WO2024101624A1 - 보툴리눔 독소의 정제방법 - Google Patents

보툴리눔 독소의 정제방법 Download PDF

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WO2024101624A1
WO2024101624A1 PCT/KR2023/013358 KR2023013358W WO2024101624A1 WO 2024101624 A1 WO2024101624 A1 WO 2024101624A1 KR 2023013358 W KR2023013358 W KR 2023013358W WO 2024101624 A1 WO2024101624 A1 WO 2024101624A1
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WO
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column
clause
botulinum toxin
type
present
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PCT/KR2023/013358
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김재영
남정선
윤범진
김승호
김민중
심명보
김주연
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(주)제테마
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying botulinum toxin (BTX), and more specifically, to cation exchange chromatography (CEX), hydrophobic interaction chromatography (HIC), and mixed mode chromatography (Type E botulinum toxin, which is performed in the order of purification using Mixed Mode Chromatography: Cation Exchange (Phosphate) and Affinity (Calcium), but additionally includes the step of treating with trypsin to activate the botulinum toxin. It relates to a purification method.
  • Botulinum toxin is a neurotoxin protein produced by bacteria such as Clostridium butyricum, Clostridium baratii, and Clostridium botulinum. Botulinum toxin blocks neuromuscular transmission and causes neuroparalytic disease in humans and animals. Seven different types of botulinum toxin have been identified: A, B, C1, D, E, F, G, and H. Each type can be distinguished by type-specific antibodies, and the paralysis they cause can be prevented. The severity and the animal species they affect vary.
  • the molecular weight of the botulinum toxin protein molecule is approximately 150 kDa, consisting of a heavy chain of approximately 100 kDa conjugated to a light chain of approximately 50 kDa.
  • botulinum toxin released by Clostridium bacteria is released by forming a complex between a 150 kDa toxin and one or more non-toxin proteins.
  • botulinum toxin is released as 900 kDa, 500 kDa, and 300 kDa complexes.
  • Botulinum toxin can be very fatal to humans, but recently, botulinum toxin has been developed for the purpose of treating a variety of conditions, including neuromuscular disorders characterized by hyperactivity of skeletal muscles.
  • BOTOX ® is a trademark of botulinum toxin A commercially developed by Allergan, Inc., which is used to treat blepharospasm, strabismus, cervical dystonia, and glabellar (facial) wrinkles. , research is continuing to develop appropriate uses for other serotypes and utilize them clinically.
  • Botulinum toxin for clinical use is generally isolated from cell culture, and various purification methods are used.
  • Botulinum toxin for clinical use is purified in complexed form by a series of precipitation and tangential flow filtration steps [Schantz E J, et al, Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 March 56(l):80-99].
  • these methods provided relatively low yields, typically less than about 10%.
  • Another method is to individually synthesize either the heavy or light chain of botulinum toxin by recombinant means rather than the complete and biologically active botulinum toxin protein [Zhou L, et al, Biochemistry 1995; 34(46):15175-81 (1995); and Johnson S K, et al, Protein Expr and Purif 2003; 32: 1-9 (2003)].
  • More recent methods include the use of hydrophobic interaction chromatography, mixed mode, and/or ion exchange chromatography to purify botulinum toxin as a complex (U.S. Patents 7,452,697 and 7,354,740).
  • the present inventors made diligent efforts to develop a purification process capable of obtaining type E botulinum toxin with high purity and excellent activity.
  • the purity was improved by using the processes of cation exchange chromatography, hydrophobic chromatography, and mixed mode chromatography.
  • botulinum toxin with very high activity can be purified, especially when using an SP column as a cation exchange resin, a Butyl column as a hydrophobic resin, and a CHT column as a mixed mode resin, 99
  • the present invention was completed by confirming that botulinum toxin with a purity of % or higher can be purified.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for purifying botulinum toxin (BTX).
  • BTX botulinum toxin
  • the present invention provides a method for purifying type E botulinum toxin, comprising the following steps.
  • step (b) purifying the culture medium pretreated in step (a) using cation exchange chromatography (CEX);
  • step (c) purifying the eluent purified in step (b) using hydrophobic interaction chromatography (HIC);
  • step (d) reacting the eluate purified in step (c) with trypsin to activate the E-type botulinum toxin;
  • the pretreatment in step (a) may be ultrafiltration.
  • the ultrafiltration may be performed using a filtration membrane with a size of 10 kDa to 300 kDa.
  • the filtration membrane may be a cassette type or hollow fiber filtration membrane.
  • the cation exchange chromatography column in step (b) is selected from the group consisting of carboxymethyl (CM), sulfoethyl (SE), sulfopropyl (SP), phosphate (P), and sulfonate (S). It may be characterized as a column equipped with a resin containing one or more functional groups.
  • the sulfopropyl (SP) column may be characterized as being at least one selected from the group consisting of SP sepharose HP column, SP sepharose FF column, and Capto S.
  • step (b) may be characterized by diluting the culture medium pretreated in step (a) with purified water or a buffer solution and injecting it into a cation exchange chromatography column.
  • the buffer solution may be a sodium citrate buffer solution.
  • a fraction containing type E botulinum toxin may be obtained by injecting a sodium citrate buffer containing sodium chloride as an elution buffer into the column.
  • the elution buffer may be a 10-50 mM sodium citrate buffer solution with a pH of 4.0-6.0 to which 0.5-1.5 M sodium chloride is added.
  • the hydrophobic chromatography column has at least one function selected from the group consisting of ether, isopropyl, butyl, octyl, and phenyl. It may be characterized as a column equipped with a resin containing a group.
  • the Butyl column may be characterized as being at least one selected from the group consisting of a Butyl sepharose HP column, Capto Butyl column, Capto phenyl column, and Phenyl HP column.
  • step (c) may be characterized in that the eluent purified in step (b) is diluted in a buffer solution with a pH of 4.0 to 6.0 and injected into a hydrophobic chromatography column.
  • the buffer solution may be a 25-75 mM sodium phosphate and/or sodium citrate buffer solution with a pH of 4.0-6.0 to which 3.5-4.5 M sodium chloride is added.
  • a fraction containing type E botulinum toxin may be obtained by injecting 25 to 75 mM sodium phosphate buffer and/or sodium citrate buffer at pH 4.0 to 6.0 into the column.
  • step (c) a step (c') of pretreating the eluent purified in step (c) may be further included.
  • the pretreatment in step (c') may be characterized by diafiltration and/or ultrafiltration.
  • the diafiltration and/or ultrafiltration may be characterized by diafiltration and/or ultrafiltration using a filtration membrane with a size of 10 kDa to 300 kDa.
  • the filtration membrane may be a cassette type or hollow fiber filtration membrane.
  • the diafiltration may be characterized as diafiltration using a 25 to 75 mM sodium phosphate buffer solution with a pH of 4.0 to 6.0.
  • the reaction in step (d) may be characterized in that the eluate is reacted with trypsin at 33 to 36°C for 0.5 to 2 hours to activate the E-type botulinum toxin in the eluate.
  • the mixed mode chromatography column in step (e) is characterized in that it is a column (CHT Ceramic Hydroxyapatite) equipped with a resin containing a calcium phosphate composite Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 functional group. You can.
  • the CHT column may be CHT Type I and/or CHT-XT.
  • step (e) may be characterized by diluting the trypsin reaction solution of step (d) with purified water and injecting it into a mixed mode chromatography column.
  • a 5 to 50 mM sodium phosphate buffer solution with a pH of 4.0 to 6.0 to which 1.5 to 3.0 M sodium chloride is added is injected into the column to obtain a fraction containing type E botulinum toxin. there is.
  • the present invention also provides type E botulinum toxin prepared by the above method.
  • type E botulinum toxin with excellent purity and activity can be purified and thus can be usefully used in producing type E botulinum toxin.
  • the E-type botulinum toxin has the advantage of being effective on the day of injection and lasting up to a month, so it can be used to manufacture biopharmaceuticals, tissue sutures, facial fixation lifting threads, and lipolytic injections.
  • Figure 1 shows the results of analysis of botulinum toxin in the eluate by FPLC and SDS-PAGE after cation exchange chromatography according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the results of analyzing botulinum toxin in the eluent after hydrophobic chromatography according to an embodiment of the present invention by FPLC and SDS-PAGE.
  • Figure 3 shows the results of SDS-PAGE analysis of the purification step using trypsin according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the results of analysis of botulinum toxin in the eluate by FPLC and SDS-PAGE after mixed mode chromatography according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 shows the results of SE-HPLC analysis of the purity of botulinum toxin purified according to the present invention.
  • Figure 6 shows the results of SDS-PAGE analysis of samples at each stage of botulinum toxin purification according to the present invention.
