KR20180037420A - 보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 방법 - Google Patents

보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 방법 Download PDF

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Abstract

음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피하는 과정을 포함하는 보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소 A형 거대 복합체를 분리하는 방법을 제공한다.

Description

보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 방법{Method for isolating botulinum toxin from a solution containing botulinum toxin}
보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 방법에 관한 것이다.
신경 독성을 지닌 독소를 분비하는 클로스트리디움 균주들이 1890년대에서부터 지금까지 발견되었으며, 지난 70년간 이들 균주들이 분비하는 독소에 대한 특성이 연구되어 왔다(Schant, E. J. 등, Microbiol. Rev. 56; 80; 1992).
클로스트리디움 속은 127종 이상이며, 형태 및 기능에 따라 구분된다. 혐기성, 그람 양성 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔은 사람 및 동물에서 보툴리즘이라는 신경마비 질환을 일으키는, 강력한 폴리펩티드 신경독소를 생산한다. 클로스트리디움 보툴리눔의 포자는 토양에서 발견되며, 제대로 처리되지 않은 식품에서도 다량 배양 될 수 있다. 이러한 것들이 다양하게 보툴리즘의 원인이 되기도 한다.
보툴리눔 독소는 그 혈청학적 특징에 따라 A에서 G까지의 7가지 형으로 나뉘어 진다. 각 독소는 약 150 kDa 정도의 독소 단백질을 가지고 있는데, 자연적으로는 여러 비독성 단백질들과 결합되어 있는 복합체로 이루어져 있다. 중간 복합체 (300 kDa)는 독소 단백질과 비독성-비헤마글루티닌(HA) 단백질로 이루어져 있고, 큰 복합체 (500 kDa) 및 거대 복합체 (900 kDa)는 중간 복합체가 헤마글루티닌과 결합되어 있는 형태를 띠고 있다(Sugiyama, H., Microbiol. Rev., 44, 419; 1980). 이러한 비독성 비헤마글루티닌 단백질들은 장내에서 낮은 pH와 각종 단백질 가수분해 효소로부터 독소를 보호하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다 (Sugiyama, H., Microbiol. Rev., 44, 419; 1980).
독소는 세포 내에서 분자량이 약 150 kDa인 하나의 폴리펩티드로 합성된 후, 세포내 단백질 분해 효소의 작용이나 트립신과 같은 인위적인 효소 처리에 의하여 N말단으로부터 1/3되는 위치에서 절단되어 2개의 단위체인 경쇄 (light chain: 분자량 50 kDa)와 중쇄 (heavy chain: 분자량 100 kDa)로 나뉘어 진다. 이렇게 나뉘어진 독소는 단일 폴리펩티드일 때에 비해 그 독성이 크게 증가한다. 두 단위체는 이황화결합에 의해 서로 연결되어 있으며, 각각은 다른 기능을 갖는다. 중쇄는 표적(target)이 되는 세포의 수용체 (receptor)와 결합하고 (FEMS Microbiol.Lett. 72, 243; 1990), 낮은 pH(pH 4.0)에서 생체막과 반응하여 채널 (channel)을 형성하는 기능을 가지며 (Mantecucco, C. 등, TIBS 18, 324; 1993), 경쇄는 약리활성을 가지고 있어 계면활성제를 사용하여 세포에 투과성을 부여하거나, 전기천공 (electroporation)등으로 세포내 투입되었을 때 신경전달물질의 분비를 방해한다 (Poulain, B. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4090 ; 1988).
