PT1638595E - Fsh liofilizada / formulações de hl - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "FSH LIOFILIZADA / FORMULAÇÕES DE HL" Âmbito da Invenção A invenção insere-se no âmbito de formulações liofilizadas da hormona de estimulação folicular (FSH), hormona luteinizante (HL), e misturas de FSH com hormona luteinizante (HL), e métodos para produzir essas formulações.

Antecedentes da invenção A hormona de estimulação folicular (FSH), a hormona luteinizante (HL) e a gonadotrofina coriónica (GC) são proteínas injetáveis pertencentes à classe das gonadotrof inas. As FSH, HL e hGC são usadas, de uma forma isolada e em combinações, no tratamento de infertilidade e distúrbios da reprodução, tanto em doentes do sexo masculino como feminino.

Na natureza, a FSH e a HL são produzidas pela glândula pituitária. Para uso farmacêutico, a FSH e a HL e as suas variantes podem ser produzidas recombinantemente (rFSH e rLH) , ou podem ser produzidas a partir da urina de mulher em pós menopausa (uFSH e uLH). A FSH é usada em doentes do sexo feminino na indução da ovulação (10) e na hiperestimulação controlada do ovário (HCO) em técnicas de reprodução assistida (TRA). Num regime de tratamento tipico para indução de ovulação, são administradas diariamente ao doente, injeções de FSH ou de uma variante (cerca de 75 até 300 UI de FSH/dia) durante um 2 período de cerca de 6 até cerca de 12 dias. Num regime de tratamento típico para a hiperestimulação controlada do ovário, são administradas diariamente ao doente injeções de FSH ou uma variante (cerca de 150-600 UI FSH/dia), durante um período de cerca de 6 até 12 dias. A FSH também é usada para induzir a espermatogéneses em homens que sofrem de oligospermia. Um regime em que se usam 150 UI de FSH, 3 vezes por semana, numa combinação com 2'500 UI de hGC, duas vezes por semana, tem tido sucesso na obtenção de melhorias na contagem de esperma em homens que sofrem de hipogonadismo hipogonadotrófico1. A HL é usada em doentes do sexo feminino, em combinação com FSH, em IO e em HCO, particularmente naquelas doentes que têm níveis muito baixos de HL endógena ou resistência à HL, tal como mulheres que sofrem de hipogonadismo hipogonadotrófico (HH, WHO grupo I) ou doentes mais velhas (por exemplo, 35 anos ou mais velhas) , e em doentes nas quais a implantação de embrião ou aborto precoce é um problema. A HL em combinação com a FSH tem sido tradicionalmente disponibilizadas numa preparação chamada gonadotrofina da menopausa humana (hGM), extraída da urina de mulher em pós menopausa. A hGM tem uma proporção 1:1 de atividade FSH:HL. A GC atua no mesmo recetor da HL e provoca as mesmas respostas. A GC tem uma meia-vida de circulação maior do que a HL e é, por isso, geralmente usada como uma fonte de atividade HL de longa atuação. A GC é usada nos regimes IO e HCO, para imitar o pico natural de HL e desencadear a ovulação. Uma injeção de gonadotrofina coriónica humana (hGC) é usada para desencadear ovulação no final da 3 estimulação com FSH ou uma mistura de FSH e HL. A GC pode também ser usada junto com a FSH durante a estimulação de 10 e HCO, de modo a fornecer atividade HL durante a estimulação em doentes, nas quais a atividade HL é desejável, tais como aquelas acima mencionadas.

As FSH, HL e GC são membros da família da hormona de glicoproteína, heterodímera, que também inclui a hormona estimulante da tiróide (TSH). Os membros desta família são heterodímeros, compreendendo uma subunidade α e β. As subunidades são mantidas juntas por interações não covalentes. A FSH humana (hFSH) heterodímera consiste em (i) uma subunidade da glicoproteína alfa madura com 92 aminoácido, a qual também é comum a outros membros da família humana (por exemplo, gonadotrofina coriónica ("GC"), hormona luteinizante ("HL") e hormona estimulante da tiróide ("TSH"); e (ii) uma subunidade beta madura de 111 aminoácidos, que é única para a FSH2. A HL heterodímera humana consiste em (i) uma subunidade de glicoproteína alfa madura de 92 aminoácidos; e (ii) uma subunidade beta madura de 112, que é única para a LH3. As subunidades alfa e beta das glicoproteínas podem ter propensão para se dissociarem nas formulações, devido à interação com um conservante, tensoativo e outros excipientes. A dissociação das subunidades conduz a uma perda de potência biológica4. A FSH é formulada para injeção intramuscular (IM) ou subcutânea (SC) . A FSH é fornecida na forma liofilizada (sólida) em frascos ou ampolas de 75 Ul/frasco e 150 UI/frasco com uma vida de prateleira de um e meio a dois anos, quando armazenada a 2-25°C. Uma solução para injeção é formada por reconstituição do produto liofilizado com água para injeção (API) . Para a indução da ovulação ou da 4 hiperestimulação ovárica controlada, são recomendadas injeções diárias com doses de partida de 75 UI até 600 UI durante até cerca de dez dias. Dependendo da resposta do doente, podem ser usados até três ciclos de tratamento com doses aumentadas de FSH. Com formulações liofilizadas, é pedido ao doente para reconstituir um novo frasco de material liofilizado com diluente e administrá-lo imediatamente após a sua reconstituição numa base diária [Folheto informativo N1700101A, publicado em fevereiro de 1996, pela FertinexTm (urofolitropina para injeção, purificada) para injeções subcutâneas, por Serono Laboratories, Inc., Randolph, MA]. A FSH também foi formulada em formatos de líquidos em doses únicas e multidoses, em frascos, ou ampolas. Formatos de doses unitárias devem permanecer estáveis e potentes em armazenamento antes de serem usadas. Formatos multidose não podem permanecer estáveis e potentes somente antes de serem usadas, mas têm também de permanecer estáveis, potentes e relativamente livres de bactérias durante o período de administração, do regime de uso em doses múltiplas, após o selo da ampola ter sido retirado. Por esta razão, os formatos de multidoses contêm agentes bacteriostáticos. A HL é formulada para injeção intramuscular (IM) ou subcutânea (SC) . A HL é fornecida na forma liofilizada (sólida) em frascos ou ampolas de 75 Ul/frasco com uma vida de prateleira de um e meio a dois anos quando armazenada a 2-25°C. A solução para injeção é formada, reconstituindo o produto liofilizado com água para injeção (API) . Para a indução da ovulação ou hiperestimulação ovárica controlada, em conjugação com a FSH, são recomendadas injeções diárias 5 com doses de início em 75 UI até 600 UI HL durante até cerca de dez dias. A US 5,384,132 divulga preparações contendo gonadotropina liofilizada que contêm FSH e HL e um estabilizador do sal do ácido dicarboxílico, tal como citrato, e opcionalmente compreendendo sacarose e tensoativos. É obrigatória a presença de um sal do ácido dicarboxílico de acordo com este documento para alcançar a estabilidade. A EP 0 618 808 (Applied Research Systems ARS Holding N. V.) divulga uma composição farmacêutica compreendendo uma mistura homogénea sólida de gonadotrofina e uma quantidade estabilizadora de sacarose sozinha ou em combinação com glicina. A EP 0 814 841 (Applied Research Systems ARS Holding N. V.) divulga um estabilizador de composição farmacêutica líquida, compreendendo uma gonadotrofina coriónica humana recombinante (hGC) e uma quantidade estabilizadora de manitol. A EP 0 448 146 (AKZO N.V.) divulga uma gonadotrofina estabilizadora contendo liofilizado que compreende uma parte em peso de uma gonadotrofina; e 200 até 10.000 partes em peso de um estabilizador do sal do acido dicarboxí lico associado com uma gonadotrofina. A EP 0 853 945 (Akzo Nobel N.V.) divulga uma formulação contendo gonadotrofina líquida contendo FSH e HL caracterizada por a formulação compreender uma gonadotrofina e quantidades estabilizadoras de um ácido policarboxílico ou um sal deste e um composto tioéter. Tal 6 como na 5, 384,132 é obrigatória a presença de um ácido carboxilico para atingir a estabilidade da formulação. A WO 00/04913 (Eli Lilly e Co.) divulga uma formulação compreendendo FSH ou uma variante de FSH, contendo uma subunidade alfa e beta, e um conservante selecionado do grupo que consiste em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzilico, alquil parabeno (metilo, etilo, propilo, butilo e semelhantes) , cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio, dihidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas destes num diluente aquoso.