  • Figure 7 shows the results of RP-HPLC analysis of the purity of botulinum toxin purified according to the present invention.
  • Figure 8 shows the results of confirming the HPLC purity of botulinum toxin purified under optimized conditions.
  • Figure 9 shows the results of SDS-PAGE comparison of botulinum toxin cleavage ability according to trypsin-derived species.
  • botulinum toxin refers to a neurotoxin produced by Clostridium botulinum, as well as a botulinum toxin (or a light or heavy chain thereof) recombinantly produced by a non-Clostridial species.
  • botulinum toxin also includes both pure botulinum toxin (e.g., about 150 kDa) as well as botulinum toxin complexes (e.g., 300, 600, and 900 kDa complexes).
  • the “pure botulinum toxin” is defined as a botulinum toxin that has been separated, or substantially separated, from other proteins, including proteins that form a botulinum toxin complex. Pure botulinum toxin may have a purity of 95% or higher, preferably 99% or higher.
  • the botulinum toxin producing strain may be Clostridium botulinum or a variant thereof, most preferably Clostridium botulinum type E, but is not limited thereto, and may be any strain capable of producing botulinum toxin. Its usability will be obvious to those skilled in the art.
  • the present invention relates to a method for purifying type E botulinum toxin, comprising the following steps.
  • step (b) purifying the culture medium pretreated in step (a) using cation exchange chromatography (CEX);
  • step (c) purifying the eluent purified in step (b) using hydrophobic interaction chromatography (HIC);
  • step (d) reacting the eluate purified in step (c) with trypsin to activate the E-type botulinum toxin;
  • the pretreatment in step (a) may be characterized as ultrafiltration, but is not limited thereto.
  • the ultrafiltration may be characterized as ultrafiltration using a filtration membrane with a size of 10 kDa to 300 kDa, preferably 50 kDa to 100 kDa, but is not limited thereto.
  • the filtration membrane may be a cassette type or hollow fiber filtration membrane, but is not limited thereto.
  • the cation exchange chromatography column in step (b) is selected from the group consisting of carboxymethyl (CM), sulfoethyl (SE), sulfopropyl (SP), phosphate (P), and sulfonate (S). It may be characterized as a column equipped with a resin containing one or more functional groups, but is not limited thereto.
  • the sulfopropyl (SP) column can effectively remove impurities and maintain high activity of botulinum toxin in the cation exchange chromatography.
  • SP sepharose HP column As the sulfopropyl (SP) column, SP sepharose HP column, SP sepharose FF column, Capto S, etc. can be used, preferably SP sepharose HP column, but is not limited thereto.
  • the SP sepharose HP column contains a sulfopropyl functional group and is in the form of a 6% spherical, cross-linked agarose matrix, DBC is 55 mg/mL based on Ribonuclease A, and particle size is 34 ⁇ m. It may be a column equipped with phosphor resin, but is not limited thereto.
  • step (b) when purification is performed using a type of chromatography other than cation exchange chromatography (e.g., anion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, or mixed mode chromatography) and a column thereof, the present invention
  • a type of chromatography other than cation exchange chromatography e.g., anion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, or mixed mode chromatography
  • the present invention Compared to purification using cation exchange chromatography and its column (e.g., sulfopropyl (SP) column), the purification yield and purity of botulinum toxin type E may be lower.
  • SP sulfopropyl
  • step (b) may be characterized by diluting the culture solution pretreated in step (a) with purified water or a buffer solution and injecting it into a cation exchange chromatography column, but is not limited to this.
  • the concentration and pH of the buffer may be appropriate for binding E-type botulinum toxin to a cation exchange chromatography column, but are not limited thereto.
  • the buffer solution may be characterized as a sodium citrate buffer solution, but is not limited thereto.
  • a fraction containing type E botulinum toxin may be obtained by injecting a sodium citrate buffer containing sodium chloride as an elution buffer into the column, but is not limited to this.
  • the elution buffer may be characterized as a 10-50 mM sodium citrate buffer solution with pH 4.0-6.0 to which 0.5-1.5 M sodium chloride is added, but is not limited thereto.
  • step (b) of the present invention impurities are removed, and type E botulinum toxin in complex form can be captured.
  • the hydrophobic chromatography column has at least one function selected from the group consisting of ether, isopropyl, butyl, octyl, and phenyl. It may be characterized as a column equipped with a resin containing a group, but is not limited thereto.
  • the Butyl column can effectively separate proteins in non-complexed form.
  • the Butly column may be a Butyl sepharose HP column, a Capto Butyl column, a Capto phenyl column, a Phenyl HP column, etc., and a Butyl sepharose HP column may be preferably used, but is not limited thereto.
  • the Butyl sepharose HP column has a highly cross-linked agarose 6% matrix, exhibits a degree of substitution of 50 ⁇ mol Butyl groups/mL, and has a bead size of 34 ⁇ m. It may be a column equipped with a resin, but is not limited thereto.
  • step (c) when purification is performed using a type of chromatography other than hydrophobic chromatography (e.g., cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, or mixed mode chromatography) and a column thereof, the present invention Compared to purification using hydrophobic chromatography and its column (e.g., Butyl column), the purification yield and purity of botulinum toxin type E may be lower.
  • a type of chromatography other than hydrophobic chromatography e.g., cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, or mixed mode chromatography
  • the purification yield and purity of botulinum toxin type E may be lower.
  • step (c) may be characterized in that the eluate purified in step (b) is diluted in a buffer solution of pH 4.0 to 6.0 and injected into a hydrophobic chromatography column, but is not limited to this.
  • the buffer solution may be characterized as a 25 to 75 mM sodium phosphate and/or sodium citrate buffer solution with a pH of 4.0 to 6.0 to which 3.5 to 4.5 M sodium chloride is added, but is not limited thereto.
  • the concentration and pH of the buffer may be appropriate for binding E-type botulinum toxin to a hydrophobic chromatography column, but are not limited thereto.
  • a fraction containing type E botulinum toxin may be obtained by injecting 25 to 75 mM sodium phosphate and/or sodium citrate buffer solution at pH 4.0 to 6.0 into the column. Not limited.
  • Impurities (75 kDa) may be further removed in step (c) of the present invention, but are not limited thereto.
  • step (c) pretreatment of the eluent purified in step (c) may be further included, but is not limited thereto.
  • the pretreatment in step (c') may be characterized by diafiltration and/or ultrafiltration, but is not limited thereto.
  • the filtration membrane may be a cassette type or hollow fiber filtration membrane, but is not limited thereto.
  • the diafiltration and/or ultrafiltration may be characterized as diafiltration and/or ultrafiltration using a filtration membrane with a size of 10 kDa to 300 kDa, preferably 30 kDa to 50 kDa. Not limited.
  • the diafiltration may be characterized as diafiltration using a 25 to 75 mM sodium phosphate buffer solution with a pH of 4.0 to 6.0, but is not limited thereto.
  • step (d) of the present invention when trypsin is treated at 33 to 36°C for 0.5 to 2 hours, the HC (heavy chain, 100 kDa) and LC (light chain, 50 kDa) of the 150 kDa E-type botulinum toxin protein are formed.
  • the peptide bond (covalent bond) can be cleaved and the botulinum toxin can be activated.
  • the reaction in step (d), may be characterized in that the eluent is reacted with trypsin at 33 to 36°C for 0.5 to 2 hours to activate the E-type botulinum toxin in the eluate. , but is not limited to this.
  • the trypsin may be characterized as pig-derived trypsin, but is not limited thereto.
  • the mixed mode chromatography column in step (e) is characterized in that it is a column (CHT Ceramic Hydroxyapatite) equipped with a resin containing a calcium phosphate composite Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 functional group. may, but is not limited to this.
  • the CHT column can effectively remove other impurities and increase the purity of botulinum toxin of ⁇ 300 kDa.
  • the CHT column may be CHT TypeI, CHT-XT, etc., and preferably a CHT-XT column, but is not limited thereto.
  • the present invention in the case of purification using a type of chromatography other than mixed mode chromatography (e.g., cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, or hydrophobic chromatography) and a column thereof in step (e), the present invention Compared to purification using mixed mode chromatography and its column (eg, CHT column), the purification yield and purity of botulinum toxin type E may be lower.
  • a type of chromatography other than mixed mode chromatography e.g., cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, or hydrophobic chromatography
  • the purification yield and purity of botulinum toxin type E may be lower.
  • step (e) may be characterized by diluting the trypsin reaction solution of step (d) with purified water and injecting it into a mixed mode chromatography column, but is not limited to this.