보툴리눔 독소 타입 A는 사람에게 알려진 가장 치명적인 천연 생물학제이다. 몰을 기준으로 할때, 보툴리눔 독소 타입 A는 디프테리아 보다 18억배, 시안화 나트륨보다 6억배, 코브로톡신 보다 3천만배, 그리고 콜레라 보다 1천 2백만배 더 치명적이다, Singh, Critical Aspects of Bacterial protein Toxins, page 63-84 of natural toxins II, edited by B.R.Sigh et al., Plenum Press, New York (1976)
독소는 신경근육종말 (neuromuscular junction)의 콜린성 전시냅스 (cholinergic presynapse)에서 아세틸콜린의 엑소시토시스 (exocytosis)를 저해하여 전신 무력증을 일으킨다. 극미량의 독소를 처리해도 독성이 나타나는 것으로 보아 이 독소는 어떤 효소 활성을 가질 것으로 생각되어져 왔다(Simpson, L. L. 등, Ann. Rev. Pharmaeol. Toxicol. 26, 427; 1986). 최근 밝혀진 바에 의하면, 독소는 메탈로펩티다제 활성 (metallopeptidase activity)을 가지고 있으며, 그 기질은 엑소사이토시스 장치 복합체 (exocytosis machinary complex)를 이루는 단위 단백질들인 시냅토브레빈 (synaptobrevin), 신택신 (syntaxin), 25 kDa의 시냅토좀 연계 단백질 (synaptosomal associated protein of 25 kDa) (SNAP 25)등이다. 각 형의 독소는 이 세가지 단백질들 중 하나를 기질로 삼고 있는데, B, D, F 및 G형은 시냅토브레빈을, A와 E형은 SNAP25를, C형은 신택신을 특정부위에서 절단하는 것으로 알려져 있다 (Binz, T. 등, J. Biol. Chem.265, 9153; 1994).
한국공개특허공보 제10-2012-0105417호는 발효 배지를 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키고 이어서 음이온 교환 크로마토그래피 매질에서 나온 용리액을 양이온 교환 크로마토그래피와 접촉시켜 발효 배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 회수하는 단계를 포함하는 클로스트리디움 보툴리눔 배양액으로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 상기 방법은 음이온 교환 크로마토그래피 매질에 독소를 결합시킨 후 용리하는 것으로서, 매질에 결합시키지 않고 흘려보내는 것에 대하여는 개시하고 있지 않다.
상기 방법에 의하면 보툴리눔 독소 단백질의 정제시 보툴리눔 독소로부터 신경독성 성분(즉, 대략 150 kDa 신경독성 분자), 중간복합체(300 kDa) 또는 큰 복합체(500 kDa)가 불순물로부터 해리되어 제거된다는 문제점이 있었다.
일 양상은 보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소 A형 거대 복합체를 분리하는 방법을 제공한다.
일 양상은 보툴리눔 독소 함유 용액을 보툴리눔 독소의 등전점(isoelectric point: PI) 이하의 산도에서 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계;상기 매질과 결합하지 않은 상기 용액을 보툴리눔 독소의 등전점 이하의 산도에서 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; 및 상기 양이온 교환 크로마토그래피 매질로부터 보툴리눔 독소 A형 거대 복합체를 분리하는 단계; 또는
보툴리눔 독소 함유 용액을 등전점 이하의 산도에서 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 매질로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 단계, 상기 매질에서 분리된 독소를 포함하는 용액을 등전점 이하의 산도에서 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계, 및 상기 매질과 결합하지 않은 상기 용액으로부터 보툴리눔 독소 A형 거대 복합체를 분리하는 단계;를 포함하는, 보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소 A형 거대 복합체를 분리하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 보툴리눔 독소 함유 용액을 보툴리눔 독소의 등전점(isoelectric point: pI) 이하의 산도에서 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계;상기 매질과 결합하지 않은 상기 용액을 보툴리눔 독소의 등전점 이하의 산도에서 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; 및 상기 양이온 교환 크로마토그래피 매질로부터 보툴리눔 독소 A형 거대 복합체를 분리하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 있어서, "보툴리눔 독소 A형 거대 복합체"는 보툴리눔 독소(BoNT), 비-독성 비-HA(NTNHA) 및 HA 성분으로 구성된 16S 즉 약 500kDa의 독소가 HA 단백질 중 하나인 HA1에 의하여 두 16S 독소가 연결된 디머일 수 있다.
상기 방법은 보툴리눔 독소 함유 용액을 보툴리눔 독소의 등전점(isoelectric point: pI) 이하의 산도에서 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계를 포함한다.
상기 단계에서, 상기 보툴리눔 독소 함유 용액은 클로스트리디움 보툴리눔 배양액 또는 그로부터 유래된 것일 수 있다. 그로부터 유래된 것은 배양액으로 상기 독소가 부분적으로 정제된 것일 수 있다. 클로스트리디움 보툴리눔의 배양은 알려진 방법에 의하여 이루어진 것일 수 있다. 상기 배양은 식물 유래 성분 함유 배지에서 수행된 것일 수 있다. 식물 유래 성분 함유 배지를 사용하여 배양함으로써, 종래 알려진 바와는 달리, 세포 외로 독소를 발현시키는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, "세포 외로 독소를 발현시킨다"라는 표현의 의미는 세포가 독소를 세포 내에서 생산한 후 자발적으로 세포 외부로 배출하는 것뿐만 아니라, 세포 내부에 발현된 독소를 포함하는 세포가 파쇄 (lysis)되어 독소가, 배양물 중의 세포 내부가 아닌, 배양물의 용액 부분에 노출되는 것을 포함한다.