Sumário da invenção É um objeto da invenção fornecer novas formulações liofilizadas de misturas de FSH e HL, fornecer métodos para a sua preparação, e métodos para o seu uso em tratamentos farmacêuticos ou veterinários de distúrbios de fertilidade.

Num primeiro aspeto, a invenção fornece uma formulação liofilizada consistindo em FSH ou uma variante desta, tal como a HL ou uma variante desta, um tensoativo selecionado a partir do Tween 20 (monolaurato de polioxitileno (20) sorbitano), Tween 40 (monopalmitato de polioxitileno (20)sorbitano), Tween 80 (monooleato de polioxitileno (20) sorbitano), um antioxidante, que é a metionina, um tampão fosfato e um agente de estabilização e de tonicidade, selecionados a partir do grupo que consiste em monossacáridos, dissacáridos e álcoois de açúcar.

Num segundo aspeto, a invenção fornece um método para o fabrico de uma formulação liofilizada, compreendendo a formação de uma mistura, que consiste em FSH ou uma 7 variante sua e HL ou uma variante desta, um tensoativo selecionado do Tween 20 (monolaurato de polioxitileno (20) sorbitano), Tween 40 (monopalmitato de polioxitileno (20) sorbitano), Tween 80 (monooleato de polioxitileno (20) sorbitano), um antioxidante, que é a metionina, um tampão fosfato e um agente de estabilização e de tonicidade, selecionados do grupo que consiste em monossacáridos, dissacáridos e álcoois de açúcar e submetendo a mistura a liofilização.

Num terceiro aspeto, a invenção fornece um artigo de fabrico para uso farmacêutico humano, compreendendo um primeiro recipiente cheio com uma formulação liofilizada, consistindo em FSH assim como HL ou uma variante da variante FSH ou HL, um tensoativo selecionado a partir de Tween 20 (monolaurato de polioxitileno (20) sorbitano), Tween 40 (monopalmitato de polioxitileno (20) sorbitano), Tween 80 (monooleato de polioxitileno (20) sorbitano), um antioxidante, que é metionina, um tampão fosfato e um agente de estabilização e de tonicidade, selecionados a partir do grupo que consiste em monossacáridos, dissacáridos e álcoois de açúcar, e um segundo recipiente compreendendo um solvente para reconstituição.

Descrição pormenorizada da invenção

As formulações da mistura FSH/HL da presente invenção têm propriedades ou estabilidade melhoradas ou mais adequadas, e são úteis para o tratamento da infertilidade em mulheres e/ou homens. Estas formulações e artigos de fabrico são também adequados para o uso em sistemas de aplicação injetáveis e alternativos, por exemplo, mas não limitado a, nasal, pulmonar, transmucosa, transdérmico, oral, subcutâneo, intramuscular ou de libertação parentérica prolongada. Numa forma de realização particularmente preferida, as formulações da invenção são para injeção subcutânea e/ou intramuscular. As formulações FSH, HL ou as variante de FSH e HL fornecidas podem também ter potência aumentada in vivo ao longo do tempo em comparação com produtos comerciais conhecidos, ao prevenirem ou reduzirem a perda de atividade ou estabilidade, ou melhorando qualquer aspeto da eficiência ou intenção da administração, por exemplo, através de pelo menos um dos modos, frequência, dosagem, conforto, e facilidade de utilização, atividade biológica in vitro ou in vivo, e os afins. A hormona de estimulação folicular, ou FSH, como aqui usada, refere-se à FSH produzida como uma proteína madura de comprimento total a qual inclui, mas não é limitada a FSH ou "hFSH" humana, embora produzida recombinantemente ou isolada de fontes humanas, tais como a urina de uma mulher em pós menopausa. A sequência da proteína da subunidade alfa de glicoproteína humana é fornecida na SEQ ID NO: 1, e a sequência da proteína da subunidade beta da FSH é dada na SEQ ID NO: 2. A expressão "variante de FSH" significa que é para englobar aquelas moléculas que diferem na sequência do aminoácidos, no padrão de glicosilação ou na ligação da intersubunidade da FSH humana mas exibindo atividade de FSH. Os exemplos incluem CTP-FSH, uma FSH de ação prolongada recombinante modificada, que consiste em uma subunidade α do tipo selvagem e uma subunidade β híbrida, nas quais o peptídeo carboxi terminal de hGC foi fundido ao C-terminal da subunidade da FSH, como descrito em LaPolt et al.; Endocrinology; 1992, 131, 2514-2520; ou Klein et al.; 9

Development and characterization of a long-acting recombinant hFSH agonist; Human Reprod. 2003, 18, 50-56]. Está também incluída a cadeia unitária CTP-FSH, uma molécula da cadeia simples, consistindo nas seguintes sequências (desde N-terminal até C-terminal) :

9 pFSH phGC-CTP (113-145)

aFSH em que PFSH significa a subunidade da FSH, PhGC CTP (113-145) significa o peptídeo carboxi terminal do hGC e aFSH significa a subunidade α da FSH, como descrito em Klein et al5. Outros exemplos das variantes da FSH incluem moléculas da FSH, com sítios de glicosilação adicionais incorporados nas subunidades α e/ou β, como divulgado na WO 01/58493 (Maxygen), particularmente como divulgado nas reivindicações 10 e 11 da WO 01/58493, e as moléculas FSH com intersubunidade de pontes S-S, como divulgados na WO 98/58957.

