KR20070116710A - 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 동물 산물이 없는 시스템및 프로세스 - Google Patents

보툴리눔 독소를 정제하기 위한 동물 산물이 없는 시스템및 프로세스 Download PDF

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KR20070116710A
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후이 시앙
밍지앙 루오
핑 왕
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알러간, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명에 따르면 APF 발효 배지로부터 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 크로마토그래피 프로세스 및 시스템이 제공된다.

Description

보툴리눔 독소를 정제하기 위한 동물 산물이 없는 시스템 및 프로세스{ANIMAL PRODUCT FREE SYSTEM AND PROCESS FOR PURIFYING A BOTULINUM TOXIN}
상호 참조
본 출원은 Ping Wang and Stephen Donovan에 의한 " Media for clostridium bacterium and process for obtaining a clostridial toxin"이라는 명칭의 2005년 3월 3일자로 출원된 미국 특허출원의 일부계속 출원이며, 2003년 9월 25일 출원된 미국 특허출원 번호 10/672,876의 일부계속출원으로, 이 출원들의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 병합되어 있다.
본 발명은 클로스트리디움 독소를 정제하기 위한 시스템 및 플세스에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 보툴리눔 독소 신경독을 정제하기 위한 크로마토그래피 프로세스에 관한 것이다.
치료, 진단, 조사 또는 미용의 목적으로 사람 또는 동물에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물은 활성 성분을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 하나 이상의 부형제, 완충제, 캐리어, 안정화제, 보존제 및/또는 벌크제를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물 중의 활성 성분은 보툴리눔 독소와 같은 생물제제일 수 있다. 보툴리눔 독소 약제학적 조성물을 제조하는 데 사용되는 보툴리눔 독소 활성 성분은 하나 이상의 동물 유래 산물(벌크 보툴리눔 독소를 얻는 데 사용되는 하나 이상의 배양 및 발효 배지 중의 고기 브로스 및 카세인 성분, 및 최종 조성된 보툴리눔 독소 약제학적 조성물 중의 혈액 분획 또는 혈액 유래 부형제와 같은)을 사용하는 다단계(multi step) 배양, 발효 및 조성 프로세스를 통하여 얻을 수 있다. 동물 유래 산물을 사용하는 방법을 통하여 생성된 활성 성분 생물제제를 포함하는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 경우, 환자가 다양한 병원체 또는 감염성 물질을 받아들이게 되는 위험성이 존재한다. 예를 들어, 프리온(prion)이 약제학적 조성물 중에 존재할 수 있다. 프리온은 단백질가수분해효소성 감염 물질로서, 정상적인 단백질을 만드는 동일한 핵산 서열로부터 비정상적인 구조 이형체(abnormal coformational isoform)를 발생시킬 수 있다는 가설이 있다. 또한, 번역후 단계에서 정상적인 이형체가 프리온 단백질 이형체로 되는 "리크루트먼트 반응(recruitment reaction)"시 감염성이 존재한다. 정상적인 내재성 세포 단백질이 병원체성 프리온 구조로 잘못 폴딩되는 것(misfold)을 유도한다는 것이 분명하다.
크로이츠펠트-야콥병은 사람 전염성 해면양 뇌증(transmissable spongiform encephalopathies)의 드문 신경퇴행성 질환으로, 전염성 물질은 프리온 단백질의 비정상적인 이형체임이 분명하다. 크로이츠펠트-야콥병이 있는 개체는 명백히 완전한 건강 상태로부터 6개월 이내에 무동성무언증(akinetic mutism)으로 악화될 수 있다. 그러므로, 동물 유래 산물을 사용하여 얻어지거나, 정제되거나 조성되는 보툴리눔 독소와 같은 생물제제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 경우, 크로 이츠펠트-야콥병과 같은, 프리온 매개 질환을 얻게 될 위험성이 존재한다.
보툴리눔 독소
클로스트리디움 속은 127 종 이상이며, 형태 및 기능에 따라 구분된다. 혐기성, 그람 양성 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)은 사람 및 동물에서 보툴리즘이라는 신경마비 질환을 일으키는, 강력한 폴리펩티드 신경독인, 보툴리눔 독을 제공한다. 클로스트리디움 보툴리눔의 포자는 토양에서 발견되며, 제대로 살균되지 않고 밀봉된, 집에서 통조림된 식품 용기에서 배양될 수 있어, 이러한 것들이 많은 보툴리즘의 원인이 된다. 보툴리즘 증상은 전형적으로 클로스트리디움 보툴리눔 배양물 또는 포자에 감염된 음식을 먹은 후 18 내지 36시간이 지나서 나타난다. 보툴리눔 독소는 독성이 감소되지 않은 채로 장 내막을 통과하여 말초 운동 뉴런을 공격할 수 있는 것으로 보인다. 보툴리눔 독소 중독의 증상은, 보행장애, 연하장애 및 언어장애, 호흡근육의 마비 및 사망으로 증상이 진행될 수 있다.
보툴리눔 독소 타입 A는 사람에게 알려진 가장 치명적인 천연 생물학제이다. 마우스에서 상업적으로 입수가능한 보툴리눔 독소 타입 A(정제된 신경독 복합체)의 LD50은 약 50 피코그램이다. 몰을 기준으로 할때, 보툴리눔 독소 타입 A는 디프테리아보다 18억배, 시안화 나트륨보다 6억배, 코브로톡신 (cobrotoxin)보다 3천만배, 그리고, 콜레라보다 1천2백만배 더 치명적이다. Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, page 63-84(chapter 4) of Natural Toxins II, edited by B.R.Sigh et al., Plenum Press, New York(1976)(보툴리눔 독소 타입 A의 상기한 LD50 0.3ng이 1U과 동일하다는 것은 약 0.05ng의 BOTOX®가 1유닛이라는 사실에 의해 보정된다). BOTOX
Figure 112006063785627-PCT00001
는 캘리포니아 어바인 소재 Allergan, Inc.사에서 상업적으로 입수가능한 정제된 신경독 복합체 보툴리눔 독소 타입 A의 상표명이다. 보툴리눔 독소 1 유닛(U)은, 체중이 각각 18-20g인 암컷 스위스 웹스터 마우스(Swiss Webster mice)에 복강내 주사를 통한 LD50로서 정의할 수 있다. 다른 말로, 보툴리눔 독소 1 유닛은 암컷 스위스 웹스터 마우스 그룹의 50%를 죽일수 있는 보툴리눔 독소의 양이다. 면역학적으로 구별되는 7개의 보툴리눔 신경독은, 타입-특이적인 항체로 중화하여 구별되는 각각 신경독 세로타입(serotype) A, B, C1, D, E, F 및 G로 특징지워진다. 상이한 세로타입의 보툴리눔 독소는 작용하는 동물 종 및 일으키는 마비의 정도 및 지속시간에 따라 차이가 있다. 예를 들어, 래트에서 발생하는 마비율로 측정할 때, 보툴리눔 독소 타입 A는 보툴리눔 독소 타입 B에 비하여 500배 더 강력한 것으로 측정되었다. 또한, 보툴리눔 독소 타입 B는, 보툴리눔 독소 타입 A 영장류 LD50의 약 12배인 480U/kg을 영장류에 투여할 때도 독성이 없는 것으로 측정되었다. 보툴리눔 독소는 콜린성 운동 뉴런에 강한 친화도를 가지고 결합하고, 뉴런으로 들어가 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것으로 여겨진다.
보툴리눔 독소는 활동항진성 골격근을 특징으로 하는 신경근육 장애의 치료를 위해 임상 세팅에 사용되고 있다. 보툴리눔 독소 타입 A는 미국 식품의약청에 의해서, 12세 이상 환자에 대한 본태성 안검경련, 사시 및 반측안면 경련의 치료에 사용되는 것이 승인되었으며, 경부 디스토니아의 치료 및 미간 (안면) 주름의 처치에 대해서도 승인되었다. FDA는 경부 디스토니아의 치료에 대하여 보툴리눔 독소 타입 B도 승인하였다. 보툴리눔 독소 타입 A의 말초 주사(예를 들어, 근육내 또는 피하)에 대한 임상 효과는 보통 주사후 일주일 이내에 나타나며, 종종 주사후 몇시간후에 나타나기도 한다. 일회 보툴리눔 독소 타입 A의 근육내 주사에 의한 증상 구제(즉, 이완된 근육 마비)의 전형적인 지속시간은 약 3 개월 내지 약 6개월일 수 있다.
