TWI841075B - 肉毒桿菌毒素的純化方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種肉毒桿菌毒素（Botulinum Toxin，BTX）的純化方法，更詳細地，上述方法為如下的工藝：以利用陽離子交換色譜（Cation Exchange Chromatography；CEX）、疏水性色譜（Hydrophobic Interaction Chromatography；HIC）及混合模式色譜（Mixed Mode Chromatography: Cation Exchange(Phosphate) and Affinity(Calcium)）來純化的步驟的循序執行，還包括進行胰蛋白酶（Trypsin）處理來使肉毒桿菌毒素活化的步驟，可純化具有優秀的純度及活性的肉毒桿菌毒素，因此，可有用地用於肉毒桿菌毒素的產生。

Description

肉毒桿菌毒素的純化方法
本發明涉及一種肉毒桿菌毒素（Botulinum Toxin；BTX）的純化方法及肉毒桿菌毒素，更詳細地，涉及一種E型肉毒桿菌毒素的純化方法，其以利用陽離子交換色譜（Cation Exchange Chromatography；CEX）、疏水性色譜（Hydrophobic Interaction Chromatography；HIC）及混合模式色譜（Mixed Mode Chromatography：Cation Exchange(Phosphate) and Affinity(Calcium)）純化的步驟的循序執行，還包括進行胰蛋白酶（Trypsin）處理來使肉毒桿菌毒素活化的步驟。
肉毒桿菌毒素是由如丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、巴氏梭菌（Clostridium baraffi）和肉毒桿菌（Clostridium botulinum）的細菌產生的一種神經毒蛋白。肉毒桿菌毒素阻斷神經肌肉的傳導，並且造成人類和動物的神經麻痹疾病。肉毒桿菌毒素已經鑒定出A型、B型、C1型、D型、E型、F型、G型和H型等不同的7種肉毒桿菌毒素，每種類型的肉毒桿菌毒素都可以通過相應的類型特異性抗體來區分，不同種類的肉毒桿菌毒素所造成的麻痹的嚴重程度和受其影響的動物種類不同。
肉毒桿菌毒素的蛋白分子的分子量約為150kDa，包括一條約為50kDa的輕鏈和一條與該輕鏈綴合的約100kDa的重鏈。然而，從肉毒桿菌釋放的肉毒桿菌毒素是以150kDa的毒素蛋白與至少一種非毒素蛋白的複合物的形式釋放的。例如，肉毒桿菌毒素以900kDa、500kDa和300kDa的複合物形式釋放。
肉毒桿菌毒素對於人類而言可能是非常致命的，但最近開發出的肉毒桿菌毒素用於治療多種症狀，包括以骨骼肌過度活動（skeletal muscle hyperactivity）為特徵的神經肌肉障礙。例如，BOTOX®是Allergan公司商業化開發的肉毒桿菌毒素A的商標，其用於緩解或治療眼瞼痙攣、斜視、頸部肌張力障礙和眉間（面部）皺紋，並且目前正在研究開發適用於其他血清型的應用以及在臨床上利用這些血清型。
供臨床使用的肉毒桿菌毒素一般是從細胞培養物中分離出來的。在這種情況下，使用多種純化方法。
通過一系列的沉澱和切向流過濾步驟以複合形式純化供臨床使用的肉毒桿菌毒素[Schantz E J, et al, Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 March 56(l):80-99]。然而，此方法通常提供低於約10％的相對低的產率。其他使用的方法包括尺寸排阻、離子交換和/或親和色譜[Schmidt J J, et al, Anal Biochem 1986 July; 156(1):213-219; Kannan K, et al, Mov Disord 2000; 15(Suppl 2):20 (2000); Wang YC, Dermatol Las Faci Cosm Surg 2002; 58 (2002); 及美國專利第2003/0008367號]。
另一種方法是通過重組方式獨立合成肉毒桿菌毒素的重鏈或輕鏈之一，而不是合成完整且具有生物活性的肉毒桿菌毒素蛋白[Zhou L, et al, Biochemistry 1995; 34(46):15175-81 (1995); 及Johnson S K, et al, Protein Expr and Purif 2003; 32: 1-9 (2003)]。
最近的方法涉及使用疏水相互作用色譜、混合模式和/或離子交換色譜來純化作為複合物的肉毒桿菌毒素（美國專利第7452697號及第7354740號）。
