KR101434558B1 - 식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법 - Google Patents

식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101434558B1
KR101434558B1 KR1020110072576A KR20110072576A KR101434558B1 KR 101434558 B1 KR101434558 B1 KR 101434558B1 KR 1020110072576 A KR1020110072576 A KR 1020110072576A KR 20110072576 A KR20110072576 A KR 20110072576A KR 101434558 B1 KR101434558 B1 KR 101434558B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
culture
toxin
medium
glucose
yeast extract
Prior art date
Application number
KR1020110072576A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110091492A (ko
Inventor
정현호
양기혁
김학우
이병국
윤영숙
홍형표
Original Assignee
(주)메디톡스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)메디톡스 filed Critical (주)메디톡스
Priority to KR1020110072576A priority Critical patent/KR101434558B1/ko
Publication of KR20110091492A publication Critical patent/KR20110091492A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101434558B1 publication Critical patent/KR101434558B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 식물 유래 성분 함유 배지를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 가요성 폐쇄 용기를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법을 제공을 제공한다.

Description

식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법{Method of producing clostridium botulinum toxin using a media containing plant derived components and a flexible closed container}
본 발명은 식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법에 관한 것이다.
신경 독성을 지닌 독소를 분비하는 클로스트리디움 균주들이 1890년대에서부터 지금까지 발견되었으며, 지난 70년간 이들 균주들이 분비하는 독소에 대한 특성이 연구되어 왔다(Schant, E. J. 등, Microbiol. Rev. 56; 80; 1992).
클로스트리디움 속은 127종 이상이며, 형태 및 기능에 따라 구분된다. 혐기성, 그람 양성 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔은 사람 및 동물에서 보툴리즘이라는 신경마비 질환을 일으키는, 강력한 폴리펩티드 신경독소를 생산한다. 클로스트리디움 보툴리눔의 포자는 토양에서 발견되며, 제대로 처리되지 않은 식품에서도 다량 배양 될 수 있다. 이러한 것들이 다양하게 보툴리즘의 원인이 되기도 한다.
보툴리눔 독소는 그 혈청학적 특징에 따라 A에서 G까지의 7가지 형으로 나뉘어 진다. 각 독소는 약 150 kDa 정도의 독소 단백질을 가지고 있는데, 자연적으로는 여러 비독성 단백질들과 결합되어 있는 복합체로 이루어져 있다. 중간 복합체 (300 kDa)는 독소 단백질과 비독성-비헤마글루티닌 단백질로 이루어져 있고, 큰 복합체 (500 kDa) 및 거대 복합체 (900 kDa)는 중간 복합체가 헤마글루티닌과 결합되어 있는 형태를 띠고 있다(Sugiyama, H., Microbiol. Rev. , 44, 419; 1980). 이러한 비독성 비헤마글루티닌 단백질들은 장내에서 낮은 pH와 각종 단백질 가수분해 효소로부터 독소를 보호하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다 (Sugiyama, H., Microbiol. Rev., 44, 419; 1980).
독소는 세포 내에서 분자량이 약 150 kDa인 하나의 폴리펩티드로 합성된 후, 세포내 단백질 분해 효소의 작용이나 트립신과 같은 인위적인 효소 처리에 의하여 N말단으로부터 1/3되는 위치에서 절단되어 2개의 단위체인 경쇄 (light chain: 분자량 50 kDa)와 중쇄 (heavy chain: 분자량 100 kDa)로 나뉘어 진다. 이렇게 나뉘어진 독소는 단일 폴리펩티드일 때에 비해 그 독성이 크게 증가한다. 두 단위체는 이황화결합에 의해 서로 연결되어 있으며, 각각은 다른 기능을 갖는다. 중쇄는 표적(target)이 되는 세포의 수용체 (receptor)와 결합하고 (FEMS Microbiol.Lett. 72, 243; 1990), 낮은 pH(pH 4.0)에서 생체막과 반응하여 채널 (channel)을 형성하는 기능을 가지며 (Mantecucco, C. 등, TIBS 18, 324; 1993), 경쇄는 약리활성을 가지고 있어 계면활성제를 사용하여 세포에 투과성을 부여하거나, 전기천공 (electroporation)등으로 세포내 투입되었을 때 신경전달물질의 분비를 방해한다 (Poulain, B. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4090 ; 1988).
보툴리눔 독소 타입 A는 사람에게 알려진 가장 치명적인 천연 생물학제이다. 몰을 기준으로 할때, 보툴리눔 독소 타입 A는 디프테리아 보다 18억배, 시안화 나트륨보다 6억배, 코브로톡신 보다 3천만배, 그리고 콜레라 보다 1천 2백만배 더 치명적이다, Singh, Critical Aspects of Bacterial protein Toxins, page 63-84 of natural toxins II, edited by B.R.Sigh et al., Plenum Press, New York (1976).
독소는 신경근육종말 (neuromuscular junction)의 콜린성 전시냅스 (cholinergic presynapse)에서 아세틸콜린의 엑소시토시스 (exocytosis)를 저해하여 전신 무력증을 일으킨다. 극미량의 독소를 처리해도 독성이 나타나는 것으로 보아 이 독소는 어떤 효소 활성을 가질 것으로 생각되어져 왔다(Simpson, L. L. 등, Ann. Rev. Pharmaeol. Toxicol. 26, 427; 1986). 최근 밝혀진 바에 의하면, 독소는 메탈로펩티다제 활성 (metallopeptidase activity)을 가지고 있으며, 그 기질은 엑소사이토시스 장치 복합체 (exocytosis machinary complex)를 이루는 단위 단백질들인 시냅토브레빈 (synaptobrevin), 신택신 (syntaxin), 25 kDa의 시냅토좀 연계 단백질 (synaptosomal associated protein of 25 kDa) (SNAP 25)등이다. 각 형의 독소는 이 세가지 단백질들 중 하나를 기질로 삼고 있는데, B, D, F 및 G형은 시냅토브레빈을, A와 E형은 SNAP25를, C형은 신택신을 특정부위에서 절단하는 것으로 알려져 있다 (Binz, T. 등, J. Biol. Chem.265, 9153; 1994).