모든 보툴리눔 독소 세로타입들이 신경근 접합부에서 신경전달물질 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것이 분명하지만, 이들은 각각 상이한 신경분비 단백질을 공격하거나 및/또는 상이한 부위에서 이들 단백질을 절단한다. 보툴리눔 독소 타입 A는 아연 엔도펩티다아제이며, 세포내, 시냅토솜 관련 단백질 SNAP-25의 펩티드 결합을 특이적으로 가수분해한다. 보툴리눔 타입 E 또한 25 킬로달톤(kD)의 시냅토솜 관련 단백질(SNAP-25)를 절단하지만, 이 단백질 내에서, 보툴리눔 독소 타입 A와는 상이한 아미노산 서열을 대상으로 한다. 보툴리눔 독소 타입 B, C, F 및 G는 소포 관련 단백질(VAMP, 소위 시냅토브레빈이라 칭함)에 작용하며, 각각의 세로타입은 이 단백질의 상이한 부위들을 절단한다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 C1은 신택신과 SNAP-25를 모두 절단하는 것으로 나타났다. 이러한 작용 메카니즘의 차이점이 다양한 보툴리눔 독소 세로타입 작용의 상대적인 효력 및/또는 지속시간에 영향을 줄 것이다.
세로타입에 관계없이, 독소 중독의 분자적 메카니즘은 유사하며, 적어도 3 단계로 구성되는 것으로 보인다. 이 과정의 첫번째 단계에서는, 중쇄(H 사슬)와 세포 표면 수용체의 특이적인 상호작용에 의해서, 독소가 표적 뉴런의 시냅스전 막에 결합한다; 이 수용체는 보툴리눔 독소 타입 및 파상풍 독소 타입 각각에 따라 다른 것으로 여겨진다. 세포 표면에 대한 독소의 표적화에는 H 사슬의 카르복실 말단 단편, Hc이 중요한 것으로 여겨진다.
두번째 단계에서는, 독소가 중독된 세포의 원형질막을 가로질러 통과한다. 일차로 독소는 수용체-매개 엔도시토시스를 통하여 세포에 의해서 감싸져서, 독소를 포함하는 엔도좀이 형성된다. 그리고 나서, 독소는 엔도좀을 빠져나와 세포의 세포질로 들어간다. 이 단계는 약 pH 5.5 이하에서 독소의 구조 변경을 유발하는 H 사슬의 아미노 말단 단편, HN에 의해서 매개되는 것으로 여겨진다. 엔도좀은 엔도좀 내부 pH를 감소시키는 양성자 펌프를 가지는 것으로 알려져 있다. 구조적 위치이동으로 인해 독소의 소수성 잔기가 노출되어, 독소가 엔도솜 막으로 둘러싸일 수 있게 된다. 그리고 나서, 독소는 엔도솜 막을 통하여 시토졸로 전위된다 .
보툴리눔 독소 활성화 메카니즘의 마지막 단계는 H 사슬과 L 사슬을 연결하는 디설파이드 결합의 환원을 포함하는 것으로 여겨진다. 보툴리눔 독소의 전체 독성 활성은 완전독(holotoxin)의 L 사슬에 포함되며; L 사슬은 인식, 및 신경전달물질-함유 소포(vesicle)와 원형질 막의 세포질 표면과의 도킹, 및 원형질 막과 소포와의 융합에 꼭 필요한 단백질을 선택적으로 절단하는 아연(Zn++) 엔도펩티다아 제이다. 보툴리눔 신경독, 보툴리눔독소 타입 B,D,F 및 G는 시냅토브레빈(또는 소포-관련 막 단백질(VAMP)라 칭함), 시냅토솜 막 단백질의 분해를 야기한다. 시냅스 소포의 세포질 표면에 존재하는 VAMP은 대부분 이러한 분해작용 중 하나의 결과로 제거된다. 각각의 독소는 상이한 결합을 특이적으로 절단한다.
보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은, 알려진 보툴리눔 독소 세로타입 7가지 모두에서, 약 150kD이다. 흥미롭게도, 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 보툴리눔 독소는 관련된 비독성 단백질과 함께 150kD 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 복합체로서 방출된다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 900k, 500Dk 및 300kD 형으로 생성될 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 B 및 C1은 500kD 복합체로서만 생성되는 것으로 보인다. 보툴리눔 독소 타입 D는 300kD 및 500kD 복합체로서 생성된다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 E 및 F는 약 300kD 복합체로서만 생성된다. 이 복합체들(즉, 분자량이 약 150kD 보다 큰 것)은 비독성 적혈구응집소 단백질 및 비독소 및 비독성 비적혈구응집소 단백질을 포함하는 것으로 여겨진다. 그러므로, 보툴리눔 독소 복합체는 보툴리눔 독소 분자(신경독 성분) 및 하나 이상의 비독성, 적혈구응집소 단백질 및/또는 비 독소, 비 적혈구응집소 단백질(후자는 NTNH 단백질로 칭할 수 있다). 이러한 두가지 비독소 단백질(보툴리눔 독소 분자와 함께 관련 신경독 복합체를 포함하는)은 보툴리눔 독소 분자 변성에 대한 안정성 및 독소가 섭취될 때 소화성 산에 대한 보호를 제공하는 데에 작용할 것이다. 또한, 보툴리눔 독소 복합체가 더 클 수록(분자량이 약 150kD 이상), 보툴리눔 독소 복합체가 근육 주사된 부위로부터 보툴리눔 독소가 더 천천히 확산될 것이다. pH 7.3에서 적혈구로 복합체를 처치하거나, 약 pH 7-8의 적합한 완충액 중에서 복합체를 컬럼 크로마토그래피와 같은 분리 프로세스를 거치게 하여, 독소 복합체를 독소 단백질 및 적혈구응집소 단백질로 분해할 수 있다. 보툴리눔독소 단백질은 적혈구응집소 단백질 제거시 현저하게 불안정해진다.
모든 보툴리눔 독소 세로타입이, 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아에 의해서, 프로테아제에 의해 절단 또는 닉킹되어(nicked) 신경활성화되어야만 하는 비활성 단일 사슬 단백질로서 생성된다. 보툴리눔 독소 세로타입 A 및 G를 생성하는 박테리아 균주는 내재성 프로테아제를 지니며, 따라서 세로타입 A 및 G는 박테리아 배양물로부터 주로 활성형으로서 회수될 수 있다. 이와 대조적으로, 보툴리눔 독소 세로타입 C1, D 및 E는 비단백분해성 균주에 의해 합성되므로, 배양물에서 회수될 때 전형적으로 비활성화된 상태이다. 세로타입 B 및 F는 단백분해성 및 비단백분해성 균주 모두에 의해서 생성되므로, 활성 또는 비활성 형으로 회수될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 보툴리눔 독소 타입 B 세로타입을 생성하는 단백분해성 균주는 생성된 독소의 일부만을 절단한다. 닉킹되지 않은 분자에 대한 닉킹된 분자의 정확한 비율은 배양시간 및 배양물의 온도에 따라 다르다. 그러므로, 아마도 알려진대로 보툴리눔 독소 타입 A에 비해 보툴리눔 독소 타입 B은 효력이 상당히 낮기 때문에, 예를 들어, 소정 백분율의 어떤 표본의 보툴리눔 독소 타입 B 독소도 비활성 일 것이다. 임상 표본에서 비활성 보툴리눔 독소 분자의 존재는 표본의 총체적인 단백질 부하에 기여할 것이며, 이는 임상적인 효과에는 기여하지 않으면서 항원성의 증가와 연관된다. 또한, 보툴리눔 독소 타입 B는 동일한 투여량에서, 근육내 주사시, 보툴리눔 독소 타입 A보다 활성 지속시간이 짧고, 효력이 떨어진다.
in vitro 연구에서, 보툴리눔 독소가, 뇌간 조직의 일차 세포 배양물로부터 아세틸콜린 및 노르에피네프린의 칼륨 양이온 유도 방출을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 보툴리눔 독소는 척수 뉴런의 일차 배양물에서 글리신 및 글루타메이트의 유발 방출을 억제하며, 뇌 시냅토솜 표본에서 신경전달물질 아세틸콜린, 도파민, 노르에피네프린, CGRP 및 글루타메이트 각각의 방출을 억제하는 것으로 보고되었다.
