el H-Ras y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) , las vacunas para terapias génicas como, por ejemplo, la ALLOVECTIN®, la LEUVECTIN® y la VAXID®, el PROLEUKIN® rIL-2, el inhibidor LURTOTECAN® de la topoisomerasa 1, el ABARELIX® r RH y las sales, los ácidos o los derivados de cualquiera de las sustancias anteriores que sean aceptables para un uso farmacéutico. Un "agente quimioterapéutico antimetabolito" es aquel estructuralmente similar a un metabolito pero que el cuerpo no puede utilizar de forma productiva. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos antimetabolito serían la gemcitabina (GEMZAR®), el 5-fluorouracilo (5-FU), la capecitabina (XELODA™) , la 6-mercaptopurina, el metotrexato, la 6-tioguanina, el pemetrexed, el raltitrexed, la arabinosilcitosina ARA-C, la citarabina (CYTOSAR-U®) , la dacarbacina (DTIC-DOME®) , la azocitosina, la desoxicitosina, la piridmidena, la fludarabina (FLUDARA®), la cladrabina, la 2-desoxi-D-glucosa etc. "La "gemcitabina" o "monoclorhidrato de 2 ' -desoxi-2 ' , 2 ' -difluorocitidina (isómero-b)" es un nucleósido análogo que exhibe actividad antitumoral. La fórmula empírica de la gemcitabina HCl es C9H11F2N304 A HCl. Eli Lilly comercializa la gemcitabina HCl bajo la marca comercial GEMZAR®. Un "agente quimioterapéutico basado en el platino" comprende un compuesto orgánico que contiene platino como parte integral de la molécula. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos basados en el platino serían el carboplatino, el cisplatino y el oxaliplatino . Por "quimioterapia basada en el platino" se entiende una terapia con uno o más agentes quimioterapéuticos basados en el platino, opcionalmente en combinación con uno o más agentes terapéuticos de otras clases. Un cáncer "resistente a la quimioterapia" significa que el cáncer del paciente ha progresado durante el tiempo que ha recibido un régimen de quimioterapia basada (es decir, el paciente es "refractario a la quimioterapia") o dentro de un período de 12 meses (por ejemplo, al cabo de seis meses) tras completar el régimen de quimioterapia. Un cáncer "resistente al platino" significa que el cáncer del paciente ha progresado durante el tiempo que ha recibido quimioterapia basada en el platino (es decir, el paciente es "refractario al platino") o dentro de un período de 12 meses (por ejemplo, al cabo de seis meses) tras completar el régimen de quimioterapia basada en el platino. Un "agente antiangiogénico" se refiere a un compuesto que bloquea el desarrollo de los vasos sanguíneos o, en cierta medida, interfiere en el mismo. El factor antiangiogénico puede ser, por ejemplo, una pequeña molécula o anticuerpo que se une a un factor de crecimiento o un receptor del factor de crecimiento involucrado en la promoción de la angiogénesis. El factor antiangiogénico preferente en la presente memoria descriptiva es un anticuerpo que se una al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , como el bevacizumab (AVASTIN®) . El término "citoquina" es un término genérico para aquellas proteínas, liberadas por una población de células, que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citoquinas son las linfoquinas, las monoquinas y las hormonas polipeptídicas tradicionales. Las citoquinas también incluyen hormonas del crecimiento como la hormona humana del crecimiento, la hormona humana del crecimiento N-metionilo y la hormona bovina del crecimiento, la hormona paratiroidea, la tiroxina, la insulina, la proinsulina, la relaxina, la prorrelaxina, las hormonas glicoproteicas como la hormona estimuladora del folículo (FSH) , la hormona estimuladora del tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH) , el factor de crecimiento hepático, el factor de crecimiento fíbroblastico, la prolactma, el lactógeno placentario, los factores a y ß de necrosis tumoral, las sustancias de inhibición mulleriana, los peptidos asociados a la gonadotropina de los ratones, la mhibma, la activina, el factor de crecimiento endotelial vascular, la mtegrina, la trombopoyetina (TPO) , los factores de crecimiento nervioso como el NGF-ß, el factor de crecimiento plaquetario, los factores de crecimiento tumoral (TGFs) como el TGF-a y el TGF-ß, los factores -I y -II de crecimiento similar a la insulina, la eptropoyetina (EPO) , los factores osteomductivos, los interferones como el mterferon-a, -ß y -?, los factores de estimulación colonial (CSFs) como el CSF macrófago (M-CSF), el CSF granulocito macrófago (GM-CSF) y el CSF granulocito (G-CSF), las interleuquinas (ILs) como la IL-1, la IL-la, la IL-2, la IL-3, la IL-4, la IL-5, la IL-6, la IL-7, la IL-8, la IL-9, la IL-10, la IL-11 y la IL-12, un factor de necrosis tumoral como el TNF-a o el TNF-ß y otros factores polipéptidos incluyendo el LIF y el ligando de kit (KL) . En la presente memoria descriptiva, el término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o cultivos celulares recombinantes y equivalentes biológicamente activos de citoquinas de secuencia nativa . En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término "fármaco que actúa sobre el EGFR" se refiere a un agente terapéutico que se une al EGFR y, opcionalmente, inhibe su activación. Ejemplos de estos agentes serian los anticuerpos y las pequeñas moléculas que se unen al EGFR. Ejemplos de anticuerpos que se unen al EGFR serian los anticuerpos MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (véase la patente de EE.UU. N° 4.943 533, Mendelsohn et al . ) , así como variantes de los mismos, como el 225 quimerizado (225q o Cetuximab; ERBUTIX®) y el 225 humano reorganizado (225h) (véase el documento WO 96/40210, Imclone Systems Inc.), IMC-11F8, un anticuerpo totalmente humano que actúa sobre el EGFR (Imclone), los anticuerpos que se unen al EGFR mutante de clase II (patente de EE.UU. N° 5.212.290), los anticuerpos humanizados y quiméricos que se unen al EGFR, tal como se describe en la patente de EE.UU. N° 5.891.996, y los anticuerpos humanos que se unen al EGFR, como el ABX-EGF (véase el documento WO98/50433, Abgenix) , el EMD 55900 (Stragliotto et al . , Eur . J. Cáncer, 32A: 636-640 (1996)); EMD7200 (matuzumab), un anticuerpo humanizado contra EGFR dirigido contra EGFR que compite tanto con EGF como con TGF-alfa por unirse a EGFR; y el mAb 806 o el mAb 806 humanizado (Johns et al . , J. Biol . Chem . , 279(29) :30375-30384 (2004)). El anticuerpo contra el EGFR puede conjugarse con un agente citotóxico, generando de este modo un inmunoconjugado (véase, por ejemplo, la patente europea 659.439A2, Merck Patent GmbH). Ejemplos de pequeñas moléculas que se unen al EGFR serían la ZD1839 o Gefitinib (IRESSAJ; Astra Zeneca), la CP-358774 o Erlotinib HCL (TARCEVAJ; Genentech/OSI) y la AG1478 y la AG1571 (SU 5271; Sugen); EMD-7200. Un "inhibidor de la tirosina quinasa" es una molécula que inhibe la actividad de una tirosina quinasa como pueda ser un receptor HER. Ejemplos de estos inhibidores serian los fármacos que actúan sobre el EGFR mencionados en el párrafo anterior, un inhibidor de la tirosina quinasa HER2 de pequeña molécula como el TAK165 comercializado por Takeda; CP-724,714, un inhibidor oral selectivo del receptor ErbB2 de la tirosina quinasa (Pfizer e OSI); los inhibidores dobles de HER como el EKB569 (comercializado por Wyeth) que preferentemente se unen al EGFR pero inhiben las células que sobreexpresan tanto HER2 como EGFR, el GW572016, un inhibidor oral de la tirosina quinasa HER2 y el EGFR (comercializado por Glaxo) , el PKI-166 (comercializado por Novartis); los paninhibidores de HER como el canertinib (CI-1033; Pharmacia) , los inhibidores de Raf-1 como el agente antisentido ISIS-5132, comercializado por ISIS Pharmaceuticals, que inhibe la señalización de Raf-1; los inhibidores de TK no dirigidos contra HER como el mesilato de imatinib (GleevacJ) comercializado por Glaxo; el inhibidor Cl- 1040 de la quinasa I regulada por la MAPK extracelular (comercializado por Pharmacia) ; las quinazolinas, como la quinazolina PD 153035, - (3-cloroanilino) , las piridopirimidinas, las pirimidopirimidinas, las pirrolopirimidinas, como la CGP 59326, la CGP 60261 y la CGP 62706, las pirazolopirimidinas, pirimidinas 4- (fenilamino) -7H-pirrolo [2, 3-d] , el curcumin (diferuloil metano, 4, 5-bis (4-fluoroanilino) ftalimida) ; las tirfostinas que contienen residuos de nitrotiofeno; el PD-0183805 (Warner-Lamber) ; las moléculas antisentido (por ejemplo, aquellas que se unen al ácido nucleico que codifica la HER) ; las quinoxalinas (patente de EE.UU. N° 5.804.396); las trifostinas (patente de EE.UU. N° 5.804.396); el ZD6474 (Astra Zeneca); el PTK-787 (Novartis/Schering AG) ; los paninhibidores de HER como el CI-1033 (Pfizer); el Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly) ; el mesilato de imatinib (Gleevac; Novartis); el PKI 166 (Novartis); el GW2016 (Glaxo SmithKline) ; el CI-1033 (Pfizer); el EKB-569 (Wyeth); el semaxinib (Sugen); el ZD6474 (AstraZeneca); el PTK-787 (Novartis/Schering AG) y el INC-1C11 (Imclone), o como se describa en cualquiera de las siguientes publicaciones de patentes: la patente de EE.UU. N° 5.804.396, el documento WO99/09016 (American Cyanimid) , el documento WO98/43960 (American Cyanamid), el documento W097/38983 (Warner Lambert), el documento WO99/06378 (Warner Lambert), el documento WO99/06396 (Warner Lambert), el documento WO96/30347 (Pfizer, Ine), el documento W096/33978 (Zeneca), el documento W096/3397 (Zeneca) y el documento WO96/33980 (Zeneca) . En la presente memoria descriptiva, una dosis "fija " representa una dosis que se administra a un paciente humano independientemente del peso (WT) o área de superficie corporal (BSA) del paciente. Por tanto, la dosis fija no se indica como dosis mg/kg o mg/m2, sino como una antidad absoluta del agente terapéutico. Una dosis "de carga" suele incluir una dosis inicial de un agente terapéutico administrado a un paciente, y va seguida de una o más dosis de mantenimiento del mismo. Generalmente se administra una única dosis de carga, pero en la presente memoria descriptiva se contemplan dosis de carga múltiples. En general, la cantidad de dosis de carga administrada (s) supera la cantidad de dosis de mantenimiento administrada (s) y/o la(s) dosis de carga se administra (n) más frecuentemente que la(s) dosis de mantenimiento, para alcanzar la estabilidad de concentración deseada del agente terapéutico antes de lo que se podria alcanzar con la(s) dosis de mantenimiento. En la presente memoria descriptiva una dosis de "mantenimiento" se refiere a una o más dosis de agente terapéutico administrada (s) al paciente a lo largo del periodo de tratamiento. Normalmente, las dosis de mantenimiento se administran en intervalos separados, como por ejemplo aproximadamente cada semana, aproximadamente cada 2 semanas, aproximadamente cada 3 semanas, o aproximadamente cada 4 semanas . II . Producción de anticuerpos Puesto que en la realización preferida el inhibidor de la dimerización de HER es un anticuerpo, a continuación viene una descripción de técnicas ejemplares para la producción de anticuerpos HER utilizados de conformidad con la presente invención. El antigeno HER que se utiliza para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular de un receptor de HER o una porción del mismo, que contenga el epítopo deseado. Alternativamente, las células que expresan HER en su superficie celular (por ejemplo, células NIH-3T3 transformadas para sobreexpresar HER2, o una línea celular de carcinoma como por ejemplo células SK-BR-3, consultar Stancovski et al . PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)) se pueden utilizar para generar anticuerpos. Otras formas del receptor HER útiles para generar anticuerpos serán aparentes para aquellos expertos en la materia, (i) Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales se producen preferentemente en animales mediante inyecciones subcutáneas (se) o intraperitonales (ip) del antigeno relevante y un adyuvante.

Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que sea inmunogénica en la especie que se está inmunizando, por ejemplo, hemocianina de Kehole Limpet (HKL) , albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de la tripsina de la soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12, o R1N=C=NR, en donde R y R1 son grupos alquílicos. Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados al combinar, por ejemplo, 100 µg o 5 µg de la proteina o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con tres volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectar la solución intradérmicamente en múltiples lugares. Un mes más tarde, los animales se refuerzan con entre 1/5 y 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples lugares. Entre siete y catorce días más tarde los animales se desangran y el suero se analiza para titular los anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta obtener los niveles adecuados de titulación. Preferentemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antigeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo reticulante diferente. Los conjugados también se pueden hacer en cultivos celulares recombinantes como fusiones proteicas. Asimismo, los agentes agregantes como el alumbre se utilizan para incrementar la respuesta inmune. (ii) Anticuerpos monoclonales En el sector existen varios métodos de creación de anticuerpos monoclonales de la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden crearse utilizando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohier et al . , Na ture, 256:495 (1975), mediante métodos de ADN recombinantes (Patente de los Estados Unidos N° 4.816.567). En el método del hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, como un hámster, se inmuniza como se describió anteriormente para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteina utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vi tro . Después, los linfocitos se fusionan con las células de mieloma utilizando un agente fusionante adecuado, como por ejemplo polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986) ) . Por lo tanto, las células de hibridoma preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contenga una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parental no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales no poseen la enzima hipoxantina-guanina-fosfombosil-transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas generalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , cuyas sustancias evitan el crecimiento de células con déficit de HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan altos niveles estables de producción de anticuerpos por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio como el medio HAT. Entre estas, las lineas celulares de mieloma preferidas son lineas de mieloma murino, como aquellas derivadas de los tumores de ratones MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles en el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Estados Unidos. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de raton-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); y Brodeur et al . , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applica tions, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

El medio de cultivo en el cual las células hib idoma crecen se analiza para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos directamente contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma está determinada por la inmunoprecipitación o por un ensayo de unión, como el radioinmunoensayo (RÍA) o ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) . La afinidad de unión de un anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis Scatchard de Munson et al . , Anal . Biochem . , 107:220 (1980). Después de identificar que las células de hibridoma producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilución y pueden crecer mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecer m vivo como tumores con ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan del medio de cultivo, fluidos ascíticos o suero mediante procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales, como por ejemplo, proteina-A-sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad. Se aisla el ADN que codifica los anticuerpos monoclonales y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que después se transfectan a células huésped como por ejemplo células E. coli, células COS de simios, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen el anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes . Los artículos de reseña sobre expresión recombinante en bacterias del ADN que codifican el anticuerpo incluyen Skerra et al . , Curr . Opinión m Immunol . , 5:256-262 (1993) y Pluckthun, Immunol . Revs . , 130:151-188 (1992). En otra forma de realización, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de librerías de fagos de anticuerpos generados mediante las técnicas descritas en McCafferty et al . , Na ture, 348:552-554 (1990). Clackson et al . , Na ture, 352:624-628 (1991) y Marks et al . , J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando librerías de fagos. Las publicaciones subsiguientes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) mediante combinación de cadenas (Marks et al . , Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), asi como una infección combinatoria y recombinación in vivo como estrategia para construir librerías de fagos muy grandes (Waterhouse et al . , Nuc . Acids . Res . , 21:2265-2266 (1993)). De este modo, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales . El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificación de los dominios constantes de la cadena pesada y cadena ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente de los Estados Unidos N° 4.816.567, y Morrison, et al . , Proc . Na ti Acad. Sci . USA, 81:6851 (1984)), o uniendo covalentemente todo o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido, que no sea inmunoglobulina, a la secuencia de codificación de la inmunoglobulina. Típicamente dichos polipéptidos que no son inmunoglobulinas se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación del antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprenda un sitio de combinación del antígeno con especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación del antigeno que tenga especificidad para otro antígeno diferente. (iii) An ticuerpos humanizados En el sector se han descrito métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Preferiblemente, a un anticuerpo humanizado se le introduce (n) uno o más residuos de aminoácidos de una fuente no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se conocen generalmente como residuos "importados" que generalmente se toman de un dominio variable de "importación".