As variantes FSH aqui referidas, também incluem as deleções do carboxi terminal da subunidade beta que é mais curta do que o comprimento total da proteína madura da SEQ ID NO: 2. As deleções do carboxi terminal da subunidade beta humana são fornecidas nas SEQ IDS NOS: 3, 4, e 5. É entendido que as variantes do carboxi terminal da cadeia beta formem dímeros com uma subunidade alfa conhecida para formar um heterodímero variante de FSH.

Os heterodímeros FSH ou heterodímeros variantes de FSH podem ser produzidos por qualquer método adequado, tal como recombinantemente, por isolamento ou purificação a partir 10 de recursos naturais como pode ser o caso, ou por sintese química, ou qualquer combinações destes. O uso do termo "recombinante" refere-se à preparação das FSH, HL ou variantes das FSH e HL que são produzidas através do uso de tecnologia de DNA recombinante (ver por exemplo a WO 85/01958). As sequências para clones genómicos e de cDNA da FSH, são conhecidas por subunidades alfa e beta de espécies várias6. Um exemplo de um método para expressar FSH ou HL usando tecnologia recombinante é por transfeção das células eucarióticas com sequências de DNA que codificam uma subunidade alfa e beta da FSH ou HL, se fornecidas num vetor ou em dois vetores, cada subunidade tendo um promotor separado, como descrito nas patentes Europeias nos. EP 0 211 894 e EP 0 487 512. Outro exemplo da utilização de tecnologia recombinante para produzir FSH ou HL, é pela utilização de recombinação homóloga para inserir um segmento regulador heterólogo em ligação operativa a sequências endógenas que codificam as subunidades da FSH ou HL, como descrito na Patente Europeia no. EP 0 505 500 (Applied Research Systems ARS Holding NV). A FSH ou a variante de FSH usadas de acordo com a presente invenção podem ser produzidas, não só por meios recombinantes, incluindo a partir de células de mamífero, mas também podem ser purificadas a partir de outras fontes biológicas, tais como fontes urinárias. Metodologias aceitáveis incluem aquelas descritas em Hakola, K. Molecular and Cellular Endocrinology, 127: 59-69, 1997; Keene, et al., J. Biol. Chem., 264: 4769- 4775, 1989; Cerpa-Poijak, et al., Endocrinology, 132: 351-356, 1993; Dias, et ai., J. Biol. Chem., 269: 25289-25294, 1994; Flack, et al., J. Biol. Chem., 269: 14015-14020, 1994; e 11

Valove, et al., Endocrinology, 135: 2657-2661, 1994,

Patente U.S. 3,119, 740 e Patente US no. 5,767, 067. A hormona luteinizante, ou HL, como aqui usada refere-se à HL produzida como uma proteína madura de comprimento total, a qual inclui, mas não está limitada a HL humano ou "hLH", se produzida recombinantemente ou isolada de fontes humanas, tal como a urina das mulheres em pós menopausa. A sequência da proteína da subunidade da glicoproteína alfa humana é fornecida na SEQ ID NO: 1, e a sequência da proteína da subunidade beta da HL humana7 é dada na SEQ ID NO: 6. Numa forma de realização preferida a HL é recombinante. A expressão "variante de HL" é entendida para englobar aquelas moléculas que diferem na sequência de aminoácidos, no padrão de glicosilação ou na ligação inter-subunidades da HL humana, mas exibindo a atividade HL.

Os heterodímeros da HL ou heterodímeros da variante HL podem ser produzidos por qualquer método adequado, tal como recombinantemente, por isolamento ou purificação a partir de fontes naturais como pode ser o caso, ou por síntese química, ou qualquer combinação destes.

Os termos "administrar" ou "administração" significam introduzir uma formulação da presente invenção no corpo de um doente com essa necessidade para tratar uma doença ou condição. O termo "doente" significa um mamífero que é tratado a uma doença ou condição. Doentes são, mas não limitados a, das 12 seguinte origem, humana, ovina, suina, equestre, bovina, de coelho e afins. 0 termo "potência" em relação à atividade de FSH, refere-se à capacidade de formulação da FSH ou de uma formulação de mistura, eliciar respostas biológicas associadas com a FSH, tal como o aumento de peso do ovário no ensaio de Steelman-Pohley8, ou o crescimento folicular num doente feminino. 0 crescimento folicular num doente feminino pode ser avaliado por ultrasom, por exemplo, em termos do número de folículos com um diâmetro médio de ou de cerca de 16 mm após 8 dias de estimulação. A atividade biológica é avaliada em relação a um padrão aceite para a FSH. 0 termo "potência" em relação à atividade da HL, refere-se à capacidade de uma formulação da HL ou uma formulação misturada, eliciarem respostas biológicas associadas com a HL, tais como o método de aumento de peso da vesícula seminal9. A atividade biológica da HL é avaliada em relação a um padrão aceite para a HL. 0 termo "diluente aquoso" refere-se a um solvente líquido que contem água. Os sistemas de solventes aquosos podem ser constituídos unicamente por água, ou podem consistir em água mais um ou mais solventes miscíveis, e podem conter dissolvidos solutos tais como açúcares, tampões, sais ou outros excipientes. Os solventes não aquosos mais comummente usados são álcoois orgânicos de cadeia curta, tais como, metanol, etanol, propanol, cetonas de cadeia curta, tal como acetona, e poliálcoois, tal como glicerol.

