KR20200121245A

KR20200121245A - 보툴리눔 독소의 정제방법

Info

Publication number: KR20200121245A
Application number: KR1020200044716A
Authority: KR
Inventors: 김재영; 남정선; 김승호; 최승관; 윤범진; 최진희
Original assignee: (주)제테마
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2020-04-13
Publication date: 2020-10-23
Also published as: TWI797442B; KR102516204B1; EP3957647A1; KR20200121247A; MX2021012522A; US20220186201A1; TW202104243A; WO2020213928A1; EP3957647A4; KR102485146B1; BR112021020486A2; CN114341167A

Abstract

본 발명은 (a) 보툴리눔 독소를 포함하는 배양액을 침전시키는 단계; (b) 황산 침전된 보툴리눔 독소를 미세여과하는 단계; (c) 미세여과된 보툴리눔 독소를 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계; 및 (d) 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 단계를 포함하는 보툴리눔 독소의 정제방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피의 단순 공정으로 순도 및 활성이 뛰어난 보툴리눔 독소를 정제할 수 있어, 보툴리눔 독소 생산에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

보툴리눔 독소의 정제방법{A Purification Method of Botulinum Toxin}

본 발명은 보툴리눔 독소의 정제방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피의 단순 공정으로 순도가 높은 보툴리눔 독소를 수득할 수 있는 정제방법에 관한 것이다.

보툴리눔 독소는 클로스트리디움 부티리쿰 (Clostridium butyricum), 클로스트리디움 바라티 (Clostridium baratii) 및 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)과 같은 박테리아에 의해서 생산되는 신경독소 단백질이다. 보툴리눔 독소는 신경근육 전달을 차단하고, 인간 및 동물에게 신경-마비성 질환을 일으킨다. 특히, 보툴리눔 독소 A형은 인간에게 매우 치명적인 것으로 알려져 있다. A형 이외에도 7가지 다른 B, C1, D, E, F, G 및 H형의 보툴리눔 독소가 규명되었다. 보툴리눔 독소 각각의 유형은 각 유형 특이적 항체에 의해 구별될 수 있으며, 이들이 유발하는 마비의 중증도 및 이들이 영향을 미치는 동물 종은 서로 상이하다.

보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은, 약 50kDa 경쇄에 접합된 약 100 kDa의 중쇄로 구성되어, 약 150kDa이다. 그러나, 클로스트리디움 박테리아에 의해 방출되는 보툴리눔 독소는 150kDa 독소와 하나 또는 그 이상의 비-독소 단백질(nontoxin protein)이 복합체를 형성하여 방출된다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 는 900kDa, 500kDa 및 300kDa 복합체로 방출된다.

보툴리눔 독소는 인간에게 매우 치명적일 수 있으나, 최근에는 골격근 활동항진을 특징으로 하는 신경근육 장애를 포함하여 다양한 증상을 치료하기 위한 목적으로 보툴리눔 독소가 개발되고 있다. 예를 들어 보톡스(BOTOX^®)는 알러간사(Allergan, Inc.)로부터 상업적으로 개발한 보툴리눔 독소 A의 상표로, 이는 안검경련, 사시, 경부 근긴장이상 및 미간(안면) 주름 개선 치료에 활용되고 있고, 다른 혈청형들도 그에 적합한 용도를 개발하여 임상적으로 활용하고자 하는 연구가 계속되고 있다.

임상적 용도의 보툴리눔 독소는 일반적으로 세포 배양물에서 분리되는데, 이 때 다양한 정제 방법이 사용되고 있다.