然而，在技術領域中仍然需要一種用於分離穩定且具有生物活性的完整肉毒桿菌毒素的改善的純化方法。
因此，經由廣泛努力開發一種能夠獲得純度高、活性優秀的E型肉毒桿菌毒素的純化工藝，本發明人發現，可以利用陽離子交換色譜、疏水性色譜及混合模式色譜的工藝來純化純度及活性非常高的肉毒桿菌毒素，尤其，當使用SP柱作為陽離子交換樹脂，使用丁基柱作為疏水性樹脂、使用CHT柱作為混合模式樹脂時，可純化為具有99%以上的純度的肉毒桿菌毒素，從而完成了本發明。
發明所欲解決之問題
本發明的目的在於，提供肉毒桿菌毒素的純化方法。
解決問題之技術手段
為了實現上述目的，本發明提供一種E型肉毒桿菌毒素的純化方法。上述E型肉毒桿菌毒素的純化方法包括：步驟（a），預處理產生E型肉毒桿菌毒素的菌株培養液；步驟（b），利用陽離子交換色譜來純化在上述步驟（a）中預處理的培養液；步驟（c），利用疏水性色譜來純化在上述步驟（b）中純化的洗脫液；步驟（d），將在上述步驟（c）中純化的洗脫液與胰蛋白酶反應來使上述E型肉毒桿菌毒素活化；以及步驟（e），利用混合模式色譜純化上述胰蛋白酶反應液。
本發明的特徵在於，在上述步驟（a）中，上述預處理可以為超濾。
本發明的特徵在於，上述超濾可利用大小為10kDa至300kDa的濾膜來進行超濾。
本發明的特徵在於，上述濾膜可以為盒型（Cassette type）或中空纖維型（Hallow fiber）濾膜。
本發明的特徵在於，在上述步驟（b）中，陽離子交換色譜柱可以為填充樹脂的柱，該柱包含選自由羧甲基（CM）、磺乙基（SE）、磺丙基（SP）、磷酸（P）及磺酸鹽（S）組成的組中的一種以上的官能基團。
本發明的特徵在於，上述磺丙基柱可以為選自由SP瓊脂糖HP（SP sepharose HP）柱、SP瓊脂糖FF（SP sepharose FF）柱及卡普托S（Capto S）組成的組中的一種以上。
本發明的特徵在於，在上述步驟（b）中，利用純水或緩衝液稀釋在步驟（a）中預處理的培養液並注入至陽離子交換色譜柱。
本發明的特徵在於，上述緩衝液可以為的檸檬酸鈉（Sodium citrate）緩衝液。
本發明的特徵在於，可通過向上述柱注入作為洗脫緩衝液的包含氯化鈉的檸檬酸鈉緩衝液來獲得包含E型肉毒桿菌毒素的級分（Fraction）。
本發明的特徵在於，上述洗脫緩衝液可以為添加有0.5～1.5M氯化鈉的pH值為4.0～6.0的10～50mM檸檬酸鈉緩衝液。
本發明的特徵在於，在上述步驟（c）中，疏水性色譜柱為填充樹脂的柱，該樹脂包含選自由醚（Ether）、異丙基（Isopropyl）、丁基（Butyl）、辛基（Octyl）及苯基（Phenyl）組成的組中的一種以上的官能基團。
本發明的特徵在於，上述丁基柱可以為選自由丁基瓊脂糖HP（Butyl sepharose HP）柱、卡普托丁基（Capto Butyl）柱、卡普托苯基（Capto phenyl）柱及苯基HP（Phenyl HP）柱組成的組中的一種以上。
本發明的特徵在於，在上述步驟（c）中，將在步驟（b）中純化的洗脫液稀釋在pH值為4.0～6.0的緩衝液並注入至疏水性色譜柱。
本發明的特徵在於，上述緩衝液可以為添加有3.5～4.5M氯化鈉的pH值為4.0～6.0的25～75mM磷酸鈉和/或檸檬酸鈉緩衝液。
本發明的特徵在於，可通過向上述柱注入pH值為4.0～6.0的25～75mM磷酸鈉緩衝液和/或檸檬酸鈉緩衝液來獲得包含E型肉毒桿菌毒素的級分。
本發明的特徵在於，上述步驟（c）之後，還可包括步驟（c’），其預處理在上述步驟（c）中純化的洗脫液。
本發明的特徵在於，在上述步驟（c’）中，上述預處理可以為滲濾和/或超濾。
本發明的特徵在於，上述滲濾和/或超濾可利用大小為10kDa至300kDa的濾膜來進行滲濾和/或超濾。
本發明的特徵在於，上述濾膜可以為盒型或中空纖維型濾膜。
本發明的特徵在於，上述滲濾可利用pH值為4.0～6.0的25～75mM磷酸鈉緩衝液來進行滲濾。
本發明的特徵在於，在上述步驟（d）中，上述反應可利用胰蛋白酶使上述洗脫液在33～36℃的溫度下反應0.5小時～2小時來使上述洗脫液中的E型肉毒桿菌毒素活化。
本發明的特徵在於，在上述步驟（e）中，混合模式色譜柱可以為填充包含磷酸鈣複合物Ca 10(PO 4) 6(OH) 2官能基團的樹脂的柱，即CHT（陶瓷羥磷灰石，Ceramic Hydroxyapatite）柱。
本發明的特徵在於，上述CHT柱可以為CHT Ⅰ型和/或CHT-XT。
本發明的特徵在於，在上述步驟（e）中，可通過利用純水稀釋步驟（d）的胰蛋白酶反應液並注入至混合模式色譜柱。