  • the dilution with purified water may be characterized as dilution to lower the buffer concentration of the trypsin reaction solution to bind the E-type botulinum toxin to the mixed mode chromatography column, but is not limited thereto.
  • a 5 to 50 mM sodium phosphate buffer solution with a pH of 4.0 to 6.0 to which 1.5 to 3 M sodium chloride is added is injected into the column to obtain a fraction containing type E botulinum toxin.
  • a pH of 4.0 to 6.0 to which 1.5 to 3 M sodium chloride is added is injected into the column to obtain a fraction containing type E botulinum toxin.
  • step (e) of the present invention impurities (75 kDa) are further removed, and the purity of the botulinum toxin complex can be increased.
  • the mixed mode chromatography step may use any mixed mode chromatography process known in the art.
  • Mixed mode chromatography involves the use of solid-phase chromatography supports in the form of resins, monoliths, or membranes that use multiple chemical mechanisms to adsorb proteins or other solutes.
  • Examples useful in the present invention include, but are not limited to, chromatographic supports that utilize a combination of two or more of the following mechanisms: anion exchange, cation exchange, hydrophobic interaction, hydrophilic interaction, thiophilic interaction, Hydrogen bonding, pi-pi bonding, and metal affinity.
  • a mixed mode chromatography process includes (1) anion exchange and hydrophobic interaction techniques; (2) cation exchange and hydrophobic interaction techniques; and/or (3) combine electrostatic and hydrophobic interaction techniques.
  • the mixed mode chromatography step can be accomplished by using columns and resins, such as Capto® adhere columns and resins available from GE Healthcare Life Sciences.
  • the Capto ® adhere column is a multimodal medium for intermediate purification and polishing of monoclonal antibodies after capture.
  • the mixed mode chromatography step may be performed in flow-through mode. In another aspect, the mixed mode chromatography step can be performed in bind-elute mode.
  • the mixed mode chromatography step can be accomplished by using one or more of the following systems: Capto ® MMC (Cytiva), HEA HyperCelTM (Pall Corporation), PPA HyperCelTM (Pall Corporation), MBI HyperCelTM (Pall Corporation), MEP HyperCelTM (Pall Corporation), Blue Trisacryl M (Pall Corporation), CFTTM Ceramic Fluoroapatite (Bio-Rad Laboratories, Inc.), CHTTM Ceramic Hydroxyapatite (Bio-Rad Laboratories, Inc.) and/ or ABxTM (JT Baker).
  • Capto ® MMC Cell MultimediaCard Chemical Company
  • HEA HyperCelTM PPA HyperCelTM
  • MBI HyperCelTM Pall Corporation
  • MEP HyperCelTM Pall Corporation
  • Blue Trisacryl M Pall Corporation
  • CFTTM Ceramic Fluoroapatite Bio-Rad Laboratories, Inc.
  • CHTTM Ceramic Hydroxyapatite Bio-
  • the cation exchange chromatography column is a sulfopropyl (SP) column
  • the hydrophobic chromatography column is a Butyl column
  • the hydrophobic chromatography column is a Butyl column.
  • the mixed mode chromatography column may be, but is not limited to, a CHT-XT column, but if a different type of column is used, the purification yield and purity of botulinum toxin type E may be lowered.
  • the botulinum toxin purified by the above method may be characterized as botulinum toxin type E with a purity of 99% or more, and the botulinum toxin purified in this way may be characterized as having a higher purity than the botulinum toxin purified by the existing method.
  • the present invention relates to type E botulinum toxin prepared by the above method from another aspect.
  • fraction means that at least one target molecule (e.g., botulinum toxin) contained in a biopharmaceutical preparation along with one or more impurities passes through a substance that binds to one or more impurities, and the target
  • a molecule refers to a group in which the passed substances, including the target molecule, are collected separately.
  • purification used in the present invention refers to an operation to increase purity by removing mixed impurities from a substance.
  • purification refers to botulinum bacteria produced by overgrowth and death of botulinum bacteria from a culture medium of botulinum bacteria. It refers to a process that separates toxins and is used as a method to improve purity during the botulinum toxin production process.
  • Ultra-filtration UF
  • pretreatment process for culture media of type E botulinum toxin producing strains.
  • a Pellicon ® 2 Mini Cassette (50 kDa, 0.1 m 2 ) was installed in the TFF System. Measure culture recovery fluid volume, pH, and conductivity. The culture recovery liquid is first concentrated through ultrafiltration. Purified water is added to the first concentration process solution, and secondary concentration is performed to recover the second concentration process solution. Purified water is added to the TFF system, and the remaining process liquid is recovered and combined with the already recovered secondary concentrated process liquid. Check the combined final process liquid volume, pH, and conductivity.
  • Example 1 A column packed with SP-HP resin was mounted on FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography).
  • the final process solution prepared in Example 1 was adjusted to pH 5.0 using 1 N hydrogen chloride (HCl), and the process solution was injected into the column. After injection, the column was washed with equilibration/wash buffer (20 mM sodium citrate, pH 5.0). After washing, equilibration/elution buffer (20 mM sodium citrate, 1 M sodium chloride, pH 5.0) was injected, and fractions in the 0 to 0.5 M sodium chloride range were sequentially obtained. Each fraction was confirmed by SDS-PAGE, and samples for SDS-PAGE analysis were prepared under the conditions shown in Table 1.
  • Sample preparation conditions for SDS-PAGE analysis Components Reduced condition Non-reduced condition Botulinum toxin (1 mg/mL) 3 uL 3 uL LDS Sample buffer (4x) 5 uL 5 uL Sample reducing agent (10x) 2 uL 0 uL Purified water 10 uL 12 uL Total volume 20 uL
  • Sartocon Slice 200 (30 kDa, 0.02 m 2 ) was installed on the TFF System.
  • the eluent obtained from the second hydrophobic chromatography is diafiltered (DF) more than 1,000 times with 50 mM sodium phosphate, pH 5.8 (hereinafter referred to as DF buffer).
  • DF buffer diafiltered
  • the final process solution is filtered through a 0.2 ⁇ m filter and stored at 4°C.
  • Example 2-3 The final process solution of Example 2-3 was reacted with Trypsin (Roche, 06369880) at 35°C for 1 h, and then the Trypsin reaction solution was recovered. Dilute the trypsin reaction solution in a 1:4 ratio using cooled purified water. Check the amount, pH, and conductivity of the diluted reaction liquid. After checking the pH, it was titrated to pH 5.8 using 1 N sodium hydroxide and confirmed by SDS-PAGE ( Figure 3).
  • a column packed with CHT-XT (Resin) was mounted on FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography).
  • the trypsin reaction solution of Example 2-5 was injected into the column. After injection, the column was washed with equilibration/wash buffer (10 mM sodium phosphate, pH 5.8). After washing, equilibration/elution buffer (10 mM sodium phosphate, 2 M sodium chloride, pH 5.8) was injected, and fractions in the 0 to 2.0 M sodium chloride range were sequentially obtained.
  • Clostridium botulinum type E complex toxin (Metabiologics, Inc. Lot: E010821-01) was used as a research reference standard, a commercially available botulinum toxin. It was diluted with a buffer solution of 10 mM sodium phosphate, pH 5.8, to a concentration of /mL, and samples for SDS-PAGE were prepared by dividing into reduced and non-reduced conditions as shown in Table 1.
  • the sample was electrophoresed in Novex Wedge Well 8 ⁇ 16% Tris-Glycine, 10 well (Invitrogen, XP08160BOX), poured about 30 mL of Instnat Bluestain reagent, placed on a shaker and stained for 60 minutes, then the staining reagent was completely removed and purified water was added. After pouring about 30 mL, the washing process by placing it on a shaker for 30 minutes was repeated more than 5 times. When the stain was sufficiently removed and the band could be identified, the gel was analyzed using an Image Analyzer.
  • the specific titer value of the stock solution was evaluated through a potency test using animals with the botulinum toxin purified in Example 3. After intraperitoneally injecting 0.1 mL into 10 female mice weighing 18 to 22 g per group, the mortality rate (LD 50 ) over 3 days was measured. The number of deaths measured over 3 days was calculated as a specific titer value using the statistical program Combi-stats using probit analysis. The test was repeated three times, and the average specific titer value of the three repetitions was evaluated to be 4.5 x 10 7 U/mg.
  • the purity of the purified botulinum toxin was analyzed by SE-HPLC and RP-HPLC using the conditions in Tables 4 and 5.
  • the SE-HPLC results are shown in Figure 5, and it was confirmed that the purity was 99.61% at a retention time (RT) of 15.9.
  • the RP-HPLC results are as shown in Figure 7, two main peaks were confirmed and no impurity peaks were confirmed.