국제특허공개 제WO06/096163에는 시드 배양 및 본 배양을 질소 하에서 수행하고, 독소 단백질을 발현하기 위해 pH를 5~5.5로 조정하고 있다. 또한, 여러 단계의 크로마토그래피 공정을 수행하고, 재사용가능한 장비 및 소모품을 사용하여 세척 및 멸균을 실시해야 한다. 이러한 시스템은 cGMP (공인된 우수 의약품 제조기준)을 맞추는데 많은 인력과 투자비용, 위험요소 존재하게 된다.
이에 본 발명자들은 식물유래 성분을 조합을 사용하여, 클로스트리디움 보툴리눔 독소가 세포 외로 다량 발현된다는 것을 발견하고, 또한, 일회용 생물반응기를 이용하여 절대 혐기균인 클로스트리디움 보툴리눔 균을 이용한 발효 공정을 통하여 보툴리눔 독소를 효과적으로 생산할 수 있다는 것을 발견하였다. 그리고, 세포가 제거된 배양액으로부터 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 용이하고 매우 간단하게 정제할 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 식물 유래 성분 함유 배지를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 가요성 폐쇄 용기를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 (a) 식물 유래 성분 함유 배지 중에서 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)을 배양하여, 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 세포 외로 발현시키는 단계; 및 (b) 얻어진 배양물로부터 세포를 제거하여 세포 외에 발현된 클로스트리디움 보툴리눔 독소가 포함된 부분을 얻고, 상기 부분으로부터 상기 독소를 분리하는 단계:를 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은, (a) 식물 유래 성분 함유 배지 중에서 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)을 배양하여, 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 세포 외로 발현시키는 단계를 포함한다. 본 단계는 식물 유래 성분 함유 배지를 사용하여 배양함으로써, 종래 알려진 바와는 달리, 세포 외로 독소를 발현시키는 것에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, "세포 외로 독소를 발현시킨다"라는 표현의 의미는 세포가 독소를 세포 내에서 생산한 후 자발적으로 세포 외부로 배출하는 것뿐만 아니라, 세포 내부에 발현된 독소를 포함하는 세포가 파쇄 (lysis)되어 독소가, 배양물 중의 세포 내부가 아닌, 배양물의 용액 부분에 노출되는 것을 포함한다.
상기 식물 유래 성분 함유 배지는 피톤 펩톤 (phytone peptone)을 함유하는 것, 바람직하게는, 피톤 펩톤, 효모 추출물 (yeast extract), 및 포도당을 포함하는 것일 수 있다. 이에 대하여, 상기 식물 유래 성분 함유 배지는 식물 트립톤 (vegetable tryptone), 소이톤 (soytone), 및 소듐 티오글리콜레이트 (sodium thioglycolate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 더 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 식물 유래 성분 함유 배지는 포도당, 효모 추출물 및 피톤 펩톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤 및 식물 트립톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤 및 소이톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 소이톤 및 식물 트립톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 소듐 티오글리콜레이트, 피톤 펩톤, 식물 트립톤 및 소이톤을 포함하는 배지; 및 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤, 식물 트립톤 및 소이톤을 포함하는 배지;로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 식물 유래 성분 함유 배지로서 열거된 각 배지 중의 포도당, 효모 추출물, 소듐 티오글리콜레이트, 피톤 펩톤, 식물 트립톤, 및 소이톤의 함량은 중량 기준으로 각각 0.2% 내지 2%, 0.5% 내지 3%, 0.05% 내지 2%, 0.5% 내지 2%, 0.5% 내지 2%, 및 0.5% 내지 2%인 것일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 식물 유래 성분 함유 배지는 포도당, 효모 추출물 및 피톤 펩톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤 및 식물 트립톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤 및 소이톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 소이톤 및 식물 트립톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 소듐 티오글리콜레이트, 피톤 펩톤, 식물 트립톤 및 소이톤을 포함하는 배지; 및 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤, 식물 트립톤 및 소이톤을 포함하는 배지;로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로, 상기 열거된 각 배지 중의 포도당, 효모 추출물, 소듐 티오글리콜레이트, 피톤 펩톤, 식물 트립톤, 및 소이톤의 함량은 중량 기준으로 각각 0.2% 내지 2%, 0.5% 내지 3%, 0.05% 내지 2%, 0.5% 내지 2%, 0.5% 내지 2%, 및 0.5% 내지 2%이고, 나머지는 물로 구성되는 것일 수 있다.
상기 독소는 보툴리눔 독소 A, B, C, D, E, F 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 타입 A 독소이다.
(a) 단계의 배양은, 입구와 출구가 구비된 가요성 재질로 구성된 폐쇄 용기에 배양 배지 및 클로스트리디움 보툴리눔을 접종하고 배양하는 것일 수 있다. 상기 폐쇄 용기는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 상업적으로 구입가능하다 (예, CultibagTM: Wave Biotech 사). 예를 들면, 상기 폐쇄 용기는 국제특허공개 제WO00/66706호에 개시되어 있는 것일 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 상기 폐쇄 용기는 미리 멸균되어 있고, 백의 형태, 예를 들면 플라스틱 백의 형태를 갖는 것일 수 있다.