本發明的特徵在於，可通過向上述柱注入包含1.5～3.0M氯化鈉的pH值為4.0～6.0的5～50mM磷酸鈉緩衝液來獲得包含E型肉毒桿菌毒素的級分。
本發明還提供通過上述方法製備的E型肉毒桿菌毒素。
對照先前技術之功效
根據本發明，可純化純度及活性優秀的E型肉毒桿菌毒素，從而可有用地用於產生E型肉毒桿菌毒素。
並且，上述E型肉毒桿菌毒素具有注射當天表達效果且效果最長持續一個月的優點，因此，可用於製造生物醫藥品、組織縫合及面部固定提升線、脂肪分解注射劑等。
以下，詳細說明本發明。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所涉及的領域中技術人員所理解的含義相同的含義。一般來說，本文使用的命名法是本領域中眾所周知的，並且也是常用的。
在本發明中，術語「肉毒桿菌毒素」不僅是指由肉毒桿菌產生的神經毒素，還指由非肉毒桿菌菌種重組所產生的肉毒桿菌毒素（或輕鏈或重鏈）。如本文所用，肉毒桿菌毒素還包括：肉毒桿菌毒素複合物（即300kDa、600kDa和900kDa複合物）以及純肉毒桿菌毒素（即，約150kDa）。上述“純肉毒桿菌毒素”被定義為從其他蛋白質中分離或基本上分離的肉毒桿菌毒素，這些蛋白質包括形成該肉毒桿菌毒素複合物的蛋白質。純肉毒桿菌毒素可以具有95％或更高的純度，優選為99％或更高的純度。
在本發明中，產生毒素的肉毒桿菌菌株可以是肉毒桿菌或其變種，最優選為肉毒桿菌E型，但並不限定於此，對於本領域技術人員而言，顯然可以使用能夠產生肉毒桿菌毒素的任何菌株。
因此，在一方面，本發明涉及E型肉毒桿菌毒素的純化方法。上述E型肉毒桿菌毒素的純化方法包括：
步驟（a），預處理產生E型肉毒桿菌毒素的菌株培養液；
步驟（b），利用陽離子交換色譜來純化在上述步驟（a）中預處理的培養液；
步驟（c），利用疏水性色譜來純化在上述步驟（b）中純化的洗脫液；
步驟（d），將在上述步驟（c）中純化的洗脫液與胰蛋白酶反應來使上述E型肉毒桿菌毒素活化；以及
步驟（e），利用混合模式色譜純化上述胰蛋白酶反應液。
本發明的特徵在於，在上述步驟（a）中，上述預處理可以為超濾，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，上述超濾可利用大小為10kDa至300kDa的濾膜，優選地，可利用大小為50kDa至100kDa的濾膜來進行超濾，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，上述濾膜可以為盒型或中空纖維型濾膜，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，在上述步驟（b）中，陽離子交換色譜柱可以為填充樹脂的柱，該樹脂包含選自由羧甲基、磺乙基、磺丙基、磷酸及磺酸鹽組成的組中的一種以上的官能基團，但並不局限於此。
尤其，磺丙基柱可有效地去除上述陽離子交換色譜中的雜質，並可保持肉毒桿菌毒素的高活性。可利用SP瓊脂糖HP柱、SP瓊脂糖FF柱、卡普托S等作為上述磺丙基柱，優選地，可使用SP瓊脂糖HP柱作為上述磺丙基柱，但並不局限於此。
在本發明的一實施例中，上述SP瓊脂糖HP柱為填充樹脂的柱，該樹脂包含磺丙基官能基團，且為具有6%球形（spherical）、交聯的瓊脂糖基質（cross-linked agarose matrix）形式，並且基於核糖核酸酶A（Ribonuclease A），具有55mg/mL的DBC，且粒徑（Particle size）為34μm，但並不局限於此。
在本發明中，當在上述步驟（b）中利用除陽離子交換色譜之外的其他種類的色譜（例如，陰離子交換色譜、疏水性色譜或混合模式色譜）及其柱來純化時，相比于利用本發明的陽離子交換色譜及其柱（例如，磺丙基柱）來純化的情況，可降低肉毒桿菌毒素E型的純化收率及純度。
本發明的特徵在於，在上述步驟（b）中，可利用純水或緩衝液稀釋在步驟（a）中預處理的培養液並注入至陽離子交換色譜柱，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，上述緩衝液的濃度及pH為了使E型肉毒桿菌毒素結合在陽離子交換色譜柱中而滴定，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，上述緩衝液可以為檸檬酸鈉緩衝液，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，可通過向上述柱注入作為洗脫緩衝液的包含氯化鈉的檸檬酸鈉緩衝液來獲得包含E型肉毒桿菌毒素的級分，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，上述洗脫緩衝液可以為添加有0.5～1.5M氯化鈉的pH值為4.0～6.0的10～50mM檸檬酸鈉緩衝液，但並不局限於此。