  • the peak with a retention time of 15.6 was confirmed to be pure botulinum toxin, and the peak with a retention time of 17.2 was confirmed to be NTNH, a complex component.
  • SE-HPLC analysis conditions Item SE-HPLC Condition Column PROTEIN LW-803 Size 8 mm ⁇ 300 mm Stationary phase silica gel for chromatography R (3 ⁇ m) Column Temperature 25 ⁇ 5°C Sampler temperature 5 ⁇ 3°C Mobile phase 100mM Citric acid-Na2PO4, pH 5.6, 0.3 M NaCl Flow rate 0.5mL/min Running time 30min Detection UV detector, 278 nm Injection volume 10 ⁇ L (10 ⁇ g)
  • bovine-derived trypsin other than bovine-derived trypsin is not effective in activating and purifying botulinum toxin. Accordingly, the present inventors compared and analyzed the cases of using porcine-derived trypsin and the case of using bovine-derived trypsin (Sigma, T1426). Specifically, the inventors used porcine-derived trypsin and bovine-derived trypsin at a temperature of 33 to 36°C for 0.5 to 2 hours and then added a trypsin inhibitor (trypsin added to botulinum toxin). (same ratio as amount) to stop the enzyme reaction, and the sample was analyzed by SDS-PAGE.
  • porcine-derived trypsin and bovine-derived trypsin at a temperature of 33 to 36°C for 0.5 to 2 hours and then added a trypsin inhibitor (trypsin added to botulinum toxin). (same ratio as amount) to stop the enzyme reaction, and the sample was analyzed by S

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Abstract

본 발명은 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin, BTX)의 정제방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 양이온 교환 크로마토그래피(Cation Exchange Chromatography; CEX), 소수성 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction Chromatography; HIC) 및 혼합 모드 크로마토그래피(Mixed Mode Chromatography: Cation Exchange(Phosphate) and Affinity(Calcium))를 이용하여 정제하는 단계의 순서로 수행하되, 보툴리눔 독소를 활성화시키기 위해 트립신(Trypsin)을 처리하는 단계를 추가로 포함하는 공정으로 순도 및 활성이 뛰어난 보툴리눔 독소를 정제할 수 있어, 보툴리눔 독소 생산에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

보툴리눔 독소의 정제방법
본 발명은 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin; BTX)의 정제방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 양이온 교환 크로마토그래피(Cation Exchange Chromatography; CEX), 소수성 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction Chromatography; HIC) 및 혼합 모드 크로마토그래피(Mixed Mode Chromatography: Cation Exchange(Phosphate) and Affinity(Calcium))를 이용하여 정제하는 단계의 순서로 수행하되, 보툴리눔 독소를 활성화시키기 위해 트립신(Trypsin)을 처리하는 단계를 추가로 포함하는 E형 보툴리눔 독소의 정제방법에 관한 것이다.
보툴리눔 독소는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum), 클로스트리디움 바라티(Clostridium baratii) 및 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)과 같은 박테리아에 의해서 생산되는 신경독소 단 백질이다. 보툴리눔 독소는 신경근육 전달을 차단하고, 인간 및 동물에게 신경마비성 질환을 일으킨다. 보툴리눔 독소는 7가지 다른 A, B, C1, D, E, F, G 및 H형의 보툴리눔 독소가 규명되었으며, 각각의 유형은 각 유형 특이적 항체에 의해 구별될 수 있으며, 이들이 유발하는 마비의 중증도 및 이들이 영향을 미치는 동물 종은 서로 상이하다.
보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은, 약 50 kDa 경쇄에 접합된 약 100 kDa의 중쇄로 구성되어, 약 150 kDa이다. 그러나, 클로스트리디움 박테리아에 의해 방출되는 보툴리눔 독소는 150 kDa 독소와 하나 또는 그 이상의 비-독소 단백질(Non-toxin protein)이 복합체를 형성하여 방출된다. 예를 들어, 보툴리눔 독소는 900 kDa, 500 kDa 및 300 kDa 복합체로 방출된다.
보툴리눔 독소는 인간에게 매우 치명적일 수 있으나, 최근에는 골격근 활동 항진을 특징으로 하는 신경근육 장애를 포함하여 다양한 증상을 치료하기 위한 목적으로 보툴리눔 독소가 개발되고 있다. 예를 들어 보톡스(BOTOX®)는 알러간사(Allergan, Inc.)로부터 상업적으로 개발한 보툴리눔 독소 A의 상표로, 이는 안검경련, 사시, 경부 근긴장이상 및 미간(안면) 주름 개선 치료에 활용되고 있고, 다른 혈청형들도 그에 적합한 용도를 개발하여 임상적으로 활용하고자 하는 연구가 계속되고 있다.
임상적 용도의 보툴리눔 독소는 일반적으로 세포 배양물에서 분리되는데, 이 때 다양한 정제 방법이 사용되고 있다.
임상적 용도의 보툴리눔 독소는 일련의 침전 및 접선 유동 여과 단계에 의해서 복합체화된 형태(Complexed form)로 정제된다[Schantz E J, et al, Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 March 56(l):80-99]. 그러나, 이러한 방법은 전형적으로는 약 10% 미만의 상대적으로 낮은 수율을 제공하였다. 그 밖의 다른 방법들은 크기 배제, 이온 교환, 및/또는 친화성 크로마토그래피를 사용하였다[Schmidt J J, et al, Anal Biochem 1986 July; 156(1):213-219; Kannan K, et al, Mov Disord 2000; 15(Suppl 2):20 (2000); Wang YC, Dermatol Las Faci Cosm Surg 2002; 58 (2002); 및 미국 특허 제2003/0008367호].
또 다른 방법은 완전하고 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소 단백질보다는 보툴리눔 독소의 중쇄 또는 경쇄 중의 하나를 재조합 수단에 의해서 개별적으로 합성하는 방법이 있다[Zhou L, et al, Biochemistry 1995; 34(46):15175-81 (1995); 및 Johnson S K, et al, Protein Expr and Purif 2003; 32: 1-9 (2003)].
보다 최근의 방법으로는, 복합체로서 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합 모드, 및/또는 이온 교환 크로마토그래피의 사용을 포함한다(미국특허 제7,452,697호 및 제7,354,740호).
그러나, 본 기술분야에서는 여전히 안정하고 생물학적으로 활성을 보이는 완전한 보툴리눔 독소를 분리하기 위한 개선된 정제방법이 요구된다.
이에, 본 발명자들은 순도가 높고, 활성이 우수한 E형 보툴리눔 독소를 수득할 수 있는 정제 공정을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피의 공정을 이용하여 순도와 활성이 매우 높은 보툴리눔 독소를 정제해 낼 수 있음을 확인하였으며, 특히, 양이온 교환수지로 SP 컬럼을 사용하고, 소수성 레진으로 Butyl 컬럼을 사용하며, 혼합 모드 레진으로 CHT 컬럼을 사용하였을 때, 99% 이상의 순도를 가지는 보툴리눔 독소를 정제할 수 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin; BTX)의 정제방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 E형 보툴리눔 독소의 정제방법을 제공한다.