Um "agente de isotonicidade" é um composto que é fisiologicamente tolerado e transmite uma tonicidade 13 adequada a uma formulação para prevenir o fluxo liquido de água ao longo das membranas da célula que estão em contato com a formulação. Compostos como a glicerina, são comummente usados para esses propósitos em concentrações conhecidas. Outros agentes de isotonicidade adequados incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos ou proteínas (por exemplo, glicina ou albumina) , sais (por exemplo, cloreto de sódio), e açúcares (por exemplo , dextrose, sacarose e lactose) . 0 termo "tampão" ou "tampão fisiologicamente aceitável" refere-se a soluções de compostos que são conhecidas por serem seguras para utilização farmacêutica ou veterinária em formulações e que têm o efeito de manter ou controlar o pH da formulação na gama de pH desejada para a formulação. Tampões aceitáveis para controlar o pH a um pH moderadamente acídico para um pH moderadamente básico incluem, mas não estão limitados a, compostos tais como fosfato, acetato, citrato, arginina, TRIS, e histidina. "TRIS" refere-se a 2-amino-2-hidroximetil-l, 3 propanodiol, e para qualquer sal deste farmaceuticamente aceitável. Tampões preferidos são tampões fosfato com solução salina ou um sal aceitável. 0 termo "tampão fosfato" refere-se a soluções contendo ácido fosfórico ou sais deste, ajustado a um pH desejado. Geralmente os tampões fosfato são preparados a partir de ácido fosfórico, ou um sal de ácido fosfórico, incluindo mas não limitado a sais de sódio e potássio. Vários sais do ácido fosfórico são conhecidos na técnica, tais como sais de sódio e potássio monobásico, dibásico, e tribásico do ácido. Os sais do ácido fosfórico são também conhecidos por ocorrerem como hidratos do sal que ocorre. Os tampões 14 fosfato podem cobrir uma gama de pHs, tais como desde cerca de pH 4 até cerca de pH 10, e gamas preferidas desde cerca de pH 5 até cerca de pH 9, e a gama mais preferida de ou cerca de 6,0 até ou cerca de 8,0, mais preferencialmente até ou cerca de pH 7,0. O termo "frasco" ou "recipiente" referem-se amplamente a um reservatório adequado para reter FSH na forma sólida ou liquida contida num estado estéril. Exemplos de um frasco como o que é aqui usado incluem ampolas, cartuchos, embalagens blister, ou outros tais como recipientes adequados para aplicação da FSH a um doente via de seringa, bomba (incluindo osmótica), cateter, emplastro transdérmico, spray pulmonar ou transmucosa. Frascos adequados para embalar produtos para administração parentérica, pulmonar, transmucosa, ou transdérmica são bem conhecidos e reconhecidos na técnica. O termo "estabilidade" refere-se a estabilidade fisica, quimica e conformacional da FSH e da HL nas formulações da presente invenção (incluindo a manutenção da potência biológica). A instabilidade de uma formulação de proteína pode ser causada pela degradação quimica ou agregação das moléculas de proteína para formar polímeros de uma ordem mais alta, pela dissociação dos heterodímeros em monómeros, desglicosilação, modificação de glicosilação, oxidação (particularmente da subunidade a) ou qualquer outra modificação estrutural que reduza pelo menos uma atividade biológica de um polipéptido FSH incluido na presente invenção.

Uma solução ou formulação "estável", é uma em que o grau de degradação, modificação, agregação, perda de atividade 15 biológica e afins, das proteínas aí existentes é controlada aceitavelmente, e não aumenta inaceitavelmente com o tempo. Preferencialmente a formulação mantém pelo menos ou cerca de 80% da atividade da FSH marcada e pelo menos ou cerca de

80% da atividade da HL marcada durante um período de 6 meses a uma temperatura de ou de cerca de 2-8 °C, mais preferencialmente a ou cerca de K> 1 co 0 o mais preferencialmente a ou a cerca de 4-5°C. A atividade FSH pode ser medida usando o bioensaio de aumento de peso do ovário de Steelman-Pohley5. A atividade da HL pode ser medida usando o bioensaio de aumento de peso da vesícula seminal10. 0 termo "tratar" refere-se à administração, acompanhamento, gestão e/ou cuidado de um doente para o qual a administração de FSH e/ou HL é desejável para fins de estimulação do folículo ou testicular ou qualquer outra resposta fisiológica regulada pela FSH e/ou HL. O tratamento pode assim incluir, mas não está limitado a, administração de FSH e/ou HL para a indução ou melhoria da qualidade do esperma, estimulação da libertação de testosterona no sexo masculino, ou desenvolvimento folicular ou para indução da ovulação nas fêmeas.

Um "sal" de uma proteína é um sal de adição de ácido ou de base. Tais sais são preferencialmente formados entre qualquer um ou mais dos grupos carregados na proteína e qualquer um ou mais catiões ou aniões não tóxicos, fisiologicamente aceitáveis. Sais orgânicos e inorgânicos incluem, por exemplo, aqueles preparados a partir dos ácidos tais como hidroclórico, sulfúrico, sulfónico, tartárico, fumárico, hidrobrómico, glicólico citrico, maleico, fosfórico, succínico, acético, nítrico, benzóico, 16 ascórbico, p-tolueno-sulfónico, benzenosulfónico, naftalenosulfónico, propiónico, carbónico, e afins, ou por exemplo, amónio, sódio, potássio, cálcio, ou magnésio.

Os inventores verificaram que um tensoativo selecionado a partir do grupo dos polisorbatos, em particular Tween 20 (polioxitileno (20) monolaurato de sorbitano), Tween 40 (polioxitileno (20) monopalmitato de sorbitano), Tween 80 (polioxitileno (20) monooleato de sorbitano) é um excipiente adequado para preparar uma formulação estável compreendendo uma mistura de HL e FSH. O tensoativo preferido é o Tween 20. Os polisorbatos são tensoativos que se encontram disponíveis comercialmente (por exemplo, na Merck). 0 tensoativo, por exemplo o Tween 20, está preferencialmente presente na formulação liofilizada numa concentração de menos ou cerca de 0,001 até ou cerca de 0,1 mg por mg da formulação total, mais preferencialmente a ou cerca de 0,01 até ou cerca de 0,075 mg/mg.

Preferencialmente a concentração de Tween, particularmente Tween 20, nas formulações reconstituídas é de ou cerca de 0,01 mg/mL até ou cerca de 1 mg/mL, mais preferido de ou cerca de 0,05 mg/mL até ou cerca de 0,5 mg/mL, mais particularmente preferido de ou cerca de 0,2 mg/mL até ou cerca de 0,4 mg/mL, o mais preferido de ou cerca de 0,1 mg/mL. A hormona de estimulação folicular (FSH) no interior da formulação liofilizada está presente preferencialmente numa concentração (p/p) a ou cerca de 0,1 até 10 \iq/mq da formulação total. Numa forma de realização, a hormona de 17 estimulação folicular (FSH) está presente numa concentração de menos ou de cerca de 0,3 até 5 μg/mg da formulação total. Numa forma de realização adicional a hormona de estimulação folicular (FSH) está presente a uma concentração de ou cerca de 0,37 até 2 μg/mg da formulação total. A hormona luteinizante (HL) dentro da formulação liofilizada está presente preferencialmente a uma concentração de ou cerca de 0,1 até 3 μg/mg da formulação total. Numa forma de realização, a hormona luteinizante (HL) está presente numa concentração de ou cerca de 0,1 até 1 μg/mg da formulação total. Numa forma de realização adicional, a hormona luteinizante (HL) está presente a uma concentração de ou cerca de 0,1 até 0,6 μg/mg da formulação total.