상기 식물 유래 성분 함유 배지는 피톤 펩톤 (phytone peptone)을 함유하는 것, 바람직하게는, 피톤 펩톤, 효모 추출물 (yeast extract), 및 포도당을 포함하는 것일 수 있다. 이에 대하여, 상기 식물 유래 성분 함유 배지는 식물 트립톤 (vegetable tryptone), 소이톤 (soytone), 및 소듐 티오글리콜레이트 (sodium thioglycolate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 더 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 식물 유래 성분 함유 배지는 포도당, 효모 추출물 및 피톤 펩톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤 및 식물 트립톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤 및 소이톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 소이톤 및 식물 트립톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 소듐 티오글리콜레이트, 피톤 펩톤, 식물 트립톤 및 소이톤을 포함하는 배지; 및 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤, 식물 트립톤 및 소이톤을 포함하는 배지;로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
또한, 상기 식물 유래 성분 함유 배지로서 열거된 각 배지 중의 포도당, 효모 추출물, 소듐 티오글리콜레이트, 피톤 펩톤, 식물 트립톤, 및 소이톤의 함량은 중량 기준으로 각각 0.2% 내지 2%, 0.5% 내지 5%, 0.05% 내지 2%, 0.5% 내지 2%, 0.5% 내지 2%, 및 0.5% 내지 2%인 것일 수 있다. 또한, 상기 식물 유래 성분 함유 배지는 포도당, 효모 추출물 및 피톤 펩톤을 포함하는 배지; 포도당, 및 효모 추출물 함유 배지; 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤 및 식물 트립톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤 및 소이톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 소이톤 및 식물 트립톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 소듐 티오글리콜레이트, 피톤 펩톤, 식물 트립톤 및 소이톤을 포함하는 배지; 및 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤, 식물 트립톤 및 소이톤을 포함하는 배지;로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로, 상기 열거된 각 배지 중의 포도당, 효모 추출물, 소듐 티오글리콜레이트, 피톤 펩톤, 식물 트립톤, 및 소이톤의 함량은 중량 기준으로 각각 0.2% 내지 2%, 0.5% 내지 5%, 0.05% 내지 2%, 0.5% 내지 2%, 0.5% 내지 2.0%, 및 0.5% 내지 2%이고, 나머지는 물로 구성되는 것일 수 있다.
상기 독소는 보툴리눔 독소 A, B, C, D, E, F 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 타입 A 독소이다. 상기 보툴리눔 독소 A의 등전점은 약 6.06일 수 있다. 따라서, 상기 "등전점 이하의 산도"는 분리하고자 하는 독소의 타입에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 타입 A 독소인 경우, 상기 산도는 pH 6.06이하, pH 6.05이하, pH 6.00이하, pH 5.7이하, pH 5.5이하, pH 5.0이하, pH 4.5이하, pH 4.0이하, 또는 pH 3.5 이하일 수 있다. 타입 A 독소인 경우, 상기 산도는 pH 2.5 내지 6.05, pH 3.0 내지 6.00, pH 3.5 내지 5.5, pH 3.5 내지 5.0, pH 3.5 내지 4.5, pH 3.5 내지 4.0, pH 3.5 내지 6.00, pH 4.0 내지 6.0, pH 4.5 내지 6.0, pH 5.5 내지 6.0, pH 4.0 내지 5.5, 또는 pH 4.5 내지 5.5일 수 있다.
상기 음이온교환 크로마토그래피에 사용되는, 음이온교환수지로는 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 사차 암모니움(Quaternary ammonium, Q)기들로 치환된 것들을 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 미국특허 제5,696,077호, 국제특허공개 제WO96/05222 및 미국특허 제5,846,929호에 기재된 바와 같은 DEAE-Sephadex를 사용할 수 있다. 바람직하게는 강염기성의 사차 암모니움기를 가지는 그룹이나 또는 약염기성의 디에틸아미노에틸(DEAE) 그룹을 가지는 음이온 교환수지 중에서 어느 하나를 선택하여 사용한다.