일 예로 보툴리눔 독소는 일련의 침전 및 접선 유동 여과 단계에 의해서 복합체화된 형태(complexed form)로 정제된다. [참조: 예를 들어, Schantz E J, et al, Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 March 56(l):80-99] 그러나, 이러한 방법은 전형적으로는 약 10% 미만의 상대적으로 낮은 수율을 제공하였다. 그 밖의 다른 방법들은 크기 배제, 이온 교환, 및/또는 친화성 크로마토그래피를 사용하였다 [참조: 예를 들어, Schmidt J J, et al, Anal Biochem 1986 July; 156(1):213-219; Kannan K, et al,, Mov Disord 2000; 15(Suppl 2):20 (2000); Wang YC, Dermatol Las Faci Cosm Surg 2002; 58 (2002); 및 미국 특허 제2003/0008367호].

또 다른 방법은 완전하고 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소 단백질보다는 보툴리눔 독소의 중쇄 또는 경쇄 중의 하나를 재조합 수단에 의해서 개별적으로 합성하는 방법이 있다 [참조: 예를 들어, Zhou L, et al, Biochemistry 1995; 34(46):15175-81 (1995); 및 Johnson S K, et al, Protein Expr and Purif 2003; 32: 1-9 (2003)]. 그러나, 이러한 방법들은 완전하고 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소 단백질을 재형성시키기 위한 추가 단계를 필요로 하는 단점이 있다.

보다 최근의 방법으로는, 복합체로서 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합 모드, 및/또는 이온 교환 크로마토그래피의 사용을 포함한다[참조: 예를 들어, 미국특허 제7,452,697호 및 제7,354,740호].

그러나 본 기술분야에서는 여전히 안정하고 생물학적으로 활성을 보이는 완전한 보툴리눔 독소를 분리하기 위한 개선된 정제방법이 요구된다. 이에 본 발명자들은 간소화된 방법으로 순도 높은 보툴리눔 독소를 분리하기 위한 정제방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 음이온 교환 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피의 단순화된 공정을 이용하여 순도가 매우 높은 보툴리눔 독소를 생산해 낼 수 있음을 확인하였으며, 특히, 음이온 교환수지로 Q 컬럼을 사용하고, 양이온 교환수지로 SP 칼럼을 사용하였을 때, 95% 이상의 순도를 가지는 보툴리눔 독소를 정제할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

미국공개특허 제2003/0008367호 미국등록특허 제7,452,697호 미국등록특허 제7,354,740호

Schantz E J, et al, Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 March 56(l):80-99 Schmidt J J, et al, Purification of type E botulinum neurotoxin by high-performance ion exchange chromatography, Anal Biochem 1986 July; 156(1):213-219 Kannan K, et al, Methods development for the biochemical assessment of Neurobloc (botulinum toxin type B), Mov Disord 2000; 15(Suppl 2):20 Wang YC, The preparation and quality of botulinum toxin type A for injection (BTXA) and its clinical use, Dermatol Las Faci Cosm Surg 2002; 58 Zhou L, et al, Expression and purification of the light chain of botulinum neurotoxin A: A single mutation abolishes its cleavage of SNAP-25 and neurotoxicity after reconstitution with the heavy chain, Biochemistry 1995; 34(46):15175-81 Johnson S K, et al, Scale-up of the fermentation and purification of the recombination heavy chain fragment C of botulinum neurotoxin serotype F expressed in Pichia pastoris, Protein Expr and Purif 2003; 32: 1-9

본 발명의 목적은 단순 공정으로 순도가 매우 높은 보툴리눔 독소를 정제하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 보툴리눔 독소의 정제방법을 제공한다:

(a) 보툴리눔 독소를 포함하는 배양액을 전처리하는 단계;

(b) 전처리된 보툴리눔 독소를 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계; 및

(c) 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 단계.