Nas formulações reconstituídas, a concentração de FSH na formulação está preferencialmente a ou cerca de 150 UI/mL a ou cerca de 2.000 UI/mL, mais preferencialmente a ou cerca de 300 UI/mL a ou cerca de 1.500 UI/mL, mais particularmente preferido a ou cerca de 450 a ou cerca de 750, o mais preferido a ou cerca de 600 UI/mL.

Nas formulações reconstituídas, a concentração de HL na formulação está preferencialmente a ou cerca de 50 UI/mL até ou cerca de 2.000 UI/mL, mais preferencialmente a ou cerca de 150 até ou cerca de 1.500 UI/mL, particularmente mais preferido a ou cerca de 300 UI/mL até ou cerca de 750 UI/mL, particularmente preferido a 625 UI/mL. 18 A proporção entre FSH e HL (FSH:HL, UI:UI, FSH medida com o ensaio dos aumento de peso do ovário e a HL medida com o ensaio de aumento de peso da vesícula seminal) está preferencialmente dentro do intervalo de ou de cerca de 6:1 até ou cerca de 1:6, mis preferencialmente a ou cerca de 4:1 até ou cerca de 1:2, mais particularmente preferido a ou cerca de 3:1 até em ou cerca de 1:1. Particularmente as proporções preferidas são 1:1 e 2:1.

Preferencialmente a FSH e a HL são produzidas recombinantemente, de uma forma particularmente preferida são produzidas nas células transfetadas do ovário de um hamster chinês com um vetor ou vetores compreendendo um DNA que codifica a subunidade alfa e a subunidade beta da glicoproteína humana da FSH ou da HL. 0 DNA que codifica as subunidades alfa e beta pode estar presente nos mesmos ou em vetores diferentes. A FSH e HL recombinantes têm várias vantagens sobre os seus homólogos urinários. Técnicas de cultura e isolamento usando células recombinantes permitem uma consistência entre lotes. Em contrapartida, a FSH e a HL urinárias variam grandemente de lote para lote em características tais como pureza, padrão de glicosilação, sialilação e oxidação das subunidades. Devido a uma maior consistência de lote para lote e de pureza das FSH e HL recombinantes, as hormonas podem ser facilmente identificadas e quantificadas usando técnicas, tais como a focalização isoelétrica (IEF). A facilidade com que as FSH e HL recombinantes podem ser identificadas e quantificadas, permite o enchimento de frascos através da massa da hormona (enchimento por massa) em vez do enchimento por bioensaio. 19

As formulações liofilizadas da presente invenção têm tampão fosfato, em que os contraiões preferidos são os iões sódio ou potássio. As soluções salinas de tampão fosfato são bem conhecidas na técnica, tais como solução salina tamponada com fosfato da Dulbecco. As concentrações de tampão na solução total podem variar entre ou cerca de 5mM, 9,5mM, lOmM, 50mM, lOOmM, 150mM, 200mM, 250mM, e 500mM. Preferencialmente a concentração de tampão é de ou cerca de lOmM. Particularmente preferido é um tampão de 10 mM de iões fosfato com um pH de 7,0.

Preferencialmente um tampão é ajustado de modo a que as formulações reconstituídas das formulações liofilizadas da presente invenção tenham um pH entre ou de cerca de 6,0 e de ou cerca de 8,0, mais preferencialmente de ou cerca de 6,8 até ou cerca de 7,8, incluindo cerca de pH 7,0, pH 7,2, e 7,4.

Preferencialmente um tampão é ajustado de tal maneira, que as formulações reconstituídas de misturas de FSH e HL da presente invenção têm pH entre ou cerca de 6,0 ou cerca de 9,0, mais preferencialmente de ou cerca de 6,8 até ou cerca de 8 5, incluindo cerca de pH 7,0, pH 8,0, e 8,2, o mais preferido em ou cerca de pH 8,0.

De modo a fornecer uma injetável, as formulações liofilizadas da presente invenção são reconstituídas usando um solvente adequado. Um solvente preferido para injeção é água.

Numa forma de realização específica adicional, a invenção fornece uma formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 1. Preferencialmente a FSH e HL estão 20 presentes numa proporção (FSH:HL) de ou cerca de 2:1 até ou cerca de 1:1.

Numa forma de realização especifica adicional, a invenção fornece um método para produzir uma formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 22.

Ainda numa forma de realização especifica adicional, a invenção fornece um método para a produção de uma composição farmacêutica embalada compreendendo uma mistura liofilizada que consiste em FSH assim como em HL e um tensoativo selecionado a partir de Tween 20 (polioxitileno (20) monolaurato de sorbitano), Tween 40 (polioxitileno (20) monopalmitato de sorbitano), Tween 80 (polioxitileno (20) monooleato de sorbitano), um antioxidante que é metionina, um tampão fosfato e um agente de estabilização e tonicidade selecionados a partir do grupo que consiste em monossacáridos, dissacáridos e álcoois de açúcar num recipiente.

Ainda numa outra forma de realização preferida, a invenção fornece um artigo para produção de um uso farmacêutico humano de acordo com a reivindicação 19.

As formulações liofilizadas da invenção podem ser mantidas durante pelo menos ou cerca de 6 meses, 12 meses ou 24 meses. Sob as condições de armazenamento preferidas, antes da primeira utilização, as formulações são mantidas fora do alcance da luz intensa (preferencialmente no escuro), a temperaturas de ou cerca de 25, preferencialmente de ou cerca de 2-8 °C, mais preferencialmente de ou cerca de 4-5 °C. 21

As formulações liofilizadas da invenção contêm um antioxidante o qual é metionina. 0 antioxidante previne a oxidação da FSH e HL (particularmente a subunidade a) . 0 antioxidante metionina está presente preferencialmente numa concentração de ou cerca de 0,001 até ou cerca de 0,1 mg por mg da formulação total, mais preferencialmente em ou cerca de 0,01 até ou cerca de 0,075 mg/mg.

Na formulação reconstituída, a metionina está presente preferencialmente numa concentração de ou cerca de 0,01 até ou cerca de 1,0 mg/mL, mais preferencialmente a ou cerca de 0,05 até ou cerca de 0,5 mg/mL, o mais preferencialmente a ou cerca de 0,1 mg/mL.

As formulações liofilizadas da invenção contêm um mono ou dissacárido ou um álcool de açúcar como agentes de ajustamento de estabilidade e tonicidade, tais como sacarose, dextrose, lactose, manitol e/ou glicerol. O mais preferido é sacarose. Na formulação reconstituída, a sacarose está presente a ou a cerca de 60 mg/mL.

Como notado acima, a invenção fornece formulações liofilizadas, em particular para uso unitário. As formulações da invenção são adequadas para uso farmacêutico e veterinário.