보툴리눔 독소 타입 A가 다양한 임상 조건을 처치하는데 성공함에 따라 다른 보툴리눔 독소 세로타입도 관심을 끌었다. 따라서, 적어도 보툴리눔 독소 타입 A, B, E 및 F를 사람을 처치하는 데 사용임상적으로 사용하게 되었다. 또한, 순수한 보툴리눔 독소(약 150kDa)를 사람을 처치하는 데 사용하였다. 예를 들어, KOHL A., et al., Comparison of the effect of botulinum toxin A (Botox (R)) with the highly-purified neurotoxin (NT201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000; 15 (Suppl 3): 165 참조. 한편, 보툴리눔 독소 복합체를 사용하는 것과 대조적로, 순수한 보툴리눔 독소(약 150kDa)를 사용하여 약제학적 조성물을 제조할 수 있다.
타입 A 보툴리눔 독소는 pH 4-6.8의 묽은 수용액에 용해되는 것으로 알려져 있다. 약 7 이상의 pH에서는 비독성 안정화 단백질이 신경독으로부터 분리되어, 그 결과 독성이 점차 소실되며, 특히 pH 및 온도가 상승할 때 그러하다. SCHANTZ E.J., et al. PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF botulinum toxin type A for human treatment (in particular pages 44-45), being CHAPTER 3 OF JANKOVIC, J., et al, THERAPY WITH BOTULINUM TOXIN, MARCEL DEKKER, Inc (1994) 참조.
일반적으로 효소에서 그렇듯이, 보툴리눔 독소들(이들은 세포내 펩티다아제임)의 생물학적 활성은, 적어도 일부분, 그들의 3차원적 구조에 따라 달라진다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A는 열, 다양한 화학물질, 표면 긁힘 및 표면 건조에 의해서 독성이 제거될 수 있다. 또한, 공지의 배양, 발효 및 정제에 의해 얻어진 독소 복합체를 아주 아주 낮은 독소 농도로 희석하여 약제학적 조성물 제제에 사용하는 경우, 적합한 안정화제가 없으면, 독소의 독성이 빠르게 제거된다는 것이 공지되어 있다. 대량으로 희석하면 특이적 독성이 빠르게 손실되기 때문에, 수 밀리그램 양의 독소를 밀리리터당 수 나노그램을 함유하는 용액으로 희석하는 것은 상당히 어렵다. 독소를 함유하는 약제학적 조성물을 제조한 후, 수개월 또는 수년동안 사용할 수 있기 때문에, 독소는 알부민 및 젤라틴과 같은 안정화제를 사용하여 안정화하여야만 한다.
하기와 같이, 다양한 임상 세팅에서 보툴리눔 독소를 사용하는 것이 보고되었다:
(1) 여러 근육부위에 1회 근육내 주사당 약 75-125 유닛의 BOTOX®를 사용하여, 경부 디스토니아(cervical dystonia)를 처치;
(2) 1회 근육내 주사당 5-10 유닛의 BOTOX®를 사용하여, 미간 주름(이마 주름)을 처치(5 유닛을 비근근에 근육내 주사하고, 10 유닛을 각각의 추미근에 근육내 주사)
(3) 치골직장근에 약 30-80 유닛의 BOTOX®를 괄약근내 주사하여 변비를 처치
(4) 윗눈꺼풀의 측면연골전 안윤근 및 아래 눈꺼풀의 측면연골전 안윤근에, 근육당 약 1-5 유닛의 BOTOX®를 근육내 주사하여 안검경련을 처치
(5) 외안근에 약 1-5 유닛의 BOTOX®를 근육내 주사하여 사시를 치료, 주사량은 주사하는 근육의 크기 및 원하는 근육마비 정도(즉, 원하는 디옵터 교정 정도)에 따라 달라짐.
(6) 하기와 같이, 상이한 5부위의 상지 굴근에 BOTOX®를 근육내 주사하여 졸중 후의 상지 경련을 처치
(a) 심지굴근 : 7.5 U 내지 30 U
(b) 천지굴근 : 7.5 U 내지 30 U
(c) 척측수근굴근 : 10 U 내지 40 U
(d) 요측수근굴근 : 15 U 내지 60 U
(e) 상완이두근 : 50 U 내지 200 U
한번에 각각 상기한 5가지 근육에 주사하여, 각 처치 때마다 환자의 상지 굴근에 90 U 내지 360 U의 BOTOX®를 근육내 주사.
(7) 25 U의 BOTOX®를 두부 주위에 주사(미간, 전두근 및 측두근에 대칭적으 로 주사)하여 편두통을 처치
25 U을 주사한 후 3개월간 편두통의 발생빈도, 최대강도, 수반되는 구토 및 급성의 약물사용의 감소정도로 측정할 때, 편두통의 예방처치로서 비히클에 견줄만한 상당한 장점을 제공함.
보툴리눔 독소 타입 A는 12 개월 이상 효능을 지속할 수 있으며(European J. Neurology 6 (Supp 4): S111-S1150 : 1999), 어떤 상황에서는 27 개월동안 지속될 수 있다. The Laryngoscope 109: 1344-1346: 1999 참조. 그러나, BOTOX®의 근육내 주사의 일반적인 지속시간은 전형적으로 약 3 내지 4개월이다.
상업적으로 입수가능한 보툴리눔 독소 함유 약제학적 조성물이 BOTOX®(Allergan, Inc., of Irvine, Califonia으로부터 입수가능)라는 상표로 시중에 유통되고 있다. BOTOX®는 정제된 보툴리눔 독소 타입 A 복합체, 사람 혈청 알부민 및 염화나트륨으로 구성되며, 살균, 진공건조 형태로 포장되어 있다. 보툴리눔 독소 타입 A는, N-Z 아민 및 효모 추출물을 함유하는 배지에서 배양된 클로스트리디움 보툴리눔 홀 종(Hall strain)의 배양물로부터 제조한다. 배양물 용액으로부터 일련의 산 침전을 통하여, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체를 활성 고분자량 독소 단백질 및 관련 적혈구응집소 단백질로 구성되는 결정형 복합체로 정제한다. 결정형 복합체를 염수 및 알부민을 포함하는 용액에 재-용해하고, 살균 여과(0.2미크론)한 후, 진공건조한다. 근육내 주사 전에, BOTOX®는 살균된, 방부제없는 염수로 재구성(reconstitute)될 수 있다. 각각의 BOTOX® 바이알은 방부제없는, 살균된, 진공-건조 형태로서, 약 100 유닛(U)의 클로스트리디움 보툴리눔 독소 타입 A 정제 된 신경독 복합체, 0.5 밀리그램의 사람 혈청 알부민 및 0.9 밀리그램의 염화나트륨을 함유한다.
진공-건조된 BOTOX®를 재구성하기 위해서, 방부제없는, 살균된 일반 염수; (0.9% 염화 나트륨 주사액)을 사용하여, 적정량의 희석제를 알맞은 크기의 주사기에 넣는다. BOTOX®는 거품내기 또는 유사한 격렬한 교반에 의해서 변성되므로, 희석제는 서서히 바이알에 주입한다. 재구성된 BOTOX®는 냉장고(2 내지 8℃)에 보관하며, 재구성된 BOTOX®는 투명하고, 무색인 액체로, 입자 물질이 없다. 재구성된 BOTOX®는 30일까지 효능을 유지하는 것으로 보고되었다. Guttman C., Botox retains its efficiacy for blepharospasm treatment after freezing and storage, New York investigators find, Euro Times 2000 Noc/Dec;5(8):16 참조. 진공건조된 제품은 냉동고에서 -5℃이하로 보관한다.
일반적으로, 4가지 생리학적 그룹의 클로스트리디움 보툴리눔이 알려져 있다(I, II, III 및 IV). 혈청학적으로 구분되는 독소를 생성할 수 있는 미생물들이 하나 이상의 생리학적 그룹에서 나올 수 있다. 예를 들어, 타입 B 및 F 독소는 그룹 I 또는 II의 계통에 의해서 생성될 수 있다. 또한, 보툴리눔 신경독을 생성할 수 있는 다른 계통의 클로스트리디움계 종(C. baratii, F 타입; C.buturicum, E 타입; C. novyi, C1 또는 D 타입)이 확인되었다.
클로스트리디움 보툴리눔 타입들의 생리학적 그룹을 하기 표 I에 열거하였다.