(a) E형 보툴리눔 독소 생산 균주 배양액을 전처리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 전처리된 배양액을 양이온 교환 크로마토그래피(Cation Exchange Chromatography; CEX)를 이용하여 정제하는 단계;
(c) 상기 (b)단계에서 정제된 용리액을 소수성 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction Chromatography; HIC)를 이용하여 정제하는 단계;
(d) 상기 (c)단계에서 정제된 용리액을 트립신(Trypsin)과 반응시켜 상기 E형 보툴리눔 독소를 활성화시키는 단계; 및
(e) 상기 트립신 반응액을 혼합 모드 크로마토그래피(Mixed Mode Chromatography)를 이용하여 정제하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 전처리는 한외여과인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 한외여과는 10 kDa 내지 300 kDa 크기의 여과막을 이용하여 한외여과하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 여과막은 카세트형(Cassette type) 또는 중공사형(Hallow fiber) 여과막인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 카복시 메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 기능기를 포함하는 레진이 장착된 컬럼인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 설포프로필(SP) 컬럼은 SP sepharose HP 컬럼, SP sepharose FF 컬럼 및 Capto S으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 전처리된 배양액을 정제수 또는 완충액에 희석시켜 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 주입시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 완충액은 구연산 나트륨(Sodium citrate) 완충액인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 컬럼에 용출 완충액인 염화나트륨이 포함된 구연산 나트륨 완충액을 주입하여 E형 보툴리눔 독소가 포함된 분획(Fraction)을 수득하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 용출 완충액은 0.5 ~ 1.5 M 염화나트륨이 첨가된 pH 4.0 ~ 6.0인 10 ~ 50 mM 구연산 나트륨 완충액인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 소수성 크로마토그래피 컬럼은 에테르(Ether), 이소프로필(Isopropyl), 부틸(Butyl), 옥틸(Octyl) 및 페닐(Phenyl)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 기능기를 포함하는 레진이 장착된 컬럼인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Butyl 컬럼은 Butyl sepharose HP 컬럼, Capto Butyl 컬럼, Capto phenyl 컬럼 및 Phenyl HP 컬럼으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 (b)단계에서 정제된 용리액을 pH 4.0 ~ 6.0인 완충액에 희석시켜 소수성 크로마토그래피 컬럼에 주입시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 완충액은 3.5 ~ 4.5 M 염화나트륨이 첨가된 pH 4.0 ~ 6.0인 25 ~ 75 mM 인산나트륨 및/또는 구연산 나트륨 완충액인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 컬럼에 pH 4.0 ~ 6.0인 25 ~ 75 mM 인산나트륨 완충액 및/또는 구연산 나트륨 완충액을 주입하여 E형 보툴리눔 독소가 포함된 분획(Fraction)을 수득하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계 이후 (c') 상기 (c)단계에서 정제된 용리액을 전처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c') 단계에서 상기 전처리는 투석여과 및/또는 한외여과 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 투석여과 및/또는 한외여과는 10 kDa 내지 300 kDa 크기의 여과막을 이용하여 투석여과 및/또는 한외여과하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 여과막은 카세트형(Cassette type) 또는 중공사형(Hallow fiber) 여과막인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 투석여과는 pH 4.0 ~ 6.0인 25 ~ 75 mM 인산나트륨 완충액으로 투석여과한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계에서 상기 반응은 상기 용리액을 33 ~ 36°C에서 0.5 ~ 2시간 동안 트립신으로 반응시켜 상기 용리액 내 E형 보툴리눔 독소를 활성화시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계에서 혼합 모드 크로마토그래피 컬럼은 인산칼슘 합성물 Ca10(PO4)6(OH)2 기능기를 포함하는 레진이 장착된 컬럼(CHT Ceramic Hydroxyapatite)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CHT 컬럼은 CHT TypeⅠ 및/또는 CHT-XT인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계는 (d)단계의 트립신 반응액을 정제수에 희석시켜 혼합 모드 크로마토그래피 컬럼에 주입시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 컬럼에 1.5 ~ 3.0 M 염화나트륨이 첨가된 pH 4.0 ~ 6.0인 5 ~ 50 mM 인산 나트륨 완충액을 주입하여 E형 보툴리눔 독소가 포함된 분획(Fraction)을 수득하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조한 E형 보툴리눔 독소를 제공한다.
본 발명에 따르면 순도 및 활성이 뛰어난 E형 보툴리눔 독소를 정제할 수 있어 E형 보툴리눔 독소 생산에 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 상기 E형 보툴리눔 독소는 주입 당일 효과가 발현되어 최대 한 달간 효과가 지속되는 장점이 있으므로 바이오 의약품, 조직 봉합 및 안면 고정 리프팅실, 지방분해주사제 등을 제조하는 데 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 양이온 교환 크로마토그래피 후 용리액에서 보툴리눔 독소를 FPLC 및 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 소수성 크로마토그래피 후 용리액에서 보툴리눔 독소를 FPLC 및 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 트립신(Trypsin)을 이용하여 정제하는 단계를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 혼합 모드 크로마토그래피 후 용리액에서 보툴리눔 독소를 FPLC 및 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따라 정제한 보툴리눔 독소의 순도를 SE-HPLC로 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따라 보툴리눔 독소 정제단계별 시료를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따라 정제한 보툴리눔 독소의 순도를 RP-HPLC로 분석한 결과이다.
도 8은 최적화된 조건으로 정제된 보툴리눔 독소의 HPLC 순도를 확인한 결과이다.
도 9는 트립신(Trypsin) 유래 종에 따른 보툴리눔 독소 절단능에 대한 SDS-PAGE 비교 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에 있어서, 용어 "보툴리눔 독소"는 클로스트리디움 보툴리눔에 의해서 생성된 신경독뿐아니라, 비-클로스트리디움계 종에 의해서 재조합적으로 제조된 보툴리눔 독소(또는 이의 경쇄 또는 중쇄)를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, 보툴리눔 독소는 또한 보툴리눔 독소 복합체(예컨대, 300, 600 및 900 kDa 복합체)뿐 아니라 순수한 보툴리눔 독소(예컨대, 약 150 kDa)를 모두 포함한다. 상기 "순수한 보툴리눔 독소"는 보툴리눔 독소 복합체를 형성하는 단백질들을 포함하는, 다른 단백질들로부터 분리된, 또는 실질적으로 분리된 보툴리눔 독소로서 정의된다. 순수한 보툴리눔 독소는 순도가 95% 이상일 수 있으며, 바람직하게는 99% 이상이다.
본 발명에서 있어서, 보툴리눔 독소 생산 균주는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 또는 이의 변이체이고 가장 바람직하게는 클로스트리디움 보툴리눔 E형 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 보툴리눔 독소 생산이 가능한 어떠한 균주라도 사용가능함은 통상의 기술자에게는 자명할 것이다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 본 발명은 다음 단계를 포함하는 E형 보툴리눔 독소의 정제방법에 관한 것이다.
(a) E형 보툴리눔 독소 생산 균주 배양액을 전처리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 전처리된 배양액을 양이온 교환 크로마토그래피(Cation Exchange Chromatography; CEX)를 이용하여 정제하는 단계;
(c) 상기 (b)단계에서 정제된 용리액을 소수성 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction Chromatography; HIC)를 이용하여 정제하는 단계;
(d) 상기 (c)단계에서 정제된 용리액을 트립신(Trypsin)과 반응시켜 상기 E형 보툴리눔 독소를 활성화시키는 단계; 및
(e) 상기 트립신 반응액을 혼합 모드 크로마토그래피(Mixed Mode Chromatography)를 이용하여 정제하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 전처리는 한외여과인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 한외여과는 10 kDa 내지 300 kDa, 바람직하게는 50 kDa 내지 100 kDa 크기의 여과막을 이용하여 한외여과하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 여과막은 카세트형(Cassette type) 또는 중공사형(Hallow fiber) 여과막인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 카복시 메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 기능기를 포함하는 레진이 장착된 컬럼인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