Como notado acima, numa forma de realização preferida, a invenção fornece a produção de um artigo, compreendendo o material de embalagem e um frasco compreendendo FSH e HL liofilizadas assim como Tween 20. O segundo recipiente inclui água para injeção como diluente. 22 0 nível de hormona proteica nas formulações da invenção inclui quantidades produzindo, por reconstituição, concentrações desde de cerca de 1,0 μρ/πΛ até cerca de 50 mg/mL, embora as concentrações mais baixas e mais altas sejam operacionais e estejam dependentes do veículo de distribuição pretendido, por exemplo, os métodos das soluções das formulações serão diferentes dos emplastros transdérmicos, dos pulmonares, dos transmucosa, ou dos osmóticos ou da micro bomba. A concentração da hormona proteica é preferencialmente de ou cerca de 5,0 μρ/πΛ até ou cerca de 2 mg/mL, mais preferencialmente de ou cerca de 10 μ9/ηϋ1 até ou cerca de 1 mg/mL, o mais preferido de ou cerca de 50 μρ/mL até ou cerca de 200 μρ/πΛ.

Preferencialmente as formulações da invenção retêm pelo menos ou cerca de 80% da atividade da FSH e/ou da atividade da HL na altura do embalamento ao longo de um período de 24 meses (antes da primeira utilização). A atividade da FSH pode ser medida utilizando o bioensaio do aumento de peso do ovário de Steelman-Pohley5. A atividade da HL pode ser medida utilizando o bioensaio de aumento de peso da vesícula seminal do rato.

As formulações da presente invenção podem ser preparadas por um processo que compreende a mistura de FSH e HL e Tween 20, bem como outros excipientes como um antioxidante e/ou um tampão e submetendo a mistura a uma liofilização. A mistura dos componentes e a sua liofilização é realizada usando procedimentos convencionais. Para preparar uma formulação adequada, por exemplo, uma quantidade medida de FSH ou da variante de FSH, de HL ou da variante de HL, é combinada com Tween 20 e o resultado da mistura é 23 liofilizada e depois dispensada em frascos, ampolas ou cartuchos. Variações deste processo serão reconhecidas por um especialista comum na técnica. Por exemplo, a ordem pela qual os componentes são adicionados, mesmo se forem utilizados aditivos adicionais, a temperatura e o pH a que a formulação é preparada, são todos fatores que podem ser otimizados para a concentração e meios de administração usados.

As formulações reconstituídas obtidas das formulações liofilizadas da invenção podem ser administradas usando dispositivos reconhecidos. Exemplos que compreendem estes sistemas de frasco único incluem dispositivos de caneta injetora para aplicação de uma solução como EasyJect@, Gonal-FS Pen, HumajectQ, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPena®, e OptiPen®.

Os produtos reclamados presentemente incluem material de embalagem. 0 material de embalagem fornece, para além da informação requerida pelas agências reguladoras, as condições sob as quais o produto deve ser usado. 0 material de embalagem da presente invenção fornece instruções ao doente para reconstituir a formulação liofilizada da invenção no diluente aquoso para formar uma solução e usar a solução do produto ao longo de um periodo de vinte e quatro horas ou maior para os dois frascos, húmido/seco. Para o frasco único, de solução de produto, o rótulo indica que essa solução pode ser armazenada após a primeira utilização durante um periodo de vinte e quatro horas ou maior, preferencialmente até 12 ou 14 dias. Os produtos presentemente reivindicados são úteis como produto farmacêutico para uso humano. 24 0 exemplo que se segue é fornecido, meramente para ilustração adicional da preparação das formulações e composições da invenção. 0 âmbito da invenção não poderá ser construído consistindo meramente no exemplo seguinte.

Exemplo

As gonadotrofinas recombinantes (FSH/HL) dos presentes exemplos foram preparadas pela expressão das células no OHC (Ovário Hamster Chinês), transformado com o correspondente DNA recombinante, de acordo com a técnica descrita nas Patentes europeias EP 160699 e EP 211894.

As outras substâncias usadas nos exemplos foram as seguintes:

Sacarose extra pura código Merck 1.07653 Di-hidrogenofosfato de sódio mono-hidratado (indicado como NaH2P04 H20) código Merck 1.06346 Hidrogenofosfato Di-sódio di-hidratado (indicado como Na2HP04 2H20) código Merck 1.06580 Tween 20 código Merck 822184 L-Metionina Rexim Água para injeção Ácido ortofosfórico 85% extra puro código Merck 1. 00563

Solução de ácido ortofosfórico (17% p/p aprox.) Hidróxido de sódio em partículas, extra puro, código Merck 1.06498

Formulação liofilizada de FSH e de HL

Foi preparada uma formulação liofilizada A com a seguinte composição:

25 Formulação A

FSH μς 12,0 (165 U.I.

HL μς 3,7 (92 U.I.)

Sacarose

NaH2P04 H20

Na2HP04 2H20

Tween 20 L-Metionina mg 30,0 mg 0,45 mg 1,11 mg 0,05 mg 0,1 O processo de produção consiste em misturar a substância do fármaco diretamente com os componentes, filtrando a solução obtida e liofilizando o filtrado.

Uma descrição de cada passo do processo é dada da seguinte forma: adicionar API num recipiente tarado, hidrogenofosfato de di-sódio di-hidratado, dihidrogenofosfato de sódio mono hidratado, Sacarose, Tween 20 a 5% e L-metionina e agitar durante 10 minutos até completar a dissolução.

verificar o pH e eventualmente corrigi-lo para pH 7,0010,2 com NaOH a 10% ou H3P04 diluído adicionar FSH e HL à mistura acima preparada e agitar cuidadosamente a solução obtida durante 10 minutos. verificar de novo o pH e eventualmente ajustá-lo a 7,010,1 com 10% de NaOH ou H3P04 diluídos. filtrar a solução com uma membrana de 0,22 μιη Durapore com uma proporção de filtração de não menos que 15g/cm2, sob fluxo de gás de Azoto com uma pressão não maior que 1,5 atm. 26 recolher a solução num frasco previamente esterilizado. encher o recipiente de vidro com a solução filtrada, ajustar a rolha e colocar os frascos cheios num tabuleiro de aço inoxidável. - carregar os tabuleiros para o liofilizador e liofilar o produto usando o seguinte ciclo liofilização: equilibrar a +4 °C durante cerca de 20 minutos, trazer a temperatura de prateleira para os -25 °C e mantê-la durante 2 horas. trazer a temperatura de prateleira para os -15 °C e mantê-la durante 1 hora. . trazer a temperatura de prateleira para os -45 °C e mantê-la durante 3 horas. . trazer a temperatura do condensador para os -65 °C. aplicar vácuo à câmara.