La humanización se puede realizar esencialmente a través del método de Winter et al. (Jones et al . , Na ture, 321:522-525 (1986); Riechmann et al . , Na ture, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al . , Science, 239:1534-1536 (1988)), al sustituir las secuencias de la región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los Estados Unidos N° 4.816.567) en donde se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de especies no humanas. En la práctica, los anticuerpos humanizados son generalmente anticuerpos humanos en donde los residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos de anticuerpos de roedores . La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se utilizarán para realizar los anticuerpos humanizados es muy importante para disminuir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado método del "más apto", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de un roedor se compara con toda la librería conocida de secuencias de dominio variable de humanos. Se acepta la secuencia humana que sea más parecida a la de los roedores, entonces, como la región estructural humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al . , J. Immunol . , 151:2296 (1993); Chothia et al . , J. Mol . Biol . , 196:901 (1987)). Otro procedimiento utiliza una región estructural particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo en particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura se puede utilizar para diferentes anticuerpos humanizados (Cárter et al . , Proc. Na ti . Acad. Sci . USA, 89:4285 (1992); Presta et al . , J. Immunol . , 151:2623 (1993)). Es también importante que los anticuerpos se humanicen con retención de la afinidad alta para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con el procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales que utilizan modelos tridimensionales de las secuencias parentales y de las humanizadas. Generalmente se dispone de modelos de inmunoglobina tridimensional conocidos para las personas familiarizadas con el sector. Existen programas informáticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidata. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis de la función probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que tienen influencia en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias receptoras y de importación para lograr la característica deseada del anticuerpo, como por ejemplo una mayor afinidad por el/los antígeno(s). En general, los residuos de la región hipervariable están directamente y más sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión del antígeno. WO01/00245 describe ejemplos de la producción de anticuerpos HER2 humanizados que se unen a HER2 y bloquean la activación del ligando de un receptor HER. El anticuerpo humanizado que es de particular interés en la presente memoria descriptiva bloquea la activación mediada del EGF, TGF-a y/o HRG de la MAPK esencialmente de manera tan eficaz como el anticuerpo monoclonal murino 2C4 (o fragmento Fab alli) y/o une HER2 esencialmente de manera tan eficaz como el anticuerpo monoclonal murino 2C4 (o fragmento Fab alli) . El anticuerpo humanizado de la presente memoria descriptiva, por ejemplo, comprende residuos de la región hipervariable no humanos incorporados a un dominio pesado variable humano y además puede comprender una sustitución de la región estructural (FR) en una posición seleccionada del grupo compuesto por 69H, 71H y 73H que utiliza el sistema de numeración de dominio variable especificado en Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological In terest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) . En otra forma de realización, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones de FR en dos o todas las posiciones 69H, 71H y 73H. Un ejemplo de anticuerpo humanizado que es de interés en la presente memoria descriptiva comprende residuos determinantes de complementariedad del domino pesado variable GFTFTDYTMX, en donde X es preferentemente D o S (identificador de secuencia N° 7), DVNPNSGGSIYNQRFKG (identificador de secuencia N° 8); y/o NLGPSFYFDY (identificador de secuencia N° 9), que comprenden de manera opcional modificaciones de aminoácidos de aquellos residuos CDR, por ej . , en donde las modificaciones mantienen o mejoran esencialmente la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, la variante del anticuerpo de interés puede tener desde aproximadamente uno a aproximadamente siete o aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en las secuencias variables pesadas CDR anteriores. Dichas variantes de anticuerpos se pueden preparar por maduración de afinidad, por ej . , como se describe a continuación. El anticuerpo humanizado más preferido comprende la secuencia aminoacídica del dominio variable pesado con identificador de secuencia N° 4. El anticuerpo humanizado puede comprender residuos determinantes de complementariedad de dominio ligero variables KASQDVSIGVA (identificador de secuencia N° 10); SASYX1X2X3, en donde X1 es preferentemente R o L, X2 es preferentemente Y o E, y X3 es preferentemente T o S (identificador de secuencia N° 11); y/o QQYYIYPYT (identificador de secuencia N° 12), por ej . además de aquellos residuos CDR de dominio pesado variable del párrafo anterior. Dichos anticuerpos humanizados comprenden de manera opcional modificaciones de aminoácidos de los residuos CDR mencionados anteriormente, por ej . , en donde las modificaciones mantienen o mejoran esencialmente la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, la variante del anticuerpo de interés puede tener desde aproximadamente una a aproximadamente siete o aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en las secuencias CDR variables ligeras anteriores. Dichas variantes de anticuerpos se pueden preparar por maduración de afinidad, por ej . , como se describe a continuación. El anticuerpo humanizado más preferido comprende la secuencia aminoacídica del dominio variable ligero con identificador de secuencia N° 3. Esta solicitud también contempla los anticuerpos con afinidad madurada que se unen a HER2 y bloquean la activación del ligando de un receptor HER. El anticuerpo parental puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, por ej . uno que contenga las secuencias variable ligera y/o variante pesada de SEQ ID Nos. 3 y 4, respectivamente (es decir, que comprende el VL y/o VH de pertuzumab) . El anticuerpo con afinidad madurada preferentemente se une al receptor HER2 con una afinidad superior a aquella del 2C4 murino o pertuzumab (por ej . , con afinidad mejorada de aproximadamente dos o aproximadamente cuatro veces, a aproximadamente 100 veces o aproximadamente 1000 veces, por ej . , tal como se evalúa utilizando un dominio extracelular HER2 (ECD) ELISA) . Los ejemplos de residuos pesados variables CDR para sustitución incluyen H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99, o combinaciones de dos o más (por ej . dos, tres, cuatro, cinco, seis, o siete de estos residuos). Ejemplos de residuos ligeros variables CDR para alteración incluyen L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 o la combinación de dos o más (por ej . dos a tres, cuatro, cinco o hasta aproximadamente diez de estos residuos) . Se contemplan varias formas del anticuerpo humanizado o de anticuerpo con afinidad madurada. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado o el anticuerpo con afinidad madurada puede ser un fragmento de anticuerpo, como por ejemplo Fab, que se conjuga opcionalmente con uno o más agente (s) citotóxicos para generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado o el anticuerpo con afinidad madurada puede ser un anticuerpo intacto, como un anticuerpo intacto IgGl. El anticuerpo intacto IgGl preferido comprende la secuencia de cadena ligera con identificador de secuencia N° 13 y la secuencia de cadena pesada con identificador de secuencia N° 14. (ív) An ticuerpos humanos Como alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, actualmente es posible producir animales transgenicos (por ej . , ratones) capaces, una vez inmunizados, de producir un completo repertorio de anticuerpos humanos cuando no exista producción de ínmunoglobulma endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la cadena pesada del anticuerpo que se une a la región del gen (JH) en ratones quiméricos y en lineas germinales de ratones mutantes ocasiona la completa inhibición de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia del grupo de genes de la inmunoglobulina de la linea germinal humana en la linea germinal de dicho ratón mutante ocasionará la producción de anticuerpos humanos frente al antígeno presentado. Consultar, por ej . , Jakobovits et al . , Proc. Na ti . Acad. Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al . , Na ture, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al . , Year in Immuno . , 7:33 (1993); y Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,591,669, 5,589,369 y 5,545,807. Alternativamente, se puede utilizar la tecnología de presentación en fagos (McCafferty et al . , Na ture 348:552-553 (1990)) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vi tro, del repertorio de genes de dominios de inmunoglobulina variables (V) de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta tecnología, los genes de dominios V de anticuerpos se clonan en pauta de lectura con un gen proteico de revestimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, como el M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma fago, las selecciones que se basan en propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra esas propiedades. Por lo tanto, el fago imita alguna de las propiedades de la célula B. La presentación en fagos se puede realizar en una variedad de formatos, para su reseña consulte, por ej . , Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Se pueden utilizar varias fuentes de segmentos del gen V para la presentación en fagos. Clackson et al . , Na ture, 352:624-628 (1991) aislaron un conjunto de anticuerpos anti-oxazolona de una pequeña librería combinatorial de genes V aleatoria derivada de bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos contra un gran conjunto de antígenos (incluyendo autoantigenos) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks et al . , J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991), o Griffith et al . , EMBO J. 12:725-734 (1993). Véase también las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Tal y como se describe anteriormente, los anticuerpos humanos también se pueden generar mediante células B activadas in vi tro (Consultar patentes de los Estados Unidos 5.567.610 y 5.229.275) . Los anticuerpos humanos contra el HER2 se describen en la patente de los Estados Unidos núm. 5.772.997 concedida el 30 de junio de 1998 y WO 97/00271 publicada el 3 de enero de 1997. (v) Fragmen tos de anticuerpos Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos que comprendan una o más regiones de unión del antigeno. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ej . , Morimoto et al . , Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al . , Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente en células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las librerías de fagos descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH se puede recuperar directamente de E. coli y ser químicamente unidos para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al . , Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente desde cultivos de células huésped recombinantes. Otra técnica para la producción de fragmentos de anticuerpos será aparente para aquellos profesionales expertos. En otras formas de realización, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena simple (scFv) . Véase el documento WO 93/16185; la patente de los Estados Unidos N° 5.571.894; y la patente de los Estados Unidos N° 5.587.458. El fragmento de anticuerpo puede ser también un "anticuerpo lineal", por ej . , tal y como se describe en la patente de los Estados Unidos N° 5.641.870 por ejemplo. Dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. (vi) Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos epítopos diferentes.

Los anticuerpos biespecíficos ejemplares se pueden unir a dos epítopos diferentes de la proteína HER2. Otros anticuerpos de este tipo pueden combinar un punto de unión HER2 con un (os) punto (s) de unión para EGFR, HER3 y/o HER4. Alternativamente, un brazo HER2 se puede combinar con un grupo que se una a una molécula activadora en un leucocito como por ejemplo una molécula receptora de célula-T (por ej . CD2 o CD3), o receptores Fc para IgG (FcyR), como por ejemplo Fc?RI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) para centrar los mecanismos de defensa celulares en la célula que expresa HER2. Los anticuerpos biespecificos también se pueden utilizar para localizar agentes citotóxicos de las células que expresan HER2. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a HER2 y un brazo que se une al agente citotóxico (por ej . saporin, anti-interferón- a, alcaloide de la vinca, cadena A de ricino, metotrexato o hapteno con un isótopo radiactivo) . Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ej . anticuerpos biespecíficos F(ab')2).

WO 96/16673 describe un anticuerpo biespecífico HER2/Fc?RIII y la patente de los Estados Unidos NI 5.837.234 desvela un anticuerpo biespecifico contra HER2/Fc?RI IDM1 (Osidem) . Un anticuerpo biespecífico HER2/Fca se muestra en el documento WO98/02463. La patente de los Estados Unidos 5.821.337 muestra un anticuerpo biespecífico HER2/CD3.MDX-210 es un HER2-Fc?RIII Ab biespecifico. Los métodos para producción de anticuerpos biespecíficos son conocidos en el sector. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al . , Na ture, 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una posible mezcla de 10 moléculas diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecifica correcta. La purificación de la molécula correcta, que generalmente se realiza mediante etapas de cromatografia de afinidad, es bastante complicada y la producción de producto es baja. Se desvelan procedimientos similares en el documento WO 93/08829, y en Traunecker et al . , EMBO J. , 10:3655-3659 (1991).

De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (puntos de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan en las secuencias de domino constante de la inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Es preferible tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contengan el punto necesario para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, de cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan a un organismo huésped adecuado. Esto mantiene la gran flexibilidad al ajustar las proporciones mutuas de tres fragmentos polipéptidos en realizaciones en donde las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos utilizados en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación de dos o de las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión es de al menos de dos cadenas de polipéptidos en resultados con proporciones iguales en rendimientos altos o cuando las proporciones no tienen particular importancia.

En una realización preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecificos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina hibrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (proporcionando una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una de las mitades de la molécula biespecífica proporciona un método fácil de separación. Este enfoque se desveló en el documento WO 94/04690. Para obtener más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos consultar, por ejemplo, Suresh et al . , Methods in Enzymology, 121:210 (1986). De acuerdo con otro enfoque descrito en la patente de los Estados Unidos N° 5.731.168, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos se puede modificar para maximizar el porcentaje de heterodimeros que se recuperan de un cultivo celular recombinante. La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales cortas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula del anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más largas (por ej . tirosina o triptófano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena (s) lateral (es) larga (s) se crean en la interfaz de la segunda molécula del anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales largas de aminoácidos por cadenas más cortas (por ej . alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre los productos finales no deseados como los homodímeros. Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulantes o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede unir a la avidina o a la biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para actuar sobre las células no deseadas de las células del sistema inmune (patente de los Estados Unidos N° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección de VIH (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados se pueden realizar utilizando cualquier procedimiento reticulante. Los agentes reticulantes adecuados son bien conocidos en la materia, y se desvelan en la patente de los Estados Unidos N° 4.676.980 junto con un gran número de técnicas reticulantes. Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descritos en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar utilizando una unión química. Brennan et al . , Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento en el que los anticuerpos intactos se separan proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2- Estos fragmentos se reducen con la presencia de arsenito de sodio del agente que forma complejos con el ditiol para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces a derivados del tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte entonces en Fab' -tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado Fab'-TNB para formar un anticuerpo biespecífico.

Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Descubrimientos actuales han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E . coli , que se pueden unir químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al . , J. Exp . Med. , 175: 217-225 (1992) describe la producción de una molécula F(ab')2de anticuerpo biespecífico completamente humanizada. Cada fragmento Fab' se secretó de manera separada a partir de E. coli y se sometió a unión química dirigida in vitro para formar el anticuerpo biespecifico. Por lo tanto, el anticuerpo biespecífico formado era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor HER2 y las células T humanas normales, así como desencadenar la actividad litica de los linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano . También se han descrito varias técnicas para realizar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivos celulares recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecificos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al . , J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992) . Los péptidos con cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se reoxidaron para formar los heterodimeros del anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodimeros del anticuerpo. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para realizar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a aparearse con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, formando, por lo tanto, dos lugares de unión del antigeno. También se ha informado otra estrategia para realizar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante la utilización de dímeros FV de cadena única (sFv) . Consultar Gruber et al . , J. Immunol . , 152:5368 (1994). Se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecífieos . Tutt et al . J. Immunol . 147: 60 (1991). (vii) Otras modificaciones de la secuencia de aminoácidos Se contemplan la(s) modificación (es) de la secuencia de aminoácidos descritas en la presente memoria. Por ejemplo, se puede querer mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se pueden preparar al introducir cambios nucleótidos adecuados en el ácido nucleico del anticuerpo, o mediante síntesis del péptido. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de y/o inserciones dentro y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias del aminoácido del anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se realiza para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios aminoacidicos también pueden alterar los procesos postraduccionales del anticuerpo, como por ejemplo cambiar el número o la posición de los lugares de glicosilación. Un procedimiento útil para identificar ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se llaman "mutagénesis de barrido de alanina" tal como lo describen Cunningham y Wells Science, 244:1081-1085 (1989) . Aquí, se identifica un residuo o un grupo de residuos dianas (por ej . residuos cargados como por ejemplo arg, asp, his, lys, y glu) y se reemplazan por aminoácidos cargados neutra o negativamente (preferentemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antigeno.

Estas ubicaciones de los aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan al introducir más u otras variantes en, o por, los sitios de sustitución. Por lo tanto, a pesar de que el lugar para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminada, la naturaleza de la mutación per se no se necesita predeterminar. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un lugar dado, se realiza el barrido de alanina o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las variantes expresadas del anticuerpo se monitorizan para detectar la actividad deseada. Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en los extremos amino y/o carboxi terminal que abarcan desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, asi como inserciones dentro de la secuencia de uno o múltiples residuos de aminoácidos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionil en el extremo N terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula del anticuerpo incluyen la fusión del extremo N o terminal o C del anticuerpo a una enzima (por ej . para ADEPT) o un polipéptido que aumente la semivida sérica del anticuerpo. Otro tipo de variante es una variante de sustitución aminoacídica. Estas variantes reemplazan al menos un residuo de aminoácidos en la molécula del anticuerpo por un residuo diferente. Los lugares de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero las alteraciones FR también se contemplan. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 debajo del encabezado "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones ocasionan un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe a continuación con referencia a las clases de aminoácidos, y los productos se pueden monitorizar.