상기 폐쇄 용기는 흔들기 운동 (rocking motion)에 의하여 교반되는 것일 수 있다. 이러한 흔들기 운동은 상기 폐쇄 용기가 올려지는 플랫폼과 이 플랫폼을 진동 (oscillation) 축을 중심으로 흔들어주는 락커 (rocker)에 의하여 이루어질 수 있다. 이러한 락커는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, Cultibag (Wave Biotech 사 또는 Sartorius 사)의 일부로서 구매될 수 있다. 상기 폐쇄 용기는 공기 불투과성 (air impermeable)이어서, 배양 배지 및 세포가 접종시점에서 배양이 완료될 때까지 그 내부가 산소가 공급되지 않는 조건으로 유지될 수 있다.
따라서, 상기 배양은 혐기성을 유지하기 위하여, 질소의 공급, 산소제거 활성을 가진 화학물질 (예를 들면, 소듐 티오글리콜레이트)의 사용 또는 pH 조절 없이 이루어지는 것일 수 있다. 상기 배양은 흔들기 운동에 의한 교반이 이루어지거나, 교반이 없는 상태에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법은, 또한, (b) 얻어진 배양물로부터 세포를 제거하여 세포 외에 발현된 클로스트리디움 보툴리눔 독소가 포함된 부분을 얻고, 상기 부분으로부터 상기 독소를 분리하는 단계:를 포함한다. 본 단계는 세포가 제거된 배양액 중에 존재하는 독소를 분리하는 것으로, 용액 중에 포함되어 있는 독소를 분리하는 종래 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다.
일 구체예에서, (b) 단계는, (b-1) 배양물로부터 세포를 제거하고 얻어진 배양액에 산을 첨가하여 독소를 침전시킨 다음 침전물을 분리하는 단계; (b-2) 상기 분리된 침전물을 매질 중에 용해시키고 한외여과하는 단계 및 (b-3) 여과된 시료를 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
(b-1) 단계에서, 세포의 제거는 심층 여과 (depth filtration) 및 마이크로여과 (microfiltration)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 여과에 의하여 이루어지고, 독소의 침전은 산을 첨가하여 배양액을 pH 3 내지 4로 유지하여 이루어지는 것일 수 있다. 상기 산은 황산, 염산, 빙초산을 포함한, 아세트산 등이 될 수 있다.
(b-2) 단계에서, 한외여과는 분자량 컷오프 100kDa 이하의 막을 사용하여 이루어지는 것일 수 있다. 침전물의 용해는 버퍼 예를 들면, 10mM 내지 50mM 시트레이트 버퍼 (pH 5.0 내지 pH 6.0)를 사용하여 이루어질 수 있다.
상기 (b-3) 단계에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 덱스트란, 아가로즈 물질을 기초로 한 DEAE, Q 세파로즈, 또는 Q 세파덱스를 사용한 것일 수 있으며, 용출은 NaCl을 사용하지 않고 시트레이트 버퍼만을 사용해서 용출하는 방법에 의하여 이루어질 수 있다.
다른 구체예에서, (a) 단계 및 (b) 단계는 하나 이상의 단계가 미리 멸균된 1회용 용기를 사용하여 이루어지고, 각 단계에서 시료가 이동되는 용기의 내부 공간과 작업자가 작업을 하는 상기 용기의 외부 공간은 소통 없이 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 통상의 개방된 시스템에서 배양물로부터 세포를 제거하는 것은, 원심분리 또는 여과에 의하여 수행될 수 있는데, 이 경우 배양물을 원심분리 용기 또는 여과기에 도입하는 과정 및 원심분리 및 여과 후 시료를 회수하는 과정에서 시료가 외부 공간에 노출되는 경우가 발생한다. 또한, 통상의 개방된 시스템에서 침전, 한외여과 및 크로마토그래피는, 시료를 침전, 한외여과 및 크로마토그래피를 위하여 반응용기, 한외여과기 및 크로마토그래피 칼럼에 도입하는 과정 및, 침전, 한외 여과 및 크로마토그래피 후 시료를 회수하는 과정에서 시료가 외부 공간에 노출되는 경우가 발생한다. 본원 발명은, 상기한 (a) 단계 및 (b) 단계의 하나이상의 단계가 멸균된 일회용 용기를 사용하여, 용기와 용기가 용기 외부와 접촉이 없는 상태가 되도록 연결된 상태에서 수행될 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 입구와 출구가 구비된 가요성 재질로 구성된 폐쇄 용기에 배양 배지 및 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)을 접종하고 배양하여, 보툴리눔 독소를 배양물 중에 발현시키는 단계; 및 (b) 얻어진 배양물로부터 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 분리하는 단계:를 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은, (a) 입구와 출구가 구비된 가요성 재질로 구성된 폐쇄 용기에 배양 배지 및 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)을 접종하고 배양하여, 보툴리눔 독소를 배양물 중에 발현시키는 단계를 포함한다.
상기 폐쇄 용기는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 상업적으로 구입가능하다 (예, CultibagTM: Wave Biotech 사). 예를 들면, 상기 폐쇄 용기는 국제특허공개 제WO00/66706호에 개시되어 있는 것일 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 상기 폐쇄 용기는 미리 멸균되어 있고, 백의 형태, 예를 들면 플라스틱 백의 형태를 갖는 것일 수 있다.