특히, 설포프로필(SP) 컬럼은 상기 양이온 교환 크로마토그래피에서 효과적으로 불순물을 제거하고 보툴리눔 독소의 높은 활성을 유지할 수 있다. 상기 설포프로필(SP) 컬럼으로는 SP sepharose HP 컬럼, SP sepharose FF 컬럼, Capto S 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 SP sepharose HP 컬럼을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 SP sepharose HP 컬럼은 설포프로필 기능기를 포함하고, 6% spherical, cross-linked agarose matrix 형태이며, DBC는 Ribonuclease A 기준으로 55 mg/mL, Particle size는 34 μm인 레진이 장착된 컬럼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 양이온 교환 크로마토그래피 외 다른 종류의 크로마토그래피(예컨대, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 또는 혼합 모드 크로마토그래피) 및 이의 컬럼을 이용하여 정제하는 경우 본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피 및 이의 컬럼(예컨대, 설포프로필(SP) 컬럼)을 이용하여 정제하는 경우에 비해 보툴리눔 독소 E형의 정제 수율 및 순도가 낮아질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 전처리된 배양액을 정제수 또는 완충액에 희석시켜 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 주입시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 완충액의 농도 및 pH는 E형 보툴리눔 독소를 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 결합시키기 위해 적정한 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 완충액은 구연산 나트륨(Sodium citrate) 완충액인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 컬럼에 용출 완충액인 염화나트륨이 포함된 구연산 나트륨 완충액을 주입하여 E형 보툴리눔 독소가 포함된 분획(Fraction)을 수득하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 용출 완충액은 0.5 ~ 1.5 M 염화나트륨이 첨가된 pH 4.0 ~ 6.0인 10 ~ 50 mM 구연산 나트륨 완충액인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 (b) 단계에서 불순물이 제거되고, 복합체 형태의 E형 보툴리눔 독소를 포획(Capture)할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 소수성 크로마토그래피 컬럼은 에테르(Ether), 이소프로필(Isopropyl), 부틸(Butyl), 옥틸(Octyl) 및 페닐(Phenyl)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 기능기를 포함하는 레진이 장착된 컬럼인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
특히, Butyl 컬럼은 비-복합체 형태(Non-complexed form)의 단백질을 효과적으로 분리할 수 있다. 상기 Butly 컬럼으로는 Butyl sepharose HP 컬럼, Capto Butyl 컬럼, Capto phenyl 컬럼, Phenyl HP 컬럼 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 Butyl sepharose HP 컬럼을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 Butyl sepharose HP 컬럼은 Highly cross-linked agarose 6% matrix를 갖고, 50 μmol Butyl groups/mL의 치환도(Degree of substitution)를 나타내며, 34 μm의 bead size를 갖는 레진이 장착된 컬럼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 소수성 크로마토그래피 외 다른 종류의 크로마토그래피(예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 혼합 모드 크로마토그래피) 및 이의 컬럼을 이용하여 정제하는 경우 본 발명의 소수성 크로마토그래피 및 이의 컬럼(예컨대, Butyl 컬럼)을 이용하여 정제하는 경우에 비해 보툴리눔 독소 E형의 정제 수율 및 순도가 낮아질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 (b)단계에서 정제된 용리액을 pH 4.0 ~ 6.0인 완충액에 희석시켜 소수성 크로마토그래피 컬럼에 주입시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 완충액은 3.5 ~ 4.5 M 염화나트륨이 첨가된 pH 4.0 ~ 6.0인 25 ~ 75 mM 인산나트륨 및/또는 구연산 나트륨 완충액인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 완충액의 농도 및 pH는 E형 보툴리눔 독소를 소수성 크로마토그래피 컬럼에 결합시키기 위해 적정한 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 컬럼에 pH 4.0 ~ 6.0인 25 ~ 75 mM 인산나트륨 및/또는 구연산 나트륨 완충액을 주입하여 E형 보툴리눔 독소가 포함된 분획(Fraction)을 수득하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 (c) 단계에서 불순물(75 kDa)이 추가로 제거될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계 이후 (c') 상기 (c)단계에서 정제된 용리액을 전처리하는 단계;를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (c') 단계에서 상기 전처리는 투석여과 및/또는 한외여과 하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 여과막은 카세트형(Cassette type) 또는 중공사형(Hallow fiber) 여과막인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 투석여과 및/또는 한외여과는 10 kDa 내지 300 kDa, 바람직하게는 30 kDa 내지 50 kDa 크기의 여과막을 이용하여 투석여과 및/또는 한외여과하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 투석여과는 pH 4.0 ~ 6.0인 25 ~ 75 mM 인산나트륨 완충액으로 투석여과 하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 (d) 단계에서 트립신(Trypsin)을 33 ~ 36°C, 0.5 ~ 2시간 처리하면 150 kDa의 E형 보툴리눔 독소 단백질의 HC(Heavy chain, 100kDa)과 LC(Light chain, 50kDa) 사이의 펩타이드 결합(공유결합)이 절단되어 보툴리눔 독소가 활성화될 수 있다.
즉, 본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계에서 상기 반응은 상기 용리액을 33 ~ 36°C에서 0.5 ~ 2시간 동안 트립신으로 반응시켜 상기 용리액 내 E형 보툴리눔 독소를 활성화시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 트립신은 돼지 유래 트립신인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계에서 혼합 모드 크로마토그래피 컬럼은 인산칼슘 합성물 Ca10(PO4)6(OH)2 기능기를 포함하는 레진이 장착된 컬럼(CHT Ceramic Hydroxyapatite)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CHT 컬럼은 기타 불순물을 효과적으로 제거하고, ~ 300 kDa의 보툴리눔 독소의 순도를 증가시킬 수 있다. 상기 CHT 컬럼은 CHT TypeⅠ, CHT-XT 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 CHT-XT 컬럼을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계에서 혼합 모드 크로마토그래피 외 다른 종류의 크로마토그래피(예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 크로마토그래피) 및 이의 컬럼을 이용하여 정제하는 경우 본 발명의 혼합 모드 크로마토그래피 및 이의 컬럼(예컨대, CHT 컬럼)을 이용하여 정제하는 경우에 비해 보툴리눔 독소 E형의 정제 수율 및 순도가 낮아질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계는 (d)단계의 트립신 반응액을 정제수에 희석시켜 혼합 모드 크로마토그래피 컬럼에 주입시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 정제수의 의한 희석은 트립신 반응액의 완충액 농도를 낮추어 E형 보툴리눔 독소를 혼합 모드 크로마토그래피 컬럼에 결합시키기 위해 희석한 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 컬럼에 1.5 ~ 3 M 염화나트륨이 첨가된 pH 4.0 ~ 6.0인 5 ~ 50 mM 인산 나트륨 완충액을 주입하여 E형 보툴리눔 독소가 포함된 분획(Fraction)을 수득하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다
본 발명의 (e) 단계에서 불순물(75 kDa)이 추가로 제거되고, 보툴리눔 독소 복합체의 순도를 증가시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 혼합 모드 크로마토그래피 단계는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 혼합 모드 크로마토그래피 공정을 사용할 수 있다. 혼합 모드 크로마토그래피는 단백질 또는 기타 용질을 흡착하기 위해 복수개의 화학적 메커니즘을 사용하는 수지, 모노리스 또는 멤브레인 형태의 고체상 크로마토그래피 지지체 들의 사용을 포함한다. 본 발명에 유용한 예에는, 하기 메커니즘들 중 둘 이상의 조합을 사용하는 크로마토그래피 지지체들이 비-제한적으로 포함된다: 음이온 교환, 양이온 교환, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 친황성(Thiophilic) 상호작용, 수소 결합, 파이-파이 결합, 및 금속 친화성. 특정 양태에서, 혼합 모드 크로마토그래피 공정은 (1) 음이온 교환 및 소수성 상호작용 기법; (2) 양이온 교환 및 소수성 상호작용 기법; 및/또는 (3) 정전기 및 소수성 상호작용 기법을 조합한다. 하나의 양태에서, 혼합 모드 크로마토그래피 단계는 GE 헬스케어 라이프 사이언시스로부터 입수가능한 Capto® adhere 컬럼 및 수지와 같은 컬럼 및 수지를 사용함으로써 달성될 수 있다. 상기 Capto® adhere 컬럼은 포획 후의 단일클론 항체의 중간 정제 및 폴리싱을 위한 다중모드 매질이다. 특정 양태에서, 혼합 모드 크로마토그래피 단계는 유동-통과 모드(Flow-through mode)로 수행될 수 있다. 다른 양태에서, 혼합 모드 크로마토그래피 단계는 결합-용출 모드(Bind-elute mode)로 수행될 수 있다. 다른 양태에서, 혼합 모드 크로마토그래피 단계는 하기 시스템들 중의 하나 이상을 사용함으로써 달성될 수 있다: Capto® MMC(Cytiva), HEA HyperCel™(Pall Corporation), PPA HyperCel™(Pall Corporation), MBI HyperCel™(Pall Corporation), MEP HyperCel™(Pall Corporation), Blue Trisacryl M(Pall Corporation), CFT™ Ceramic Fluoroapatite(Bio-Rad Laboratories, Inc.), CHT™ Ceramic Hydroxyapatite(Bio-Rad Laboratories, Inc.) 및/또는 ABx™(J.T. Baker). 상기 혼합 모드 크로마토그래피 단계에 사용되는 특정 방법들은 사용되는 특정 컬럼 및 수지에 좌우될 수 있고, 통상적으로 제조업자에 의해 공급되거나 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 설포프로필(SP) 컬럼이고, 상기 (c) 단계에서 소수성 크로마토그래피 컬럼은 Butyl 컬럼이고, 상기 (e) 단계에서 혼합 모드 크로마토그래피 컬럼은 CHT-XT 컬럼일 수 있고, 이에 제한되지 않으나, 상기와 다른 종류의 컬럼을 이용하는 경우 보툴리눔 독소 E형의 정제 수율 및 순도가 낮아질 수 있다.