본 발명에 따르면, 음이온 교환 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피로 구성된 단순 공정으로도 보툴리눔 독소의 정제 후 순도를 개선하고 특히 900kDa의 보툴리눔 독소 형태로 정제할 수 있어, 보툴리눔 독소 생산에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 음이온 교환 크로마토그래피 후 용리액에서 보툴리눔 독소를 FPLC 및 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 양이온 교환 크로마토그래피 후 용리액에서 보툴리눔 독소를 FPLC 및 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 보툴리눔 독소와 상업적으로 구입한 보툴리눔 독소의 정제 효과를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따라 정제한 보툴리눔 독소의 순도를 확인한 결과이다.
도 5는 한국 출원번호 10-2013-0092024의 정제방법으로 정제된 보툴리눔 독소의 순도를 확인한 결과이다.
도 6은 미국 출원번호 11/932789의 정제방법으로 정제된 보툴리눔 독소의 순도를 확인한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 보툴리눔 독소 배양액을 음이온 교환 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피의 정제공정으로 정제하는 경우, 기존의 방법으로 생산된 보툴리눔 독소에 비해 순도가 높고 약 900kDa의 균일한 형태의 보툴리눔 독소가 분리 및 정제되는 것을 확인하였으며, 특히, 음이온 교환수지로 Q 컬럼을 사용하고, 양이온 교환수지로 SP 칼럼을 사용하였을 때, 95% 이상의 순도를 가지는 보툴리눔 독소를 정제할 수 있는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 다음 단계를 포함하는 보툴리눔 독소의 정제방법에 관한 것이다:

(a) 보툴리눔 독소를 포함하는 배양액을 전처리하는 단계;

본 발명에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 Q 컬럼인 것이 바람직하고, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 SP 컬럼인 것이 바람직하다.

본 발명에서, 상기 Q 컬럼은 4차 암모니움(Q) 기능기를 포함하는 물질이 충진되어 있는 컬럼을 의미하며, 상기 SP 컬럼은 설포프로필 기능기를 포함하는 물질이 충진되어 있는 컬럼을 의미한다.

본 발명의 (a) 단계에서 보툴리눔 독소를 포함하는 배양액은 당업계에 공지된 통상의 방법을 사용하여 수득된 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양액을 사용할 수 있으며, 배양을 위해 사용될 수 있는 통상적인 배지를 이용하여 배양이 가능하나, 특히 동물 유래 성분이 배제된 배지를 이용하여 배양하는 것이 바람직하며, 예를 들어, PYG 배지(Potato peptone 3%, Yeast extract 1%, Glucose 1%)를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 보툴리눔 독소 생산 균주는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 또는 이의 변이체이고 가장 바람직하게는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) type A, NCTC13319 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 보툴리눔 독소 생산이 가능한 어떠한 균주라도 사용가능함은 통상의 기술자에게는 자명할 것이다.

본 발명의 (a) 단계에서의 배양액을 전처리하는 단계는 구체적 실시 양태로서 제균(예를 들어, 심층여과 및/또는 제균여과 등에 의해)된 배양액을 산 침전 또는 한외여과하는 단계일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

산 침전은 황산 침전 또는 염산 침전인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 즉, 본 발명의 (a) 단계에서 산 침전은 배양을 종료한 뒤 pH가 3.0 내지 4.5, 바람직하게는 pH가 3.3 내지 4.0, 가장 바람직하게는 pH가 3.4 내지 3.6이 되도록 산, 일 양태로서 황산 또는 또 다른 양태로서 염산을 첨가하여 보툴리눔 독소를 포함하는 배양액을 산 침전시키는 것일 수 있다.

한외여과 막으로는 카세트 타입(cassette type) 또는 중공막(hollow fiber)을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 즉, 본 발명의 (a) 단계에서 한외여과는 막크기가 50kDa 내지 500kDa, 바람직하게는 100kDa 내지 300kDa의 막크기로 한외여과하여 보툴리눔 독소를 포함하는 배양액을 회수하는 것일 수 있다.