예를 들면, 강염기성의 음이온교환 그룹으로는 Q Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, Resource Q, Source 15Q, Source 30Q, Mono Q, Mini Q, Capto Q, Capto Q ImpRes, Q HyperCel, Q Cermic HyperD F, Nuvia Q, UNOsphere Q, Macro-Prep High Q, Macro-Prep 25 Q, Fractogel EMD TMAE(S), Fractogel EMD TMAE Hicap (M), Fractogel EMD TMAE (M), Eshmono Q, Toyopearl QAE-550C, Toyopearl SuperQ-650C, Toyopearl GigaCap Q-650M, Toyopearl Q-600C AR, Toyopearl SuperQ-650M, Toyopearl SuperQ-650S, TSKgel SuperQ-5PW (30), TSKgel SuperQ-5PW (20), TSKgel SuperQ-5PW 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에 공지된 음이온교환수지를 사용할 수 있다.
상기 음이온 교환 크로마토그래피에 의하여 클로스트리디움 보툴리눔 독소는 매질에 결합하지 않고 통과하여 흘러 나오게 되며, 불순물은 매질에 결합하게 된다. 흘러나온 액체는 추가적으로 분리에 사용된다.
상기 단계에서, 상기 접촉은 상기 보툴리눔 독소 함유 용액을 매질에 흘려주는 것, 예를 들면 칼럼 중에 충진된 상기 매질에 일정한 조건에서 흘려주는 것을 포함한다. 흘려주는 유속, 온도, 시간 등의 조건은 조절될 수 있다. 상기 접촉은 컬럼 완충액으로는 포스페이트 완충액, 시트레이트 완충액 또는 아세테이트 완충액을 사용할 수 있다. 컬럼 완충액의 농도는 5mM 내지 30 mM, 예를 들면, 7mM 내지 27 mM, 10mM 내지 25 mM, 또는 15mM 내지 20 mM로 조절할 수 있다. 이동상의 유속은 0.5㎖/분 내지 5.0㎖/분, 1.0 내지 30.0㎖/분, 10 내지 30.0㎖/분, 15 내지 25.0㎖/분일 수 있다. 이때, 완충액의 전도도는 3 내지 30mS/cm로 맞추고 컬럼의 평형화가 끝나면 시료를 주입할 수 있다.
상기 방법은 또한, 상기 매질과 결합하지 않은 상기 용액을 보툴리눔 독소의 등전점 이하의 산도에서 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 "등전점 이하의 산도" 및 "접촉"에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 단계에서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 매질로서 술포프로필(sulfopropyl: SP) 및 메틸 술포네이트(S)와 같은 강산성의 양이온 교환 기를 갖거나 카르복시메틸(carboxymethyl: CM)과 같은 약산성의 양이온 교환기를 갖는 매질일 수 있다.
상기 방법은 또한, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 매질로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 독소를 분리하는 단계는 용출 용매를 상기 매질과 접촉시켜 보툴리눔 독소를 상기 용출 용매 중에서 회수하는 단계를 포함한다. 상기 용출 용매는 상기 매질로부터 상기 독소를 떼어낼 수 있는 것이면 어느 것이나 사용될 수 있다. 상기 용출 용매는 예를 들면, 상기 칼럼의 완충에 사용된 완충액 또는 염 농도 또는 전기 전도도가 적적하게 조절된 상기 완충액가 될 수 있다. 상기 염은 Na, 또는 K의 염일 수 있다. 상기 컬럼 완충액으로는 포스페이트 완충액, 시트레이트 완충액 또는 아세테이트 완충액을 사용할 수 있다. 컬럼 완충액의 농도는 5mM 내지 100 mM, 예를 들면, 10mM 내지 100 mM, 20mM 내지 100 mM, 또는 30mM 내지 70 mM로 조절할 수 있다. 이동상인 용출 용매의 유속은 0.5㎖/분 내지 5.0㎖/분, 1.0 내지 150.0㎖/분, 50.0 내지 150.0㎖/분, 75.0 내지 125.0㎖/분일 수 있다. 이때, 용출 용매액의 전도도는 3 내지 30mS/cm일 수 있다. 상기 용출 용매는 0.5 내지 2.0M 예를 들면 1.0M NaCl을 포함하는 포스페이트 버퍼 (50mM pH 5.0)일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계 전, 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계 전 또는 이 두 단계의 각 단계 전에 상기 보툴리눔 독소 또는 그를 함유하는 용액의 산도를 보툴리눔 독소의 등전점 이하로 조정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 조정하는 단계는 상기 보툴리눔 독소 또는 그를 함유하는 용액을 보툴리눔 독소의 등전점 이하의 산도를 갖는 버퍼와 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 버퍼는 포스페이트 버퍼, 시트레이트 버퍼, 아세테이트 버퍼 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 버퍼는 pH 3.5 내지 6.5, 또는 3.5 내지 5.5인 것일 수 있다. 