클로스트리디움 보툴리눔의 생리학적 그룹
그룹 독소 세로타입 생화학 젖 소화물 글루코오스 발효 리파아제 파지 및 플라스미드 표현형 관련 클로스트리디움 (비독성)
I A, B, F 단백가수분해성 당분해성 + + + + C.sporogenes
II B, E, F 비단백가수분해성 당분해성 향정신성 - + + +
III C, D 비단백가수분해성 당분해성 + _ + + + C. novyi
IV G 단백가수분해성 비당분해성 + - - - C. subterminale
적합한 생리학적 그룹의 클로스트리디움 보툴리눔 미생물을 선택하여 이러한 독소 타입들을 생성할 수 있다. 그룹 I의 미생물들은 보통 단백가수분해성으로 칭해지며, 타입 A, B 및 F의 보툴리눔 독소들을 생성한다. 그룹 II의 미생물들은 당분해성으로, 타입 B, E 및 F의 보툴리눔 독소들을 생성한다. 그룹 III의 미생물들은 보툴리눔 독소 타입 C 및 D만을 생성하며, 상당량의 프로피온산을 생성한다는 점에서 그룹 I 및 II의 미생물들과는 구분된다. 그룹 IV 미생물들은 타입 G의 신경독만을 생성한다.
실질적으로 동물 산물이 없는 특이적인 배지를 사용하여 파상풍 독소를 얻는 것이 알려져 있다. 미국 특허 6,558,926 참조. 그러나, 이 특허에 기재된 "동물 산물이 없는" 배지조차도 박토-펩톤(Bacto-peptone), 고기 소화물(meat digest)을 사용한다. 특히, 클로스트리디움 테타니에 의한 파상풍 독소의 생성과 클로스트리디움 보툴리눔에 의한 보툴리눔 독소의 생성은 그에 따른 성장, 배지 및 발효 파라미터 및 고려사항이 상이하다. Johnson, E.A., et al., Clostridium botulinum and its neurotoxins: a metabolic and cellular perspective, Toxicon 39(2001), 1703-1722 참조.
활성 보툴리눔 신경독의 생성
다양하게 수정된 공지의 Schantz 프로세스를 사용한 클로스트리디움 보툴리눔의 혐기성 발효에 의해, 약제학적 조성물의 제조를 위한 보툴리눔 독소를 얻을 수 있다(예를 들어, Schantz E.J., et al., Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 Mar;56(1):80-99; Schantz E.J., et al. preperation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment, chapter 3 in Jankovic J., ed. Neurological Disease and Theraphy. Theraphy with botulinum toxin(1994), New York, Marcel Dekker;1994, pages 41-49, and; Schantz E.J., et al., Use of crystalline type A botulinum toxin in medical research, in:Lewis GE Jr, ed. Biomedical Aspects of Botulism(1981) New York, Academic Press, pages 143-50 참조)
클로스트리디움 보툴리눔 신경독(순수 독소로서 또는 보툴리눔 독소 복합체로서)은 또한 적합한 유전자를 가진 재조합 숙주세포의 호기성 발효에 의해 얻을 수 있다. 1999년 7월 6일 등록된 Williams에 의한 발명의 명칭이 Vaccine for clostridium botulinum neurotoxin인 U.S. 특허 5,919,665 및 2003년 11월 20일 공개된 Williams 등에 의한 발명의 명칭이 Soluble recombinant botulinum toxin proteins인 U.S. 특허 출원 20030215468 참조.
또한, 보툴리눔 독소(150kD 분자) 및 보툴리눔 독소 복합체(300kDa 내지 900 kDa)를, 예를 들어, List Biological Laborotories, Inc., Campbell, Califonia; the Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, U.K.; Wako(Osaka, Japan), Metabiologics(Madison, Wisconsin) 및 Sigma Chemicals of St Louis, Missouri로부터 입수할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 보툴리눔 독소 함유 약제학적 조성물로는 사용전에 0.9% 염화나트륨으로 재구성하는, 동결건조 분말 형태의 100 유닛 바이알로 된, Allergan, Inc., Irvine, califonia으로부터 입수가능한 BOTOX®(사람 혈청 알부민 및 염화나트륨이 있는 보툴리눔 독소 타입 A 신경독 복합체), 사용전에 0.9% 염화나트륨으로 재구성하는 분말형태인, lpsen Limited, Berkshire, U.K.로부터 입수가능한 Dysport®(사람 혈청 알부민 및 락토오즈가 있는 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A 독소 헤마글루티닌 복합체 제제) 및 MyoBloc™(보툴리눔 독소 타입 B, 사람 혈청 알부민, 소디움 숙시네이트 및 염화 나트륨을 약 pH 5.6으로 포함하는 주사액으로서, San Diego, Califonia의 Solstice Neurosciences로부터 입수가능(이전에는 Elan Corporation, Dublin, Ireland로부터 입수가능))가 포함된다.
치료, 진단, 조사 또는 미용의 목적으로 사람 또는 동물에 투여하기에 적합한 클로스트리디움계 독소 약제학적 조성물을 제조하는 데는 많은 단계가 필요하다. 이러한 단계들은 정제된 클로스트리디움계 독소를 얻고, 정제된 클로스트리디움계 독소를 조성하는 데 포함될 수 있다. 첫번째 단계는, 전형적으로 아가 플레이트에서, 따뜻한 혐기성 대기에서와 같이, 박테리아 성장에 도움이되는 조건하에 클로스트리디움계 박테리아를 배양하는 단계일 수 있다. 배양 단계에서 원하는 모양 및 다른 특징들을 가진 클로스트리디움 콜로니를 얻을 수 있다. 두번째 단계에서는 선택된 배양된 클로스트리디움 콜로니를 적합한 배지에서 발효시킬 수 있다. 일정 기간의 발효 후에, 클로스트리디움 박테리아가 전형적으로 클로스트리디움계 독소를 배지로 분해 및 방출한다. 세번째로, 배양 배지를 정제하여 벌크 또는 생(raw) 독소를 얻을 수 있다. 전형적으로, 벌크 독소를 얻기 위한 배양 배지 정제는, 다른 시약들 중에서, DNase 및 RNase와 같은 동물 유래 효소들을 사용하여 실시하며, 이들은 핵산을 분해하고 제거를 용이하게 하는 데 사용된다. 얻어지는 벌크 독소는 높은 특이적 활성을 가진 고도로 정제된 독소일 것이다. 적합한 완충액 중에 안정화시킨 후, 벌크 독소를 하나 이상의 부형제와 함께 조성하여 사람에 투여하기에 적합한 클로스트리디움계 독소 약제학적 조성물을 제조할 수 있다. 클로스트리디움계 독소 약제학적 조성물은 약제학적 활성 성분으로서 클로스트리디움계 독소를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 하나 이상의 부형제, 완충액, 캐리어, 안정화제, 방부제 및/또는 벌크제를 포함할 수 있다.
클로스트리디움 독소 발효 단계에서 홀(whole) 클로스트리디움 박테리아, 분해된 박테리아, 배양 배지 영양분 및 발효 부산물을 포함하는 배약액을 얻는다. 이 배양 용액을 여과하여 홀 및 분해된 박테리아와 같은 큰 성분들을 제거하여 정화 배양물을 얻는다. 정화 배양물 용액(clarified culture solution)은 클로스트리디움계 및 다양한 불순물들을 포함하며, 벌크 독소(bulk toxin)이라고 부르는 농축된 클로스트리디움 독소를 얻기 위해 가공될 수 있다.
하나 이상의 동물 유래 산물(젖 분해 카세인, DNase 및 RNase와 같은)을 사용한, 벌크 클로스트리디움계 독소를 얻기 위한 발효 및 정제 프로세스가 공지되어 있다. 보툴리눔 독소 복합체를 얻기 위한 이러한 공지의 비-APF 프로세스의 예로 Schantz 프로세스가 있다. Schantz 프로세스(초기 세포 배양으로부터 발효 및 독소 정제까지)는 예를 들어, 배양 바이알 중의 동물 유래 박토 쿡드 미트 배지(Bacto Cooked Meat medium), 콜로니 성장 및 선별을 위한 콜럼비아 혈액 아가 플레이트, 및 발효 배지 중의 카세인과 같은 동물 공급원으로부터 유래한 산물을 많이 사용한다. 또한, Schantz 벌크 독소 정제 프로세스는 발효된 배양 배지에 포함된 독소에 존재하는 핵산을 가수분해하기 위해서 소에서 유래한 DNase 및 RNasefmf 사용한다.
적은 양의 동물 유래 산물을 사용하는, 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid)를 얻기 위한 발효 프로세스(동물 단백질이 없는, 또는 "APF" 발효 단계라 칭함)이 공지되어 있다. Demain 등의 2003년 5월 6일 등록된 Method for production of tetanus toxin using media substantially free of animal prducts란 명칭의 U.S. 특허 6,558,926 참조. 클로스트리디움계 독소를 얻기위한 APF 발효단계는 얻어진 벌크 독소가 바이러스, 프리온 또는 다른 원치않는 성분들로 오염되어 이후에도 약제학적 활성 성분 클로스트리디움계 독소가 사람에게 투여하기 위한 약제학적 조성물로 조성될 때 그와 함께 존재할 가능성(이미 매우 낮지만)을 감소시키는 잠재적인 이점을 가진다.