상기 방법으로 정제된 보툴리눔 독소는 순도 99% 이상의 보툴리눔 독소 E형인 것을 특징으로 할 수 있으며, 이와 같이 정제된 보툴리눔 독소는 기존 방법으로 정제된 보툴리눔 독소에 비해 높은 순도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서 상기 방법으로 제조한 E형 보툴리눔 독소에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "분획(Fraction)"은 하나 이상의 불순물과 함께 생물약학적 제제에 함유된 적어도 하나의 표적 분자(예컨대 보툴리눔 독소)가 하나 이상의 불순물과 결합하는 물질을 통하여 통과하며, 상기 표적 분자는 보통 결합하지 않는(즉, Flow-through) 또는 결합 후 용리되는 분리 방법에서, 표적 분자를 포함하여 통과된 물질이 각각 분리되어 수집되어 있는 그룹을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "정제"는 어떤 물질로부터 혼재해 있는 불순물을 제거하여 순도를 높이는 조작을 의미하며, 본 명세서에 있어서 정제는 보툴리눔균의 배양액으로부터 보툴리눔균이 과성장한 후 사멸되면서 생산한 보툴리눔 독소를 분리해내는 것이며, 보툴리눔 독소 생산 과정 중의 순도를 향상시키기 위한 방법으로 사용되는 공정을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않은 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
[실시예]
[실시예 1]
E형 보툴리눔 독소 생산 균주 배양액의 전처리 공정 한외여과(Ultra-Filtration, UF)
TFF System에 Pellicon®2 Mini Cassette(50 kDa, 0.1 m2)를 장착하였다. 배양회수액 volume과 pH와 conductivity를 측정한다. 배양회수액을 한외여과를 통해 1차 농축한다. 상기 1차 농축 공정액에 정제수를 첨가하고, 2차 농축하여 2차 농축 공정액을 회수한다. TFF system에 정제수를 첨가하고, 회수되고 남은 잔여 공정액을 회수하여 이미 회수된 2차 농축 공정액과 합친다. 상기 합쳐진 최종 공정액량과 pH, conductivity를 확인한다.
[실시예 2]
E형 보툴리눔 독소의 정제 공정
(실시예 2-1) 양이온 교환 크로마토그래피
SP-HP 수지(Resin)가 충진(Packing)된 컬럼을 FPLC (고속 단백질 액체 크로마토그래피, Fast Protein Liquid Chromatography)에 장착하였다. 실시예 1에서 준비한 최종 공정액을 1 N 염화수소 (HCl)를 이용하여 pH 5.0로 맞추어 주고, 상기 공정액을 컬럼에 주입하였다. 주입이 끝나면 평형/세척 완충액(20 mM Sodium citrate, pH 5.0)을 흘려 컬럼을 세척하였다. 세척 후 평형/용출 완충액(20 mM Sodium citrate, 1 M Sodium chloride, pH 5.0)을 주입하고, 0 ~ 0.5 M의 염화나트륨 구간의 분획 (Fraction)을 순차적으로 수득하였다. 분획은 각각 SDS-PAGE로 확인하였으며, SDS-PAGE 분석을 위한 시료는 표 1과 같은 조건으로 제조하였다.
상기 분획을 각각 SDS-PAGE로 확인한 결과, ~300 kDa 복합체 형태의 보툴리눔 독소가 해당 분획에서 정제되었음을 확인할 수 있었다(도 1).
SDS-PAGE 분석을 위한 시료 제조 조건
Components Reduced condition Non-reduced condition
Botulinum toxin(1 mg/mL) 3 uL 3 uL
LDS Sample buffer(4x) 5 uL 5 uL
Sample reducing agent(10x) 2 uL 0 uL
Purified water 10 uL 12 uL
Total volume 20 uL
(실시예 2-2) 소수성 크로마토그래피
Butyl-HP 수지(Resin)가 충진(Packing)된 컬럼을 FPLC (고속 단백질 액체 크로마토그래피, Fast Protein Liquid Chromatography)에 장착 하였다. 실시예 2-1의 SP-HP 컬럼에서 용출된 분획을 1 N 수산화나트륨(Sodium hydroxide)으로 pH 5.0에 적정하였다. SP-HP 공정 용리액에 50 mM Sodium citrate, 4 M Sodium chloride, pH 5.0 완충액을 첨가하여 conductivity가 170 ~ 180 mS/cm가 되도록 한다. 상기 완충액이 첨가된 용리액을 컬럼에 주입하였다. 주입이 끝나면 평형/세척 완충액(50 mM Sodium citrate, 2.5 M Sodium chloride, pH 5.0)을 흘려 컬럼을 세척하였다. 세척 후 평형/용출 완충액(50 mM Sodium citrate, pH 5.0)을 주입하고, 0 ~ 2.5 M 염화나트륨 구간의 분획(Fraction)을 순차적으로 수득하였다(도 2).
상기 분획을 각각 SDS-PAGE로 확인한 결과, 불순물(75kDa)이 많이 제거되고, ~300 kDa 복합체 형태의 보툴리눔 독소가 해당 분획에서 정제되었음을 확인할 수 있었다(도 2).
(실시예 2-3) 한외여과 및 투석여과(Ultra-Filtration/Dia-Filtration, UF/DF)
TFF System에 Sartocon Slice 200(30 kDa, 0.02 m2)을 장착하였다. Butyl-HP 컬럼에서 용출된 용리액량을 확인하고 pH와 conductivity를 측정한다. 2차 소수성 크로마토그래피에서 획득된 용리액을 50 mM Sodium phosphate, pH 5.8 (이하 DF 완충액)로 1,000배 이상 투석 여과(Diafiltration, DF)한다. 상기 최종 공정액의 UV흡광도 및 pH, conductivity를 측정한다. 상기 최종 공정액을 0.2 μm filter로 여과하여 4°C에 보관한다.
(실시예 2-4) 트립신(Trypsin) 처리
실시예 2-3의 최종 공정액을 Trypsin(Roche, 06369880)과 35°C, 1h 조건에서 반응시킨 후 Trypsin 반응액을 회수한다. 트립신 반응액을 냉각된 정제수를 이용하여 1:4 비율로 희석한다. 상기 희석된 반응액량 및 pH, conductivity를 확인한다. pH 확인 후 1 N 수산화나트륨을 이용하여 pH 5.8로 적정 후 각각 SDS-PAGE로 확인하였다(도 3).
그 결과, 150 kDa 신경독소 단백질(Neurotoxin)의 밀도(Density)가 5% 이하로, HC(Heavy chain, 100 kDa)과 LC(Light chain, 50 kDa)으로 나뉘는 것을 확인하였다 (도 3).
(실시예 2-5) 혼합 모드 크로마토그래피
CHT-XT(Resin)가 충진(Packing)된 컬럼을 FPLC (고속 단백질 액체 크로마토그래피, Fast Protein Liquid Chromatography)에 장착하였다. 실시예 2-5의 트립신 반응액을 컬럼에 주입하였다. 주입이 끝나면 평형/세척 완충액(10 mM Sodium phosphate, pH 5.8)으로 컬럼을 세척하였다. 세척 후 평형/용출 완충액(10 mM Sodium phosphate, 2 M Sodium chloride, pH 5.8)을 주입하고, 0 ~ 2.0 M 염화나트륨 구간의 분획(Fraction)을 순차적으로 수득하였다.
상기 분획을 각각 SDS-PAGE로 확인한 결과, 불순물(75kDa)이 많이 제거되고, ~300 kDa 복합체 형태의 보툴리눔 독소가 해당 분획에서 정제되었음을 확인할 수 있었다(도 4).
[실시예 3]
정제 단계별 E형 보툴리눔 독소 SDS-PAGE 비교
실시예 2에서 정제된 보툴리눔 독소를 포함하는 분획을 취합하고 상업적으로 구입 가능한 보툴리눔 독소인 research reference standard로 자사에서는 Clostridium botulinum type E complex toxin (Metabiologics, Inc. Lot: E010821-01) 제품을 각각 1 mg/mL의 농도가 되도록 10 mM Sodium phosphate, pH 5.8인 완충액으로 희석하고, 표 1과 같은 환원조건(Reduced)과 비-환원조건(Non-reduced)으로 구분하여 SDS-PAGE용 시료를 만들었다. 시료를 Novex Wedge Well 8 ~ 16% Tris-Glycine, 10 well (Invitrogen, XP08160BOX)에 전기영동하고, Instnat Bluestain reagent를 약 30 mL 붓고 shaker에 올려 60분간 염색한 후, 염색 시약을 완전히 제거하고 정제수를 약 30 mL 부은 후 shaker에 30분 동안 올려 세척하는 과정을 5회 이상 반복하였다. 염색이 충분히 제거되고 밴드 확인이 가능할 때, Image Analyzer를 이용하여 gel을 분석하였다.
그 결과, 단계별로 신경독소 단백질이 정제되는 과정을 SDS-PAGE로부터 확인하였고(도 6), 각 단계별 생산량(Yield)을 확인하였다(표 2). 본 발명의 정제방법이 정확한 신경독소 단백질만 정제할 수 있음을 알 수 있었다.