在本發明的步驟（b）中，去除雜質，並可捕獲（Capture）複合物形式的E型肉毒桿菌毒素。
在本發明的上述步驟（c）中，疏水性色譜柱為填充樹脂的柱，該樹脂包含選自由醚、異丙基、丁基、辛基及苯基組成的組中的一種以上的官能基團，但並不局限於此。
尤其，丁基柱可有效地分離非複合物形式（Non-complexed form）的蛋白質。可利用丁基瓊脂糖HP柱、卡普托丁基柱、卡普托苯基柱、苯基HP柱等作為上述丁基柱，優選地，可使用丁基瓊脂糖HP柱作為上述丁基柱，但並不局限於此。
在本發明的一實施例中，上述丁基瓊脂糖HP柱為填充樹脂的柱，該柱具有6%的高度交聯的瓊脂糖基質（Highly cross-linked agarose 6% matrix），示出50μmol丁基組（Butyl groups）/mL的取代程度（Degree of substitution），粒徑為34μm，但並不局限於此。
在本發明中，當在上述步驟（c）中利用除疏水性色譜之外的其他種類的色譜（例如，陽離子交換色譜、陰離子交換色譜或混合模式色譜）及其柱來純化時，相比于本發明的利用疏水性色譜及其柱（例如，丁基柱）來純化的情況，可降低肉毒桿菌毒素E型的純化收率及純度。
本發明的特徵在於，在上述步驟（c）中，將在步驟（b）中純化的洗脫液稀釋在pH值為4.0～6.0的緩衝液並注入至疏水性色譜柱，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，上述緩衝液可以為添加有3.5～4.5M氯化鈉的pH值為4.0～6.0的25～75mM磷酸鈉和/或檸檬酸鈉緩衝液，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，上述緩衝液的濃度及pH為了使E型肉毒桿菌毒素結合在疏水性色譜柱而滴定，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，可通過向上述柱注入pH值為4.0～6.0的25～75mM磷酸鈉和/或檸檬酸鈉緩衝液來獲得包含E型肉毒桿菌毒素的級分，但並不局限於此。
在本發明的步驟（c）中，還可去除雜質（75kDa），但並不局限於此。
在本發明中，上述步驟（c）之後，還可包括步驟（c’），其預處理在上述步驟（c）中純化的洗脫液，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，在上述步驟（c’）中，上述預處理可以為滲濾和/或超濾，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，上述濾膜可以為盒型或中空纖維型濾膜，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，上述滲濾和/或超濾可利用大小為10kDa至300kDa的濾膜，優選地，可利用大小為30kDa至50kDa的濾膜來進行滲濾和/或超濾，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，上述滲濾利用pH值為4.0～6.0的25～75mM磷酸鈉緩衝液進行滲濾，但並不局限於此。
在本發明的步驟（d）中，若在33～36℃的溫度下處理胰蛋白酶0.5小時～2小時，150kDa的E型肉毒桿菌毒素蛋白的重鏈（Heavy chain，HC；100kDa）與輕鏈（Light chain，LC；50kDa）之間的肽結合（共價鍵），使得肉毒桿菌毒素活化。
即，本發明的特徵在於，在上述步驟（d）中，上述反應可利用胰蛋白酶使上述洗脫液在33～36℃的溫度下反應0.5小時～2小時來使上述洗脫液中的E型肉毒桿菌毒素活化，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，上述胰蛋白酶可以為豬源性胰蛋白酶，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，在上述步驟（e）中，混合模式色譜柱可以為填充樹脂的柱，該樹脂包含磷酸鈣複合物Ca 10(PO 4) 6(OH) 2官能基團，但並不局限於此。
上述CHT柱有效地去除其他雜質，可增加～300kDa的肉毒桿菌毒素的純度。上述CHT柱可利用CHT Ⅰ型、CHT-XT等，優選地，可利用CHT-XT柱，但並不局限於此。