클로스트리디움계 독소를 정제하기 위하여 크로마토그래피를 사용하는 것이 공지되어 있다. 즉:
1. Ozusumi K., et al, Rapid, simplified method for production and purification of tetanus toxin, App & 뚜퍄구Micro, Apr. 1985, p939-943, vol 49, no.4.(1985)는 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 젤 여과를 사용하여 파상풍 독소를 정제하는 것을 개시하였다.
2. Schmidt J.J., et al., Purificatioin of type E botlinum neurotoxin by high-performance ion exchange chromatography, Anal Biochem 1986 Jul; 456(1):213-219는 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 보툴리눔 독소 타입 E를 정제하는 것을 개시였다. 또한, 리보누클레아제(RNase) 대신에 프로타민 설페이트를 사용하는 것을 개시하였다.
3. Simpson L.L., et al., Isolation and charaterization of the botulinum neurotoxins
Simpson LL; Schmidt JJ; Middlebrook JL, In:Harsman S, ed. Methods in Enzymology. Vol. 1665, Microbia Toxins:Tools in Enzymology San Diego, CA:Academic Press; vol 165;pages 76-85(1988)은 중력 흐름(gravity flow) 크로마토그래피, HPLC, 친화성 수지를 사용한 포획 단계, 크기 배제 크로마토그래피, 및 두가지 상이한 이온 교환 컬럼을 사용하는 것을 포함하는 이온(음이온 및 양이온) 교환 크로마토그래피를 사용하여 보툴리눔 신경독을 정제하는 것을 개시하였다. 다양한 세파덱스, 세파셀, 트리스아크릴, S 및 Q 컬럼이 개시되었다.
4. Zhou L. et al., Expression and purification of the light chain of botulinum neurotoxin A: A single mutation aboliches its cleavage of SNAP-25 and neurotoxicity after reconstitution with the heavy chain, Biochemistry 1995; 34(46):15175-81(1995)는 아밀로오스 친화성 컬럼을 사용하여 보툴리눔 신경독 경쇄 융합 단백질을 정재하는 것을 개시하였다.
5. Kannan K.,et al., Methods development for the biochemical assessment of Neurobloc (botulinum toxin type B), Mov disord 2000;15(Suppl 2);20(2000)은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 보툴리눔 독소 타입 B를 평가하는 것을 개시하였다.
6. Wang Y-c, The preparation and quality of botulinum toxin type A for injection(BTXA) and its clinical use, Dermatol Las Faci Cosm Surg 2002;58(2002)는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 보툴리눔 독소 타입 A를 정제하는 것을 개시하였다. 이 참조문헌은 침전과 크로마토그래피 기술을 조합하여 사용하는 것을 개시하였다.
7. Johnson S.K. et al., Scale-up of the fermentation and purification of the recombination heavy chain fragment C of botulinum neurotoxin serotype F, expreessed in Pichia pastoris, Protein Expr and Purif 2003;32:1-9 (2003)은 이온 교환 및 소수성 상호작용 컬럼을 사용하여 보툴리눔 독소 타입 F의 재조합 중쇄 단편을 정제하는 것을 개시하였다.
8. 공개된 U.S.특허출원 2003 0008367 A1(Oguma)은 이온 교환 및 락토오스 컬럼을 사용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 것을 개시하였다.
상기에 요약한 정제 방법들은 일반적으로 산업적 또는 상업적 프로세스의 규모로 실시할 수 없는 연구 또는 실험실 규모의 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 젤 여과 및 중력 흐름 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 기술은 대규모의, 입증가능한, cGMP 제조 프로세스로서 사용하도록 수정하는 것이 불가능하다. 이와 달리 또는 이에 더하여, 상기에 요약한 정제 방법들은 순수 독소(즉, 약 150kDa 신경독 분자), 또는 전체 900kDa 보툴리눔 독소 복합체와 대조적으로, 신경독의 특정 성분의 소규모 정제에 관한 것이다. 역시 공지된 바와 같이, 생물학적으로 활성인, 정제된 보툴리눔 독소 복합체를 얻는 것은, 복합체의 한 성분만을 정제하는 것보다 상당히 더 복잡하며 어렵다. 이는, 예를 들어, 생물학적으로 활성이며 안정한 보툴리눔 독소 복합체를 얻기 위해 요구되는 크기가 큰, 분해되기 쉬운, 불안정한 특성 및 특정한 이차, 삼차 및 사차 분자 및 복합체 구조 때문이다.
또한, 보툴리눔 독소 약제학적 조성물로 조성하기에 적합한 보툴리눔 독소를 얻기위한 상업적 규모의 프로세스를 포함하는 현재의 프로세스들은 전형적으로 발효 프로세스로부터 보툴리눔 독소를 따라온 불순물로부터 독소 복합체를 분리하는 일련의 침전 단계를 포함한다. 특히, 침전 기술은 보툴리눔 독소를 정제하는 생물약제학적 산업에서 광범위하게 사용된다. 예를 들어, 차가운 알콜 분류(Cohn의 방법) 또는 침전을 사용하여 혈장 단백질을 제거한다. 불행히도, 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 침전 기술은 분해능이 낮고(low resolution), 생산성이 낮으며, 조작이 어렵고, 제어 및 입증이 어려우며, 규모를 크게하거나 작게 하기 어려운 단점이 있다.
따라서, 정제 프로세스에서 물 유래 산물을 사용하지 않고 벌크 클로스트리디움계 독소를 얻도록 클로스트리디움계 독소 발효 배지를 정제하기 위한 APF 프로세스가 필요하다.
개요
본 발명은 클로스트리디움계 독소를 정제하기 위한 다양한 크로마토그래피 APF 시스템 및 프로세스를 제공한다. 본 발명의 시스템 및 프로세스는 규모를 변화시킬 수 있으며 cGMP에 적합(compliant)하다. 클로스트리디움계 독소는 바람직하게 보툴리눔 독소이며, 가장 바람직하게는 보툴리눔 독소 타입 A 900kDa 복합체이다. 본 발명은 별도의 APF 발효(즉, 발효 배지 중에 카세인 대신 콩을 사용)로부터 얻어진 클로스트리디움계 독소(보툴리눔 독소와 같은)를 정제하기 위한 상업적, 산업적 규모의 APF 정제 프로세스로서 사용할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 전형적으로 비-APF 발효 후에 보툴리눔 독소 정제를 위해 실시되는 비-APF 정제(즉, DNase 및 RNase의 사용) 프로세스를 대체할 수 있다.
본 발명은 또한 클로스트리디움계 박테리아의 Schantz 발효에 이어서, Schantz(비-APF) 정제 프로세스를 본 명세서에 개시된 APF 독소 정제 프로세스로 대체하여 사용할 수 있다. 본 발명은 APF 발효 프로세스에 이어서 사용하기에 가장 적합하도록 되어 있기 때문에, APF 발효 프로세스 후에 본 발명을 실시하는 것과 대조적로, 비-APF 발효 프로세스 후에 본 발명을 실시하는 것은 바람직하지 않다.
즉, 본 발명의 범주 내의 프로세스는 APF 발효와 함께(그에 이어서) 사용하는 것이 바람직하며, 벌크 클로스트리디움계 독소를 얻는 데 필요한 단계에서 동물 유래 산물을 사용하는 것이 더욱 감소되거나 특정 실시형태에서는 완전히 제거된다. APF 발효 프로세스에 이어서 본 발명을 실시하면 본질적으로 완전한 APF 방법론(발효 및 정제)를 확실하게 실시할 수 있다.
본 발명의 실시형태는 고수율의 고도로 정제된 생물학적 활성 클로스트리디움계 독소를 얻기 위한 시스템 및 프로세스를 제공한다. 본 발명은 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아와 같은 클로스트리디움계 박테리아의 발효 프로세스로부터 얻어진 정화 배양물을 정제하기 위하여, 동물 유래 산물이 없거나 실질적으로 없는 크로마토그래피 시스템 및 프로세스를 사용함으로써 이러한 목적을 달성한다.
정의
본 명세서에서, 하기에 기재된 용어들은 다음의 정의를 가진다.