또한, 선택적으로 전처리 단계에서 핵산을 제거하기 위해 DNase, RNase, nuclease 및/또는 benzonase를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명은 보툴리눔 독소의 정제 순도를 높이기 위하여, 추가의 정화 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에서의 정화 단계는 전처리 후 불순물을 추가로 제거하는 공정으로, 종래의 공지된 미세여과, 한외여과, 정밀여과, 심층여과 등의 공정으로 진행될 수 있다. 본 발명의 일 양태로서, 미세여과는 0.1~0.4㎛의 hollow fiber를 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 (b) 단계에서 음이온 교환 크로마토그래피는 전처리된 보툴리눔 독소를 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 결합시키는데 적정한 농도와 pH의 완충액에 용해시켜 상기 컬럼에 결합시키고, 이후 염 농도가 강화된 완충액을 이용하여 용리시키는 단계로, 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서 비-복합체 형태(non-complex form)의 보툴리눔 독소가 제거된다.

본 발명에 따른 보툴리눔 독소 정제방법에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 컬럼은 4차 암모니움(Q) 기능기를 갖는 레진이 장착된 컬럼인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 Q 칼럼인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 불순물 제거 및 보툴리눔 독소의 높은 활성 유지의 관점에서 상기 (b) 단계에서의 음이온 교환 크로마토그래피는 Q 컬럼을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 Toyopearl Super Q 650M 컬럼 , Q sepharose FF 컬럼, Q Sepharose High Performance (Q Sepharose HP) 등을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 Toyopearl Super Q 650M 컬럼 또는 Q sepharose FF 컬럼을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, Toyopearl Super Q 650M 컬럼은 4차 암모니움(Q) 기능기를 포함하는 65 μm Particle size, Methacrylic Bead type의 레진이 장착된 컬럼으로, Ion Exchange Capacity 는 0.25 ± 0.05 meq/mL 이며, DBC (Dynamic binding capacity)는 BSA 기준 149 mg/mL 이다.

본 발명에서, Q FF 컬럼은 4차 암모니움(Q) 기능기를 포함하는 90 μm Particle size, Strong anion 이며, Ion Exchange Capacity 는 0.18 ~ 0.25 mmol Cl-/mL 이다. DBC 는 HAS 기준 120 mg/mL 이다.

상기 (b) 단계에서 보툴리눔 독소는 pH 5.0 내지 7.0, 바람직하게는 pH 5.5 내지 pH 6.5의 30~70mM 인산나트륨 완충액에 용해시켜 Q 컬럼에 주입되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 (b) 단계에서 상기 컬럼에 결합된 보툴리눔 독소는 0.4~0.6M 염화나트륨이 첨가된 pH 5.0 내지 7.0, 바람직하게는 pH 5.5 내지 pH 6.5의 30~70mM 인산나트륨 완충액으로 용리되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 따른 보툴리눔 독소 정제방법에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 설포프로필(SP) 기능기를 갖는 레진이 장착된 컬럼인 것이 바람직하며, 더욱 자세하게는 SP 컬럼인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 불순물 제거 및 보툴리눔 독소의 높은 활성 유지의 관점에서 상기 (c) 단계에서의 양이온 교환 크로마토그래피는 SP 컬럼을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 SP sepharose HP 컬럼, SP sepharose FF 컬럼, Capto S 컬럼 등을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 (c) 단계에서 음이온 교환 크로마토그래피로부터 용리된 보툴리눔 독소를 포함하는 분획은 pH 3.5 내지 5.5, 바람직하게는 pH 4.0 내지 5.0의 15~25mM 구연산 나트륨 완충액에 용해시켜 SP 컬럼에 주입되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서, SP sepharose HP 컬럼은 설포프로필 기능기를 포함하고, 6% spherical, cross-linked agarose Matrix 형태이며, DBC는 ribonuclease A 기준으로 55 mg/mL, Particle size 는 34 μm인 레진이 장착된 컬럼이다.

본 발명에서, SP sepharose FF 칼럼은 설포프로필 기능기를 포함하고, 6% Highly cross-linked agarose Matrix 형태이며, DBC는 ribonuclease A 기준으로 70 mg/mL, Particle size 는 90 μm인 레진이 장착된 컬럼이다.