상기 버퍼는 10mM 내지 100mM의 포스페이트, 시트레이트 또는 아세테이트를 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계 전, 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계 전 또는 이 두 단계의 각 단계 전에 상기 보툴리눔 독소 함유 용액을 한외여과하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 한외여과는 분자량 컷-오프 25 kDa 내지 125 kDa의 막을 사용하는 것일 수 있다. 상기 한외여과는 상기 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계 전에 수행되는 것의 분자량 컷-오프, 예를 들면 분자량 컷-오프 100 kDa에 비하여 상기 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계에서 수행되는 것의 분자량 컷-오프, 예를 들면 분자량 컷-오프 50 kDa가 더 작도록 조절된 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계 전에, 배지 중에서 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)을 배양하여, 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 세포 외로 발현시키는 단계;를 포함하고, 상기 보툴리눔 독소 함유 용액은 얻어진 배양물로부터 세포를 제거하여 세포 외에 발현된 클로스트리디움 보툴리눔 독소가 포함된 부분일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계 전에, 배지 중에서 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)을 배양하여, 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 세포 외로 발현시키는 단계; 배양물로부터 세포를 제거하고 얻어진 배양액에 산을 첨가하여 독소를 침전시킨 다음 침전물을 분리하는 단계; 및 상기 분리된 침전물을 매질 중에 용해시키고 한외여과하는 단계를 포함하고, 상기 보툴리눔 독소 함유 용액은 상기 한외여과에 의하여 얻어진 용액인 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 세포의 제거는 심층 여과 (depth filtration) 및 마이크로여과 (microfiltration)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 여과에 의하여 이루어지고, 독소의 침전은 산을 첨가하여 배양액을 pH 3 내지 4로 유지하여 이루어지는 것이고, 한외여과는 분자량 컷오프 100kDa 이하의 막을 사용하여 이루어지는 것일 수 있다.
다른 방법은 또한 보툴리눔 독소 함유 용액을 등전점 이하의 산도에서 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 매질로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 단계, 상기 매질에서 분리된 독소를 포함하는 용액을 등전점 이하의 산도에서 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계, 및 상기 매질과 결합하지 않은 상기 용액으로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 단계;를 포함하는, 보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 방법을 제공한다.
상기 보툴리눔 독소 함유 용액을 등전점 이하의 산도에서 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계, 및 상기 양이온 교환 크로마토그래피 매질로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 단계는 상기에서 "상기 매질과 결합하지 않은 상기 용액" 대신에 보툴리눔 독소 함유 용액을 사용하는 것을 제외하고는 상기한 바와 같다. 또한, "상기 매질에서 분리된 독소를 포함하는 용액을 등전점 이하의 산도에서 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계, 및 상기 매질과 결합하지 않은 상기 용액으로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 단계"는 "보툴리눔 독소 함유 용액"을 대신에 "상기 매질에서 분리된 독소를 포함하는 용액"을 사용하는 것을 제외하고 상기한 바와 동일하다.
일 양상에 따른 보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 방법에 의하면, 보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소 A형 거대 복합체 즉 900kDa을 효율적으로 분리할 수 있다.
도 1은 클로스트리디움 보툴리눔 배양액으로부터 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A 독소의 분리 공정을 나타낸 도면이다.
도 2는 양이온교환 크로마토그래피 후에 얻어진 시료에 대하여 SEC-HPLC 한 결과를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 클로스트리디움 보툴리눔 배양 및 클로스트리디움 보툴리눔 독소 분리
1. 클로스트리디움 보툴리눔의 배양
본 실시예에서는 무 동물 유래 성분 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하여 세포 외로 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A 독소를 다량 발현시켰다.