Tabla 1 Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura de la base del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación plana o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el lugar diana, o (c) el residuo de la cadena lateral. Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo a similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, en Biochemis try, segunda ed., págs. 73-75, Worth Publishers, New York (1975) ) : (1) apolares: Ala (A), Val (V), Leu (L) , He (I), Pro (P) , Phe (F) , Trp (W) , Met (M) (2) polares no cargados: Gly (G) , Ser (S), Thr (T), Cys (C) , Tyr (Y) , Asn (N) , Gln (Q) (3) ácidos: Asp (D), Glu (E) (4) básicos: Lys (K) , Arg (R), His(H) Alternativamente, los residuos que aparecen naturalmente se pueden dividir en grupos basándose en sus propiedades comunes de las cadenas laterales: (1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrófilos neutrales: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Cualquier residuo de cisteína no implicado en mantener la conformación adecuada del anticuerpo también se puede sustituir, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar interuniones atipicas. A la inversa, la(s) unión (es) de cisteína se pueden agregar al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, como por ejemplo un fragmento Fv) . Un tipo de variante de sustitución particularmente preferido implica sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo parental (por ej . un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante (s) resultante (s) seleccionada (s ) para mayor desarrollo tendrá (n) propiedades biológicas mejoradas con respecto al anticuerpo parental desde el cual se generaron. Una manera conveniente de generar dichas variantes de sustitución involucra la maduración de afinidad utilizando una presentación en fagos. De manera resumida, varios lugares de región hipervariable (por ej . 6-7 lugares) se mutan para generar todas las sustituciones posibles de aminoácidos en cada lugar. Las variantes del anticuerpo generadas de esta manera se presentan de manera monovalente de las partículas fagos filamentosas como fusiones al producto del gen III de M13 dentro de cada partícula. Las variantes presentadas en fagos se monitorizan para detectar su actividad biológica (por ej . afinidad de unión) como se desvela en esta memoria descriptiva. Para identificar los lugares de la región hipervariable candidatos para la modificación, se pueden realizar barridos de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyan significativamente a la unión del antígeno. De manera alternativa o adicional puede ser beneficioso analizar un estructura cristalina del complejo antigeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el HER2 humano. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes son candidatos a la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente memoria descriptiva.

Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes está sujeto a monitorización, tal como se describe en la presente memoria descriptiva y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes se pueden seleccionar para mayor desarrollo. Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Alterar significa borrar uno o más residuos glucídicos encontrados en el anticuerpo, y/o agregar uno o más lugares de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glicosilación de anticuerpos es generalmente por enlace tipo N o tipo 0. Por enlace tipo N se entiende el anclaje del residuo glucidico en la cadena lateral de un residuo de asparragina. Las secuencias de tripéptidos asparragina-X-serina y asparragina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto la prolina, son las secuencias de reconocimiento para los anclajes enzimáticos del residuo glucídico a la cadena lateral de asparragina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un lugar de glicosilación potencial. La glicosilación por enlace tipo 0 se refiere al anclaje de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, a pesar de que también se puede utilizar 5-hidroxiprolina y 5-hidroxilisina . La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente al alterar la secuencia del aminoácido para que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descrita (s) anteriormente (para lugares de glicosilación unidos por enlace tipo N) . La alteración también se puede realizar además mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para lugares de glicosilación unidos por enlace tipo 0) . Donde el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato unido al mismo. Por ejemplo, los anticuerpos con una estructura de carbohidratos madura que no tienen fucosa unida a una región Fc del anticuerpo se describen en la solicitud de patente de los Estados Unidos N° 2003/0157108 Al, Presta, L. Ver también el documento EE.UU. N°. 2004/0093621 Al (Kyowa Hakko Kogyo Co . , Ltd). Los anticuerpos con una N-acetilglucosamina (GlcNAc) bisectriz en el carbohidrato unido a una región Fc del anticuerpo se describe en el documento WO03/011878, Jean-Mairet et al . y en la patente de los Estados Unidos N° 6,602,684, Umana et al . Los anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a una región Fc del anticuerpo se describen en el documento WO97/30087, Patel et al . Consultar, también, los documentos W098/58964 (Raju, S.) y W099/22764 (Raju, S.) con respecto a los anticuerpos con carbohidratos alterados unidos a la región Fc del mismo. Puede quererse modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ej . para incrementar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede lograr al introducir una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc del anticuerpo. De manera alternativa o adicional, un (os) residuo (s) de cisteína se puede (n) introducir en la región Fc, por lo tanto permitiendo la formación de un puente disulfuro entre las cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener mayor capacidad de internalización y/o mayor muerte celular mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Consultar Carón et al . , J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol . 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral mejorada también se pueden preparar utilizando reticulantes heterobifuncionales como se describe en Wolff et al . Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). De manera alternativa, se puede diseñar un anticuerpo con dobles regiones Fc y se puede, por lo tanto, potenciar la lisis por complemento y las capacidades ADCC. Véase Stevenson et al . An ti -Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). WO00/42072 (Presta, L.) describe los anticuerpos con función ADCC mejorada en presencia de células efectoras humanas, en donde los anticuerpos comprenden las sustituciones de los aminoácidos en la región Fc de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo con ADCC mejorada comprende sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración de residuos EU) . Preferentemente, la región Fc alterada es una región IgGl Fc humana que comprende o está compuesta por sustituciones en una, dos o tres de estas posiciones. Opcionalmente, estas sustituciones se pueden combinar con sustitución (es) que incrementan la unión Ciq y/o la CDC. Los anticuerpos con unión Ciq alterada y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) se describen en el documento W099/51642, la patente de los Estados Unidos N° 6.194.551B1, la patente de los Estados Unidos N° 6.242.195B1, la patente de los Estados Unidos N° 6.528.624B1 y la patente de los Estados Unidos N° 6.538.124 (Idusogie et ai.) Los anticuerpos comprenden la sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones del aminoácido 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 y/o 334 de la región Fc del mismo (numeración de residuos EU) . Para incrementar la semivida sérica del anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de unión a receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento del anticuerpo) tal como se describe en la patente de los Estados Unidos 5.739.277, por ejemplo. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "epitopo de unión a receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula IgG (por ej . IgGi, IgG2, IgG , o IgG ) que es responsable de incrementar la semivida sérica in vivo de la molécula IgG.

Los anticuerpos con una unión mejorada al receptor neonatal Fc (FcRn), y semividas mejoradas, se describen en el documento WO00/42072 (Presta, L.) y US2005/0014934A1 (Hinton et al . ) . Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones que mejoran la unión de la región Fc al FcRn. Por ejemplo, la región Fc puede tener sustituciones en una o más de las posiciones 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 o 434 (numeración de residuos EU) . La variante preferida de anticuerpo que comprenda región Fc con unión FcRn mejorada comprende sustituciones de aminoácidos en una, dos, o tres de las posiciones 307, 380 y 434 de la región Fc del mismo (numeración de residuos EU) . También se contemplan los anticuerpos diseñados con dos o más (preferentemente cuatro) lugares funcionales de unión al antigeno (solicitud de patente de EE.UU. N° US2002/0004587 Al, Miller et al . ) . Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante varios métodos conocidos en el sector. Estos métodos incluyen, entre otros, aislamiento desde una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos presentes en la naturaleza) o preparación mediante mutagénesis con mediación oligonucleótida (o controlada in si tu) , mutagénesis PCR, y mutagenesis de modulo de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo. (vm) Moni topzacion para encontrar anticuerpos con las propiedades deseadas Anteriormente se han descrito técnicas para generar anticuerpos. Se pueden seleccionar más anticuerpos con ciertas características biológicas, tal como se desee. Para identificar un anticuerpo que bloquea la activación del ligando de un receptor HER, se puede determinar la capacidad del anticuerpo de bloquear el ligando HER que se une a las células que expresan el receptor HER (por e . junto con otro receptor HER con el cual el receptor HER de interés forma un heteroligomero HER). Por ejemplo, las células que naturalmente expresan, o han sido transfectadas para expresar, receptores HER del heteroligomero HER, se pueden incubar con el anticuerpo y después exponerse al ligando HER marcado. Se puede evaluar la capacidad del anticuerpo de bloquear un ligando que se une a un receptor HER en el heteroligómero HER.

Por ejemplo, la inhibición de la unión del HRG a líneas celulares de tumor de mama MCF7 por anticuerpos HER2 se puede realizar utilizando cultivos de MCF7 en monocapa en hielo en un formato de placa de 24 pocilios esencialmente como se describe en el documento WO01/00245. Los anticuerpos monoclonales HER2 se pueden agregar a cada pocilio e incubar durante 30 minutos.

Se puede agregar rHRGßl17_224 etiquetado con I125 (25 pm) , y la incubación puede continuar de 4 a 16 horas. Se pueden preparar curvas dosis-respuesta y se puede calcular un valor IC50 para el anticuerpo de interés. En una forma de realización, el anticuerpo que bloquea la activación del ligando de un receptor HER tendrá una IC50 para inhibir la unión de HRG a las células MCF7 en este ensayo, de aproximadamente 50 nM o menos, preferentemente 10 nM o menos. Si el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo como por ejemplo el fragmento Fab, la IC50 para inhibir la unión HRG a las células MCF7 en este ensayo puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 nM o menos, preferentemente 50 nM o menos. De manera alternativa o adicional, se puede evaluar la capacidad de un anticuerpo de bloquear la fosforilación de tirosina estimulada por el ligando de HER de un receptor HER presente en un heteroligómero HER. Por ejemplo, las células que expresan de manera endógena los receptores HER o han sido transfectadas para expresarlos se pueden incubar con el anticuerpo y después evaluarse para detectar la actividad de fosforilación de tirosina estimulada por ligando HER utilizando un anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina (que se conjuga de manera óptima con una marca detectable) . El ensayo de activación del receptor quinasa descrito en la patente de los Estados Unidos N° 5.766.863 también está disponible para determinar la activación y del receptor HER y el bloqueo de esa actividad por parte de un anticuerpo. En una forma de realización, se puede monitorizar un anticuerpo que inhibe la estimulación por HRG de la fosforilación de tirosina pl80 en células MCF7 esencialmente como se describe en el documento WO01/00245. Por ejemplo, las células MCF7 se pueden colocar en placas de 24 pocilios y los anticuerpos monoclonales contra HER2 se pueden agregar a cada pocilio e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente; después, se puede agregar rHRGßli77_244 a cada pocilio para obtener una concentración final de 0,2 nM, y la incubación se puede prolongar durante 8 minutos. El medio se puede aspirar de cada pocilio, y las reacciones se pueden detener mediante la adición de 100 µl de tampón de muestra con SDS (5% SDS, DTT 25 mM, y Tris-HCl 25 mM, pH 6,8). Cada muestra (25 µl) se puede someter a electroforesis en un gel con gradiente de 4-12% (Novex) y después se puede transferir electroforéticamente a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Se pueden desarrollar inmunotransferencias de antifosfotirosina (a 1 µg/ml) , y la intensidad de la banda reactiva predominante a Mr -180,000 se puede cuantificar mediante densitometria de reflectancia. El anticuerpo seleccionado preferentemente inhibirá de manera significativa la estimulación por HRG de la fosforilación de la tirosina pl80 hasta aproximadamente un 0- % del control de este ensayo. Se puede preparar una curva dosis-respuesta para la inhibición de la estimulación por HRG de la fosforilación de la tirosina pl80 tal como lo determine la densitometría de reflectancia, y se puede calcular una IC50 para el anticuerpo de interés. En una forma de realización, el anticuerpo que bloquea la activación del ligando de un receptor HER tendrá una IC50 para inhibir la estimulación por HRG de la fosforilación de la tirosina pl80 en este ensayo, de aproximadamente 50 nM o menos, preferentemente 10 nM o menos. Cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, como por ejemplo el fragmento Fab, la IC50 para inhibir la estimulación por HRG de la fosforilación de la tirosina pl80 en este ensayo puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 nM o menos, preferentemente 50 nM o menos. También se puede evaluar los efectos de la inhibición del crecimiento del anticuerpo en células MDA-MB-175, por ej . , esencialmente como se describe en Schaefer et al . Oncogene 15:1385-1394 (1997). De acuerdo con este ensayo, las células MDA-MB-175 se pueden tratar con un anticuerpo monoclonal HER2 (10 µg/mL) durante 4 dias y se puede teñir con cristal violeta. La incubación con un anticuerpo anti HER2 puede mostrar un efecto de inhibición del crecimiento en esta linea celular similar al que muestra un anticuerpo monoclonal 2C4. En otra forma de realización, la HRG exógena no revertirá significativamente esta inhibición. Preferentemente, el anticuerpo será capaz de inhibir la proliferación celular de células MDA-MB-175 en mayor medida que un anticuerpo monoclonal 4D5 (y opcionalmente en mayor medida que un anticuerpo monoclonal 7F3) , ambos en presencia y ausencia de HRG exógena. En otra forma de realización, el anticuerpo anti HER2 de interés puede bloquear la asociación dependiente de heregulina de HER2 con HER3 tanto en células MCF7 como SK-BR-3, tal y como se determina en un experimento de coinmunoprecipitación como por ejemplo el descrito en el documento WO01/00245, de manera más eficaz que el anticuerpo monoclonal 4D5, y preferentemente de manera más eficaz que el anticuerpo monoclonal 7F3. Para identificar los anticuerpos contra el HER2 inhibidores del crecimiento, se pueden buscar anticuerpos que inhiban el crecimiento de las células cancerígenas que sobreexpresan HER2. En otra forma de realización, el anticuerpo inhibidor del crecimiento de elección es capaz de inhibir el crecimiento de las células SK-BR-3 en un cultivo celular en aproximadamente un 20-100% y preferentemente en aproximadamente un 50-100% a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,5 a 30 µg/ml. Para identificar dichos anticuerpos, se puede realizar el ensayo SK-BR-3 descrito en la patente de los Estados Unidos 5.677.171. De acuerdo con este ensayo, las células SK-BR-3 crecen en una mezcla 1:1 de medio F12 y DMEM complementado con 10% de suero fetal bovino, glutamina y estreptomicina-penicilina. Las células SK-BR-3 se colocan a razón de 20.000 células en una placa de cultivo celular de 35 mm (2 ml/placa de 35 mm) . Se agregan 0,5 a 30 µg/ml del anticuerpo contra el HER2 por placa. Después de seis días, se cuenta la cantidad de células, comparada con las células no tratadas, mediante un contador celular electrónico COULTERJ. Aquellos anticuerpos que inhiben el crecimiento de las células SK-BR-3 en aproximadamente un 20-100% o aproximadamente un 50-100% se pueden seleccionar como anticuerpos inhibidores del crecimiento. Consultar la patente de los Estados Unidos 5.677.171 para ensayos para detectar anticuerpos inhibidores del crecimiento como por ejemplo 4D5 y 3E8. Para seleccionar anticuerpos que producen apoptosis, se encuentra disponible un ensayo de unión a anexina que utiliza células BT474. Las células BT474 se cultivan y se siembran en placas tal y como se describe en el párrafo anterior. Después el medio se retira y se reemplaza con un medio nuevo solo o que contenga 10 µg/ml del anticuerpo monoclonal. Después de un período de incubación de tres días, las monocapas se lavan con PBS y se separan por tripsinización. Después las células se centrifugan, se resuspenden en un tampón de unión a Ca+ y se alicuotan en tubos tal y como se describe anteriormente para un ensayo de células muertas. Después, se añade a los tubos la anexina marcada (por ej . anexina V-FTIC) (lµg/ml). Las muestras se analizan utilizando un citómetro de flujo FACSCANJ y software FACSCONVERTJ CellQuest (Becton Dickinson) . Estos anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de unión a anexina en relación al control se seleccionan como anticuerpos inductores de apoptosis. Además del ensayo de unión a anexina, hay disponible un ensayo de tinción de ADN que utiliza células BT474. Para realizar este ensayo, las células BT474 que se han tratado con el anticuerpo de interés, tal y como se describe en los dos párrafos anteriores, se incuban con 9 µg/ml de HOECHST 33342J durante 2 horas a 37°C, después se analizan con un citómetro de flujo EPICS ELITEJ (Coulter Corporation) utilizando el programa MODFIT LTJ (Verity Software House) . Los anticuerpos que inducen un cambio en el porcentaje de células apoptóticas de 2 veces o más (y preferentemente 3 veces o más) que las células no tratadas (hasta células apoptóticas de 100%) se seleccionan como anticuerpos proapoptóticos utilizando este ensayo. Consultar el documento W098/17797 para obtener ensayos para monitorizar anticuerpos que inducen la apoptosis, como por ejemplo 7C2 y 7F3. Para monitorizar anticuerpos que se unen a un epítopo en el HER2 unido por un anticuerpo de interés, se puede realizar una ensayo de bloqueo cruzado habitual, como el que se describe en An tibodies , A Labora tory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Eds. Harlow y David Lañe (1988), para evaluar si el anticuerpo realiza un bloqueo cruzado de la unión de un anticuerpo, como por ejemplo 2C4 o pertuzumab, a un HER2. De manera alternativa, o adicional, el mapeo del epítopo se puede realizar mediante procedimientos conocidos en la materia y/o se puede estudiar la estructura del anticuerpo anti HER2 (Frankiin et al . Cáncer Cell 5:317-328 (2004)) para ver qué dominio(s) de HER2 está(n) unido (s) al anticuerpo. (ix) Composiciones de pertuzumab En una forma de realización de la composición del anticuerpo contra el HER2, la composición comprende una mezcla de las especies principales del anticuerpo pertuzumab y una o más variantes del mismo. En la presente memoria descriptiva, la realización preferible del pertuzumab del anticuerpo principal de la especie es uno que comprenda las secuencias de aminoácidos de variable ligera y pesada en Nos. 3 y 4, y más preferiblemente que comprenda una secuencia de aminoácido de cadena ligera seleccionada de SEQ ID No. 13 y 17, y una secuencia de aminoácido de cadena pesada seleccionada de SEQ ID No. 14 y 18 (incluyendo variantes desamidadas y/o oxidizadas de esas secuencias). En una forma de realización, la composición comprende una mezcla de las especies principales del anticuerpo pertuzumab y una variante de la secuencia de aminoácidos del mismo que comprenda una extensión lider del extremo amino terminal. Preferentemente, la extensión lider del extremo amino terminal se encuentra en una cadena ligera del anticuerpo variante (por ej . en una o dos cadenas ligeras del anticuerpo variante) . La especie principal del anticuerpo contra el HER2 o la variante del anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de anticuerpo (por ej . fragmentos Fab del F(ab')2), pero preferentemente los dos son anticuerpos de longitud completa. La variante del anticuerpo de la presente memoria descriptiva comprende una extensión lider del extremo amino terminal en cualquiera de una o más cadenas pesadas o ligeras del mismo. Preferentemente, la extensión lider del amino-terminal se encuentra en una o más de las cadenas ligeras del anticuerpo. La extensión líder del extremo amino terminal, preferentemente, comprende o está compuesto por VHS- . La presencia de la extensión líder amino terminal en la composición puede detectarse mediante varias técnicas analíticas que incluyen, pero no se limitan a, análisis de la secuencia de extremo N terminal, prueba de heterogeneidad de carga (por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico o electroforesis de la zona capilar) , espectrometría de masa, etc. La cantidad de la variante del anticuerpo en la composición suele variar desde una cantidad que representa el límite de detección de cualquier prueba (preferiblemente análisis de la secuencia de extremo N terminal) utilizada para detectar la variante hasta una cantidad inferior a la cantidad del anticuerpo principal de la especie. Generalmente, aproximadamente el 20% o menos (por ej . desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 15%, por ejemplo desde 5% hasta aproximadamente 15%) de las moléculas del anticuerpo en la composición comprende una extensión líder del extremo amino terminal. Dichas cantidades porcentuales se determinan preferentemente utilizando un análisis cuantitativo de la secuencia de extremo N terminal o un análisis de intercambio catiónico (preferentemente utilizando una columna de alta resolución e intercambio catiónico débil, como por ejemplo la columna de intercambio catiónico PROPAC WCX-10J) .. Además de la variante de la extensión lider del amino-terminal, se contemplan más alteraciones de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo y/o de la variante de la especie principal, incluyendo pero no limitado a un anticuerpo que comprenda un residuo de lisina en el extremo C terminal de una o de las dos cadenas pesadas del mismo, una variante del anticuerpo desamidada, etc. Además, el anticuerpo o variante de la especie principal puede también constar de variantes de glicosilación, algunos de cuyos ejemplos son un anticuerpo que comprenda una estructura oligosacárida Gl o G2 unida a la región Fc del mismo, un anticuerpo que comprenda un residuo glucidico unido a una cadena ligera del mismo (por ej . uno o dos residuos glucidicos, tales como glucosa o galactosa, unidos a una o dos cadenas ligeras del anticuerpo, por ejemplo unidas a uno o más residuos de lisina) , un anticuerpo que comprenda una o dos cadenas pesadas no glicosiladas, o un anticuerpo que comprenda un oligosacárido sializado unido a una o dos cadenas pesadas del mismo, etc. La composición se puede recuperar de una línea celular genéticamente modificada, por ej . una linea celular de ovario de hámster chino (CHO) que exprese el anticuerpo contra el HER2, o se puede preparar mediante la sintesis del péptido. (x) Inmunoconj ugados La invención también se relaciona con los inmunoconjugados que comprendan un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico como por ejemplo un agente quimioterapéutico, toxina (por ej . una toxina de molécula pequeña o una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de la misma), un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado) . Los agentes quimioterapéuticos son útiles en la generación de dichos inmunoconjugados que se han descrito anteriormente. Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, como por ejemplo una calicheamicina, una maitansina (patente de los Estados Unidos N° 5.208.020) un tricoteno, y CC1065 también se contemplan en la presente memoria descriptiva . En una forma de realización preferida de la invención, el anticuerpo se conjuga con una o más moléculas de maitansina (por ej . de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maitansina por molécula de anticuerpo) . La maitasina, por ejemplo, se puede convertir a May-SS-Me que se puede reducir a May-SH3 y hacer reaccionar con un anticuerpo modificado (Chari et al . Cáncer Research 52: 127-131 (1992)) para generar un inmunoconjugado maitansinoide-anticuerpo. Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo conjugado con una o más moléculas de calicheamicina. La familia de antibióticos de la calicheamicina es capaz de producir la ruptura del ADN de hebra doble en concentraciones por debajo de picomolar. Los análogos estructurales de la calicheamicina que se pueden utilizar incluyen, entre otros, Yi1. c.21, a3I, N-acetyl-yi1, PSAG and ?1! (Hinman et al . Cáncer Research 53: 3336-3342 (1993) y Lode et al . Cáncer Research 58: 2925-2928 (1998)). Véase también las Patentes americanas Nos. ,714,586; 5,712,374; 5,264,586; y 5,773,001, incorporadas expresamente a la presente memoria descriptiva por referencia.

Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden utilizar incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin unión de la toxina de la difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa ) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurí tes fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de la Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de la Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y el tricotecenos . Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. Esta invención también contempla un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ej . un ribonucleasa o una endonucleasa de ADN como por ejemplo la desoxiribonucleasa; ADNasa) . Hay disponibles una variedad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos contra el HER2 radioconjugados . Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu . Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se pueden realizar utilizando una variedad de agentes de unión a proteina bifuncionales como por ejemplo N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como por ejemplo el dimetiladipimidato HCL) , esteres activos (como por ejemplo disuccinimidil suberato) , aldehidos (como por ejemplo glutaraldehídos) , compuestos bis-azido (como por ejemplo bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (como por ejemplo bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina) , diisocianatos (como por ejemplo 2, 6-diisocianato de tolueno), y compuestos bis-activos de fluoruro (como por ejemplo 1,5-difluoruro-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar tal y como se describe en Vitetta et al . Science 238: 1098 (1987). El ácido triaminopentaacético l-isotiocianatobencil-3-metildietileno marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de un radionucleótido a un anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de la droga citotóxica en la célula, como por ejemplo un conector lábil al ácido, un conector sensible a la peptidasa, un conector dimetilico o un conector que contenga disulfuro (Chari et al . Cáncer Research 52: 127-131 (1992) ) . Alternativamente, se puede realizar una fusión de proteínas que contengan el anticuerpo y el agente citotóxico, por ej . mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos.

En la presente memoria descriptiva se contemplan otros inmunoconjugados. Por ejemplo, el anticuerpo se puede unir a uno o varios polímeros no proteináceos, por ej . polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos, o copolimeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El anticuerpo también se puede atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente), en sistemas de presentación de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones . Dichas técnicas se desvelan en Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed., (1980). Los anticuerpos desvelados en la presente memoria descriptiva también se formulan como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la materia, como por ejemplo el descrito en Epstein et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 82:3688 (1985); Hwang et al . , Proc . Na ti Acad. Sci . USA, 77:4030 (1980); patentes de los Estados Unidos N° 4.485.045 y 4.544.545; y documento W097/38731 publicado el 23 de octubre de 1997. Los liposomas con mayor tiempo de circulación se desvelan en la patente de los Estados Unidos N° 5.013.556.

Los liposomas particularmente útiles se pueden generar mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprenda fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo presentes en esta invención se pueden conjugar con los liposomas tal y como se describe en Martin et al . J. Biol . Chem . 257: 286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Opcionalmente, el liposoma puede contener un agente quimioterapéutico. Consultar Gabizon et al . J. Na tional Cáncer Inst .81 ( 19) 1484 (1989). III. Selección de los pacientes para la terapia El paciente de la presente memoria descriptiva se somete a una prueba diagnóstica antes de la terapia. Por ejemplo, la prueba diagnóstica puede analizar la expresión (incluida la sobreexpresión) , amplificación y/o activación (incluidas fosforilación o dimerización) de HER. En general, si se realiza una prueba diagnóstica, se puede obtener una muestra del paciente que necesita terapia. Si el sujeto tiene cáncer, generalmente la muestra será una muestra tumoral. En la realización preferente, la muestra será de un cáncer de ovario, peritoneo o trompas de falopio, o un cáncer de mama metastásico (MBC) o células pulmonares no pequeñas (NSCLC), cáncer de próstata o cáncer colorrectal. En la presente memoria descriptiva, la muestra biológica podrá ser una muestra fijada, por ejemplo, una muestra fijada en formol y embebida en parafina (FFPE) o una congelada. De acuerdo a una realización de la invención presentada en esta memoria descriptiva, el paciente seleccionado para terapia tendrá un tumor que muestra activación de HER (y preferiblemente de HER2). En una realización, el alcance de la activación de HER (o HER2) en células cancerosas superará significativamente el nivel de activación de dicho receptor en células no cancerosas del mismo tipo de tejido. Dicha activación excesiva puede resultar de la sobreexpresión del receptor HER y/o niveles superiores a los normales de un ligando de HER disponible para activar el receptor HER en las células cancerosas. Dicha activación excesiva puede provocar y/o estar provocada por el estado canceroso de la célula enferma. En algunas realizaciones, el cáncer será sometido a pruebas diagnósticas o prognósticas para determinar si se está produciendo amplifiación y/o sobreexpresión del receptor HER que provoque activación excesiva del receptor HER. Alternativa o adicionalmente, el cáncer puede ser sometido a pruebas diagnósticas o prognósticas para determinar si se está produciendo amplifiación y/o sobreexpresión del ligando de HER que provoque activación excesiva del receptor. En un subconjunto de estos cánceres, la activación excesiva del receptor puede ser resultado de una ruta de estimulación autocrina. A continuación se describirán con más detalle varias pruebas para determinar la activación de HER. Los métodos preferidos para determinar la activación de HER son: detección de la presencia de dímeros o heterodímeros de HER, evaluación de la fosforilación de HER o HER2, y la creación de perfiles de expresión génica. (i) Dímeros de HER Se pueden analizar las muestras de tumor para ver si existe presencia de dímeros de HER, que indica activación de HER o HER2. Cualquier método conocido en el sector puede utilizarse para detectar dímeros de HER2, como EGFR-HER2, HER2-HER3, en tumores. A continuación se describen varios métodos preferentes. Estos métodos detectan interacciones proteína-proteína no covalentes, o indican la proximidad entre las proteínas de interés. Los métodos basados en la inmunoafinidad, como la inmunoprecipitación o ELISA, pueden servir para detectar dímeros de HER. En una realización, los anticuerpos de HER2 se utilizan para inmunoprecipitar complejos que contienen HER2 de células tumorales, y a continuación el inmunoprecipitado resultante se hibrida para detectar la presencia de EGFR o HER3 por inmunotransferencia. En otra realización, los anticuerpos EGFR o HER3 pueden utilizarse para el paso de la inmunoprecipitación, y a continuación hibridarse el inmunoprecipitado con anticuerpos HER2. En otra realización, los ligandos de HER específicos de los complejos EGFR, HER3, EGFR-HER2 o HER2-HER3 pueden utilizarse para precipitar complejos, que a continuación son hibridados para detectar la presencia de HER2. Por ejemplo, los ligandos pueden conjugarse a la avidina, y los complejos pueden purificarse en una columna de biotina. En otras realizaciones, como los ensayos ELISA o las pruebas de anticuerpo tipo "sandwich", los anticuerpos contra HER2 se inmobilizan en un soporte sólido, se ponen en contacto con células tumorales o lisados de células tumorales, son lavaos y a continuación expuestos a anticuerpos contra EGFR o HER3. La unión de este último anticuerpo, que puede detectarse directamente o mediante un anticuerpo secundario conjugado a una etiqueta detectable, indica la presencia de heterodimeros.

En ciertas realizaciones, se inmoviliza el anticuerpo EGFR o HER3, y el anticuerpo contra HER2 se utiliza para el paso de detección. En otras realizaciones, se pueden utilizar ligandos de HER sustituyendo o combinados con los anticuerpos de HER.

También es posible usar reticulación química o UV para ligar dimeros covalentemente en la superficie de células vivas. Algunos ejemplos de reticulantes químicos son ditiobis (succinimidilo) propionato (DSP) y 3,3 ditiobis (sulfosuccinimidilo) propionato (DTSSP). En una realización, los extractos celulares de células cancerosas reticuladas químicamente son analizadas por SDS-PAGE e inmunotransferidas con anticuerpos contra EGFR y/o HER3. Una banda a la cual se haya realizado un ensayo supershift del peso molecular apropiado probablemente represente dímeros de EGFR-HER2 o HER2-HER3, puesto que HER2 es el compañero de dimerización preferente para EGFR y HER3. Este resultado puede confirmarse con la posterior inmunotransferencia de anticuerpos contra HER2. La transferencia resonante de la energía de fluorescencia (FRET) también puede utilizarse para detectar dimeros de EGFR-HER2 o HER2-HER3. La técnica FRET detecta cambios conformacionales proteínicos e interacciones proteína-proteína in vivo e in vi tro en base a la transferencia de energia de un fluoroforo donante a un fluoroforo receptor. Selvin, Na t . Struct . Biol . , 7:730-34 (2000). La transferencia de energía sólo tiene lugar si el fluoroforo donante está lo suficientemente cerca del fluoroforo receptor. En un experimento FRET típico, dos proteínas o dos lugares de una misma proteína se identifican con distintas sondas fluorescentes. Una de las sondas, la sonda donante, se excita hasta alcanzar un estado de más energia mediante la incisión de luz con una longitud de onda determinada. A continuación la sonda donante transmite su energía a la segunda sonda, la sonda receptora, con lo cual se reduce la intensidad de fluorescencia de la donante y se incrementa la emisión fluorescente de la receptora. Para medir la transferencia de energía, se compara la intensidad del donante, en una muestra identificada como 'sondas de donante y receptor' , con la de su intensidad en una muestra identificada únicamente como 'sonda de donante' . También se puede comparar la intensidad del receptor en sondas donante/receptor y únicamente receptor. Las sondas adecuadas son conocidas en el sector e incluyen, por ejemplo, tintes que atraviesan la membrana, como la fluoresceína y la rhodamina, tintes orgánicos, como los tintes de cianina, y los átomos lantánidos . El método y la instrumentación necesarios para la detección y medición de la transferencia de energia también son conocidos en el sector. Las técnicas basadas en FRET adecuadas para detectar y medir interacciones proteína-proteína en células individuales también son conocidas en el sector. Por ejemplo, el microscopio de transferencia resonante de energía de fluorescencia fotoblanqueadora (pbFRET) y el microscopio de formación de imágenes de tiempo de vida (FLIM) pueden utilizarse para detectar la dimerización de receptores de superficie celular. Gadella y Jovin, J. Cell Biol . , 129:1543-58 (1995). En una realización, se utiliza pbFRET ya se en células "en suspensión" o " in si tu" para detectar y medir la formación de dímeros de EGFR-HER2 o HER2-HER3, tal y como se describe en Nagy et al . , Cytometry, 32:120-131 (1998). Estas técnicas miden la reducción del tiempo de vida de la fluorescencia del donante debida a la transferencia de energía. En una realización particular, se puede utilizar una técnica FRET de flujo citométrico tipo Forster (FCET) para investigar la dimerización de EGFR-HER2 y HER2-HER3, tal y como se describe en Nagy et al . , supra , y Brockhoff et al . , Cytometry, 44:338-48 (2001).