在本發明中，當在上述步驟（e）中利用除混合模式色譜之外的其他種類的色譜（例如，陽離子交換色譜、陰離子交換色譜或疏水性色譜）及其柱來純化時，相比于本發明的利用混合模式色譜及其柱（例如，CHT柱）來純化的情況可降低肉毒桿菌毒素E型的純化收率及純度。
本發明的特徵在於，在上述步驟（e）中，將步驟（d）的胰蛋白酶反應液稀釋在純水並注入至混合模式色譜柱，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，通過上述純水的稀釋可為了降低胰蛋白酶反應液的緩衝液濃度並使E型肉毒桿菌毒素結合在混合模式色譜柱中而進行的，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，可通過向上述柱注入添加有1.5～3M氯化鈉的pH值為4.0～6.0的5～50mM磷酸鈉緩衝液來獲得包含E型肉毒桿菌毒素的級分，但並不局限於此。
在本發明的步驟（e）中，還去除雜質（75kDa），並可增加肉毒桿菌毒素複合物的純度。
在本發明中，混合模式色譜步驟可使用本技術領域公知的任意混合模式色譜工藝。混合模式色譜包括樹脂、單核或薄膜形態的固體狀色譜支撐體的使用，上述支撐體使用多個化學機制來吸附蛋白質或其他溶質。作為本發明的有用的例，非限制性的包括使用下述機制中的兩種以上的組合的色譜支撐體：陰離子交換、陽離子交換、疏水相互作用、親水相互作用、親硫（Thiophilic）相互作用、疏水結合、π鍵合及金屬親和性。在特定方式中，混合模式色譜工藝組合如下的技術：（1）陰離子交換及疏水相互作用技術；（2）陽離子交換及疏水相互作用技術；和/或（3）靜電及疏水相互作用技術。在一方式中，混合模式色譜步驟可通過使用能夠從GE healthcare life sciences購買的Capto ®adhere柱及如樹脂的柱及樹脂來實現。上述Capto ®adhere柱為用於捕獲後的單克隆抗體的中間純化及打磨的多模式介質。在特定方式中，混合模式色譜步驟可通過流經模式（Flow-through mode）執行。在再一方式中，混合模式色譜步驟可通過結合-洗脫模式（Bind-elute mode）執行。在另一方式中，混合模式色譜步驟可通過使用下述系統中的一種以上來實現：Capto ®MMC(Cytiva)、HEA HyperCel TM(Pall Corporation)、PPA HyperCel TM(Pall Corporation)、MBI HyperCel TM(Pall Corporation)、MEP HyperCel TM(Pall Corporation)、Blue Trisacryl M(Pall Corporation)、CFT TMCeramic Fluoroapatite（陶瓷氟磷灰石）(Bio-Rad Laboratories, Inc.)、CHT TMCeramic Hydroxyapatite（陶瓷羥磷灰石）(Bio-Rad Laboratories, Inc.)和/或ABx TM(J.T. Baker)。在上述混合模式色譜步驟中使用的特定方法由所使用的特定柱及樹脂確定，通常由製造商提供或在本技術領域中公知。
在本發明的一實施例中，上述步驟（b）中的陽離子交換色譜柱可以為磺丙基柱，上述步驟（c）中的疏水性色譜柱可以為丁基柱，上述步驟（e）中的混合模式色譜柱可以為CHT-XT柱，並不局限於此，在利用與上文不同種類的柱的情況下，可降低肉毒桿菌毒素E型的純化收率及純度。
通过上述方法純化的肉毒杆菌毒素为純度99%以上的肉毒杆菌毒素E型，相比于通过现有的方法純化的肉毒杆菌毒素，通过如上所述的方法純化的肉毒杆菌毒素具有更高的純度。
因此，在另一方面，本發明涉及通過上述方法製備的E型肉毒桿菌毒素。
在本說明書中使用的術語「級分」是指包含至少一種目標分子的一組穿透物質，其通過分離方法進行分離和收集，其中生物藥劑中包含該至少一種目標分子（諸如肉毒桿菌毒素）和一種或多種雜質，該至少一種目標分子穿過結合到一種或多種雜質的物質，並且該目標分子通常不與該物質結合（即，流經該物質）或與該物質結合，然後被洗脫。
在本說明書中使用的術語「純化」是指通過從某種物質中去除共存的雜質來提高純度的操作，並且在本說明書中，純化是指從肉毒桿菌的培養物中分離出當生長過度的肉毒桿菌死亡時產生的肉毒桿菌毒素，以及意指在肉毒桿菌毒素生產過程中提高純度的過程。
在下文中，將參考多個實施例以更詳細地描述本發明。然而，對於本領域技術人員而言，顯而易見的是提供這些實施例僅利用示例本發明，而不應解釋為限制本發明的範圍。
實施例
實施例1
產生E型肉毒桿菌毒素的菌株培養液的預處理工藝超濾（Ultra-Filtration，UF）