상기 (c) 단계에서 보툴리눔 독소는 0.4~0.6M 염화나트륨이 첨가된 pH 3.5 내지 5.5, 바람직하게는 pH 4.0 내지 5.0의 15~25mM 구연산나트륨 완충액으로 용리되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 방법으로 정제된 보툴리눔 독소는 순도 95% 이상의 보툴리눔 독소 A형인 것을 특징으로 할 수 있으며, 이와 같이 정제된 보툴리눔 독소는 기존 방법으로 정제된 보툴리눔 독소에 비해 높은 순도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 보툴리눔 독소는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) type A, NCTC13319 유래일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "분획(fraction)"은 하나 이상의 불순물과 함께 생물약학적 제제에 함유되는 적어도 하나의 표적 분자(예컨대 보툴리눔 독소)가 하나 이상의 불순물과 결합하는 물질을 통하여 통과하며, 상기 표적 분자는 보통 결합하지 않는(즉, 플로우 쓰루 하는) 또는 결합 후 용리되는 분리 방법에서, 표적 분자를 포함하여 통과된 물질이 각각 분리되어 수집되어 있는 그룹을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "정제"는 어떤 물질로부터 혼재해 있는 불순물을 제거하여 순도를 높이는 조작을 의미하며, 본 명세서에 있어서 정제는 보툴리눔균의 배양액으로부터 보툴리눔균이 과성장한 후 사멸되면서 생산한 보툴리눔 독소를 분리해내는 것이며, 보툴리눔 독소 생산 과정 중의 순도를 향상시키기 위한 방법으로 사용되는 공정을 의미한다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 시료 및 실험 재료 준비

1-1. 시료 준비

본 발명에서 사용한 보툴리눔 균주는 Clostridium botulinum type A, NCTC13319으로, 상기 균주는 500mL PYG 배지(Potato peptone 3%, Yeast extract 1%, Glucose 1%)에 1차 접종 후 혐기성 조건에서 12시간~24시간 ReadytoProcess WAVE 25 배양기로 34 ±1 ℃에서 배양하였다. 배양 후 균주의 성장이 대수증식기(log phase) 단계일 때 5L PYG 배지에 100mL 접종하고, 혐기성 조건에서 ReadytoProcess WAVE 25 배양기로 40~72시간 배양하였다. 배양액은 제균필터를 사용하여 제균하고 배양액만 회수하였다. 배양액에 3N 황산을 이용하여 pH 3.5로 적정하고, 침전 되는 것을 확인한 후 냉장조건에서 16시간 이상 보관하였다.

1-2. 실험 재료 준비

본 발명에서 사용된 실험 재료는 다음과 같다: 정제수 (Ultrapure water 또는 동등 이상의 품질을 가진 물), Toyopearl Super Q 650M (Tosoh Bioscience, 43205), SP sepharose HP (GE Healthcare, 171087) , Q sepharose FF(GE Healthcare, 170510), SP sepharose FF(GE Healthcare, 170729), Butyl sepharose FF (GE Healthcare, 170980), Phenyl sepharose HP (GE Healthcare, 171082), Citric acid (Merck, 1.37002.5000), Tri - sodium citrate dehydrate (Merck, 1.37042.5000), Sodium phosphate monobasic (Merck, 1.06349.1000), Sodium phosphate dibasic (Merck, 1.06585), Sodium chloride (Merck, 1.37017.5000)

실시예 2. 보툴리눔 독소의 정제

2-1. 미세여과(Microfiltration)