FRET se utiliza preferiblemente junto con las técnicas de clasificación inmunohistoquímicas . Kenworthy, Methods, 24:289-96 (2001). Por ejemplo, anticuerpos conjugados a tintes fluorescentes adecuados pueden utilizarse como sondas para la clasificación de dos proteínas distintas. Si las proteínas están cerca una de otra, los tintes fluorescentes actúan como donantes y receptores de FRET. La transferencia de energía se detecta con métodos estándar. La transferencia de energía se puede detectar con medios de flujo citométrico o sistemas de microscopio digital, como microscopio confocal o microscopio fluorescente de campo amplio conectado a una cámara CCD. En una realización de la presente invención, los anticuerpos contra HER2 y los anticuerpos contra EGFR o bien HER3 se etiquetan directamente con dos fluoroforos distintos, por ejemplo tal como se describe en Nagy et al , supra . Las células tumorales o lisados de células tumorales entran en contacto con los anticuerpos etiquetados diferencialmente, que actúan como donantes y receptores de FRET en presencia de dímeros de EGFR-HER2 o HER2-HER3. Alternativamente, los anticuerpos no etiquetados contra HER2 y o bien EGFR o bien HER3 se utilizan junto con anticuerpos secundarios etiquetados de un modo distinto que sirven como donantes y receptores. Véase, por ejemplo, Brockhoff et al . , supra . Se detecta la transferencia de energía y se determina la presencia de dímeros si se detecta que las etiquetas están cerca. En otras realizaciones, los ligandos del receptor HER específicos para HER2 y o bien EGFR o HER3 se etiquetan fluorescentemente y se utilizan para estudios FRET. En otras realizaciones de la presente invención, la presencia de dímeros en la superficie de células tumorales se demuestra mediante co-localización de HER2 con o bien EGFR o HER3 utilizando técnicas de inmunofluorescencia estándar directas o indirectas y microscopía confocal de escaneado láser. Alternativamente, se utiliza imagen por escaneado láser (LSI) para detectar la unión de anticuerpos y la co-localización de HER2 con o bien EGFR o HER3 en un formato de alto rendimiento, como una placa de micropocillos, tal y como se describe en Zuck et al , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 96:11122-27 (1999) . En otras realizaciones, la presencia de dímeros de EGFR-HER2 y/o HER2-HER3 se determina identificando la actividad enzimática que depende de la proximidad de los componentes dímeros. Un anticuerpo HER2 se conjuga con una enzima y un anticuerpo EGFR o HER3 se conjuga con una segunda enzima. Se añade un primer sustrato a la primera enzima y la reacción produce un segundo sustrato para la segunda enzima. Esto provoca una reacción con otra molécula para producir un compuesto detectable, como un tinte. La presencia de otro producto químico descompone el segundo sustrato, de tal modo que se previene la reacción con la segunda enzima a no ser que la primera y segunda enzimas, y por tanto los dos anticuerpos, estén muy cerca. En una realización particular, las células tumorales o lisados de célula entran en contacto con un anticuerpo contra HER2 conjugado con oxidasa de glucosa y un anticuerpo HER3 o EGFR conjugado con peroxidasa de rábano picante. A la reacción se añade glucosa y un precursor de tinte, como DAB, y catalasa. La presencia de dímeros viene determinada por el desarrollo del color según tinción por DAB.

Los dímeros también se pueden detectar utilizando métodos basados en el sistema de pruebas eTag™ (Aclara Bio Sciences, Mountain View, CA) , tal y como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente de EE.UU. 2001/0049105, publicada el 6 de diciembre de 2001, ambos incorporados completos expresamente como referencia. Un eTag™, o "análisis electroforético" , comprende un grupo indicador detectable, como un grupo fluorescente. También puede incluir un "modificador de movilidad", que consiste esencialmente en un grupo con una movilidad electroforética única. Estos grupos permiten separar y detectar el eTag™ de una mezcla compleja en condiciones electroforéticas definidas, como electroforesis capilar (CE) . La porción del eTag™ que contiene el grupo indicador y, opcionalmente, el modificador de movilidad se une a un primer grupo de unión de diana mediante un grupo de unión enlazador para producir un compuesto de primera unión. El primer grupo de unión de diana reconoce específicamente un primer objetivo en concreto, como un ácido nucleico o una proteína. El primer grupo de unión de diana no está limitado en modo alguno y puede ser, por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido. Preferentemente, el primer grupo de unión de diana es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Alternativamente, el primer grupo de unión de diana puede ser un ligando de receptor HER o un fragmento del mismo con capacidad de unión. Preferentemente, el grupo de unión comprende un grupo enlazador, como un sustrato de enzimas o cualquier unión química que se pueda enlazar bajo las condiciones definidas. Cuando el primer grupo de unión de diana se une a su diana, se introduce y/o activa el agente enlazador, y el grupo de unión se enlaza, soltando de este modo la porción del eTag™ que contiene el grupo indicador y el modificador de movilidad. Por tanto, la presencia de un eTag™ "libre" indica la unión del grupo de unión de diana a su diana. Preferentemente, un segundo compuesto de unión comprende el agente enlazador y un segundo grupo de unión de diana que reconoce específicamente una segunda diana. El segundo grupo de unión de diana tampoco está limitado en modo alguno y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o un ligando de receptor de HER o un fragmento de ligando con capacidad de unión. El agente enlazador sólo enlazará el grupo de unión del primer compuesto de unión si el primer y segundo compuestos de unión están cerca. En una realización de la presente invención, un primer compuesto de unión comprende un eTag™ en el cual un anticuerpo contra HER2 sirve como primer grupo de unión de diana. Un segundo compuesto de unión incluye un anticuerpo contra EGFR o HER3 unido a un agente enlazador capaz de enlazar el grupo de unión del eTag™. Preferentemente, el agente enlazador deberá ser activado para poder enlazar el grupo de unión. Las células tumorales o lisados de células tumorales entran en contacto con el eTag™, que se une a HER2, y con el anticuerpo contra EGFR o HER3, que se une a EGFR o HER3 en la superficie celular. Es preferible eliminar el compuesto de unión no unido, y activar el agente enlazador si es necesario. Si hay dímeros de EGFR-HER2 o HER2-HER3, el agente enlazador enlazará el grupo de unión y soltará el eTag™ debido a la proximidad del agente enlazador al grupo de unión. Entonces, el eTag™ suelto puede ser detectado mediante cualquiera de los métodos conocidos en el sector, como electroforesis capilar. En una realización, el agente enlazador es una especie química activable que actúa sobre el grupo de unión. Por ejemplo, el agente enlazador podria ser activado exponiendo la muestra a la luz. En otra realización, el eTag™ se construye utilizando un anticuerpo contra EGFR o HER3 como primer grupo de unión de diana, y el segundo compuesto de unión se construye a partir de un anticuerpo contra HER2. Y en otra realización, el dimero de HER se detecta mediante un anticuerpo u otro reagente que específica o preferentemente se une al dimero, comparando la unión del mismo a cualquiera de los receptores HER del dímero. (ii) Fosforila ción de HER2 La fosforilación del receptor de HER se puede evaluar mediante inmunoprecipitación de uno o más receptores HER, como el receptor HER2, y el análisis de residuo (s) fosforilado (s) en el(los) receptor(es) inmunoprecipitado (s) . Por ejemplo, la respuesta positiva se determina por la presencia de una banda fosfo-HER2 en el gel, utilizando un anticuerpo contra anti-fosfotirosina para detectar residuo (s) de tirosina fosforilada en el (los) receptor (es) HER inmunoprecipitado (s) . Los anticuerpos anti-fosfotirosina son comercializados por PanVera (Madison, Wl), una empresa subsidiaria de Invitrogen, Chemicon International Inc. (Temecula, CA) , o Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) . La respuesta negativa viene determinada por la ausencia de la banda. Se contemplan varios tipos de prueba para la detección de proteínas fosforiladas, incluidos análisis Western blot, inmunohistoquimica, ELISA, etc. En una realización, se evalúa la fosforilación del receptor de HER2 (HER2) por inmunohistoquimica utilizando un anticuerpo contra HER2 fosfoespecífico (clon PN2A; Thor et al . , J. Clin . Oncol , 18 (18) :3230-3239 (2000)). Otros métodos de detección de fosforilación de receptor (es) HER incluyen, entre otros, KIRA ELISA (Patentes de los EE.UU. Nos. 5,766,863; 5,891,650; 5,914,237; 6,025,145; y 6,287,784), espectometría de masa (comparación del tamaño de HER2 fosforilado y no fosforilado) , y prueba de proximidad e-tag tanto con un anticuerpo contra HER (es decir, HER2) como con anticuerpo fosfoespecífico y específico de fosfotirosina (es decir, utilizando el kit de prueba eTag™ comercializado por Aclara BioSciences (Mountain View, CA) . Más arriba se describen los detalles de la prueba eTag. También es posible utilizar anticuerpos fosfoespecíficos en grupos celulares para detectar estado de fosforilación en una muestra celular de proteina de transducción de la señal (EE.UU. 2003/0190689) . El ejemplo 2 que viene a continuación describe el método preferente de determinación de la fosforilación de HER2 mediante fosfo-HER2 ELISA. (m) Creación de perfiles de expresión génica En una realización, la creación de perfiles de expresión génica puede servir como surrogado para calcular directamente fosforilación de HER. Esto es particularmente útil en casos en que la muestra sea una muestra fijada (por ejemplo, una muestra tumoral fijada en formol y embebida en parafina) y pueda resultar difícil cuantificar la fosforilación de HER con fiabilidad. Por ejemplo, se evalúa la expresión de dos receptores HER o más y un ligando HER o más en una muestra, donde la expresión de dos o más receptores HER y un ligado HER o más indica activación de HER positiva en la muestra. Alternativa o adicionalmente, se puede medir la expresión de betacelulina y/o anfirregulina en la muestra, donde la expresión de betacelulina y/o anfírregulma indica activación de HER positiva en la muestra. De conformidad con la realización preferente de creación de perfiles de expresión génica para evaluar activación de HER2, se analiza si una muestra de la paciente expresa dos o más receptores HER (preferentemente seleccionados entre EGFR, HER2 y HER3) y uno o más ligandos de HER (preferentemente seleccionados entre la betacelulina, la anfirregulina, la epirregulina y el TGF-a; con mayor preferencia, la betacelulma o la anfirregulina) . Por ejemplo, los dos receptores HER o más pueden ser EGFR y HER2, o HER2 y HER3, y el (los) ligando (s) HER puede (n) ser betacelulina o anfirregulina . Preferentemente, se determina la expresión de HER2 y EGFR o HER3, asi como de la betacelulina o la anfirregulina . La expresión de la betacelulina o la anfirregulina en la muestra se puede probar aisladamente o en combinación con una prueba de expresión de dos o más receptores HER. La expresión positiva del (de los) gen (es) identificado ( s) indica que el paciente es candidato a la terapia con un inhibidor de la dimerización de HER, como el pertuzumab. Además, la expresión positiva del (de los) gen (es) identificado (s) indica que el paciente tiene más probabilidades de responder favorablemente a la terapia con el inhibidor de la dimepzacion de HER que un paciente que no exhiba dicha expresión positiva. Los distintos métodos de determinación de la expresión de mRNA o proteina incluyen, entre otros, creación de perfiles de expresión genética, reacción en la cadena de polimerasa (PCR), incluida PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) , análisis de micromatriz, análisis serial de expresión genética (SAGE), MassARRAY, el análisis de Gene Expression by Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS) , proteómica, inmunohistoquímica (IHC), etc. Preferentemente, se cuantifica mRNA. Dicho análisis del ARNm se realiza preferentemente empleando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o por análisis de micromatrices . Cuando se utilice la PCR, la forma preferente de PCR es una PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR cuantitativa) . En una realización, la expresión de uno o más de los anteriores genes mencionados se considera positiva si está en la mediana o por encima, por ejemplo, en comparación con otras muestras de la misma clase de tumor. El nivel medio de expresión puede determinarse esencialmente al mismo tiempo que se mida la expresión génica, o también se puede haber determinado previamente. Estas etapas de un protocolo representativo para crear perfiles de expresión génica utilizando tejidos fijos y embebidos en parafina como la fuente de ARN, que incluye aislamiento del ARNm, purificación, extensión del cebador y amplificación, se presentan en varios artículos publicados en revistas (por ejemplo: Godfrey et al . J. Molec . Diagnostics 2 : 84-91 (2000); Specht et al . , Am . J. Pa thol . 158: 419-29 (2001)). De manera breve, un procedimiento representativo comienza cortando secciones gruesas de 10 microgramos de muestras de tejido tumoral embebidas en parafina. Después se extrae el ARN, y se elimina la proteína y el ADN. Después del análisis de la concentración de ARN, se pueden incluir etapas de reparación y/o amplificación de ARN, de ser necesario, y el ARN se retrotranscribe utilizando promotores específicos de los genes seguidos de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) . Finalmente, los datos se analizan para identificar las mejores opciones de tratamiento disponibles para el paciente en base al patrón de expresión génica identificado en la muestra tumoral examinada . El ejemplo 3 de la presente memoria descriptiva describe los métodos preferentes para determinar activación de HER2 mediante creación de perfiles de expresión génica. (iv) Expresión y amplificación de HER Existen varias pruebas diagnósticas/prognósticas para determinar la expresión o amplificación de HER en el cáncer. En una realización, la sobreexpresión de HER puede analizarse mediante IHC, por ej . usando la prueba HERCEPTEST® (Dako). Las secciones de tejido de una biopsia tumoral embebidas en parafina pueden ser sometidas a prueba IHC y evaluarse según el siguiente criterio de intensidad de tinción proteínica de HER2 : Resultado 0 - no se observa tinción, o se observa tinción de la membrana en menos del 10% de las células tumorales.

Resultado 1+ se detecta una tinción leve/apenas apreciable en más del 10% de las células tumorales. Sólo una parte de la membrana de las células presenta tinción. Resultado 2+ se detecta una tinción débil a moderada en las membranas de más del 10% de las células tumorales. Resultado 3+ se detecta una tinción moderada a fuerte en toda la membrana de más del 10% de las células tumorales. Aquellos tumores con resultado 0 o 1+ en la evaluación de sobreexpresión de HER2 pueden ser caracterizados como tumores sin sobreexpresión de HER2, mientras que aquellos tumores con resultados 2+ o 3+ pueden ser caracterizados como tumores con sobreexpresión de HER2. Los tumores que sobreexpresan HER2 pueden ser evaluados según resultados inmunohistoquímicos correspondientes al número de copias de moléculas HER2 expresadas por célula, y pueden ser determinados bioquímicamente: 0 = 0-10.000 copias/célula, 1+ = al menos 200.000 copias/célula, 2+ = al menos unas 500.000 copias/célula, 3+ = al menos unas 2.000.000 copias/célula. La sobreexpresión de HER2 al nivel 3+, que conduce a activación independiente del ligando de la tirosina quinasa (Hudziak et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 84:7159-7163 (1987)), se presenta en aproximadamente el 30% de los cánceres de mama, y en esos pacientes, disminuye la supervivencia sin reincidencia y la supervivencia global (Slamon et al . , Science, 244:707-712 (1989); Slamon et al . , Science, 235:177-182 (1987) ) . Alternativa o adicionalmente, las pruebas FISH como INFORM™ (comercializado por Ventana, Arizona) o PATHVISION™ (Vysis, Illinois) pueden ser realizadas en tejido tumoral embebido en parafina fijado en formol para determinar la extensión (si la hay) de la amplificación de HER2 en el tumor. En una realización, el cáncer será el que expresa (y tal vez sobreexpresa) EGFR, dicha expresión podrá ser evaluada con los métodos de evaluación de expresión HER2 tal y como se ha indicado más arriba. La sobreexpresión o amplifiación del receptor HER o ligando HER también puede evaluarse utilizando una prueba diagnóstica in vivo, por ej . administrando una molécula (como un anticuerpo) que liga la molécula para que sea detectada y va marcada con una etiqueta detectable (como un isótopo radioactivo) y escaneando externamente al paciente para localizar la etiqueta. IV. Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de los inhibidores de la dimerización de HER utilizados de acuerdo con esta invención se preparan para su almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores opcionales que sean farmacéuticamente aceptables ( Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16a edición, Oslo, A. Ed. (1980)), generalmente en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. También se contemplan los cristales de anticuerpo (véase solicitud de patente de EE.UU. 2002/0136719) . Los vehículos, excipientes o estabilizadores no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones como el fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos, antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico y metionina; conservantes (como por ejemplo el cloruro de octadecildimetilbenzilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de benzetonio; fenol; alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos como por ejemplo metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como por ejemplo polivinilpirrolidona; aminoácidos como por ejemplo la glicina, glutamina, asparragina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes como por ejemplo EDTA; azúcares como por ejemplo sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones que forman sales como por ejemplo sodio; complejos metálicos (por ej . complejos Zn-proteina) ; y/o tensioactivos no iónicos como por ejemplo TWEENJ, PLURONICSJ o polietilenglicol (PEG). Las formulaciones de anticuerpos liofilizados tal y como se describen en el documento WO 97/04801 se incorporan específicamente como referencia en la presente memoria descriptiva . La formulación de pertuzumab preferida para uso terapéutico comprende 30 mg/mL de pertuzumab en acetato de histidina 20 mM, sacarosa 120 mM, 0,02% de polisorbato 20 con un pH de 6,0. Una formulación alternativa de pertuzumab comprende 25 mg/mL de pertuzumab, solución de histidina-HCl 10 mM, sacarosa 240 mM, 0,02% de polisorbato 20, con un pH de 6,0.