상기 폐쇄 용기는 흔들기 운동 (rocking motion)에 의하여 교반되는 것일 수 있다. 이러한 흔들기 운동은 상기 폐쇄 용기가 올려지는 플랫폼과 이 플랫폼을 진동축 (oscillation) 축을 중심으로 흔들어주는 락커 (rocker)에 의하여 이루어질 수 있다. 이러한 락커는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, CultibagTM (Wave Biotech 사 또는 Sartorius 사)의 일부로서 구매될 수 있다. 상기 폐쇄 용기는 공기 불투과성 (air impermeable)이서, 배양 배지 및 세포가 접종시점에서 배양이 완료될 때까지 그 내부가 산소가 공급되지 않는 조건으로 유지될 수 있다.
따라서, 상기 배양은 혐기성을 유지하기 위하여, 질소의 공급, 산소제거 활성을 가진 화학물질 (예를 들면, 소듐 티오글리콜레이트)의 사용 또는 pH 조절 없이 이루어지는 것일 수 있다.
상기 배지는 클로스트리디움 보툴리눔의 배양에 사용되는 종래 알려진 배지가 사용될 수 있다. 상기 배지는 동물 유래 성분 함유 배지, 식물 유래 성분 함유 배지 및 둘 모두를 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는 식물 유래 성분 함유 배지를 사용하는 것이다.
일 구체예에서, 상기 식물 유래 성분 함유 배지는 피톤 펩톤 (phytone peptone), 효모 추출물 (yeast extract), 및 포도당을 포함하는 것일 수 있다. 이에 대하여, 상기 식물 유래 성분 함유 배지는 식물 트립톤 (vegetable tryptone), 소이톤 (soytone), 및 소듐 티오글리콜레이트 (sodium thioglycolate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 더 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 식물 유래 성분 함유 배지는 포도당, 효모 추출물 및 소듐 티오글리콜레이트를 포함하는 배지에 피톤 펩톤, 식물 트립톤, 및 소이톤으로 구성된 군으로부터 선택된 2이상의 성분을 더 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물 및 소듐 티오글리콜레이트를 포함하고 피톤 펩톤, 식물 트립톤 및 식물 트립톤은 포함하는 배지; 및 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤, 식물 트립톤 및 소이톤을 포함하는 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 식물 유래 성분 함유 배지로서 열거된 각 배지 중의 포도당, 효모 추출물, 소듐 티오글리콜레이트, 피톤 펩톤, 식물 트립톤, 및 소이톤의 함량은 중량 기준으로 각각 0.2% 내지 2%, 0.5% 내지 3%, 0.05% 내지 2%, 0.5% 내지 2%, 0.5% 내지 2%, 및 0.5% 내지 2%인 것일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 식물 유래 성분 함유 배지는 포도당, 효모 추출물 및 소듐 티오글리콜레이트를 포함하는 배지에 피톤 펩톤, 식물 트립톤, 및 소이톤으로 구성된 군으로부터 선택된 2이상의 성분 및 물로 이루어진 배지; 포도당, 효모 추출물 및 소듐 티오글리콜레이트, 및 물로 구성되고 피톤 펩톤, 식물 트립톤 및 식물 트립톤은 포함하지 않는 배지; 및 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤, 식물 트립톤, 소이톤 및 물로 이루어진 배지;로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로, 상기 열거된 각 배지 중의 포도당, 효모 추출물, 소듐 티오글리콜레이트, 피톤 펩톤, 식물 트립톤, 및 소이톤의 함량은 중량 기준으로 각각 0.2% 내지 2%, 0.5% 내지 3%, 0.05% 내지 2%, 0.5% 내지 2%, 0.5% 내지 2%, 및 0.5% 내지 2%이고, 나머지는 물로 구성되는 것일 수 있다.
상기 독소는 보툴리눔 독소 A, B, C, D, E, F 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 타입 A 독소이다.
상기한 바와 같이 식물 유래 배지 성분을 사용하는 경우, 상기 독소는 세포외로 분비된다. 이 경우, 세포가 제거된 배양액 중에 존재하는 독소를 분리하는 것으로, 용액 중에 포함되어 있는 독소를 분리하는 종래 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다.
일 구체예에서, (b) 단계는, (b-1) 배양물로부터 세포를 제거하고 얻어진 배양액에 산을 첨가하여 독소를 침전시킨 다음 침전물을 분리하는 단계; (b-2) 상기 분리된 침전물을 매질 중에 용해시키고 한외여과하는 단계 및 (b-3) 여과된 시료를 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
(b-1) 단계에서, 세포의 제거는 심층 여과 (depth filtration) 및 마이크로여과 (microfiltration)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 여과에 의하여 이루어지고, 독소의 침전은 산을 첨가하여 배양액을 pH 3 내지 4로 유지하여 이루어지는 것일 수 있다. 상기 산은 황산, 염산, 빙초산을 포함한, 아세트산 등이 될 수 있다.
(b-2) 단계에서, 한외여과는 분자량 컷오프 100kDa 이하의 막을 사용하여 이루어지는 것일 수 있다. 침전물의 용해는 버퍼 예를 들면, 10mM 내지 50mM 시트레이트 버퍼 (pH 5.0 내지 pH 6.0)를 사용하여 이루어질 수 있다.
상기 (b-3) 단계에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 덱스트란, 아가로즈 물질을 기초로 한 DEAE, Q 세파로즈, 또는 Q 세파덱스를 사용한 것일 수 있으며, 용출은 NaCl을 사용하지 않고 시트레이트 버퍼만을 사용해서 용출하는 방법에 의하여 이루어질 수 있다.