"약"은, 정량된 아이템, 파라미터 또는 기간의 수치가, 그 아이템, 파라미터 또는 기간의 ±10%의 범위를 포함한다는 것을 의미한다.
"투여" 또는 "투여하다"는 대상에 약제학적 조성물을 주는(즉, 투여하는) 과정을 의미한다. 여기서 언급한 약제학적 조성물은 예를 들어, 근육내(i.m.), 피부내, 피부하 투여, 척수강내 투여, 두개내, 복강내(i.p.) 투여, 국소(경피) 및 임플란트(즉, 폴리머 임플란트 또는 미니삼투압 펌프와 같은 서방형 장치) 투여경로에 의해서 "국부적으로 투여된다".
"동물 산물이 없는" 또는 "실질적으로 동물 산물이 없는"은 각각 "동물 단백질이 없는" 또는 "실질적으로 동물 단백질이 없는"의 의미를 포함하며, 혈액 유래, 혈액 풀드(blood pooled) 및 다른 동물 유래 산물들 또는 화합물들이 없거나 실질적으로 없다는 것을 의미한다. "동물"은 포유류(사람과 같은), 조류, 파충류, 어류, 곤충, 거미 또는 다른 동물종들을 의미한다. "동물"은 박테리아와 같은 미생물은 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 범주에 드는 동물 산물이 없는 배지 또는 방법 또는 실질적으로 동물 산물이 없는 배지 또는 방법은 보툴리눔 독소 또는 클로스트리디움계 보툴리눔 박테리아를 포함할 수 있다. 예를 들어, 동물 산물이 없는 방법 또는 실질적으로 동물 산물이 없는 방법은, 면역글로불린, 고기 소화물, 고기 부산물 및 젖 또는 낙농 산물 또는 소화물과 같은 동물 유래 단백질이 실질적으로 없거나 본질적으로 없거나 완전히 없는 방법을 의미한다. 따라서, 동물 산물이 없는 방법의 예로는 고기 및 낙농 산물 또는 고기 또는 낙농 부산물을 배제한 방법(박테리아 배양 또는 박테리아 발효 방법과 같은)이 있다.
"보툴리눔 독소"는 클로스트리디움 보툴리눔에 의해서 생성된 신경독뿐아니라, 변형, 재조합, 하이브리드 및 키메라 보툴리눔 독소를 의미한다. 재조합 보툴리눔 독소는 비-클로스트리디움계 종에 의해서 재조합적으로 제조된 그의 경쇄 및/또는 중쇄를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "보툴리눔 독소"라는 용어는 보툴리눔 독소 세로타입 A, B, C, D, E, F 및 G를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, 보툴리눔 독소는 또한 보툴리눔 독소 복합체(즉, 300, 600 및 900kDa 복합체) 뿐아니라 순수한 보툴리눔 독소(즉, 약 150kDa 신경독 분자)를 모두 포함하며, 이들 모두가 본 발명의 실시에 유용하다. "정제된 보툴리눔 독소"는 배양 또는 발효 프로세스로부터 보툴리눔 독소를 얻을 때 따라올 수 있는 다른 단백질 및 불순물로부터 분리된, 또는 실질적으로 분리된, 순수한 보툴리눔 독소 또는 보툴리눔 독소 복합체를 의미한다. 즉, 정제된 보툴리눔 독소는 적어도 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 비-보툴리눔 독소 단백질 및 불순물이 제거될 수 있다. 보툴리눔 C2 및 C3 사이토톡신은, 신경독이 아니며, 본 발명의 범주에서 배제된다.
"클로스트리디움계 신경독"은, 클로스트리디움 보툴리눔, 클로스트리디움 부티리쿰 또는 클로스트리디움 베라티와 같은 클로스트리디움계 박테리아로부터 생성된, 또는 천연의 신경독뿐아니라, 비-클로스트리디움계 종에 의해서 재조합적으로 제조된 클로스트리디움계 신경독을 의미한다.
"완전히 없는"(즉, "구성되는"이라는 용어)은 사용되는 장비 또는 프로세스의 검출 범위 내에서, 물질이 검출될 수 없거나, 그 존재가 확인될 수 없다는 것을 의미한다.
"본질적으로 없는"(또는 "본질적으로 구성되는")은 단지 흔적량의 물질만 검출될 수 있다는 것을 의미한다.
"변형 신경독"은 천연 보툴리눔 독소와 비교할 때, 그 아미노산의 적어도 하나가 삭제, 변형 또는 치환된 보툴리눔 독소를 의미한다. 또한, 변형 보툴리눔 독소는 재조합적으로 생성된 신경독, 또는 재조합적으로 생성된 신경독의 유도체 또는 단편일 수 있다. 변형 보툴리눔 독소는, 보툴리눔 독소 수용체에 결합하는 능력 또는 뉴런으로부터 신경전달물질 방출을 억제하는 능력과 같은, 천연 보툴리눔 독소의 생물학적 활성중 적어도 하나를 유지한다. 변형 보툴리눔 독소의 일례로는 하나의 보툴리눔 독소 세로타입(세로타입 A와 같은)으로부터의 경쇄, 및 이와 상이한 보툴리눔 독소 세로타입(세로타입 B와 같은)으로부터의 중쇄를 가지는 보툴리눔 독소가 있다. 변형 보툴리눔 독소의 또다른 예로는, 물질 P(substance P)와 같은, 신경전달물질과 커플링된 보툴리눔 독소가 있다.
"환자"는 의학 또는 수의학적 케어를 받는 사람 또는 비-사람 실험대상을 의미한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 조성물들을 포유류와 같은 어떤 동물을 처치하는 데 사용할 수 있다.
"약제학적 조성물"은 활성 성분이 보툴리눔 독소일 수 있는 제제를 의미한다. "제제(formulation)"라는 용어는 약제학적 조성물 중에 신경독 활성 성분 외에 적어도 하나의 추가적인 성분(알부민 및/또는 염화나트륨과 같은)이 있다는 것을 의미한다. 따라서, 약제학적 조성물은, 사람 환자와 같은 대상에, 진단, 치료 또는 미용을 위해 투여(즉, 근육내 또는 피하 주사에 의해서, 또는 저장소 또는 임플란트의 삽입에 의해서)하기에 적합한 제제이다. 약제학적 조성물은: 동결건조 또는 진공건조된 상태; 동결건조 또는 진공건조된 약제학적 조성물을 염수 또는 물로 재구성한 후의 용액; 또는 재구성이 필요없는 용액일 수 있다. 활성 성분은 보툴리눔 독소 세로타입 A, B, C1, D, E, F 및 G 중 하나 또는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서 천연적으로 만들어질 수 있는 모든 보툴리눔 독소일 수 있다. 상기한 바와 같이, 약제학적 조성물은 액체 또는 고체일 수 있으며, 예를 들어, 진공건조될 수 있다. 약제학적 조성물의 구성 성분들이 단일 조성물 중에 포함될 수 있으며(즉, 필요한 재구성 유액을 제외한 모든 구성성분이 약제학적 조성물의 최종 조성시에 존재함), 또는 2-성분 시스템, 예를 들어, 약제학적 조성물의 최초 조성시에는 존재하지 않는 성분을 포함하는, 염수와 같은 희석액으로 재구성되는 진공건조된 조성물로서 포함될 수 있다. 2-성분 시스템(two-component system)은 2-성분 시스템의 제 1 성분과 함께 장기간 저장하기 쉽지 않은 성분들의 병합을 가능하게 하는 이점을 제공한다. 예를 들어, 재구성 비히클 또는 희석액은 사용기간 동안, 예를 들어, 1주일간의 냉장 저장시 미생물 성장으로부터 충분한 보호를 제공할 수 있는 보존제를 포함할 수 있으며, 보존제는 독소가 변성될 수 있는 기간인 2년의 냉동 저장 기간 동안에는 존재하지 않는다. 장기저장시 클로스트리디움 독소 또는 다른 성분들과 함께 존재할 수 없는 다른 성분들을 이러한 방법으로 병합할 수 있다; 즉, 사용할 시점 근처에 제 2 비히클(즉, 재구성 유액 중에)에 가하는 것이다. 보툴리눔 독소 활성 성분 약제학적 조성물을 조제하는 방법이 미국 특허 2003 0118598 A1 중에 기재되어 있다.
"실질적으로 없는"은 약제학적 조성물의 1 중량% 이하의 레벨로 존재하는 것을 의미한다.
"치료학적 제제"는 말초 근육의 과다활동(즉, 경련)을 특징으로 하는 장애 또는 질환과 같은, 장애 또는 질환을 처치하여 완화시키는 데 사용할 수 있는 제제를 의미한다.