La formulación de la presente memoria descriptiva también contiene más de un compuesto activo tal y como sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, preferentemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre si. Varios fármacos que se pueden combinar con el inhibidor de la dimerización de HER se describen en la sección de procedimiento que viene a continuación. Dichas moléculas están presentes en combinación en cantidades que sean eficaces para el fin que se busca. Los ingredientes activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente), en sistemas de presentación de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanoparticulas y nanocápsulas), o en macroemulsiones . Dichas técnicas se desvelan en Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 16 edición, Osol, A., Ed., (1980). Se pueden preparar preparaciones de liberación controlada. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de elementos moldeados, por ej . películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación controlada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli- (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli- (vinilalcohol) ) , poliláctidos (patente de los Estados Unidos N° 3.773.919), copolimeros de ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradables como por ejemplo LUPRON DEPOTJ (microesferas inyectables compuestas por copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico y acetato de leuprolida) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico .

Las formulaciones para utilizar en administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles. V. Tratamiento con inhibidores de la dimerización de HER La presente invención proporciona un método para extender el tiempo hasta progresión de la enfermedad (TTP) o supervivencia en un paciente de cáncer, cuyo cáncer presenta activación de HER, que consiste en administrar un inhibidor de la dimerización de HER al paciente en una cantidad que alargue el TTP o la supervivencia del paciente. Preferentemente, el inhibidor de la dimerización de HER es un inhibidor de dimerización HER2 y/o inhibe la heterodimerización de HER. En una realización, el cáncer del paciente muestra activación HER2, incluyendo fosforilación de HER2. Preferiblemente, la fosforilación de HER2 se evalúa utilizando una prueba fosfo-ELISA. Alternativamente, la activación de HER2 puede evaluarse creando perfiles de expresión génica o detectando dímeros o heterodímeros de HER. Más arriba, en la sección de definición, se indican ejemplos de varios cánceres que se pueden tratar con un inhibidor de la dimerización de HER. Los cánceres más indicados incluyen cáncer de ovario; cáncer de peritoneo; cáncer de trompa de falopio; cáncer de mama, incluido cáncer de mama metastático (MBC) ; cáncer de pulmón, incluido cáncer de pulmón de células pulmonares no pequeñas (NSCLC) ; cáncer de próstata; y cáncer colorrectal. En una forma de realización, el cáncer que se trata es un cáncer avanzado, refractario, recurrente, resistente a la quimioterapia y/o un cáncer resistente al platino. La terapia con inhibidor de la dimerización de HER extiende TTP y/o supervivencia. En una realización, la terapia con inhibidor de la dimerización de HER extiende el TTP o la supervivencia al menos un 20% más que el TTP o la supervivencia alcanzada administrando un agente antitumoral aprobado, o la asistencia estándar para el cáncer que se está tratando. En la realización preferida, la invención supone un método para extender el tiempo hasta progresión de la enfermedad (TTP) o supervivencia en pacientes con cáncer de ovario, peritoneo o de trompa de falopio que consiste en administrar un inhibidor de la dimerización de HER al paciente en una cantidad que alargue el TTP o la supervivencia del paciente, siempre y cuando el cáncer el paciente muestre activación de HER2. El paciente puede tener un cáncer de ovario, peritoneo o trompa de falopio avanzado, refractario, recurrente, resistente a la quimioterapia y/o un resistente al platino. La administración de pertuzumab al paciente puede, por ejemplo, extender TTP o supervivencia al menos un 20% más el TTP o la supervivencia alcanzada administrando topotecan o doxorrubicina liposomal a un paciente de estas características. El inhibidor de la dimerización de HER2 se administra al paciente humano de acuerdo con los procedimientos conocidos, como por ejemplo la administración intravenosa, por ej . como un bolo o una infusión continua durante un período de tiempo, mediante vías intramusculares, intraperitoneales, cefalorraquídeas, subcutáneas, intraarticulares, intrasinoviales, intratecales, orales, tópicas o por inhalación. Se prefiere la administración intravenosa del anticuerpo. Para la prevención o tratamiento del cáncer, la dosis adecuada del inhibidor de la dimerización de HER dependerá del tipo de enfermedad que se tratará, tal y como se define anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra para fines preventivos o terapéuticos, la terapia anterior, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico tratante. En una realización, se administra una dosis fija de inhibidor de la dimerización de HER. La dosis fija se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos. Si se administra una dosis fija, la cantidad preferible se encuentra entre unos 20mg y unos 2000 mg del inhibidor de la dimerización de HER. Por ejemplo, la dosis fija puede ser de aproximadamente 420mg, aproximadamente 525mg, aproximadamente 840mg, o aproximadamente 1050mg del inhibidor de la dimerización de HER, como pertuzumab. Si se administran una serie de dosis, pueden administrarse, por ejemplo aproximadamente cada semana, aproximadamente cada 2 semanas, aproximadamente cada 3 semanas, o aproximadamente cada 4 semanas, pero preferiblemente aproximadamente cada 3 semanas. La dosis fija puede, por ejemplo, seguirse administrando hasta que la enfermedad progrese, se produzca una reacción adversa, o en otro momento que determine el médico. Por ejemplo, se pueden administrar desde unas dos, tres o cuatro hasta unas 17 dosis fijas o más.

En una realización se administran una o más dosis de carga del anticuerpo seguidas de una o más dosis de mantenimiento del anticuerpo. En otra realización, se administran muchas dosis de la misma cantidad al paciente. Según una realización preferente de la invención, se administra una dosis fija de inhibidor de la dimerización de HER (por ej . pertuzumab) de aproximadamente 840mg (dosis de carga), seguida de una o más dosis de aproximadamente 420mg (dosis de mantenimiento) del anticuerpo. Las dosis de mantenimiento se administran preferentemente aproximadamente cada 3 semanas, por un total de al menos dos dosis, y hasta 17 o más dosis.

De acuerdo con otra realización preferente de la invención, se administran una o más dosis fija(s) de aproximadamente 1050mg del inhibidor de la dimerización de HER (por ej . pertuzumab), por ejemplo cada 3 semanas. Según esta realización, se administran una, dos o más de las dosis fijas, por ej . durante hasta un año (17 ciclos), y más tiempo si así se desea. En otra realización, una dosis fija de inhibidor de la dimerización de HER (por ej . pertuzumab) de aproximadamente 1050mg se administra como dosis de carga, seguida de una o más dosis de aproximadamente 525mg. De acuerdo con esta realización, se pueden administrar una, dos o más dosis de mantenimiento al paciente cada 3 semanas. Mientras que el inhibidor de la dimerización de HER puede administrarse como agente antitumoral único, el paciente es tratado opcionalmente con una combinación del inhibidor de la dimerización de HER, y uno o más agente (s) quimioterapéuticos.

Preferentemente al menos uno de los agentes quimioterapéuticos es un agente quimioterapéutico antimetabolito como por ejemplo la gemcitabina. La administración combinada incluye la coadministración o administración concurrente, utilizando formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en la que preferentemente exista un período en el cual ambos (o todos los) agentes activos ejerzan simultáneamente sus actividades biológicas. Por lo tanto, el agente antimetabolito quimioterapéutico se puede administrar antes de, o después de, la administración del inhibidor de la dimerización de HER. En esta forma de realización, el tiempo entre al menos una administración del agente antimetabolito quimioterapéutico y al menos una administración del inhibidor de la dimerización HER es preferentemente de aproximadamente 1 mes o menos, y más preferentemente de aproximadamente 2 semanas o menos. Alternativamente, el agente antimetabolito quimioterapéutico y el inhibidor de la dimerización de HER se administran al mismo tiempo al paciente, en una única formulación o en formulaciones separadas. El tratamiento con la combinación del agente quimioterapéutico (por ej . agente antimetabolito quimioterapéutico como por ejemplo la gemcitabina) y el inhibidor de la dimerización de HER (por ej . pertuzumab) puede ocasionar un beneficio terapéutico sinérgico, o mayor en vez de aditivo, para el paciente. Un agente antimetabolito quimioterapéutico, si se administra, se administra generalmente en dosis conocidas, u opcionalmente disminuidas debido a la acción combinada de los fármacos o a los efectos colaterales negativos atribuibles a la administración del agente antimetabolito quimioterapéutico. Los calendarios de preparación y dosificación para dichos agentes quimioterapéuticos se pueden utilizar de acuerdo a las instrucciones del fabricante y tal y como lo determine empíricamente el médico cualificado. Si el agente antimetabolito quimioterapéutico es la gemcitabina, preferentemente, se administra a una dosis de aproximadamente 600 mg/m2 a 1250 mg/m2 (por ejemplo aproximadamente 1000 mg/m2) , por ejemplo, en los días 1 y 8 de un ciclo de 3 semanas. Además del inhibidor de la dimerización de HER y el agente antimetabolito quimioterapéutico, se pueden combinar otros regímenes terapéuticos. Por ejemplo, se puede administrar un segundo (tercero, cuarto, etc.) agente quimioterapéutico, en donde el segundo agente quimioterapéutico sea otro agente antimetabolito quimioterapéutico diferente o un agente quimioterapéutico que no sea un antimetabolito. Por ejemplo, el segundo agente quimioterapéutico puede ser un taxano (como por ejemplo paclitaxel o docetaxel), capecitabino, o un agente quimioterapéutico basado en platino (como por ejemplo carboplatina, cisplatina, u oxaliplatina) , antraciclina (como por ejemplo doxorrubicina, incluyendo, doxirrubicina liposomal), topotecán, pemetrexed, alcaloide de la vinca (como por ejemplo vinorelbina), y TLK 286. Se puede administrar un "cóctel" de diferentes agentes quimioterapéuticos. Otros agentes terapéuticos que se pueden combinar con el inhibidor de dimerización de HER incluyen uno o más de: un segundo inhibidor de dimerización de HER diferente (por ejemplo, un anticuerpo contra el HER2 inhibidor del crecimiento como por ejemplo trastuzumab, o un anticuerpo contra el HER2 que induzca a la apoptosis de la célula que sobreexpresa el HER2, como por ejemplo 7C2, 7F3, o las variantes humanizadas de ellos); un anticuerpo dirigido contra un tumor diferente asociado al antigeno, como por ejemplo, EGFR, HER3, HER4 ; compuestos antihormonales, por ej . un compuesto antiestrogénico como por ejemplo el tamoxifén, o un inhibidor de la aromatasa, un cardioprotector (para evitar o disminuir cualquier disfunción miocárdica asociada con la terapia) ; una citoquina; un fármaco que actúe sobre la EGFR (como por ejemplo TARCEVA®, IRESSA® o cetuximab) ; un agente antiangiogénico (especialmente bevacizumab vendido por Genentech bajo la marca registrada de AVASTIN™) ; un inhibidor de la tirosina quinasa; un inhibidor de la COX (por ejemplo un inhibidor de la COX-1 o la C0X-2); un fármaco antiinflamatorio no esteroideo; celecoxib (CELEBREX®) ; inhibidor de la farnesil transferasa (por ejemplo Tipifarnib/ZARNESTRA® R115777 disponible de Johnson and Johnson o Lonafarnib SCH66336 disponible de Schering-Plough) ; anticuerpo que une la proteina CA 125 oncofetal como por ejemplo Oregovomab (MoAb B43.13); vacuna contra el HER2 (como por ejemplo la vacuna HER2 AutoVac de Pharmexia o la vacuna proteica APC8024 de Dendreon, o la vacuna peptídica contra el HER2 de GSK/Corixa) ; otra terapia contra HER (por ej . trastuzumab, cetixumab, ABX-EGF, EMD7200, gefitinib, erlotinib, CP724714, CI1033, GW572016, IMC-11F8, TAK165, etc.); inhibidor de la Raf y/o ras (consultar, por ejemplo, documento WO 2003/86467); inyección de liposoma doxorrubicina HCl (DOXIL®), un inhibidor de la topoisomerasa I como topetecan; taxano; un inhibidor de la tirosina quinasa dual HER2 y EGFR como lapatinib/GW572016; TLK286 (TELCYTA®) ; EMD-7200; un medicamento que trate las náuseas como por ejemplo un antagonista de la serotonina, un esteroide o una benzodiacepina; un medicamento que evite o trate los sarpullidos cutáneos o terapias estándar contra el acné, incluyendo antibióticos tópicos u orales; un medicamento que trate o prevenga la diarrea; un medicamento que disminuya la temperatura corporal como por ejemplo acetaminofeno, difenhidramina o meperidina; o factor de crecimiento hematopoyético, etc. Las dosis adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados antes mencionados son aquellas que se utilizan actualmente y se pueden disminuir debido a la acción combinada (sinergia) del agente y el inhibidor de dimerización de HER.

Además de los regímenes terapéuticos antes mencionados, el paciente puede someterse a la eliminación quirúrgica de las células cancerígenas y/o a radioterapia.

Si el inhibidor es un anticuerpo, preferiblemente el anticuerpo administrado será un anticuerpo desnudo. Sin embargo, el inhibidor administrado se puede conjugar con un agente citotóxico. Preferentemente, el inhibidor conjugado y/o antígeno al que se une lo internaliza la célula, ocasionando una mayor eficacia terapéutica del inhibidor conjugado para matar la célula cancerígena a la cual se une. En una forma de realización preferida, el agente citotóxico actúa o interfiere con el ácido nucleico en la célula cancerígena. Ejemplos de dichos agentes citotóxicos incluyen maitansinoides, calicheamicinas, ribonucleasas y ADN endonucleasas. Esta solicitud también contempla la administración del inhibidor de la dimerización de HER por terapia genética. Consultar, por ejemplo, el documento WO96/07321 publicado el 14 de marzo de 1996 con respecto al uso de la terapia génica para generar anticuerpos intracelulares. Existen dos enfoques más importantes para introducir el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células de un paciente; in vivo y ex vivo . En la administración in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, generalmente en el lugar en el cual se requiere el anticuerpo. Para el tratamiento ex vivo, se retiran las células del paciente, el ácido nucleico se introduce en estas células aisladas y las células modificadas se administran al paciente ya sea directamente o, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que se implantan en el paciente (consultar, por ej . patentes de los Estados Unidos Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere a una célula en cultivo in vi tro, o en células in vivo del huésped deseado. Las técnicas adecuadas a la transferencia de ácido nucleico en células de mamífero in vi tro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación de fosfato calcico, etc. Un vector utilizado comúnmente para la transferencia ex vivo del gen es un retrovirus . Las técnicas actualmente preferidas para la transferencia de ácido nucleico in vivo incluyen la transfección con vectores virales (como por ejemplo un adenovirus, el virus de la Herpes simple I o un adenovirus asociado) y sistemas basados en lipidos (los lipidos útiles para la transferencia mediada por lipidos del gen son DOTMA, DOPE y DC-Col, por ejemplo) . En algunas situaciones es deseable proporcionar a la fuente de ácido nucleico un agente dirigido a la célula diana, como un anticuerpo específico para una proteína de la membrana celular de la célula diana, un ligando para un receptor de la célula diana, etc. Si se utilizan liposomas, pueden utilizarse proteínas que se unen a una proteína de la membrana de la superficie celular asociada con la endocitosis para dirigir y/o para facilitar la captación, es decir, las proteínas de la cápside o fragmentos de ellas trópicos para un tipo de célula en especial, anticuerpos para proteínas que se internalizan cíclicamente, y proteínas dirigidas a la localización intracelular y que mejoran la semivida intracelular. La técnica de endocitosis mediada por un receptor se describe, por ejemplo, en Wu et al . , J. Biol . Chem . 262:4429-4432 (1987); y Wagner et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 87:3410-3414 (1990).

Como revisión de los protocolos actualmente conocidos para la marcación de genes y la terapia génica, consultar Anderson et al . , Science 256:808-813 (1992). Consultar también el documento WO 93/25673 y la referencia citada en el mismo. VI . Depósito de materiales Las siguientes líneas celulares de hibridoma se han depositado en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC) : Designación del anticuerpo ATCC N° Etecha de depósito 7C2 ATCC HB-12215 17 de octubre de 1996 7F3 ATCC HB-12216 17 de octubre de 1996 4D5 ATCC CRL 10463 24 de mayo de 1990 2C4 ATCC HB-12697 8 de abril de 1999 En los siguientes ejemplos no limitantes se proporcionan más detalles de la invención. Las divulgaciones de todas las citas de la memoria descriptiva han sido expresamente incorporadas como referencia.

EJEMPLO 1 ACTIVIDAD CLÍNICA DEL PERTUZUMAB EN CÁNCER DE OVARIO AVANZADO, REFRACTARIO O RECURRENTE Y EL PAPEL DEL ESTADO DE ACTIVACIÓN DE HER2 Este ejemplo se refiere a un estudio clínico abierto de fase II multicéntrico de brazo único en pacientes con cáncer de ovario. Los pacientes con cáncer de ovario avanzado, refractario o recurrente fueron tratados con pertuzumab, un anticuerpo contra HER2 humanizado. El pertuzumab representa un nuevo tipo de agentes dirigidos llamados inhibidores de la dimerización de HER (HDIs) que inhibe la dimerización de HER2 con EGFR, HER3 y HER4, e inhibe la señalización entre MAP y quinasa P13.