다른 구체예에서, (a) 단계 및 (b) 단계는 하나 이상의 단계가 미리 멸균된 1회용 용기를 사용하여 이루어지고, 각 단계에서 시료가 이동되는 용기의 내부 공간과 작업자가 작업을 하는 상기 용기의 외부 공간은 소통 없이 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 통상의 개방된 시스템에서 배양물로부터 세포를 제거하는 것은, 원심분리 또는 여과에 의하여 수행될 수 있는데, 이 경우 배양물을 원심분리 용기 또는 여과기에 도입하는 과정 및 원심분리 및 여과 후 시료를 회수하는 과정에서 시료가 외부 공간에 노출되는 경우가 발생한다. 또한, 통상의 개방된 시스템에서 침전, 한외여과 및 크로마토그래피는, 시료를 침전, 한외여과 및 크로마토그래피를 위하여 반응용기, 한외여과기 및 크로마토그래피 칼럼에 도입하는 과정 및, 침전, 한외 여과 및 크로마토그래피 후 시료를 회수하는 과정에서 시료가 외부 공간에 노출되는 경우가 발생한다. 본원 발명은, 상기한 (a) 단계 및 (b) 단계의 하나이상의 단계가 멸균된 일회용 용기를 사용하여, 용기와 용기가 용기 외부와 접촉이 없는 상태가 되도록 연결된 상태에서 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)은 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산할 수 있는 것이며, 예를 들면 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)의 타입 A의 HallA (ATCC 지정번호 3502)가 포함될 수 있다
클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)의 배양 조건은 당업계에 알려진 통상의 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 배양 온도는 33℃ 내지 40℃에서 배양되는 것일 수 있다. 본 발명의 방법에 의하면, 배양기 주변의 작업 환경은 통상의 작업 환경과 동일한 것으로 별도의 무균 환경을 만들어주거나, 세척할 필요가 없다.
본 발명의 방법에 있어서, 각 단계는 1회용 물질(single use consumable)을 사용하여 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 세포 제거에 사용되는 원심분리 또는 여과 시스템으로서 여과 시스템 (일회용 심층여과 및 마이크로필터)을 사용하고, 침전 시스템으로서 외부와 접촉이 없는 일회용 시스템을 사용하고, 한외여과 및 크로마토그래피 시스템으로서 일회용 한외여과 및 크로마토그래피 시스템을 사용하여 이루어질 수 있다. 또한, 시료의 이송에 있어서도, 일회용 시료 전달 시스템을 사용하는 것일 수 있다. 이렇게 함으로써, 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)의 오염에 의한 위험요소를 배제할 수 있다.
본 발명의 방법에 의하면, 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 세포 외로 발현시키므로, 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 용이하고 매우 간단하게 정제 생산할 수 있다. 그리고 혐기성 조건을 맞추기 위해 질소 배분 혹은 기타 장비를 사용할 필요없이 일반 작업 환경에서도 클로스트리디움 보툴리눔 균을 이용하여 발효공정을 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의하면, 일회용 소모품을 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 균의 배양과 정제 공정이 밀폐된 시스템에서 수행되므로, 클로스트리디움 보툴리눔 균과 독소가 위치하는 용기의 내부와 작업자의 작업이 이루어지는 용기의 외부가 서로 노출되는 경우가 없으므로, 안전하게 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산할 수 있다. 또한, 종래기술에서 기술된 복잡하게 제어되는 발효 정제 시스템을 활용하지 않더라도 고순도의 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 무 동물 유래 성분 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A 독소를 세포 외로 다량 발현하는 배지조성 확인
본 실시예에서는 무 동물 유래 성분 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A 독소가 클로스트리디움 보툴리눔의 세포 외로 다량 발현된다는 것을 다양한 식물 배지를 사용하여 확인하였다. 사용된 배지는 다음 표 1과 같다.
배지 1 2 3 4 5 6 7 8
성분 및 함량
(중량%)




 소이톤 1% 0 0 0 O 0
식물 트립톤 1% 0 0 0 O 0
피톤 펩톤 1% 0 0 0 O 0
소듐 티오글리콜레이트 0.05% 0
효모 추출물 1% 0 0 0 0 0 0 0 0
포도당 0.5% 0 0 0 0 0 0 0 0
표 1에서, 소이톤, 및 식물 트립톤은 각각 Beckton Dickinson과 Fluka 사의 제품을 사용하였으며, 피톤 펩톤 및 효모 추출물은 Beckton Dickinson 사 제품을 사용하였고, 포도당은 Merck 사의 제품을 사용하였다. 표 1의 배지 성분을 주사용수 (Water For Injection : WFI)에 녹이고, NaOH를 이용해 pH를 7.2로 조정하였다.
또한, 대조군으로써 N-Z 아민 A (Sigma: 동물 유래) 1중량%, 박토 프로테오즈 펩톤 #2 (Bacto Proteose Peptone # 2: 돼지 유래) 2중량%, 박토 효모 추출물 (Bacto Yeast Extract) (BD) 1중량%, 포도당 1중량%, 및 소듐 티오글리콜레이트 (Sigma) 0.05중량%를 물에 용해시킨 것을 사용하였다 (이하 동물 유래 배지 또는 대조군 배지라 함).