다음과 같은 약자가 본 명세서에 사용된다:
3:1:1 배양
3% HySoy, 1% HyYeast, 및 1% 글루코오스를 포함하는, 보툴리눔 독소 배양/ 발효 배지. HySoy(Quest 제품 번호 5X59022)는 콩(soy)의 효소 가수분해에 의해 제조된 펩티드의 공급원이다. HyYeast(HyYest, Quest 제품 번호 5Z10102 또는 5Z10313은 빵효모 추출물이다)
5:1:1 배양
5% HySoy, 1% HyYeast, 및 1% 글루코오스를 포함하는, 보툴리눔 독소 배양/ 발효 배지.
API 약제학적 활성 성분
APF 동물 산물이 없는
BCA 비신코닌산 (bicinchoninic acid)
CV 컬럼 부피
DF 정용여과(diafiltration)
ELISA 효소 면역 측정법.
Hc 보툴리눔 독소 중쇄
MLD50
복강내 주사된 8-23그램 Swiss-Webster 마우스의 50% 치사량에 해당하는 보툴리눔 독소의 양
SDS-PAGE 소디움도데실설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동
SEC-HPLC 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피
UF 한외여과
UV 자외선
본 발명은 클로스트리디움 독소를 여과하는 프로세스를 포함한다. 이 프로세스는 보툴리눔 독소 발효 배양물의 샘플을 얻는 단계; 보툴리눔 독소가 제 1 컬럼에 포획될 수 있도록 제 1 크로마토그래피 컬럼 수지에 배양물 샘플을 접촉시키는 단계; 제 1 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리시키는 단계; 제 1 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용리액을 제 2 컬럼 크로마토그래피 컬럼 수지에 로딩하여 정제된 보툴리눔 독소를 얻는 단계의 4 단계로 이루어질 수 있다. "보툴리눔 독소 발효 배양물"은 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아가 발효되어 박테리아가 보툴리눔 독소를 배출하는 발효 배지를 의미한다. 보툴리눔 독소 발효 배양물(배지)의 샘플은 발효 배지의 정화 배양물의 샘플이 바람직하다.
제 1 크로마토그래피 컬럼 및 제 2 크로마토그래피 컬럼은 상이한 컬럼일 수 있으며, 두가지 상이한 컬럼이 상이한 정제 메카니즘을 통해 보툴리눔 독소를 정제하도록 작용할 수 있다. 예를 들어, 제 1 크로마토그래피 컬럼은 소수성 상호작용 컬럼일 수 있으며, 제 1 크로마토그래피 컬럼은 이온 교환 컬럼일 수 있다.
본 발명의 범주에 속하는 클로스트리디움계 독소 정제 프로세스는 또한 접촉 단계 후, 용리 단계 전에 제 1 컬럼에서 불순물을 세척해 내는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 범주에 속하는 클로스트리디움계 독소 정제 프로세스는 로딩 단계후에 제 2 컬럼에서 불순물을 세척해 내는 단계를 포함할 수 있다. 게다가, 본 발명의 범주에 속하는 클로스트리디움계 독소 정제 프로세스는 또한 제 2 컬럼으로부터 불순물을 세척해 내는 단계 후에, 제 2 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리시키는 단계를 포함할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 범주에 속하는 클로스트리디움계 독소 정제 프로세스는 APF 프로세스이며, 더욱 바람직하게 실질적으로 동물 산물이 없는("APF") 프로세스이며, 더욱 바람직하게 보툴리눔 독소 복합체와 같은 클로스트리디움 독소를 정제하기 위한, 본질적으로 APF 프로세스이다.
본 발명의 범주에 속하는 클로스트리디움계 독소 정제 프로세스에 사용되는 보툴리눔 독소 발효 배양물은 APF 프로세스로 얻은 것이 바람직하며, 실질적으로 APF 프로세스로부터 얻응 것이 더욱 바람직하고, 본질적으로 APF 프로세스로부터 얻은 것이 가장 바람직하다.
실질적으로, 본 발명의 범주에 속하는 클로스트리디움계 독소 정제 프로세스에서 제공되는 정제된 보툴리눔 독소 복합체의 수득량은 보툴리눔 독소 발효 배양물의 각 10 리터에 대해 배치(batch)당 약 50mg 이상이다.
본 발명의 범주에 속하는 클로스트리디움계 독소 정제 프로세스를 실시하여 얻어진 정제된 보툴리눔 독소 복합체는 하기의 특징을 가진다: 외관은 화이트 내지 오프 화이트 현탁액; 농도는 용리액 ml당 보툴리눔 독소 복합체 2.0-3.6 mg; 278nm에서의 흡광도에 대한 260nm에서의 흡광도 비율(A260/A278)은 0.6 이하; MLD 50 유닛/mg로 나타낸 특이적 효능은 정제된 보툴리눔 독소 mg 당 2.4 X 107 내지 5.9 X 107의 MLD 50 유닛; 면역학적으로 보툴리눔 신경독 타입 A 복합체와 동일함; SDS-PAGE 특성은 표준을 따름; SEC-HPLC 특성은 전체 피크의 >95%이 900kDa 독소 복합체; 이러한 정제된 보툴리눔 독소 복합체를 얻는 데 사용된 프로세스는 확고(robust)하며, 규모를 변화시킬 수 있고(scalable), 입증가능하며(validatable), 및/또는 cGMP에 적합(compliant)하다.
본 발명의 범주에 속하는 보툴리눔 독소 복합체 정제를 위한 APF 프로세스는 하기의 단계,
(a) 실질적으로 APF 프로세스로부터 얻어진 보툴리눔 독소 발효 배양물의 샘플을 얻는 단계;
(b) 보툴리눔 독소가 제 1 컬럼에 포획될 수 있도록 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 수지에 상기 배양물 샘플을 접촉시키는 단계;
(c) 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼으로부터 불순물을 세척해 내는 단계;
(d) 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리시키는 단계(이어지는 이온 교환 크로마토그래피를 위해서, 용리 단계 후에 소수성 상호작용 크로마토글피 컬럼으로부터의 용리액을 희석시키는 단계가 올 수 있다);
(e) 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용리액(소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용리액은 상기와 같이 희석된 것일 수 있다)을 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 컬럼 수지에 로딩하는 단계;
(f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 불순물을 세척해 내는 단계;
(g) 상기 이온 교환 컬럼으로부터 보눌리눔 독소를 용리시키는 단계를 포함할 수 있으며, 이렇게 함으로써 실질적으로 APF 정제 프로세스인 보툴리눔 독소 정제 프로세스를 통하여 정제된 보툴리눔 독소를 얻을 수 있다.
앞 단락에서 설명한 APF 프로세스는 또한 보툴리눔 독소 발효 배양물의 샘플을 얻는 단계 후, 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 수지에 상기 배양물 샘플을 접촉시키는 단계 전에, 추가적으로 소수성 상호작용 크로마토그래피를 위해 정화 배양물을 컨디셔닝하는 단계를 포함할 수 있다. 추가적으로, 앞 단락에서 설명한 APF 프로세스는 소수성 상호작용 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리시키는 단계 후, 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 컬럼 수지에 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용리액을 로딩하는 단계 전에 이온 교환 크로마토그래피를 위해 소수성 상호작용 컬럼으로부터의 용리액을 컨디셔닝하는 단계를 또한 포함할 수 있다.
보툴리눔 독소를 정제하기 위한 APF 프로세스의 상세한 실시형태에서, 프로세스는 다음의 단계,
(a) 실질적으로 APF 프로세스로부터 얻어진 보툴리눔 독소 발효 배양물의 샘플을 얻는 단계;
(b) 소수성 상호작용 크로마토그래피를 위해 정화 배양물을 컨디셔닝하는 단계;
(c)보툴리눔 독소가 제 1 컬럼에 포획될 수 있도록 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 수지에 상기 배양물 샘플을 접촉시키는 단계;
(d) 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼으로부터 불순물을 세척해 내는 단계;
(e) 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리시키는 단계;
(f) 이온 교환 크로마토그래피를 위해 소수성 상호작용 컬럼으로부터의 용리액을 컨디셔닝하는 단계;
(g) 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용리액을 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 컬럼 수지에 로딩하는 단계;
(h) 상기 이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 불순물을 세척해 내는 단계;
(i) 상기 이온 교환 컬럼으로부터 보눌리눔 독소를 용리시키는 단계를 포함할 수 있으며, 이렇게 함으로써 실질적으로 APF 정제 프로세스인 보툴리눔 독소 정제 프로세스를 통하여 정제된 보툴리눔 독소를 얻을 수 있다.