미세여과 장비 AKTA flux 6(GE healthcare)를 켜고 0.2㎛ hollow fiber를 연결하였다. 증류수 5 L를 넣고 TMP 0.3bar 조건으로 장비 및 hollow fiber를 2회 세척하였다. 실시예 1-1에서 준비된 보툴리눔 독소 배양액 황산침전물 5 L를 미세여과 장비에 넣고 TMP 0.3 조건으로 1 L까지 농축한 후, 농축액에 2 L의 DW를 넣고 3 L에서 1 L까지 추가 농축하는 과정을 5회 반복하였다. 50 mM sodium phosphate(pH 6.0)를 1 L 넣고 1시간 동안 순환하여 추출(extraction)하였다. 추출액은 미세여과장비의 Permeate line으로 회수하고 미세여과 장비에 300 kDa cut off hollow fiber를 연결하였다. 상기 추출물을 넣고 TMP 0.3bar 조건으로 500mL까지 농축하여 회수한 후, 4℃에 보관하였다.

2-2. 음이온 교환 크로마토그래피

Toyopearl Super Q 650M 수지(Resin)를 AKTA Pure에 장착하였다. 평형/세척 완충액 (50 mM sodium phosphate, pH 6.0)을 1 CV, 108 mL 흘려 컬럼을 평형화하였다. 실시예 2-1에서 준비된 시료 200 mL을 8mL/분으로 주입하였다. 주입이 끝나면 2 CV, 216 mL의 평형/세척 완충액 (50mM sodium phosphate, pH 6.0)을 흘려 컬럼을 세척하였다. 세척 후 평형 및 용출 완충액을 5 CV, 50% 구배(Linear gradient)로 용출하였다(표 1 참조). 순차적으로 총 14개의 분획(fraction)이 수득되었고, 상기 분획은 각각 SDS-PAGE로 확인하였다.

Column	Toyopearl Super Q 650M
Binding 및 washing buffer	50 mM sodium phosphate, pH 6.0
Elution buffer	50 mM sodium citrate / 0.5 M sodium chloride, pH 6.0

그 결과는 도 1과 같으며, 총 14개의 분획 중 1 내지 3번째 분획에서 HA33(SDS-PAGE 상의 빨간색 화살표)이 확인되는바, 900 kDa 복합체 형태의 보툴리눔 독소가 해당 분획에서 정제되었음을 확인할 수 있었다.

2-3. 양이온 교환 크로마토그래피

Hitrap SP 컬럼 (GE Healthcare, 17115201)을 AKTA Pure에 장착을 하였다. 평형/세척 완충액 (20 mM sodium citrate pH 4.5)을 2 CV, 10 mL 흘려 컬럼을 평형화하였다. 실시예 2-2에서 SDS-PAGE를 통해 보툴리눔 독소를 포함하는 분획 1 내지 3을 모아 준비한 시료(140mL)는 20mM sodium citrate pH 4.5로 투석하고 컬럼에 5mL/분으로 주입하였다. 주입이 끝나면 5 CV, 25mL 의 평형/세척 완충액 (20 mM sodium citrate pH 4.5)을 흘려 컬럼을 세척하였다. 세척 후 평형 및 용출 완충액을 20 CV, 60% 구배(Linear gradient) 단계로 용출하였다(표 2 참조). 5 mL씩 순차적으로 총 21 개의 분획(fraction)을 수득하고, 상기 분획은 각각 SDS-PAGE로 확인하였다.

Column	SP Sepharose HP
Binding 및 washing buffer	20 mM sodium citrate, pH 4.5
Elution buffer	20 mM sodium citrate/ 0.5 M sodium chloride, pH 4.5

그 결과는 도 2와 같으며, 총 21개의 분획 중 14 내지 17번째 분획에서 불순물이 포함되지 않은 900 kDa 복합체 형태의 보툴리눔 독소가 확인되었다.

2-4. 농축

실시예 2-3의 양이온 교환 크로마토그래피로 용리된 분획 중 보툴리눔 독소를 포함하는 분획 14 ~ 17, 20 mL을 모아, 30 kDa cut off centricon에 붓고 4000×g, 4℃조건으로 0.5mL까지 농축하였다.