이렇게 준비된 각 배지 200ml를 멸균된 일회용 마이크로여과 시스템 (single use microfiltration system: 0.2㎛ Sartorius 2, Sartorius 사)을 통하여 여과하여 CultibagTM (WaveBiotech사 제품, 일회용 발효 백)에 주입하고, 여기에 클로스트리디움 보툴리눔 106 ~ 107세포/ml 농도의 시드 배양액 1ml를 시료 주입 포트를 통하여 접종하였다. CultibagTM 은 낮은 전단 응력에서 혼합을 일으키기 위하여 락킹 운동 (rocking motion)을 사용하는 일회용 생물반응기 (disposable bioreactor)이다. CultibagTM은 공기 입구 및 출구 및 시료 포트가 형성되어 있는 가요성 (flexible) 재질의 백으로서 구성되어 있으며, 상기 백의 재질을 통하여 공기가 통과할 수 없다 (air impermeable). 또한, 상기 백에는 결합된 공기 펌프가 구비되어 있어 백 부풀리기 (bag inflation) 및 세포 공급을 위하여 사용된다. 사용된 백은 1 L 용량을 갖는 것이었다.
배양은 200mL 종 배양액을 포함하는 1L CultibagTM을 CultibagTM에 포함되어 있는 락커 (rocker unit)를 사용하여 10rpm으로 락킹하면서, 37℃에서 12 내지 24시간 동안 종 배양하고, 이를 본 배양 배지 20L를 포함하고 있는 상기 백에 폴리카보네이트 재질의 멸균 일회용 커넥터 (Kleenpack connector PALL)를 통하여 접종한 뒤 48~72시간 동안 별도의 혐기 유지 조건 없이, 배양하였다. 상기 백의 시료 주입 포트에 제균 필터 (0.2㎛)를 설치하고 이를 통해 종 배양 배지 200mL를 상기 백으로 주입하였다. 배지의 주입은 페리스탈틱 펌프를 사용하여 수행되었다.
상기 종 배양 배지는 상기 백에 헤드 공간 (headspace)없이 주입하여 혐기 조건이 유지되도록 주입되었다. 상기 종 배양액을 주입할 때에도 동일하게 주입하였다. 또한, 상기 본 배양은 상기 백을 CultibagTM의 락커 (Rocker unit)의 플랫폼에 올려놓고, 온도 37℃로 유지하면서 10rpm으로 락킹 (rocking)하였다. 배양 중 백 내부를 혐기 조건으로 유지하기 위하여 별도의 질소 퍼징이나, 혐기 조건을 위한 시약을 사용하지 않았다.
배양이 종료된 후, 상기 백의 시료 포트에 멸균 커넥터인 QDC connector (사토리우스 제품)를 연결하고, 이를 통하여 배양물을 다른 일회용 백 (가요성 일회용 백)으로 이송하였다. 다음으로, 배양물이 포함되어 있는 일회용 용기에 멸균 일회용 심층여과 (Depthfilter, Sartoclear 또는 SupraCap, PALL) 및 마이크로여과기 (0.2㎛, Sartopore 2, Sartorius)을 연결하고, 이를 통하여 여과하여 세포를 제거하고, 이를 통해 얻어진 상등액은 또 다른 일회용 백에 담았다. 얻어진 상등액을 버퍼 (gelatin phosphate buffer: GPB) (0.2% 젤라틴 함유 30mM 소듐 포스페이트 pH 6.2)로 지정된 배수로 희석한 희석액 0.1ml를 각각 10마리의 생쥐 (ICR 암컷 4주령)의 복강에 주사하고, 3일 후에 죽은 생쥐의 수를 측정하였다. 그 결과는 아래 표 2와 같다.
배지
 배양물 상등액 희석 비율 및 사망률(%)
10-4 10-4 10-5
배지 1 100 100 -
배지 2 100 100 -
배지 3 100 100 -
배지 4 100 100 -
배지 5 100 100 -
배지 6 100 - -
배지 7 100 - -
배지 8 100 100 -
동물배지 100 - -
표 2에 나타낸 바와 같이, 식물 배지, 배지 1 내지 5 및 배지 8은 배양물 중에서 세포를 제거한 상등액의 독성이 동물 배지에 비하여 약 10 정도 강한 것으로 나타났다. 따라서, 식물 유래 성분 함유 배지를 사용하는 경우, 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A 독소가 세포 외로 많은 양 배출될 수 있다는 것을 발견하였다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 효모 추출물, 포도당은 클로스트리디움 보툴리눔의 생육에 통상적으로 요구되는 성분임을 고려할 때, 타입 A 독소가 세포 외로 발현되도록 하는 것은, 피톤 펩톤, 또는 소이톤 및 식물 트립톤이 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 따라서, 경제적인 측면에서는 소이톤 및 식물 트립톤의 조합에 비하여 피톤 펩톤 하나의 성분을 사용하는 것이 유리하므로, 피톤 펩톤을 효모 추출물, 포도당 및 소듐 티오글리콜레이트와 조합하여 사용하는 것이 가장 바람직한 것으로 여겨진다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 동물유래 배지를 사용한 것보다, 식물유래 성분 함유 배지 (배지 1-5, 및 8)를 이용하여 발효한 것이 발효 상등액 내에 보다 많은 양의 보툴리눔 독소 단백질이 존재하고 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은, 식물 유래 성분 함유 배지를 사용하는 경우, 보툴리눔 독소 단백질이 세포 외부로 배출되어, 복잡한 정제 단계를 거치지 않아도 되는 놀라운 효과를 발견하였다.
표 2의 결과는 세포를 제거한 배양액을 시료로 하여 SDS-PAGE 결과로부터 얻어진 결과가 동일하였다 (데이터는 나타내지 않음).