Quando o vácuo atingir um valor de 7xl0-2 mBar aumentar a temperatura de prateleira até aos -10 °C e manter durante 14 horas. aumentar a temperatura de prateleira até aos +35 °C em 8 horas e manter até ao fim do ciclo (14 horas). . interromper o vácuo para permitir o azoto seco dentro da câmara. . tapar através do sistema automático de liofilização. . selar os frascos tapados com tampas flip-off apropriadas.

As formulações A e B foram armazenadas em 25±2°C, e testadas quanto à estabilidade e atividade biológica como 27 abaixo apontado. Antes de analisar as composições, elas são reconstituídas usando água para injeção.

Os valores da estabilidade e atividade biológica foram determinados da seguinte forma: • Ensaio in vivo para FSH: A formulação foi testada quanto à atividade da FSH usando o bioensaio do aumento de peso do ovário de Steelman-Pohley. • Ensaio in vivo para a HL: A formulação foi testada quanto a atividade da HL usando o bioensaio de aumento de peso da vesícula seminal de rato. • Ensaio da subunidade alfa oxidisada: A percentagem da subunidade alfa oxidisada foi medida através do método de HPLC de fase reversa (RP-HPLC).

• Avaliação da subunidade livre (rFSH + rLH) : A percentagem da subunidade livre foi avaliada por SDS-PAGE. • Avaliação de agregados: A percentagem de agregados foi avaliada por SDS-PAGE como acima descrito para avaliação da subunidade livre.

Os testes biológicos foram efetuados em conformidade com os regulamentos da Farmacopeia Europeia. Os testes foram relatados em particular na monografia da "Menotropin". A Tabela 1 sumariza os resultados dos testes analíticos relacionados com a estabilidade e atividade biológica da formulação A. Os valores foram determinados em 4 pontos de verificação: no tempo zero, após 1 mês, 3 meses e 6 meses de armazenamento, a uma temperatura de armazenamento de 25±2°C. 28 TABELA 1 TESTE TEMPO ZERO 1 MÊS 3 MESES 6 MESES Atividade biológica FSH U.I. 154 136 133 154 Atividade biológica HL U.I. 93 86 94 80 % produto oxidisado 1,0 1,2 2,0 1,0 % dimeros/agregados <2 <2 <2 <2 % Subunidades livres <5 <5 <5 <5

Na Tabela 2 os resultados dos testes analíticos relacionados com a estabilidade e atividade biológica da formulação A armazenada a 4012° C estão sumariados para 4 pontos de controlo: tempo zero, após 3 meses, 6 meses e 9 meses de armazenamento. TABLE 2 TEST TEMPO ZERO 3 MESES 6 MESES 9 MESES Atividade biológica FSH U.I. 154 139 157 146 Atividade biológica HL U.I. 93 102 88 92 % produto oxidisado O \—1 0,9 1,0 O \—1 % dimeros/agregados <2 <2 <2 <2 % subunidades livres <5 <5 <5 <5 A partir das TABELAS 1 e 2 pode concluir-se que a atividade biológica da formulação A está bem conservada após 9 meses de armazenamento. A formulação tem uma alta estabilidade. 29 Sequências : SEQ ID NO. SEQ ID NO. SEQ ID NO. SEQ ID NO. SEQ ID NO. SEQ ID NO. 1: subunidade α de glicoproteína humana;

2: subunidade β hFSH

3: variante 1 da subunidade β de hFSH

4: variante 2 da subunidade β de hFSH

5 : variante 3 da subunidade β de hFSH 6: subunidade β de hLH

Referências 1Burgues et al.; Subcutaneous self-administration of highly purified follicle-estimulantehormone and human chorionic gonadotrophin for the treatment of male hypogonadotrophic hypogonadism. Spanish Collaborative Group on Male Hypogonadotrophic Hypogonadism; Hum. Reprod.; 1997, 12, 980-6; 2Shome et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39: 187-205 (1974); Shome, et al., J. Prot. Chem, 7: 325-339, 1988; 3Keutmann et al.; Structure of human luteinizing hormone beta subunity: evidence for related carboxyl-terminal sequence among certain peptide hormones; Biochem. Biophys. Res. Commun.; 1979,90, 842-848; Talmadge et al.; Evolution of the genes for the beta subunidades of human chorionic gonadotropin and luteinizing hormone; Nature; 1984,307, 37-40; Fiddes & Talmadge; Structure, expression, and evolution of the genes for the human glycoprotein hormones; Recent Prog. Horm. Res.; 1984,40, 43-78 4Reichert LE, Ramsey RB; Dissociation of human folículo-stimulating hormone; J. Biol. Chem.; 1975,250, 3034-3040 5Klein et al.; Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chain recombinant human hormona de estimulação folicular containing the human chorionic gonadotrophin 30 carboxyterminal peptide in the rhesus monkey; Fertility & Sterility ; 2002,77, 1248-1255 6a) Fiddes, J. C., et al., J of Mol. and Applied Genetics, 1: 3-18 (1981); b) Esch F. S. , et al. DNA 5: 363-369 (1986); c) Watkins P. C., et al., DNA 6: 205-212 (1987); d) Hirai T., et al., J. Mol. Endrocrinol. 5: 147-158 (1990) ; e) Maurer, R. A., et al., Mol. Endocrinol. 1: 717-723 (1987) ; f) Guzman K. , et al., DNA Cell Biol. 10: 593-601 (1991); g) KumarTR, et al., Gene. 1995 Dec 12; 166 (2): 335-6; h)

Kumar TR, et al., Gene. 1995 Dec 12; 166 (2): 333-4 7Biochem. Biophys. Res. Commun.; 1979, 90, 842-848 8Steelman et al.; Assay of the folícle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotrophin; Endocrinology ; 1953,53, 604-616 9Van Hell et al.; Effects of human menopausal gonadotrophin preparafions in different bioassaymethods; Acta Endocrinologica; 1964,47, 409-418 10Van Hell et al; Effects of human menopausal gonadotroph in preparations in different bioassay methods; Acta Endocrinologica; 1964,47, 409-418 31

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> ARES TRADING SA

<120> FSH liofilizada / formulações de HL <130> EP 849 Z <160> Patentln versão 3.1

Ala Pr o Asp Vai Gin Asp Cys Pro 1 5

Glu Cys Thr Leu Gin Glu Asn Pro 10 15

Phe Phe Ser Gin Pro Gly Ala Pro 20

Ile Leu Gin Cys Met Gly Cys Cys 25 30

Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro 35 40

Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu 45

Vai Gin Lys Asn Vai Thr Ser Glu 50 55

Ser Thr Cys Cys Vai Ala Lys Ser 60

Tyr Asn Arg Vai Thr Vai Met Gly 65 70

Gly Phe Vai Glu Asn His Thr Ala 75 80 <210> 1 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