Se inscribió a 65 pacientes con cáncer de ovario reincidente, con 61 recibiendo terapia con "dosis baja" del agente único pertuzumab; el pertuzumab se administró intravenosamente (IV) con una carga de 840mg seguidos por 420mg cada 3 semanas. Un segundo grupo de pacientes fue tratado con una "alta dosis" de pertuzumab; 1050mg cada 3 semanas, administrados como agente único. En este grupo se inscribió a 64 pacientes, de los cuales 62 recibieron tratamiento. Se realizaron evaluaciones del tumor después de 2, 4, 6, 8, 12 y 16 ciclos. El índice de respuesta (RR) según RECIST fue el primer punto de valoración. Las biopsias de tumor fueron obligatorias para evaluar el estado de fosforilación de HER2 (pHER2) utilizando un ensayo de inmunoabsorción enzimática tal y como se describen en el Ejemplo 2 que viene a continuación. Se evaluó el pHER2 de los sujetos del grupo 1. También se evaluaron la seguridad y tolerabilidad. Los puntos de valoración secundarios fueron TTP, duración de la respuesta, duración de la supervivencia, farmacocinética (PK) y FOSI (grupo 2) . Resultados En la figura 9 se muestran los datos demográficos de los pacientes. La edad media era de 57 años (edades comprendidas entre los 35 y los 83 años) y la ECOG PS media fue 2. La cifra media de regímenes de quimioterapia previos era de 5. Las figs. 10-14 representan las reacciones adversas en los pacientes tratados. El pertuzumab fue bien tolerado. El 61% de los pacientes experimentaron diarrea (grado 1-3) . El 5% de pacientes experimentaron una caída en la fracción de eyección a menos del 50%. La eficacia de los resultados se resume en la fig. 15. El 4% de los pacientes mostró una respuesta parcial (PR) . El 39% de los pacientes mostró enfermedad estable (SD) . Tal y como se muestra en la fig. 16, el TTP medio de los pacientes tratados con 420mg de pertuzumab fue de 7 semanas y, en el caso de pacientes tratados con 1050mg de pertuzumab, 6,6 semanas. La fig. 17 muestra la supervivencia general de los pacientes tratados con dosis alta o baja de pertuzumab. La supervivencia media fue de 40 semanas. En la fig. 18 se muestran las respuestas CA-125. El pertuzumab fue eficaz en la reducción de los niveles CA-125. Esta reducción es una indicación de la eficacia terapéutica en el cáncer de ovario. Se evaluó el estado de activación de HER2 en los pacientes del grupo 1, tratados con 420mg de pertuzumab. Los resultados se muestran en las figs. 19-23. Aproximadamente el 30% de los sujetos con cáncer de ovario registraron pHER2 positivo (más del 30% del tumor, se realizó la prueba ELISA descrita en el Ejemplo 2) . Entre los sujetos evaluables para datos de eficacia y pHER2, el 26% registraron pHER2 positivo. Consultar fig. 19 El TTP medio de los pacientes pHER2+ fue de 21 semanas, a comparar con las 6 semanas de los pacientes pHER2-, y 9 semanas de los pacientes con estado pHER2 desconocido (figs. 20 y 22).

Catorce de los 61 pacientes del grupo 1 mostraron evidencia de actividad de pertuzumab. El único paciente con una respuesta parcial (PR) fue fosfo-HER2 positiva. Consultar fig. 21 También se evaluó la supervivencia global de los pacientes. Tal y como se muestra en la fig. 23, la supervivencia global de los pacientes con pHER2 positivo tratados con pertuzumab parece superior a la supervivencia alcanzada con topotecan (supervivencia media 43 semanas) o doxorrubicina liposomal (36 semanas). Conclusiones Como agente simple, el pertuzumab se tolera bien. La toxicidad y eficacia del pertuzumab no parecen estar relacionados con la dosis. Pertuzumab actúa sobre el cáncer de ovario avanzado, refractario o recurrente. Los sujetos con estado pHER2 positivo mostraron mejoras en el TTP y la eficacia de supervivencia en comparación con sujetos con estado pHER2 negativo. La eficacia del pertuzumab, medida por TTP o supervivencia, en pacientes con activación HER2 fue superior a la alcanzada con el uso de topotecan o doxorrubicina liposomal, los agentes que se utilizan actualmente para tratar a pacientes con cáncer de ovario avanzado, refractario o recurrente.

EJEMPLO 2 FOSFO-HER2 ELISA PARA DETERMINAR LA ACTIVACIÓN DE HER2 El Ejemplo 1 que aparece sobre estas líneas describe el estudio clínico que evaluó la eficacia del pertuzumab en sujetos con cáncer de ovario avanzado, refractario o recurrente. Este ejemplo describe el desarrollo de la prueba utilizada para determinar la activación de HER2 en los pacientes tratados en el Ejemplo 1. El fosfo-HER2 ELISA fue desarrollado para medir la concentración de fosforilación de la tirosina asociada a HER-2 (HER2/pTyr) en lisados de tejido tumoral de ovario humano. La prueba utiliza placas con 96 pocilios de microvaloración de media área COSTAR™ debido al limitado volumen de la muestra.

El anticuerpo de revestimiento es un anti-HER2 ECD de cabra de afinidad purificada, y el segundo anticuerpo es un murino monoclonal biotinilado (clon 4G10) específico para la fosfotirosina. El estándar de referencia es un lisado celular SK-BR-3 con una dosificación de 132 U/mL. Una unidad iguala la cantidad de tirosina fosforilada medida en un lisado celular SK-BR-3, que contiene un total de 277 HER2 pg, tal y como determina el Total HER2 ELISA (Total HER2 ELISA) . El ELISA utiliza streptavidina-HRP AMDEX™ para detección, y TMB como sustrato. Materiales 1. Material estándar, Lisado celular SK-BR-3 1,056 U/mL HER2/pTyr 2. Fuente de control, Lisado celular SK-BR-3 1,056 U/mL 3. Anticuerpo de revestimiento, 9, 6 mg/mL de anti-HER2 ECD de cabra 4. Anticuerpo secundario, murino antifosfotirosina biotinilado, clon 4G10, 971 µg/mL (Upstate Biotech Cat #16-103) . Streptavidina AMDEX™ conjugada a HRP (SA-HRP) (Amersham Biosciences Catalog No. RPN4401) 6. Sustrato, Sustrato de peroxidasa de tetrametilbenzidina (Kirkegaard y Perry Labs [KPL] N° de catálogo 50-76-01) 7. Tampón de revestimiento, tampón de carbonato de sodio 0,05 M, pH 9, 6 8. Diluyente del ensayo, PBS/0,5% BSA/0,05% Polisorbato 20/0,05% PROCLIN 300™, pH 7.4 9. Tampón de lisis: Tampón de lisis base (50 mM Tris-HCl/150 mM NaCl/5 mM EDTA/1% TRITÓN X-100™)/1:10 Cóctel inhibidor de la proteasa/1 : 100 Cóctel inhibidor de la fosfatasa 1/1:100 Cóctel inhibidor de la fosfatasa 11/ 50 mM fluorido de sodio/2 mM ortovanadato de sodio, pH 8.1 . Diluyente de muestra, estándar y control: tampón de lisis 11. MDA-468 (ATCC# HTB-132). Nivel de expresión de HER2 : Ninguno. Tejido: glándula mamaria humana, pecho, adenocarcinoma 12. MCF-7 (ATCC# HTB-22). Nivel de expresión de HER2 : 0 (niveles de expresión normales de HER2). Tejido: glándula mamaria humana, pecho, epitelial, metástasis: adenocarcinoma efusión pleural 13. SK-BR-3 (ATCC# HTB-30, Manassas, VA) . Nivel de expresión de HER2 : 3 (alto nivel de sobreexpresión de HER2 ) . Tejido: glándula mamaria humana, pecho, metástesis: adenocarcinoma efusión pleural 14. BT-474 (ATCC# HTB-20, Manassas, VA) . Nivel de expresión de HER2 : 3 (alto nivel de sobreexpresión de HER2 ) . Tejido: glándula mamaria humana, pecho, ducto, carcinoma ductal . Lisado tumoral BT-474. Se inoculó BT-474 en ratones. Dos semanas más tarde se recogieron tumores. Los tumores recogidos se homogeneizaron para producir lisados tumorales Preparación de materiales Material/Stock estándar: El stock estándar de fosfo HER2 ELISA es el Material Estándar. El material estándar se preparó recogiendo lisados de tres placas de cultivos celulares de 245x245 mm que contenían células SK-BR-3 (SKBR3), confluyentes entre un 80% y un 90%. Los lisados celulares fueron clarificados por centrifugación y se recogió el sobrenadante. El sobrenadante se utiliza como material estándar. Se asignó una concentración de 1,056 U/mL al material estándar, de tal modo que el calibrador más bajo de la gama indicadora de la prueba fuera de 1 U/mL. Una unidad se define como la cantidad de tirosina fosforilada medida en un lisado celular SK-BR-3, que contiene un total de 277 HER2 pg, tal y como determina el Total HER2 ELISA. Controles de lisado celular: Los controles de lisado celular se prepararon a partir del material estándar. El material estándar se diluyó en el tampón de lisis para obtener niveles de HER2/pTyr que representen las gamas baja, media y alta de la curva estándar de la prueba.

Controles de lisado de tejido : Los controles de lisado de tejido se prepararon a partir de los lisados tumorales BT474.

Los lisados tumorales BT474 se diluyeron en el tampón de lisis para obtener niveles de HER2/pTyr que representen la gama alta de la curva estándar de la prueba. Fuente del revestimiento : El Stock I de anti-HER2 ECD de cabra se preparó diluyendo el material fuente (9,6 mg/mL) a 100 µg/mL en PBS. Conjugado biotinilado : El anticuerpo murino antifosfotirosina biotinilado (1 µg/mL) fue adquirido a Upstate Biotech. Este anticuerpo es un anticuerpo biotinilado, purificado de proteina A, monoclonal IgG2b-kappa producido contra fosfotiramina, unido a KLH. El anticuerpo biotinilado antifosfotirosina monoclonal (clon 4G10, Cat #05-321) es especifico para la fosfotirosina y no reacciona con fosfoserina ni fosfotreonina . Especificidad de anti-HER2 ECD de cabra : La activación del receptor HER2 se inicia cuando se produce dimerización con otros miembros de la familia. A no ser que la señalización se debe estrictamente a la homodimerización de HER2, EGFR, HER3, y/o HER4 deberán expresarse dentro del tumor activo. Cada uno de estos receptores puede estar presenta en las muestras de lisado de tejido de ovario y podría interferir en la precisión de medición de la fosforilación de la tirosina asociada a HER2 (HER2/pTyr) si estos receptores reaccionan con el anticuerpo de revestimiento. La especificidad del anticuerpo anti-HER2 ECD de cabra se determinó mediante análisis de resonancia plasmon de superficie (BIACORE 3000®, BIACORE® International AB, Neuchátel, suiza) . El anticuerpo anti-HER2 ECD de cabra fue inmovilizado en un chip sensor CM5 utilizando química de acoplamiento amino. El chip sensor fue bloqueado con 1 M de etanolamina-HCl, pH 8,5, y acondicionado con 10 mM HCl. La especificidad se determinó inyectando el recombinante soluble EGFR (sEGFR) (Research Diagnostics, Inc., Flanders, NJ) y proteínas recombinantes humanas HER2 ECD/proteínas IgGl de fusión Fc humana sobre el anticuerpo anti-HER2 de cabra inmovilizado. Las proteínas de fusión consistían en el ECD de HER2, HER3, o HER4 fusionados con la región Fc de extremo carboxi terminal 6X marcado con histidina de IgGl humana mediante un conector de péptido (R&D Systems, Minneapolis, MN) . Las respuestas relativas de referencia sustraídas para sEGFR, HER3-FC y HER4-Fc fueron -41 RU, 0,3 RU, y 2,5 RU, respectivamente. La negativa respuesta relativa obtenida para sEGFR se debió a los cambios del índice de refracción entre la fase móvil (HBS-EP) y el excipiente de muestra. La respuesta relativa de HER2-FC fue 374 RU .

Métodos El fosfo HER2 ELISA utiliza placas COSTAR™ de media área (A/2) recubiertas con anti-HER2 ECD de cabra a 4 µg/mL en tampón de carbonato sodio de 0,5 M, pH 9,6, e incubadas 18-72 horas a 2°C-8°C. Los pocilios están bloqueados con aproximadamente 150 µL de diluyente de pruebas por pocilio durante 1-2 horas y a continuación se añaden 50 µL de estándares, controles y muestras por pocilio. La dilución mínima para lisados de tejido de tumor de ovario es 1/40 en tampón de lisis. Los estándares, controles y muestras se incuban 2 horas a temperatura ambiente con agitación. Los pocilios se lavan con PBS/0.05 TWEEN 20™ y se les añade 250 ng/mL de antifosforina biotinilada. Dos horas más tarde, los pocilios e lavan y se les añade la streptavidina-HRP AMDEX™. La streptavidina-HRP AMDEX™ (SA-HRP) es un conjugado polimérico con múltiples enzimas marcadas vinculadas a streptadivina . Al cabo de 15 minutos los pocilios se lavan y se añade un sustrato de tetrametilbenzidina (TMB) que se desarrolla durante 15 minutos antes de ser detenida con 1 M de ácido fosfórico. La absorbencia se mide mediante un lector de placas SPECTRAMAX™ (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) con un filtro de 450 nm y un filtro de referencia de 650 nm. Las concentraciones de muestra se calculan en relación a un encaje logístico no lineal de cuatro parámetros de una curva estándar de siete puntos (Marquardt, D. J. Soc. Indust . Appl . Ma th . 431-441 (1963)). La gama de prueba del ELISA es de 1 a 32 U/mL. Las unidades son unidades arbitrarias, donde 1 U equivale a la cantidad de tirosina fosforilada medida en un lisado celular SK-BR-3 que contiene 277 pg de HER2 total. El límite inferior del ensayo se fijó en 1 U/mL y vino definido por el límite inferior de detección. La precisión del fosfo HER2 ELISA fue re-evaluada después de reasignar la concentración de material estándar. Se evaluó la precisión intraprueba e interprueba determinando el coeficiente de variación (CV) de HER2/pTyr en un lisado celular SKBR3 a tres niveles distintos. El lisado celular SKBR3 se diluyó para obtener niveles de HER2que representen las gamas baja, media y alta de la curva estándar de la prueba. Después de reasignar la concentración de material estándar, el control alto no encajaba con los parámetros de la gama alta de la curva estándar de la prueba. Por tanto, se diluyó un lisado de tejido de control BT474 para quedar dentro de los parámetros de la gama alta. Los lisados, que se utilizaron como controles de prueba, se analizaron en duplicado durante 5 dias. Los datos de control se importaron a STATVIEW para determinar con la ayuda de un análisis ANOVA™ la desviación estándar intraprueba e interprueba.