실시예 3. 표준품과 정제산물 비교

실시예 2에 의해 정제된 보툴리눔 독소와 상업적으로 구입 가능한 보툴리눔 독소인 C-BoNT/A1 (Cat. No. #3102, miprolab)를 각각 1mg/ml의 농도가 되도록 50mM Sodium phosphate Buffer(pH 6.2)로 희석하고, 표 3과 같은 환원조건과 비환원조건으로 구분하여 로딩용 시료를 만들었다. 시료를 Novex Wedge Well 4-20% Tris-Glucine, 10 well (Invitrogen, NP04200BOX)에 전기영동하고, Instant Blue stain reagen를 약 30 mL 붓고 Shaker에 올려 60분간 염색한 후, 염색시약을 완전히 제거하고 정제수를 약 30 mL 부은 후 Shaker에 30분 동안 올려 세척하는 과정을 5회 이상 반복하였다. 배경이 충분히 제거되고 밴드 확인이 가능할 때, Image Analyzer를 이용하여 gel을 분석하였다.

	환원조건	비환원조건
보툴리눔 독소(1mg/ml)	3 uL	3 uL
LDS Sample Buffer (4x)	5 uL	5 uL
Sample Reducing Agent (10x)	2 uL	0 uL
정제수	10 uL	12 uL
Total Volume	20 uL

그 결과, 도 3에서와 같이, 본 발명의 정제방법으로 정제된 보툴리눔 독소는 상업적으로 구입 가능한 보툴리눔 독소와 동일한 위치에서 밴드가 확인되었으며, 이로부터 본 발명의 정제방법이 정확한 목적 단백질만 정제할 수 있음을 알 수 있었으며, 표준품인 C-BoNT의 밴드에 불순물 밴드가 많이 나타난 반면, 본 발명의 정제방법으로 정제된 샘플(Jetema)의 경우, 보다 깨끗하고 뚜렷한 밴드를 확인할 수 있었다.

실시예 4. 타사의 2단계 정제 공정과의 순도 비교

보툴리눔 독소의 대표적인 제조사 중 하나인 알러간(Allergan) 사가 한국에 출원한 특허출원번호 10-2013-0092024에 기재된 정제방법으로 정제된 보툴리눔 독소의 순도를 분석해 보았다.

정제된 보툴리눔 독소의 순도 분석은 표 4의 조건을 이용하여 HPLC로 분석하였다.

Item	Condition
Column	PROTEIN KW-804
Size	8 mm × 300 mm
Stationary phase	silica gel for chromatography R (7 μm)
Temperature	25 ℃
Mobile phase	50 mM Sodium phosphate pH 6.0, 0.15 M NaCl
Flow rate	1.0 mL/min
Running time	30 min
Detection	UV detector, 278 nm
Injection volume	20 μL

그 결과, 도 5에서와 같이 주요 피크 외에 더 작은 크기의 불순물(retention time, 10.3min)이 확인되었으며, 900kDa 단백질이 150kDa, 300kDa 또는 500kDa의 단백질과 효과적으로 분리되지 못하는 것으로 나타났다.

또한, 알러간(Allergan) 사의 미국 출원번호 11/932789의 정제방법으로 정제된 보툴리눔 독소의 순도를 분석해 보았다. 그 결과, 도 6에서와 같이 주요 피크 외에 더 큰 크기의 불순물(retention time, 6.7min)이 확인되었다. 이는 원하지 않는 침전물이 생성된 것으로, 정제 과정이 단백질 구조에 영향을 미쳤음을 예상할 수 있다.

이와 대비하여 본 발명은 약 900kDa 독소만을 특이적으로 정제할 수 있으며, 정제 중 생길 수 있는 독소의 변형도 최대한 감소시킨 공정임을 도 4의 결과로부터 확인할 수 있다.