사용된 배지는 배지 총 중량에 대하여 효모 추출물 4%, 및 포도당 0.5%를 포함하는 것을 사용하였다. 상기 배지 성분을 주사용수 (Water For Injection:WFI)에 녹이고, NaOH를 이용해 pH를 7.2로 조정하여 사용하였다.
이렇게 준비된 상기 배지 200ml를 멸균된 일회용 마이크로여과 시스템 (single use microfiltration system: 0.2㎛ Sartorius 2, Sartorius 사)을 통하여 여과하여 CellbagTM (GE healthcare사 제품, 일회용 발효 백)에 주입하고, 여기에 클로스트리디움 보툴리눔 106 ~ 107세포/ml 농도의 시드 배양액 1ml를 시료 주입 포트를 통하여 접종하였다. CellbagTM은 낮은 전단 응력에서 혼합을 일으키기 위하여 락킹 운동 (rocking motion)을 사용하는 일회용 생물반응기 (disposable bioreactor)이다. CellbagTM은 공기 입구 및 출구 및 시료 포트가 형성되어 있는 가요성 (flexible) 재질의 백으로서 구성되어 있으며, 상기 백의 재질을 통하여 공기가 통과할 수 없다 (air impermeable). 또한, 상기 백에는 결합된 공기 펌프가 구비되어 있어 백 부풀리기 (bag inflation) 및 세포 공급을 위하여 사용된다. 사용된 백은 2 L 용량을 갖는 것이었다.
배양은 200mL 종 배양액을 포함하는 2L CellbagTM을 CellbagTM에 포함되어 있는 락커 (rocker unit)를 사용하여 10rpm으로 락킹하면서, 37℃에서 12 내지 30시간 동안 종 배양하고, 이를 본 배양 배지 20L를 포함하고 있는 상기 백에 폴리카보네이트 재질의 멸균 일회용 커넥터 (Kleenpack connector PALL)를 통하여 접종한 뒤 48~72시간 동안 혐기 조건을 유지하면서 배양하였다. 상기 백의 시료 주입 포트에 제균 필터 (0.2㎛)를 설치하고 이를 통해 종 배양 배지 200mL를 상기 백으로 주입하였다. 배지의 주입은 페리스탈틱 펌프를 사용하여 수행되었다.
상기 종 배양 배지는 상기 백에 헤드 공간 (headspace)없이 주입하여 혐기 조건이 유지되도록 주입되었다. 상기 종 배양액을 주입할 때에도 동일하게 주입하였다. 또한, 상기 본 배양은 상기 백을 CellbagTM의 락커 (Rocker unit)의 플랫폼에 올려놓고, 온도 37℃로 유지하면서 10rpm으로 락킹 (rocking)하였다. 배양 중 백 내부를 혐기 조건으로 유지하기 위하여 1800L의 질소를 6 시간 동안 주입하였다. 상기 배양 온도는 37℃ 외에 34℃, 35℃ 또는 36℃를 사용할 수도 있다.
배양이 종료된 후, 상기 백의 시료 포트에 멸균 커넥터인 QDC connector (사토리우스 제품)를 연결하고, 이를 통하여 배양물을 다른 일회용 백 (가요성 일회용 백)으로 이송하였다. 다음으로, 배양물이 포함되어 있는 일회용 용기에 멸균 일회용 심층여과 (Depthfilter, Sartoclear 또는 SupraCap, PALL) 및 마이크로여과기 (0.2㎛, Sartopore 2, Sartorius)을 연결하고, 이를 통하여 여과하여 세포를 제거하고, 이를 통해 얻어진 상등액은 또 다른 일회용 백에 담았다. 상기 상등액으로부터 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 분리하였다.
2. 배양물로부터 클로스트리디움 보툴리눔 독소의 분리
이하에서는 세포를 제거한 배양액으로부터 타입 A 독소를 생산하는 방법에 대하여 구체적으로 설명한다.
(1) 산 침전
상기에 얻은 배양 상등액 20L가 포함되어 있는 백에 1N 황산을 첨가하여 pH를 3.0 내지 4.5로 조정하여, 독소 단백질을 침전시켰다. 이 공정 역시 외부와의 접촉 없이 일회용 용기 (disposable sample bag) 내에서 모든 작업이 이루어졌다.