在TFF系統安裝了Pellicon ®2 Mini Cassette（50kDa，0.1m 2）。測定培養回收液容積、pH值及導電性（conductivity）。通過超濾對培養回收液進行一次濃縮。向上述一次濃縮工藝液中添加純水，並進行二次濃縮來回收二次濃縮工藝液。向TFF系統添加純水，將回收後剩餘的殘留工藝液回收，並與已回收的二次濃縮工藝液合併。確認合併的上述最終工藝液量、pH值及導電性。
實施例2
E型肉毒桿菌毒素的純化工藝
實施例2-1：陽離子交換色譜
將填充（Packing）有SP-HP樹脂（Resin）的柱裝在高速蛋白質液體色譜（Fast Protein Liquid Chromatography，FPLC）。對於在實施例1中準備的最終工藝液，利用1N氯化氫（HCl）將pH值調節為5.0，並將上述工藝液注入至柱。若注入結束，則流入平衡/洗滌緩衝液（20mM檸檬酸鈉，pH 5.0）來洗滌柱。洗滌後，注入平衡/洗脫緩衝液（20mM檸檬酸鈉，1M氯化鈉，pH 5.0），由此，依次獲得0～0.5M氯化鈉區間的級分。由SDS-PAGE分別確認級分，以表1的條件製備用於SDS-PAGE分析的樣品。
由SDS-PAGE分別確認上述級分的結果，可確認～300kDa複合物形式的肉毒桿菌毒素在相應級分中被純化（圖1）。
表1 用於SDS-PAGE分析的樣品製備條件
成分 還原條件 非還原條件
肉毒桿菌毒素（1mg/mL） 3uL 3uL
LDS樣品緩衝液（4x） 5uL 5uL
樣品還原劑（10x） 2uL 0uL
純水 10uL 12uL
總容積 20uL
實施例2-2：疏水性色譜
將填充有丁基-HP樹脂的柱裝在FPLC。對於在實施例2-1的SP-HP柱中洗脫的級分，利用1N氫氧化鈉（Sodium hydroxide）滴定為pH 5.0。向SP-HP工藝洗脫液添加50mM檸檬酸鈉、4M氯化鈉、pH 5.0緩衝液，使得導電性成為170～180mS/cm。將添加有上述緩衝液的洗脫液注入至柱。若注入結束，則流入平衡/洗滌緩衝液（50mM檸檬酸鈉，2.5M氯化鈉，pH 5.0）來洗滌柱。洗滌後，注入平衡/洗脫緩衝液（50mM檸檬酸鈉，pH 5.0），由此，依次獲得0～2.5M氯化鈉區間的級分（圖2）。
由SDS-PAGE分別確認上述級分的結果，確認去除較多雜質（75kDa），～300kDa複合物形式的肉毒桿菌毒素在相應級分中被純化（圖2）。
實施例2-3：超濾及滲濾（Ultra-Filtration/Dia-Filtration，UF/DF）
在TFF系統安裝Sartocon Slice 200（30kDa，0.02m 2）。確認從丁基-HP柱中洗脫的洗脫液量，並測定pH值及導電性。對於在二次疏水性色譜中獲得的洗脫液，利用50mM磷酸鈉、pH 5.8（以下為DF緩衝液）進行1000倍以上的透濾（Diafiltration，DF）。測定上述最終工藝液的UV吸光度及pH、導電性。利用0.2μm的篩檢程式過濾上述最終工藝液並保存在4℃中。
實施例2-4：胰蛋白酶處理
使實施例2-3的最終工藝液在35℃的溫度下與胰蛋白酶（Roche，06369880）反應1小時後，回收胰蛋白酶反應液。利用冷卻的純水以1:4比例稀釋胰蛋白酶反應液。確認稀釋的上述反應液量及pH、導電性。確認pH後，利用1N氫氧化鈉滴定為pH 5.8後，由SDS-PAGE分別確認（圖3）。
結果，確認150kDa神經毒素蛋白質（Neurotoxin）的密度（Density）為5%以下，分為HC（100kDa）及LC（50kDa）（圖3）。
實施例2-5：混合模式色譜
將填充有CHT-XT（樹脂）的柱裝在FPLC。將實施例2-5的胰蛋白酶反應液注入至柱。若注入結束，則利用平衡/洗滌緩衝液（10mM磷酸鈉，pH 5.8）洗滌柱。洗滌後，注入平衡/洗脫緩衝液（10mM磷酸鈉，2M氯化鈉，pH 5.8），由此，依次獲得0～2.0M氯化鈉區間的級分。
由SDS-PAGE分別確認上述級分的結果，去除較多的雜質（75kDa），且～300kDa複合物形式的肉毒桿菌毒素在相應級分中被純化（圖4）。
實施例3
比較各個純化步驟的E型肉毒桿菌毒素SDS-PAGE
作為整合包含在實施例2中純化的肉毒桿菌毒素的級分、市售的肉毒桿菌毒素的研究參考標準（research reference standard），本公司將E型肉毒桿菌複合毒素（Metabiologics, Inc. Lot: E010821-01）產品在10mM磷酸鈉、pH 5.8的緩衝液中分別稀釋至1mg/mL的濃度，分為如表1的還原條件及非還原條件來製備為用於SDS-PAGE的樣品。在具有8～16%順式甘胺酸（Invitrogen，XP08160BOX）的10孔Novex楔型孔盤中對樣品進行電泳，將約30mL的Instant Blue染色試劑添加至此，並將樣品在振盪器上染色60分鐘。完全去除染色試劑，添加約30mL的純化水，並在振盪器上將樣品洗滌30分鐘，將蓋過程重複5次以上。當染色被充分去除並且可以檢測到條帶時，使用圖像分析儀分析凝膠。