이상과 같이, 실시예 1에서는 식물 유래 배지 성분 사용함으로써 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A 독소가 동물 배지를 사용하는 것에 비하여 많은 양이 세포 외로 다량 발현될 수 있는 배지 조성이 존재한다는 놀라운 사실을 확인하였다.
이하에서는 세포를 제거한 배양액으로부터 타입 A 독소를 생산하는 방법에 대하여 구체적으로 설명한다.
클로스트리디움 보툴리눔 타입균들은 절대혐기 균으로서 혐기성 대기조건이 형성되지 않으면, 균의 성장은 물론 독소 산물을 발현하지도 않는다. 종래 기술에 의하면, 혐기성 대기 조건을 만들어 주기 위해서 다음과 같은 세 가지 방법을 따로 혹은 혼용하여 사용하고 있다. 첫째, 멸균을 활용한 방법, 둘째, 화학물질을 이용한 방법 (예: 소듐 티오글리콜레이트), 셋째, 질소가스를 퍼징하여 산소가 없는 대기 상태유지 하는 방법을 활용하였다. 그러나, 이러한 방법들은 장비를 구비하여야 하며, 또한 잔류물이 발생할 수 있다는 문제점이 있다. 이는 GMP (good manufacturing process) 및 BSL 3 (biosafety level 3) 실험실을 구축하는데 큰 위험 요소로 작용할 가능성이 있다. 그러나, 본 발명의 실시예에서는 식물 유래 성분 함유 배지 및/또는 일회용 생물반응기를 사용하는 경우, 위의 3가지 방법을 전혀 사용하지 않아도 산소와의 접촉을 없앨 수 있다는 것을 발견하였다 (배지 5 참조). 또한, 클로스트리디움 보툴리눔 균의 고유한 특성인 독소 단백질의 생산도 문제없는 것을 발견하였다.
또한, 앞서 언급한 선행기술에서 독소 단백질 생산을 위해 pH를 강제적으로 낮춰 주는 단계를 필요로 했으나, 본 발명에서는 놀랍게도 그러한 조작 없이 순수 발효만을 통해서 다량의 독소 단백질이 세포 외부로 발현, 생산될 수 있음을 발견하였다.
실시예 2
본 실시예에서는 CultibagTM을 사용하여 배양하는 과정에서 락킹을 하지 않을 것을 제외하고는, 실시예1의 과정과 동일하게 진행하였다.
그 결과, 생산된 독소의 양은 실시예 1의 결과와 실질적으로 차이가 없었다.
실시예 3: 식물유래 성분 함유 배지를 이용한 발효액으로부터 세포를 제거한 배양액에서 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A 독소의 분리
본 실시예에서는 실시예 1 또는 2의 배지 5를 배지조성을 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하고, 세포를 제거한 상등액으로부터 타입 A 독소를 분리하였다. 배양 조건 및 시간, 및 세포 제거 공정은 실시예 1에 나타낸 바와 같다.
배양 상등액 .20L가 포함되어 있는 백에 0.1N 황산을 첨가하여 pH를 3.0 내지 4.5로 조정하여, 독소 단백질을 침전시켰다. 이 공정 역시 외부와의 접촉 없이 일회용 용기 (disposable sample bag) 내에서 모든 작업이 이루어졌다.
다음으로, 침전이 완료되면, 멸균된 일회용 여과 시스템 (disposable slice 200 0.2㎛ 필터: Sartorius 사)을 통하여 외부와 접촉없이 여과하여 상등액을 제거하고, 침전물을 일회용 백 (sample bag, disposable)에 회수하였다. 회수된 침전물에 주사용수(WFI) 10L를 첨가하여 황산을 씻어주고, 멸균된 일회용 마이크로여과 시스템 (disposable slice 200 0.2㎛ 필터)을 상기 백에 연결하고 여과하여 상등액을 제거함으로써, 침전물을 일회용 백 내로 회수하였다.
회수된 침전물에 시트레이트 버퍼 (25mM pH 5.5) 10L를 첨가하여, 침전물에 있는 독소 단백질을 재용해시켰다. 이 공정 역시 일회용 백에서 작업하였으며, 외부와의 접촉은 일어나지 않았다. 재용해된 시료가 포함되어 있는 백에 멸균된 일회용 여과 시스템 (0.2㎛, ULTA Cap HC, GE, 미국)을 연결하고 외부와 접촉없이 여과하여 상등액을 멸균된 일회용 백에 취하고, 불용성 불순물들은 제거하였다.
불용성 불순물들이 제거된 시료가 포함되어 있는 상기 백에 분자량 컷오프 100 kDa의 멸균된 일회용 한외여과 막 (disposable slice 200 100kDa: Sartorius 사)을 연결하고, 외부와의 접촉없이 여과하여 농축하고, 시트레이트 버퍼 (25mM pH 5.5)를 사용하여 버퍼 교환을 실시하였다. 이 과정 역시, 독소 단백질은 무균 용기의 내부 표면과 접촉하고 있었으며, 외부와의 접촉은 일어나지 않았다.
다음으로, 농축 및 버퍼 교환이 완료된 시료가 포함된 상기 백에 일회용 DEAE 크로마토그래피 시스템 (DEAE BPG columnTM: GE Healthcare)과 멸균된 일회용 막 크로마토그래피 시스템 (Sartobind DTM: Sartorius)을 순차로 연결하여 외부와의 접촉없이 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피 및 막 크로마토그래피를 수행하였다. 일회용 크로마토그래피 시스템은 세척된 것으로, 시료를 로딩한 후 칼럼에 결합하지 않고 흘러나오는 것을 회수하였다. 그 결과, 외부와의 접촉 없이 불순물을 제거하고, 고순도의 타입 A 독소 단백질을 회수하였다. 그 결과, 본 발명의 실시예에 기재된 식물 유래 성분을 함유하는 배지에서 정제된 타입 A 독소 생산량은 대조군으로 사용된 동물 배지에 비하여, 약 5 내지 10배 증가하였다.