독소 단백질의 정제 단계별 수율
Sample Name Amount(mg) Yield(%)
Culture medium 105.20 100.00
SP-HP 84.90 80.70
Butyl-HP 52.80 50.19
CHT-XT 35.90 34.13
[실시예 4]
본 발명의 보툴리눔 독소 정제산물의 활성
실시예 3에 의해 정제된 보툴리눔 독소로 동물을 이용한 역가시험을 통한 원액의 특이역가 값을 평가하였다. 군당 18 ~ 22 g의 마우스 암컷 10마리에 0.1 mL씩 복강 내에 주사한 후 3일 동안의 치사율(LD50)을 측정하였다. 3일간 측정된 사망 수를 통계 프로그램인 Combi-stats을 사용하여 프로빗 분석법으로 특이역가 값을 산출하였다. 시험은 3회 반복하였으며, 3회 반복 평균 특이역가 값은 4.5 x 107 U/mg으로 평가되었다.
그 결과는 표 3과 같으며, 본 발명에 따른 정제방법이 보툴리눔 독소의 활성의 약화 없이 정제 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
보툴리눔 독소 정제산물의 활성
Test Potency(U/mg)
Test 1 4.5 X 107
Test 2 4.4 X 107
Test 3 4.6 X 107
Average 4.5 X 107
[실시예 5]
정제 공정 순도 확인
정제된 보툴리눔 독소의 순도 분석은 표 4과 표 5의 조건을 이용하여 SE-HPLC, RP-HPLC로 분석하였다. SE-HPLC 결과는 도 5와 같으며, Retention time (RT) 15.9에서 순도가 99.61%로 나온 것을 확인하였다. 또한, RP-HPLC 결과는 도 7과 같고, 2개의 main peak가 확인되었으며 불순물 peak는 확인되지 않았다. Retention time이 15.6인 peak는 순수한 보툴리눔 독소, 17.2인 peak는 복합체 성분의 NTNH로 확인하였다.
SE-HPLC 분석 조건
Item SE-HPLC Condition
Column PROTEIN LW-803
Size 8 mm Х 300 mm
Stationary phase silica gel for chromatography R (3 μm)
Column Temperature 25 ± 5°C
Sampler temperature 5 ± 3°C
Mobile phase 100mM Citric acid-Na2PO4, pH 5.6, 0.3 M NaCl
Flow rate 0.5 mL/min
Running time 30 min
Detection UV detector, 278 nm
Injection volume 10 μL (10 μg)
Figure PCTKR2023013358-appb-img-000001
[실시예 6]
정제된 보툴리눔 독소의 IPC(In Process Control) 분석 결과
실시예 2 결과에 따라 1차 SP-HP, 2차 Butyl-HP, 3차 CHT-XT 컬럼으로 정제된 산물에 대한 순도를 측정하기 위해 HPLC를 통해 분석하였다(표 4). 그 결과, 보툴리눔 독소의 순도는 99.61%임을 확인하였다(도 5 및 도 8)
[실시예 7]
트립신(Trypsin) 유래종에 따른 보툴리눔 독소 절단능 비교
소 유래 트립신 외 다른 동물 유래 트립신을 이용하는 경우 보툴리눔 독소 활성화 및 정제에 효과적이지 않다고 알려진 바 있다. 이에, 본 발명자들은 돼지(Porcine) 유래 트립신을 이용하는 경우와 소(Bovine) 유래 트립신(Sigma, T1426)을 이용하는 경우를 비교 분석하였다. 구체적으로 발명자들은 돼지(Porcine) 유래 트립신을 이용하는 경우와 소(Bovine) 유래 트립신을 33 ~ 36℃의 온도에서 0.5 ~ 2시간 반응시킨 후 트립신 저해제 (Trypsin inhibitor)를 첨가 (보툴리눔 독소에 첨가된 트립신량과 동일한 비율)하여 효소 반응을 중단시키고, 해당 시료를 SDS-PAGE로 분석하였다.
그 결과, 돼지(Porcine) 유래 트립신을 이용하는 경우와 소(Bovine) 유래 트립신을 이용하는 경우는 상기 조건에서 보툴리눔 독소의 절단능 비교에 유의한 차이가 없음을 확인하였다(도 9).

Claims (26)

  1. 다음 단계를 포함하는 E형 보툴리눔 독소의 정제방법:
    (a) E형 보툴리눔 독소 생산 균주 배양액을 전처리하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 전처리된 배양액을 양이온 교환 크로마토그래피(Cation Exchange Chromatography; CEX)를 이용하여 정제하는 단계;
    (c) 상기 (b)단계에서 정제된 용리액을 소수성 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction Chromatography; HIC)를 이용하여 정제하는 단계;
    (d) 상기 (c)단계에서 정제된 용리액을 트립신(Trypsin)과 반응시켜 상기 E형 보툴리눔 독소를 활성화시키는 단계; 및
    (e) 상기 트립신 반응액을 혼합 모드 크로마토그래피(Mixed Mode Chromatography)를 이용하여 정제하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 상기 전처리는 한외여과인 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 한외여과는 10 kDa 내지 300 kDa 크기의 여과막을 이용하여 한외여과하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 여과막은 카세트형(Cassette type) 또는 중공사형(Hallow fiber) 여과막인 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 카복시 메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 기능기를 포함하는 레진이 장착된 컬럼인 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 설포프로필(SP) 컬럼은 SP sepharose HP 컬럼, SP sepharose FF 컬럼 및 Capto S으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 전처리된 배양액을 정제수 또는 완충액으로 희석시켜 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 주입시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 완충액은 구연산 나트륨(Sodium citrate) 완충액인 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 컬럼에 용출 완충액인 염화나트륨이 포함된 구연산 나트륨 완충액을 주입하여 E형 보툴리눔 독소가 포함된 분획(Fraction)을 수득하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 용출 완충액은 0.5 ~ 1.5 M 염화나트륨이 첨가된 pH 4.0 ~ 6.0인 10 ~ 50 mM 구연산 나트륨 완충액인 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 소수성 크로마토그래피 컬럼은 에테르(Ether), 이소프로필(Isopropyl), 부틸(Butyl), 옥틸(Octyl) 및 페닐(Phenyl)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 기능기를 포함하는 레진이 장착된 컬럼인 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 Butyl 컬럼은 Butyl sepharose HP 컬럼, Capto Butyl 컬럼, Capto phenyl 컬럼 및 Phenyl HP 컬럼으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 (b)단계에서 정제된 용리액을 pH 4.0 ~ 6.0인 완충액에 희석시켜 소수성 크로마토그래피 컬럼에 주입시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 완충액은 3.5 ~ 4.5 M 염화나트륨이 첨가된 pH 4.0 ~ 6.0인 25 ~ 75 mM 인산 나트륨 및/또는 구연산 나트륨 완충액인 것을 특징으로 하는, 방법.
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 컬럼에 pH 4.0 ~ 6.0인 25 ~ 75 mM 인산나트륨 완충액 및/또는 구연산 나트륨 완충액을 주입하여 E형 보툴리눔 독소가 포함된 분획(Fraction)을 수득하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  16. 제 1항에 있어서,
    상기 (c) 단계 이후 (c') 상기 (c)단계에서 정제된 용리액을 전처리하는 단계;를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 (c') 단계에서 상기 전처리는 투석여과 및/또는 한외여과 하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 투석여과 및/또는 한외여과는 10 kDa 내지 300 kDa 크기의 여과막을 이용하여 투석여과 및/또는 한외여과 하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 여과막은 카세트형(Cassette type) 또는 중공사형(Hallow fiber) 여과막인 것을 특징으로 하는, 방법.
  20. 제 17항에 있어서,
    상기 투석여과는 pH 4.0 ~ 6.0인 5 ~ 50 mM 인산 나트륨 완충액으로 투석여과한 것을 특징으로 하는, 방법.
  21. 제 1항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서 상기 반응은 상기 용리액을 33 ~ 36°C에서 0.5 ~ 2시간 동안 트립신으로 반응시켜 상기 용리액 내 E형 보툴리눔 독소를 활성화시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
  22. 제 1항에 있어서,
    상기 (e) 단계에서 혼합 모드 크로마토그래피 컬럼은 인산칼슘 합성물 Ca10(PO4)6(OH)2 기능기를 포함하는 레진이 장착된 컬럼(CHT Ceramic Hydroxyapatite)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 CHT 컬럼은 CHT TypeⅠ 및/또는 CHT-XT인 것을 특징으로 하는, 방법.
  24. 제 1항에 있어서,
    상기 (e) 단계는 (d)단계의 트립신 반응액을 정제수에 희석시켜 혼합 모드 크로마토그래피 컬럼에 주입시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 컬럼에 1.5 ~ 3.0 M 염화나트륨이 포함된 pH 4.0 ~ 6.0인 5 ~ 50 mM 인산 나트륨 완충액을 주입하여 E형 보툴리눔 독소가 포함된 분획(Fraction)을 수득하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항의 방법으로 제조한, E형 보툴리눔 독소.
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