結果，從SDS-PAGE確認純化各個步驟的神經毒素蛋白質的過程（圖6），並確認了各步驟的生產量（Yield）（表2）。可知，本發明的純化方法可準確地純化神經毒素蛋白質。
表2 毒素蛋白質的各個純化步驟的收率
樣品名 量（ mg ） 生產量（ % ）
培養基 105.20 100.00
SP-HP 84.90 80.70
丁基-HP 52.80 50.19
CHT-XT 35.90 34.13
實施例4
本發明的肉毒桿菌毒素純化產物的活性
對於通過實施例3純化的肉毒桿菌毒素，通過利用動物的效價試驗評估原液的特異效價值。向每組18～22g的雌性小鼠10只，腹腔注射0.1mL後，測定3天的致死率（LD 50）。對於3天內測定的死亡數，使用作為統計程式的Combi-stats以概率單位分析法計算特異效價值。試驗反復3次，3次重複平均特異效價值評估為4.5×10 7U/mg。
結果如表3，可確認本發明的純化方法可在不弱化肉毒桿菌毒素的活性的同時進行純化。
表3 肉毒桿菌毒素純化產物的活性
試驗 效價（ U/mg ）
試驗1 4.5×10 7
試驗2 4.4×10 7
試驗3 4.6×10 7
平均 4.5× 10 7
實施例5
純化工藝純度確認
對於純化的肉毒桿菌毒素的純度分析，利用表4及表5的條件以SE-HPLC、RP-HPLC分析。SE-HPLC結果如圖5，確認保留時間（Retention time，RT）15.9中的純度為99.61%。並且，RP-HPLC結果如圖7，確認兩個主峰（main peak），未確認雜質峰。保留時間為15.6的峰為純肉毒桿菌毒素，且保留時間為17.2的峰為複合物成分的NTNH。
表4 SE-HPLC分析條件
項目 SE-HPLC 條件
柱 PROTEIN LW-803
尺寸 8mm×300mm
固定相 色譜用矽膠R（3μm）
柱溫 25±5℃
採樣溫度 5±3℃
移動相 100mM檸檬酸-Na 2PO 4，pH 5.6，0.3M NaCl
流速 0.5mL/分鐘
執行時間 30分鐘
檢測 UV檢測器，278nm
注射容積 10μL（10μg）
表5 RP-HPLC分析條件
項目 RP-HPLC 條件
柱 ZORBAX 300SB-C3
柱溫 60℃
採樣溫度 4℃
流速 1.0mL/分鐘
執行時間 40分鐘
檢測 UV檢測器，220nm
注射容積 20 μL
移動相 A）含0.1%三氟乙酸的水 B）含0.1%三氟乙酸的80%乙腈
時間（分鐘） A線（%） B線（%）
0 100 0
20 0 100
25 0 100
35 100 0
40 100 0
實施例6
純化的肉毒桿菌毒素的過程品質控制（In Process Control，IPC）分析結果
為了根據實施例2結果測定由一次SP-HP、二次丁基-HP、三次CHT-XT柱純化的產物的純度，通過HPLC進行分析（表4）。結果，確認肉毒桿菌毒素的純度為99.61%（圖5及圖8）。
實施例7
比較胰蛋白酶源種的肉毒桿菌毒素切割功能
在利用除牛源胰蛋白酶之外的其他動物源胰蛋白酶的情況下，肉毒桿菌毒素活化及純化效果差。因此，本發明人比較分析了豬（Porcine）源胰蛋白酶的情況和牛（Bovine）源胰蛋白酶（Sigma，T1426）的情況。具體地，發明人使豬源胰蛋白酶的情況及牛源胰蛋白酶在33～36℃的溫度下反應0.5小時～2小時後，添加胰蛋白酶抑制劑（Trypsin inhibitor）（與添加至肉毒桿菌毒素的胰蛋白酶量相同的比例）來中斷酶反應，由SDS-PAGE分析相應樣品。
結果，確認利用豬源胰蛋白酶的情況和利用牛源胰蛋白酶的情況下，上述條件下的肉毒桿菌毒素的切割功能比較沒有顯著差異（圖9）。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
無
圖1為根據本發明的一實施例，經過陽離子交換色譜後的洗脫液中的肉毒桿菌毒素的FPLC及SDS-PAGE分析結果。 圖2為根據本發明的一實施例，經過疏水性色譜後的洗脫液中的肉毒桿菌毒素的FPLC及SDS-PAGE分析結果。 圖3為根據本發明的一實施例，利用胰蛋白酶進行純化的步驟的SDS-PAGE分析結果。 圖4為根據本發明的一實施例，經過混合模式色譜後的洗脫液中的肉毒桿菌毒素的FPLC及SDS-PAGE分析結果。 圖5為根據本發明純化的肉毒桿菌毒素的純度的SE-HPLC分析結果。 圖6為根據本發明，各個肉毒桿菌毒素純化步驟的樣品的SDS-PAGE分析結果。 圖7為根據本發明純化的肉毒桿菌毒素的純度的RP-HPLC分析結果。 圖8為根據最優條件純化的肉毒桿菌毒素的HPLC純度的測定結果。 圖9為根據胰蛋白酶源種的肉毒桿菌毒素切割功能的SDS-PAGE比較結果。