His Lys Ser 90

Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr 85 32 <210> 2 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Lys Thr Leu Gin Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile 15 10 15

Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr lie Ala Ile Glu Lys 20 25 30

Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly 35 40 45

Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Vai Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys 50 55 60

Ile Gin Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Vai Tyr Glu Thr Vai Arg 65 70 75 80

Vai Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Vai 85 90 95

Ala Thr Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys 100 105 110

Thr Vai Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys 115 120 125

Glu 33 <210> 3 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu 15 10 15

Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Leu Vai Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gin 35 40 45

Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Vai Tyr Glu Thr Vai Arg Vai Pro 50 55 60

Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Vai Ala Thr 65 70 75 80

Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Vai 85 90 95

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu 100 105 34 <210> 4 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Αεη Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Ala Xle Glu Lys Glu Glu Cys Arg 15 10 15

Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Trp C ys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr Arg 20 25 30

Asp Leu Vai Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gin Lys Thr Cys 35 40 45

Thr Phe Lys Glu Leu Vai Tyr Glu Thr Vai Arg Vai Pro Gly Cys Ala 50 55 60

His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Vai Pro Vai Ala Thr Gin Cys His 65 70 75 80

Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Vai Arg Gly Leu 85 90 95

Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met 100 105 35 <210> 5 <211> 110

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu 15 10 15

Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Leu Vai Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gin 35 40 45

Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Vai Tyr Glu Thr Vai Arg Vai Pro 50 55 60

Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Vai Ala Thr 65 70 75 80

Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Vai 85 90 95

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys 100 105 110 <210> 6 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Ser Arg Glu Pro Leu Arg Pro Trp Cys His Pro Ile Asn Ala Ile Leu 15 10 15 36

Ala Vai Glu Lys Glu Gly Cys Pro Vai Cys Ile Thr Vai Asn Thr Thr 20 25 30

Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Arg Vai Leu Gin Ala Vai Leu 35 40 45

Pro Pro Leu Pro Gin Vai Cys Thr Tyr Arg Asp Vai Arg Phe Glu Ser 50 55 60

Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Vai Asp Pro Vai Vai Ser Phe 65 70 75 80

Pro Vai Ala Leu Ser Cys Arg Cys Gly Pro Cys Arg Arg Ser Thr Ser 85 90 95

Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys Asp His Pro Gin 100 105 110

Lisboa, 18 de abril de 2013

Claims (21)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma formulação liofilizada compreendendo hormona de estimulação folicular (FSH) ou uma variantes desta, assim como a hormona luteinizante (HL) ou uma variante desta, um tensoativo selecionado a partir de um polissorbato incluindo Tween 20 (polioxitileno (20) monolaurato de sorbitano), Tween 40 (polioxitileno (20) monopalmitato de sorbitano), Tween 80 (polioxitileno (20) monooleato de sorbitano), um antioxidante que é metionina. Um tampão fosfato e um agente de estabilidade e de tonicidade selecionados a partir do grupo que consiste em monossacáridos, dissacáridos e álcoois de açúcar.

2. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 1, em que o tensoativo é Tween 20.

3. Formulação liofilizada de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, em que a hormona de estimulação folicular é hormona de estimulação folicular humana e/ou a hormona luteinizante (HL) é hormona luteinizante humana (HL).

4. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 3, em que a hormona de estimulação folicular é uma hormona de estimulação folicular humana urinária e/ou a hormona luteinizante (HL) é hormona luteinizante humana urinária (HL).

5. Formulação liofilizada de acordo com qualquer das reivindicações de 1 até 3, em que a hormona de 2 estimulação folicular é hormona de estimulação folicular humana recombinante e/ou a hormona luteinizante (HL) é hormona luteinizante humana recombinante (HL).

6. Formulação liofilizada de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que a hormona de estimulação folicular (FSH) está presente numa concentração (p/p) de menos ou cerca de 0,1 até 10 μg/mq da formulação total.

7. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 6, em que a hormona de estimulação folicular (FSH) está presente numa concentração de ou cerca de 0,3 até 5 μρ/ιηρ da formulação total.

8. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 7, em que a hormona de estimulação folicular (FSH) está presente numa concentração de menos ou cerca de 0,37 até 2 μρ/ιηρ da formulação total.

9. Formulação liofilizada de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que a hormona luteinizante (HL) está presente numa concentração de ou cerca de 0,1 até 3 μg/mq da formulação total.

10. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 9, em que a hormona luteinizante (HL) está presente numa concentração de ou cerca de 0,1 até 1 μg/mq da formulação total. 3

11. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 10, em que a hormona luteinizante (HL) está presente numa concentração de ou cerca 0,1 até 0,6 μς/τας da formulação total.

12. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a proporção de FSH para HL está dentro do intervalo de ou cerca de 6:1 até ou cerca de 1:6.

13. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 12, em que a proporção de FSH para HL está dentro do intervalo de ou cerca de 4:1 até ou cerca de 1:2.

14. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 13, em que a proporção de FSH para HL está dentro do intervalo de ou cerca de 3:1 até ou cerca de 1:1.

15. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 14, em que a proporção de FSH por HL está dentro do intervalo de ou cerca de 2:1 e 1:1.

16. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o agente de estabilidade e tonicidade é sacarose.

17. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, que consiste dos seguintes componentes: rFSH, rLH, Tween20, sacarose, metionina, um tampão fosfato.

18. Formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 17, em que as quantidades em peso 4 relativo dos componentes compreendem 12,0 μρ de FSH recombinante, 3,7 μρ de HL recombinante, 30,0 mg de sacarose, 0,45 mg de NaH2PC>4 H20, 1,11 mg de Na2HPC>4 2H20, 0,05 mg de Tween 20 e 0,1 mg de L-metionina.

19. Um artigo de fabrico, compreendendo um primeiro recipiente cheio com uma formulação liofilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 18 e um segundo recipiente compreendendo um solvente para reconstituição.

20. Um artigo da fabrico, de acordo com a reivindicação 19, em que o segundo recipiente contém água para reconstituição.

21. Método para fabrico de uma formulação liofilizada de acordo com qualquer das reivindicações 1 até 18, compreendendo o passo de formar uma mistura de FSH com HL assim como Tween 20 (polioxitileno (20) monolaurato de sorbitano), Tween 40 (polioxitileno (20) monopalmitato de sorbitano), Tween 80 (polioxitileno (20) monooleato de sorbitano), um antioxidante que é metionina, um tampão fosfato e um agente de estabilidade e de tonicidade selecionados a partir do grupo que consiste em monossacáridos, dissacáridos e álcoois de açúcar e sujeitando a mistura a uma liofilização. Lisboa, 18 de abril de 2013