다음으로, 침전이 완료되면, 멸균된 일회용 여과 시스템 (disposable slice 200 0.2㎛ 필터: Sartorius 사)을 통하여 외부와 접촉없이 여과하여 상등액을 제거하고, 침전물을 일회용 백 (sample bag, disposable)에 회수하였다. 회수된 침전물에 주사용수(WFI) 5L를 첨가하여 황산을 씻어주고, 멸균된 일회용 마이크로여과 시스템 (disposable slice 200 0.2㎛ 필터)을 상기 백에 연결하고 여과하여 상등액을 제거함으로써, 침전물을 일회용 백 내로 회수하였다.
(2) 농축 및 여과
회수된 침전물에 시트레이트 버퍼 (25mM pH 5.5) 10L를 첨가하여, 침전물에 있는 독소 단백질을 재용해시켰다. 이 공정 역시 일회용 백에서 작업하였으며, 외부와의 접촉은 일어나지 않았다. 재용해된 시료가 포함되어 있는 백에 멸균된 일회용 여과 시스템 (0.2㎛, ULTA Cap HC, GE, 미국)을 연결하고 외부와 접촉없이 여과하여 상등액을 멸균된 일회용 백에 취하고, 불용성 불순물들은 제거하였다.
불용성 불순물들이 제거된 시료가 포함되어 있는 상기 백에 분자량 컷오프 100 kDa의 멸균된 일회용 한외여과 막 (disposable slice 200 100kDa: Sartorius 사)을 연결하고, 외부와의 접촉없이 여과하여 농축하였다. 이 과정 역시, 독소 단백질은 무균 용기의 내부 표면과 접촉하고 있었으며, 외부와의 접촉은 일어나지 않았다.
(3) 음이온 교환 크로마토그래피
다음으로, 농축 및 버퍼 교환이 완료된 시료가 포함된 상기 백에 일회용 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피 시스템 (DEAE BPG columnTM: GE Healthcare)을 사용하여 외부와의 접촉없이 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 구체적으로, 상기 시트레이트 버퍼 (25mM pH 5.5)를 상기 DEAE 음이온 교환 수지가 충진된 칼럼에 흘려주어 평형화하고, 상기 독소 함유 상기 시트레이트 버퍼 (25mM pH 5.5)를 칼럼을 통하여 흘려 주었다. 이 단계에서, 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A 독소는 음이온 교환수지에 흡착되지 않고 대부분이 주요 불순물은 흡착되어 제거되었다. 흘려주는 동안 유속은 20ml/분이고, pH는 5.5으로 유지하였다.
(4) 농축 및 여과
다음으로, 상기 음이온 교환 크로마토그래피에서 음이온 교환 수지에 결합하지 않고 흘러 나오는(flow through) 용액 중 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A 독소를 포함하는 분획을 취하였다.
상기 분획이 포함되어 있는 백에 분자량 컷오프 50 kDa의 멸균된 일회용 한외여과 막 (disposable slice 200 100kDa: Sartorius 사)을 연결하고, 외부와의 접촉없이 여과하여 농축하고, 포스페이트 버퍼 (50mM pH 5.0)를 사용하여 버퍼 교환을 실시하였다. 이 과정 역시, 독소 단백질은 무균 용기의 내부 표면과 접촉하고 있었으며, 외부와의 접촉은 일어나지 않았다. 버퍼 교환에 사용되는 버퍼는 포스페이트 버퍼 (50mM pH 5.0) 뿐만 아니라, 10 내지 75mM의 포스페이트 버퍼, 시트레이트 버퍼 또는 아세테이트 버퍼로서 클로스트리디움 보툴리눔 독소의 pI 값보다 낮은 pH 3.5 내지 6.5, 또는 pH 3.5 내지 5.5인 것이 사용될 수 있다.
(5) 양이온 교환 크로마토그래피
다음으로, 버퍼 교환에 의하여 얻어진 시료가 포함된 상기 백에 일회용 SP 양이온 교환 크로마토그래피 시스템 (GE healthcare, SP sepharose FF)을 사용하여 외부와의 접촉없이 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 구체적으로, 상기 포스페이트 버퍼 (75mM pH 5.0)를 상기 SP 양이온 교환 수지가 충진된 컬럼에 흘려주어 평형화하고, 상기 시료를 컬럼을 통하여 흘려 주었다. 이 단계에서 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A 독소는 양이온 교환수지에 흡착된다. 유속은 100 mL/min으로 25분 동안 흘려주고, pH 5.0으로 유지하였다. 그 후 1M NaCl을 포함한 포스페이트 버퍼 (75mM pH 5.0)를 사용하여 용출하였다.