실시예 5. 2단계 크로마토그래피 공정과 본 발명의 정제 공정 비교

알러간(Allergan) 사의 미국 등록특허 제7,452,697호와 미국 공개특허 제2019-0201505호에 기재된 보툴리눔 독소 정제에 사용된 레진과 본 발명의 정제방법에 사용된 레진의 다른 타입을 적용한 정제방법을 사용하여, 정제된 보툴리눔 독소의 순도 및 역가를 비교하였다(표 5).

순도는 표 4의 방법으로 HPLC로 확인하였으며, 역가는 Mouse assay 분석법으로 단백질 농도가 1 mg/mL 인 상태에서, 마우스의 3일간 사망 개체수 결과를 바탕으로 CombiStats에 적용하여 Probit법으로 통계처리하여 역가를 계산하였다.

	1^st 칼럼 레진	2^nd 칼럼 레진
본 발명 (실험예 1)	Toyopearl Super Q 650M	SP sepharose HP
본 발명 (실험예 2)	Q sepharose FF	SP sepharose FF
US 7,452,697 (비교예 1)	Butyl sepharose FF	SP sepharose HP
US 2019-0201505 (비교예 2)	SP sepharose HP	Phenyl sepharose HP

각 실험예와 비교예에서 사용한 컬럼의 종류와 정제 조건은 표 6~9에 나타내었다.

그 결과, 표 10에 나타난 바와 같이, 본 발명의 정제 방법인 실험예 1로 정제된 보툴리눔 독소는 높은 순도 98.6 %를 확인하였으며, 타입이 다른 레진을 사용한 정제 방법인 실험예 2도 비슷한 수준의 결과(순도 95.2%)를 나타내었다. 알러간사의 특허에 기재된 정제방법인 비교예 1 및 비교예 1의 방법에 의해 정제된 보톨리눔 독소는 실험예 1 및 실험예 2에 의해 정제된 독소에 비하여 순도가 낮은 것으로 나타났다. 보툴리눔 독소의 역가는 비교예 1의 방법으로 정제한 독소를 제외하고 전체적으로 높은 수준의 결과를 확인하였다.

	단계	SEC-HPLC (순도, %)	역가 (Unit/mg)
실험예 1	Toyopearl Super Q 650M-> SP-HP	98.6	3.17 X10⁷
실험예 2	Q -FF -> SP-FF	95.2	4.05 X10⁷
비교예 1	Butyl-FF -> SP-HP	63.1	1.10 X10⁷
비교예 2	SP-HP -> Phenyl-HP	82.7	4.16 X10⁷

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 보툴리눔 독소의 정제방법:
(a) 보툴리눔 독소를 포함하는 배양액을 전처리하는 단계;
(b) 전처리된 보툴리눔 독소를 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계; 및
(c) 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서의 음이온 교환 크로마토그래피는 Q 컬럼을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
제2항에 있어서, 상기 Q 컬럼은 Toyopearl Super Q 650M 컬럼 , Q sepharose FF 컬럼 및 Q Sepharose HP 컬럼으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서의 양이온 교환 크로마토그래피는 SP 컬럼을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
제4항에 있어서, 상기 SP 컬럼은 SP sepharose HP, SP sepharose FF 컬럼 및 Capto S 컬럼으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
제2항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 보툴리눔 독소는 pH 5.5~6.5의 30~70mM 인산나트륨 완충액에 용해시켜 Q 컬럼에 주입되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
제2항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 보툴리눔 독소는 0.4~0.6M 염화나트륨이 첨가된 pH 5.5~6.5의 30~70mM 인산나트륨 완충액으로 용리되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
제3항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 보툴리눔 독소는 pH 4.0~5.0의 15~25mM 구연산나트륨 완충액에 용해시켜 SP 컬럼에 주입되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
제3항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 보툴리눔 독소는 0.4~0.6M 염화나트륨이 첨가된 pH 4.0~5.0의 15~25mM 구연산나트륨 완충액으로 용리되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.
제1항에 있어서, 정제된 보툴리눔 독소는 순도 95% 이상의 보툴리눔 독소 A형인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 정제방법.