이상과 같은 각 단계에서 얻어진 시료는 SDS-PAGE와 SEC-HPLC를 통하여 분석하였다. 최종 정제 결과, 순도 95% 이상의 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A를 얻었다. 따라서, 세포를 제거한 배양액으로부터 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A를 고순도 및 높은 생산성으로 생산할 수 있었다.
SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 결과, 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A는 8개 단백질의 복합체로서, 본 발명의 방법에 따라 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A가 고순도 및 고생산성으로 생산될 수 있음을 알 수 있다 (데이터는 나타내지 않음).

Claims (11)

  1. (a) 입구와 출구가 구비된 가요성 재질로 구성된 폐쇄 용기에 배양 배지 및 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)을 접종하고 배양하여, 보툴리눔 독소를 배양물 중에 발현시키는 단계; 및
    (b) 얻어진 배양물로부터 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 분리하는 단계;를 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법으로서,
    (a) 단계 및 (b) 단계는 하나 이상의 단계가 미리 멸균된 1회용 용기를 사용하여 용기와 용기가 외부와 접촉이 없는 상태가 되도록 연결된 상태에서 수행되는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폐쇄 용기는 미리 멸균되어 있고, 백의 형태를 갖는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폐쇄 용기는 흔들기 운동 (rocking motion)에 의하여 교반되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폐쇄 용기는 공기 불투과성 (air impermeable)인 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배양은 혐기성을 유지하기 위하여, 질소의 공급, 산소제거 활성을 가진 화학물질의 사용 또는 pH 조절 없이 이루어지는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지는 포도당, 효모 추출물 및 피톤 펩톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤 및 식물 트립톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤 및 소이톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 소이톤 및 식물 트립톤을 포함하는 배지; 포도당, 효모 추출물, 소듐 티오글리콜레이트, 피톤 펩톤, 식물 트립톤 및 소이톤을 포함하는 배지; 및 포도당, 효모 추출물, 피톤 펩톤, 식물 트립톤 및 소이톤을 포함하는 배지;로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 배양 배지로서 열거된 각 배지 중의 포도당, 효모 추출물, 소듐 티오글리콜레이트, 피톤 펩톤, 식물 트립톤, 및 소이톤의 함량은 중량 기준으로 각각 0.2% 내지 2%, 0.5% 내지 3%, 0.05% 내지 2%, 0.5% 내지 2%, 0.5% 내지 2%, 및 0.5% 내지 2%인 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 독소는 보툴리눔 독소 A, B, C, D, E, F 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, (b) 단계는,
    (b-1) 배양물로부터 세포를 제거하고 얻어진 배양액에 산을 첨가하여 독소를 침전시킨 다음 침전물을 분리하는 단계;
    (b-2) 상기 분리된 침전물을 매질 중에 용해시키고 한외여과하는 단계 및
    (b-3) 여과된 시료를 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계;를 포함하는 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, (b-1) 단계에서, 세포의 제거는 심층 여과 (depth filtration) 및 마이크로여과 (microfiltration)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 여과에 의하여 이루어지고, 독소의 침전은 산을 첨가하여 배양액을 pH 3 내지 4로 유지하여 이루어지는 것이고, (b-2) 단계에서, 한외여과는 분자량 컷오프 100kDa 이하의 막을 사용하여 이루어지는 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법.
  11. 삭제
KR1020110072576A 2011-07-21 2011-07-21 식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법 KR101434558B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110072576A KR101434558B1 (ko) 2011-07-21 2011-07-21 식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110072576A KR101434558B1 (ko) 2011-07-21 2011-07-21 식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020080046152A Division KR20090120222A (ko) 2008-05-19 2008-05-19 식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110091492A KR20110091492A (ko) 2011-08-11
KR101434558B1 true KR101434558B1 (ko) 2014-08-27

Family

ID=44928864

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110072576A KR101434558B1 (ko) 2011-07-21 2011-07-21 식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101434558B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101339349B1 (ko) * 2013-08-02 2013-12-09 주식회사 대웅 보툴리눔 독소의 제조방법
KR20240041474A (ko) * 2022-09-23 2024-04-01 (주)제테마 보툴리눔 독소 생산성을 증가시키는 방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6673598B1 (en) * 2002-10-29 2004-01-06 Synthecon, Inc. Disposable culture bag
KR20070116710A (ko) * 2005-03-03 2007-12-11 알러간, 인코포레이티드 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 동물 산물이 없는 시스템및 프로세스

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6673598B1 (en) * 2002-10-29 2004-01-06 Synthecon, Inc. Disposable culture bag
KR20070116710A (ko) * 2005-03-03 2007-12-11 알러간, 인코포레이티드 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 동물 산물이 없는 시스템및 프로세스

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110091492A (ko) 2011-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2733216B1 (en) Method of producing clostridium botulinum toxin using media containing plant-derived components and flexible closed container
US11326155B2 (en) Process and system for obtaining botulinum neurotoxin
KR102485898B1 (ko) 보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 방법
JP5518024B2 (ja) 動物由来産物不含方法およびボツリヌス毒素を精製するための方法
KR101434558B1 (ko) 식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170704

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180816

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190624

Year of fee payment: 6