Los CVS se calcularon de la manera siguiente: 100 x (Desviación estándar) / (valor de control medio) Los CVs de precisión intraprueba fueron de 4%, 4%, 3%, y 11% para los controles BT474, Alto, Medio y Bajo, respectivamente. Los CVs de precisión interprueba fueron de %, 6%, 5%, y 14% para los controles BT474, Alto, Medio y Bajo, respectivamente . Durante el desarrollo del fosfo HER2 ELISA, se diluyó un lisado celular SKBR3 a 22,9, 6,39, y 1.71 U/mL en lisado celular MDA468 neto. Las muestras se diluyeron en un tampón de lisis que contenía SKBR3 HER2/pTyr para mantener un nivel de HER2/pTyr constante a lo largo de toda la serie de dilución mientras que se diluían los efectos matriz. La serie de diluciones fue analizada en el Fosfo HER2 ELISA y comparada con SKBR3 HER2/pTyr sin MDA468 para determinar la recuperación. El porcentaje de recuperación se calculó de la manera siguiente : 100 x SKBR3 HER2/pTyr diluido en MDA468 SKBR3 HER2/pTyr diluido en el tampón de lisis Los resultados de recuperación de SKBR3 HER2/pTyr en los tres niveles en presencia de lisado celular MDA468 revelaron que la matriz mejora significativamente la recuperación en las diluciones de muestra entre neto y 1/16 a nivel 1,71 U/mL, con recuperaciones HER2/pTyr entre el 120% y el 127%. La interferencia de la matriz no se observó en ningún otro nivel. En todos los niveles se demostró una recuperación de entre el 80% y el 120% contando a partir de la dilución de muestra de 1/16 en el tampón de lisis. Los lisados de ovario y tumor BT474 se diluyeron en serie dos veces en el tampón de lisis y fueron posteriormente analizados en el Fosfo HER2 ELISA. La dilución inicial para las muestras de BT474, que se analizaron durante el desarrollo, fue 1/20. Los lisados de ovario se analizaron después de reasignar la concentración del material estándar. La dilución inicial de los lisados de ovario varió según las concentraciones de HER2/pTyr esperadas. La diferencia porcentual de la serie de diluciones, que es un indicador de la linealidad de la dilución de muestra, se calculó tal como se indica a continuación: 100 x (mayor valor de resultado corregido - menor valor de resultado corregido) (media de los valores mayor y menor de resultado corregido) Las diferencias porcentuales para el lisado de tejido de ovario HF8198 se calcularon empezando en una dilución de 1/80, 1/160, o 1/320. Las diferencias porcentuales para el lisado de tejido de ovario HF7945 se calcularon empezando en una dilución de 1/320, 1/640, o 1/1280. Las diferencias porcentuales de los lisados de tejido de ovario restantes se calcularon empezando en una dilución de 1/20 o 1/40 para determinar la dilución minima además de evaluar la linealidad de la dilución. Las diferencias de la serie de dilución BT474 estuvieron entre -9% y 12%. Las diferencias de las series de diluciones HF7930 y HF7934 empezando en una dilución de 1/10 fueron del 43% y el 38% respectivamente. Las diferencias de HF8197 fueron del 2%, 8% y 5% para series de dilución que empezaban en 1/320, 1/160 y 1/1280, respectivamente. Las diferencias de HF8198 fueron del 72%, 34% y 3% para series de dilución que empezaban en 1/80, 1/160 y 1/320, respectivamente. Después de cambiar la concentración del material estándar, se analizaron dieciocho lisados de tejido de ovario distintos en el Fosfo HER2 ELISA. Las muestras se diluyeron dos veces empezando de 1/20 a 1/160. Una muestra era LTR a dilución 1/20; 10 muestras eran LTR a dilución 1/40. Siete muestras tenían niveles medibles de HER2/pTyr en diluciones 1/20 y 1/40, y una muestra tenia niveles medibles de HER2/pTyr incluso en dilución 1/80. Las diferencias entre las muestras que tenían niveles medibles de HER2/pTyr en diluciones 1/20 y 1/40 estaban entre 16% y 34%, con tres de las siete muestras presentando diferencias inferiores al 20%. La muestra que tenía niveles de HER2/pTyr medibles incluso en dilución 1/80, la muestra HF7931, presentaba diferencias del 16% y 4% en las series de dilución que empezaban a 1/20 y 1/40, respectivamente. El pertuzimab y el trastuzumab fueron analizados en el fosfo HER2 ELISA para determinar si interferían. Los anticuerpos fueron disueltos a concentraciones de entre 1,5 y 10.000 ng/mL en lisados celulares estimulados en heregulina MCF7 (MCF7+ ) con un contenido de 98,48 U/mL de HER2/pTyr. Durante el desarrollo, los lisados celulares y de tejido fueron sometidos a cuatro ciclos de congelación y descongelación para determinar los efectos de los ciclos de temperatura. El lisado celular congelado SKBR3 y los lisados tumorales BT474 se descongelaron a temperatura ambiente. Se retiraron 10 µL de cada lisado, y a continuación se diluyeron en el diluyente de pruebas. Los lisados restantes se congelaron instantáneamente en una mezcla de hielo seca y metanol, y a continuación se descongelaron de nuevo. Una vez más se retiraron muestras de prueba, que fueron disueltas en el diluyento de pruebas (primer ciclo de congelación/descongelación, lx) . El procedimiento de congelación instantánea, descongelación y colección de muestras se repitió dos veces para obtener muestras del segundo y tercer ciclo de congelación/descongelación (2x y 3x, respectivamente) .

Las muestras diluidas se analizaron en el fosfo HER2 ELISA para determinar la recuperación de HER2/pTyr respecto a la muestra "fresca". La muestra "fresca" es la muestra recogida de la descongelación inicial. La recuperación de HER2/pTyr en muestras Ix, 2x, y 3x de SKBR3 fue de 104%, 109%, y 113%, respectivamente. La recuperación de HER2/pTyr en la muestra 314A de BT474 fue de 99%, 103% y 99% en las muestras lx, 2x y 3x, respectivamente.

La recuperación de HER2/pTyr en la muestra 365 de BT474 fue de 111%, 96% y 99% en las muestras lx, 2x y 3x, respectivamente.

El Límite inferior de cuantificació (LLOQ) fue definido como la concentración media del control bajo, es decir, 1,35 U/mL. Puesto que el control bajo se incluye en todos los experimentos, es un indicador fiable del limite bajo con el cual se pueden medir las muestras con precisión. Así pues, la concentración mínima cuantificable en el fosfo HER2 ELISA es el LLOQ multiplicado por la dilución de muestra mínima (1/40) , es decir, 54 U/mL.

Conclusiones Se realizó un ELISA sensible y preciso para medir la fosforilación de la tirosina asociada a HER-2 (HER2/pTyr) en lisados de tejido tumoral. El fosfo HER2 ELISA demostró poseer una precisión de hasta 1,35 U/mL con una concentración mínima cuantificable de 54 U/mL, donde 1 U equivale a la cantidad de tirosina fosforilada medida en un lisado celular SK-BR-3 que contiene 277 pg de HER2 total. El fosfo-HER2 ELISA demonstró poseer buena precisión en cuatro niveles. Los CVs de previsión intraprueba fueron de 4%, 3%, 3%, y 11% para los controles de lisado de tejido BT474, y los controles de lisado celular SKBR3 Alto, Medio y Bajo, respectivamente. Los CVs de previsión interprueba fueron de 5%, 6%, 5%, y 14% para los controles de lisado de tejido BT474, y los controles de lisado celular SKBR3 Alto, Medio y Bajo, respectivamente. El fosfo HER2 ELISA demonstró una buena recuperación de HER2/pTyr en presencia de lisado celular MDA468. Empezando con una dilución a 1/16, las recuperaciones variaron entre el 88% y el 120%. ELISA demonstró una gran especificidad, puesto que EGFR, HER3-IgG Fc, y HER4-IgG Fc no reaccionan con el revestimiento de la prueba. El tumor de ovario humano y los lisados de tejido tumoral xenotransplantado de ratón BT474 se utilizaron para analizar la linealidad de la dilución y la dilución mínima de muestra. Las diferencias de los valors corregidos de dilución para los lisados tumorales de BT474 estuvieron entre -9% y 12%. De lo siete lisados de ovario que tenían niveles medibles de HER2/pTyr en diluciones a 1/20 y 1/40, sólo tres tenían diferencias inferiores al 20%, mientras que seis de los siete presentaban diferencias inferiores o iguales al 23%. La muestra que tenia niveles de HER2/pTyr medibles incluso en dilución 1/80, la muestra HF7931, presentaba diferencias del 4% en la serie de dilución que empezaba a 1/40. Ninguna de las muestras anteriores cumplió con el criterio de <20% en una dilución mínima de 1/20 y, por tanto, la dilución mínima de muestra será 1/40. Los lisados de tejido BT474 y las muestras de lisado de tejido de ovario humano HF8197 y HF8198 mostraron niveles medibles elevados de HER2/pTyr y requirieron diluciones de entre 1/80 y 1/320 para quedar en los parámetros del alcance cuantitativo de la prueba. Las muestras BT474 y la muestra HF8197, que registró la concentración de HER2/pTyr más elevada en el subconjunto de tejido de tumor de ovario humano, se diluyó linealmente en todo el alcance de la prueba. En cambio, la muestra HF8198 no se diluyó linealmente, puesto que las concentraciones de HER2/pTyr corregidas para dilución se incrementaron monotónicamente en todo el alcance de la prueba y parecieron estabilizarse en una dilución 1/320. Los lisados celulares SKBR3 sometidos a tres ciclos de congelación/descongelación mostraron una muy buena recuperación. La recuperación HER2/pTyr estuvo entre el 104% y el 113% en comparación con la misma muestra recién descongelada .

Dos lisados de tumor BT474 también fueron sometidos a tres ciclos de congelación/descongelación. La recuperación fosfo HER2 de BT474 estuvo entre el 99% y el 103%. La recuperación HER2/pTyr de BT474 estuvo entre el 96% y el 111%. Por tanto, parece que los ciclos de temperatura no afectan la actividad fosfo HER2. El fosfo HER2 ELISA no demuestra ninguna interferencia ni de pertuzumab o trastuzumab.

EJEMPLO 3 CREACIÓN DE PERFILES DE EXPRESIÓN GÉNICA PARA DETERMINAR ACTIVACIÓN DE HER2 Este ejemplo muestra cómo la activación de HER2 puede evaluarse determinando la creación de perfiles de expresión génica como alternativa para determinar directamente la fosforilación de HER2. Esta creación de perfiles puede hacerse en especímenes frescos, congelados, o especímenes de tumor de ovario fijados en formol y embebidos en parafina, pero preferiblemente en estos últimos. Los especímenes de cáncer de ovario tratados con pertuzumab se perfilaron para expresión génica utilizando el análisis de micromatriz AFFYMETRIX® realizado siguiendo las instrucciones del fabricante. Los datos de la expresión de las micromatrices se analizaron para identificar los patrones génicos que se asociarían al estado de fosforilación de HER2. Sorprendentemente, emergió un patrón en donde los tumores con altos niveles relativos de expresión de EGFR, HER2, HER3 y del ligando de HER betacelulina también fueron positivos para la fosforilación de HER2. La correlación fue positiva en seis de los seis casos positivos de fosforilación de HER2, y ninguno de los casos negativos de fosforilación de HER2 se predijeron como negativos utilizando datos de expresión de micromatriz como base para el algoritmo. En un segundo análisis, la predicción del estado de fosforilación de HER2 se logró utilizando un único gen, llamado betacelulina. Los seis tumores positivos en la fosforilación de HER2 tenían una expresión de betacelulina por encima de la mediana, nuevamente utilizando datos de expresión de las micromatrices. Un segundo método de cuantificación de la expresión génica, la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) , fue utilizado para validar, y fue comparado con los datos de micromatriz. El método qRT-PCT sería preferible para medir la expresión génica en una muestra de paciente típica disponible en un entorno clinico. Ya se han establecido plataformas de tecnología diagnóstica para este método. El qRT-PCR se realizó tal y como se describe en Cronin et al . , Am . J. Pa thol . 164(l):35-42 (2004); y Ma et al . , Cáncer Cell 5:607-616 (2004). El ARN se extrajo de tumores de ovario congelados utilizando reactivos comercialmente disponibles de Qiagen, Valencia, California. Se diseñaron cebadores y sondas para el análisis por RT-PCR cuantitativa TAQMAN™ para proporcionar longitudes del "amplicón" de aproximadamente 100 bases o menos. Los transcritos se cuantificaron por RT-PCR cuantitativa utilizando un instrumento TAQMAN™ (Applied BioSystems) con niveles de expresión de los genes de prueba normalizados con respecto a los genes de referencia. El gen "de mantenimiento" GUS se seleccionó como el gen de control debido a su baja variación y su alta expresión.

Partiendo de los experimentos referenciados más arriba, se desarrolló un algoritmo basado en la creación de perfiles de expresión génica de tumores con estado de fosforilación HER2 conocido mediante ELISA. Un tumor se considera positivo para un perfil de expresión génica asociado con la fosforilación de HER2 que tiene una expresión de betacelulina o anfirregulina y HER2 dentro de la mediana o por encima de la mediana y/o una expresión de EGFR y/o HER3 dentro de la mediana o por encima de la mediana. De manera alternativa, sólo mediante la RT-PCR cuantitativa se puede medir la expresión de betacelulina o anfirregulina para identificar los tumores con fosforilación de HER2 predicha.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para extender el tiempo hasta progresión de la enfermedad (TTP) o supervivencia en un paciente de cáncer que consiste en administrar un inhibidor de la dimerización de HER al paciente en una cantidad que alargue el TTP o la supervivencia del paciente, siempre y cuando el cáncer el paciente muestre activación HER.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el inhibidor de la dimerización HER es un inhibidor de la dimerización de HER2.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2 en el que el inhibidor de la dimerización HER inhibe la heterodimerización de HER.
4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el cáncer del paciente muestra activación de HER2.
5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el cáncer del paciente muestra fosforilación de HER2.
6. El procedimiento de la reivindicación 5 en el que el cáncer del paciente muestra fosforilación HER2 tal como se evalúa en una prueba phospho-ELISA.
7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el cáncer del paciente muestra activación de HER2 tal como se evalúa creando perfiles de expresión génica .
8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el inhibidor de la dimerización de HER es un anticuerpo.
9. El procedimiento de la reivindicación 8 en el que el anticuerpo se une a un receptor HER seleccionado de un grupo compuesto por EGFR, HER2 y HER3.
10. El procedimiento de la reivindicación 9 en el que el anticuerpo se une a HER2.
11. El procedimiento de la reivindicación 10 en el que el anticuerpo contra HER2 se une al Dominio II del dominio extracelular de HER2.
12. El procedimiento de la reivindicación 11 en el que el anticuerpo se une a la unión entre los dominios I, II y III de HER2.
13. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que el anticuerpo HER comprende las secuencias de aminoácidos de variable ligera y pesada en SEQ ID Nos. 3 y 4, respectivamente.
14. El procedimiento de la reivindicación 13 en el que el inhibidor de la dimerización de HER es pertuzumab.
15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 14 en el que el anticuerpo contra HER es un anticuerpo desnudo.
16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 15 en el que el anticuerpo contra HER es un anticuerpo intacto.
17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 15 en el que el anticuerpo contra HER es un fragmento de anticuerpo que consta de una región de unión a antigeno.
18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en que el cáncer se selecciona a partir del grupo formado por el cáncer de ovario, peritoneo, trompas de Falopio, cáncer de mama metastásico (MBC) , cáncer de células pulmonares no pequeñas (NSCLC), cáncer de próstata o cáncer colorrectal.
19. El procedimiento de la reivindicación 18 en el que el cáncer es un cáncer de ovario, peritoneo o trompas de falopio.
20. El procedimiento de la reivindicación 18 en el que el cáncer es un cáncer de ovario avanzado, refractario o recurrente .
21. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el inhibidor de la dimerización de HER se administra como un agente antitumoral único.
22. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 20 que comprende la administración de un segundo agente quimioterapéutico al paciente.
23. El procedimiento de la reivindicación 22, en que se selecciona el segundo agente terapéutico del grupo formado por un agente quimioterapéutico, un anticuerpo contra HER, un anticuerpo contra el antigen asociado a un tumor, un compuesto antihormonal, un cardioprotector, un citoquina, un fármaco que actúe sobre la EGFR, un agente antiangiogénico, un inhibidor de la tirosina quinasa, un inhibidor de la COX, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo, un inhibidor de la farnesil transferasa, un anticuerpo que une la proteina CA 125 oncofetal, vacuna contra el HER2, terapia contra HER, inhibidor de la Raf y/o ras, doxorrubicina liposomal, topotecan, taxano, un inhibidor de la tirosina quinasa, TLK286, EMD-7200, un fármaco que trate la nausea, un fármaco que evite o trate los sarpullidos cutáneos o terapias estándar contra el acné, un medicamento que trate o prevenga la diarrea, un fármaco que disminuya la temperatura corporal, y un factor de crecimiento hematopoyético.
24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico.
25. El procedimiento de la reivindicación 24 en el que el agente quimioterapéutico es un agente quimioterapéutico antimetabolito.
26. El procedimiento de la reivindicación 25 en el que el agente quimioterapéutico antimetabolito es la gemcitabina.
27. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que el segundo agente terapéutico es trastuzumab, erlotinib o bevacizumab.
28. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el se alarga el TTP.
29. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el se alarga la supervivencia.
30. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la administración del inhibidor de la dimerización de HER extiende el TTP o la supervivencia al menos un 20% más que el TTP o la supervivencia alcanzada administrando un agente antitumoral aprobado para el paciente de cáncer.
31. Un método para extender el tiempo hasta progresión de la enfermedad (TTP) o supervivencia en pacientes con cáncer de ovario, peritoneo o de trompa de falopio que consiste en administrar un inhibidor de la dimerización de HER al paciente en una cantidad que alargue el TTP o la supervivencia del paciente, siempre y cuando el cáncer el paciente muestre activación de HER2.
32. El procedimiento de la reivindicación 31 en el que la paciente tiene cáncer de ovario.
33. El procedimiento de la reivindicación 31 ó 32 en el que el cáncer es un cáncer avanzado, refractario o recurrente.
34. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 31 a la 33 en el que la administración de pertuzumab al paciente extiende el TTP o la supervivencia al menos un 20% más que el TTP o la supervivencia alcanzada administrando topotecan o doxorrubicina liposomal al paciente.
35. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 31 a la 34 que además comprenda la administración de un agente quimioterapéutico al paciente.
36. El procedimiento de la reivindicación 35 en el que el agente quimioterapéutico es un agente quimioterapéutico antimetabolito.
37. El procedimiento de la reivindicación 36 en el que el agente quimioterapéutico antimetabolito es la gemcitabina.