얻어진 시료에 대하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography: SEC-HPLC)를 통하여 독소의 순도를 분석하였다. 이동상은 pH6.5의 40 mM 포스페이트 용액을 사용하였으며, SRT SEC-500 (Sepax Technologies사, P/N 215500) 컬럼을 연결하고 보툴리눔 A형 독소단백질 40 μL를 로딩(loading)하여 0.8 mL/min으로 20분간 흘려주었다.
도 1은 클로스트리디움 보툴리눔 배양액으로부터 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A 독소의 분리 공정을 나타낸 도면이다.
도 2는 양이온교환 크로마토그래피 후에 얻어진 시료에 대하여 SEC-HPLC 한 결과를 나타낸 도면이다.
이름 체류 시간(분) 면적 % 면적
12S 12.306 77163 0.19
19S 9.459 40065228 99.64
HMW1 7.000 - -
HMW2 8.578 127860 0.32
표 1은 도 2의 피크에 대한 데이터를 나타낸 것으로, 타입 A 독소의 순도는 99.64%이었다. 특히, 체류 시간(RT)에서 나타내는 HMW1는 0%로서 존재하지 않았다. 표 1에서 HMW1 및 HMW2는 응집물1 및 응집물2를 나타내고, 12S(300kDa) 및 19S(900kDa)는 각각 BoNT 독소와 비-독성 비-HA(NTNHA)로 구성된 12S 독소 ('M 독소'라고도 함) 및 BoNT, NTNHA 및 HA 성분으로 구성된 16S(500kDa) 독소가 HA 단백질 중 하나인 HA1에 의하여 두 16S 독소가 연결된 디머(dimer)인 것으로 여겨진다. 상기 HA 성분은 3개 다른 단백질 즉, HA1, HA2 및 HA3을 갖는다. 독소 타입A는 12S, 16S 및 19S의 형태를 갖는다.
따라서, 상기한 정제 방법에 의하면, 해리되지 않은 보툴리눔 독소 타입 A의 거대 복합체를 고순도로 분리할 수 있다.

Claims (9)

  1. 보툴리눔 독소 함유 용액을 보툴리눔 독소의 등전점(isoelectric point: PI) 이하의 산도에서 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계;
    상기 매질과 결합하지 않은 상기 용액을 보툴리눔 독소의 등전점 이하의 산도에서 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; 및
    상기 양이온 교환 크로마토그래피 매질로부터 보툴리눔 독소 A형 거대 복합체를 분리하는 단계; 또는
    보툴리눔 독소 함유 용액을 등전점 이하의 산도에서 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 매질로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 단계, 상기 매질에서 분리된 독소를 포함하는 용액을 등전점 이하의 산도에서 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계, 및 상기 매질과 결합하지 않은 상기 용액으로부터 보툴리눔 독소 A형 거대 복합체를 분리하는 단계;를 포함하는, 보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소 A형 거대 복합체를 분리하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 보툴리눔 독소의 등전점 이하의 산도는 pH 3.5 내지 6.0인 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계 전, 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계 전 또는 이 두 단계의 각 단계 전에 상기 보툴리눔 독소 또는 그를 함유하는 용액의 산도를 보툴리눔 독소의 등전점 이하로 조정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 조정하는 단계는 상기 보툴리눔 독소 또는 그를 함유하는 용액을 보툴리눔 독소의 등전점 이하의 산도를 갖는 버퍼와 혼합하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 버퍼는 포스페이트 버퍼, 시트레이트 버퍼, 또는 아세테이트 버퍼인 것인 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 버퍼는 pH 3.5 내지 6.0인 것인 방법.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 버퍼는 10mM 내지 100mM의 포스페이트, 시트레이트 또는 아세테이트를 포함하는 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 DEAE, 또는 Q 음이온 교환 크로마토그래피인 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 CM, S, 또는 SP 양이온 교환 크로마토그래피인 것인 방법.
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