Claims (23)

  1. 一種E型肉毒桿菌毒素的純化方法，包括：步驟(a)，預處理產生E型肉毒桿菌毒素的菌株培養液；步驟(b)，利用陽離子交換色譜來純化在上述步驟(a)中預處理的培養液；步驟(c)，利用疏水性色譜來純化在上述步驟(b)中純化的洗脫液；步驟(d)，將在上述步驟(c)中純化的洗脫液與胰蛋白酶反應來使上述E型肉毒桿菌毒素活化；以及步驟(e)，利用混合模式色譜純化上述胰蛋白酶反應液，其中，在步驟(b)中，該陽離子交換色譜的柱為填充包含磺丙基官能基團之樹脂的柱，其中，在步驟(c)中，該疏水性色譜的柱為填充包含丁基官能基團之樹脂的柱，且其中，在步驟(e)中，該混合模式色譜的柱為填充包含磷酸鈣複合物Ca10(PO4)6(OH)2官能基團之樹脂(CHT，陶瓷羥磷灰石，Ceramic Hydroxyapatite)的柱。
  2. 如請求項1所述的純化方法，其中，在上述步驟(a)中，上述預處理為超濾。
  3. 如請求項2所述的純化方法，其中，上述超濾通過利用大小為10kDa至300kDa的濾膜來進行。
  4. 如請求項3所述的純化方法，其中，上述濾膜為盒型或中空纖維型濾膜。
  5. 如請求項1述的純化方法，其中上述磺丙基柱為選自由SP瓊脂糖HP柱、SP瓊脂糖FF柱及卡普托S組成的組中的一種以上。
  6. 如請求項1所述的純化方法，其中，在上述步驟(b)中，利用純水或緩衝液將在步驟(a)中預處理的培養液稀釋並注入至陽離子交換色譜柱。
  7. 如請求項6所述的純化方法，其中，上述緩衝液為的檸檬酸鈉緩衝液。
  8. 如請求項6所述的純化方法，其中，通過向上述柱注入作為洗脫緩衝液的包含氯化鈉的檸檬酸鈉緩衝液來獲得包含E型肉毒桿菌毒素的級分。
  9. 如請求項8所述的純化方法，其中，上述洗脫緩衝液為添加有0.5M至1.5M氯化鈉的pH值為4.0至6.0的10mM至50mM檸檬酸鈉緩衝液。
  10. 如請求項1所述的純化方法，其中，上述丁基柱為選自由丁基瓊脂糖HP柱、卡普托丁基柱、卡普托苯基柱及苯基HP柱組成的組中的一種以上。
  11. 如請求項1所述的純化方法，其中，在上述步驟(c)中，將在步驟(b)中純化的洗脫液稀釋在pH值為4.0至6.0的緩衝液並注入至疏水性色譜柱。
  12. 如請求項11所述的純化方法，其中，上述緩衝液為添加有3.5M至4.5M氯化鈉的pH值為4.0至6.0的25mM至75mM磷酸鈉和/或檸檬酸鈉緩衝液。
  13. 如請求項11所述的純化方法，其中，通過向上述柱注入pH值為4.0至6.0的25mM至75mM磷酸鈉緩衝液和/或檸檬酸鈉緩衝液來獲得包含E型肉毒桿菌毒素的級分。
  14. 如請求項1所述的純化方法，其中，上述步驟(c)之後，還包括步驟(c’)，預處理在上述步驟(c)中純化的洗脫液。
  15. 如請求項14所述的純化方法，其中，在上述步驟(c’)中，上述預處理為滲濾和/或超濾。
  16. 如請求項15所述的純化方法，其中，上述滲濾和/或超濾通過利用大小為10kDa至300kDa的濾膜來進行。
  17. 如請求項16所述的純化方法，其中，上述濾膜為盒型或中空纖維型濾膜。
  18. 如請求項15所述的純化方法，其中，上述滲濾通過利用pH值為4.0至6.0的5mM至50mM磷酸鈉緩衝液來進行。
  19. 如請求項1所述的純化方法，其中，在上述步驟(d)中，上述反應利用胰蛋白酶使上述洗脫液在33℃至36℃的溫度下反應0.5小時至2小時來使上述洗脫液中的E型肉毒桿菌毒素活化。
  20. 如請求項1所述的純化方法，其中，上述CHT柱為CHT I型和/或CHT-XT。
  21. 如請求項1所述的純化方法，其中，在上述步驟(e)中，通過利用純水將步驟(d)的胰蛋白酶反應液稀釋並注入至混合模式色譜柱。
  22. 如請求項21所述的純化方法，其中，通過向上述柱注入包含1.5M至3.0M氯化鈉的pH值為4.0至6.0的5mM至50mM磷酸鈉緩衝液來獲得包含E型肉毒桿菌毒素的級分。
  23. 一種通過請求項1至22中任一項之方法純化的E型肉毒桿菌毒素。
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