또한, 클로스트리디움계 독소, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체를 정제하는 시스템이 본 발명의 범주에 속한다. 이러한 시스템은 발효 배양물로부터 보툴리눔 독소를 포획하기 위한 제 1 크로마토그래피 컬럼 수지; 상기 제 1 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리시키는 용리 완충액; 상기 제 1 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용리액으로부터 보툴리눔 독소를 포획하기 위한 제 2 컬럼 크로마토그래피 컬럼 수지, 및; 상기 제 2 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리시키는 제 2 용리 완충액를 포함할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 클로스트리디움계 독소를 동물 산물이 없는(APF) 시스템 및 프로세스를 사용하여 정제할 수 있는 데에 기초한다. 본 발명은 클로스트리디움 보툴리눔 신경독을 정제하기 위한 동물 산물이 없는 시스템 및 프로세스를 포함한다. 클로스트리디움 보툴리눔 신경독은 300kD, 500kD 또는 900kD(대략적인 분자량) 복합체 또는 이들의 혼합물과 같은 보툴리눔 독소 타입 A 복합체일 수 있다. 클로스트리디움 보툴리눔 신경독은 세로타입 A,B,C,D,E,F 또는 G 중 어느 하나 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 또한, 시스템 및 프로세스는 재조합, 하이브리드, 키메라 또는 변형 보툴리눔 독소(경쇄, 중쇄, 또는 이들 사슬을 함께)와 함께 실시할 수 있다.
특히, 본 발명에 개시된 시스템 및 프로세스는 규모를 변화시킬 수 있으며, 이는 약제학적 제품을 위해서 사용되는 산업적 또는 상업적 프로세스로부터 얻어진 대량의 보툴리눔 독소를 정제하는 데 사용할 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 이 시스템 및 프로세스는 U.S.CFR(미국 연방 행정 규정집)에서 요구하는 cGMP(공인된 우수 의약품 제조기준)에 적합하며, 이는 규제 요건을 만족시킬 수 있다는 것을 의미한다.
실험을 통해서, 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A(홀 종, Hall strain) 신경독 복합체와 같은 클로스트리디움계 독소를 정제하는 APF 시스템 및 프로세스가 개별되었다. Schantz(비-APF) 발효 프로세스 또는 APF 발효 프로세스로부터 얻어진 발효 배지로부터 클로스트리디움계 독소를 정제하였다. Schantz 프로세스는 동물 유래 산물을 사용한다. 특히, APF 발효 프로세스는 클로스트리디움계 박테리아를 배양 및 발효시키는 데 사용하는 배지의 영양분으로 사용되는 동물 유래 산물(카세인 및 고기 브로스와 같은)을 감소시키거나 제거하는 반면에, APF 발효 프로세스 후에는 전형적으로 효소 DNase 및 RNase와 같은 동물 유래 산물을 사용하는 하나 이상의 정제 단계가 온다. 발효 배지의 정제는 벌크 클로스트리디움계 독소를 얻기 위해서 필요하다. 벌크 클로스트리디움 독소(순수 독소 또는 독소 복합체)는 클로스트리디움계 독소 약제학적 조성물을 조성하는 데 사용할 수 있다.
바람직하게, 본 발명은 APF 발효 단계와 함께 실시할 수 있다. APF 발효단계와 함께 본 발명을 실시하면, 연합된 APF 발효 프로세스 및 APF 정제 프로세스가 제공된다. 또한, 본 발명의 시스템 및 방법은 카세인 또는 다른 동물 단백질에 기초한 발효 배지와 대조적으로, APF 발효 배지에 실시하는 데 최적화되어 있다. 비-APF 발효에 본 발명을 실시하는 경우에는 정제된 보툴리눔 독소의 수득량이 더 낮거나 및/또는 효능이 더 낮을 수 있다.
즉, Schantz 및 APF 보툴리눔 독소 정제 프로세스는 모두 보툴리눔 독소를 안정화하기 위한 벤즈아미딘 및 발효 배지 중에 보툴리눔과 함께 존재하는 핵산을 제거하기 위한 DNase 및 RNase와 같은 동물 유래 산물을 사용하지만(실시예 6 및 7 참조), 본 발명은 이러한 동물 유래 산물을 사용하지 않고 보툴리눔 독소를 정제할 수 있다.
본 발명은 보툴리눔 독소 복합체와 같은 클로스트리디움계 독소를 정제하기 위한 시스템 및 프로세스를 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 범주에 속하는 특정 시스템은 본 발명의 범주에 속하는 특정 프로세스와 함께 실시된다. 본 발명의 범주에 속하는 시스템은 다수의 크로마토그래피 단계(바람직하게 연속되는 시리즈로서)를 포함한다. 본 발명의 범주에 속하는 프로세스는 클로스트리디움계 독소 발효 배지를 다수의 크로마토그래피 컬럼을 통해 통과시켜 고순도 및 고효능의 클로스트리디움계 독소를 얻는 것을 포함한다. 이러한 정제된 클로스트리디움계 독소는 클로스트리디움계 독소 약제학적 조성물을 조성하는 데 적합하다. 본 발명의 범주에 속하는 시스템 및 프로세스의 중요한 파라미터는 특정 컬럼, 완충액 및 사용되는 작동 (컬럼 가동)조건을 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태에 있어서, 광범위한 제 1 단계는 발효 배지 정화 배양물을 소수성 상호작용 컬럼(부틸 세파로오스 패스트 플로우["FF"] 컬럼과 같은)에 로딩하는 것일 수 있다. 제 1 컬럼은 클로스트리디움계 독소(보툴리눔 독소 복합체와 같은)를 포획하고, 컬럼을 통해 불순물이 흘러내리게 된다. 소수성 상호작용 컬럼이 발효 배지 중에 보툴리눔 독소와 함께 존재하는 많은 불순물들은 분리(흘러나옴)하면서도, 보툴리눔 독소 복합체의 생물학적 활성을 유지한 채로 보툴리눔 독소 복합체(특정 3차 및 4차 구조를 가진 큰 단백질)를 발효 배지로부터 효과적으로 포획한다는 것을 알아내었다. 적합한 완충액은 포획된(결합된) 클로스트리디움계 독소를 소수성 상호작용 컬럼으로부터 용리시키는 데 사용한다.
본 발명의 특정 실시형태의 광범위한 제 2 단계에서는, 제 1 컬럼으로부터의 용리액을 제 2 컬럼에 로딩하여 클로스트리디움계 독소를 더욱 정제한다. 바람직하게, 제 2 컬럼이 불순물로부터 클로스트리디움계 독소를 분리하기 위한 상이한 메카니즘을 제공하는 경우, 제 2 컬럼 크로마토그래피 단계가 더욱 효과적인 정제 단계를 제공할 수 있다는 것을 알아내었다. 즉, 바람직하게, 제 2 크로마토그래피 단계에서는 SP 세파로오스 고성능["HP"] 컬럼과 같은 상이한 컬럼을 사용한다.
후 크로마토그래피 (컬럼) 단계에서, 고순도 벌크 보툴리눔 독소 복합체를 얻기 위해 제 2 컬럼으로부터의 용리액을 더욱 가공할 수 있다. 이러한 추가적인 가공 단계는 한외여과 및 정용여과에 의한 완충액 교환, 멸균 여과 및 정제된 보툴리눔 독소 복합체의 암모늄 설페이트 현탁액 제조를 포함할 수 있다.
본 발명은 규모를 변경할 수 있으며 cGMP에 적합한 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 시스템 및 프로세스를 포함하며, 얻어진 벌크 보툴리눔 독소는 하기 표 1에 설명한 특징을 가진다.
정제된 보툴리눔 신경독 특징
외관 화이트 내지 오프-화이트 현탁액
농도 2.0-3.6 mg/ml
핵산(A260/A278) 0.6 이하
특이적 효능(MLD50 유닛/mg) 2.4-5.9 x 107
면역학적 동일성 통과
SDS-PAGE 표준을 따름
SEC-HPLC 900kDa 독소 복합체 > 95% 전체 피크
상업적으로 입수가능한 보툴리눔 독소 함유 약제학적 조성물이 BOTOX®(Allergan, Inc., of Irvine, Califonia으로부터 입수가능)라는 상표로 시판되고 있다. BOTOX®는 상기 표 1에 설명한 특징을 가진다. BOTOX®는 정제된 보툴리눔 독소 타입 A 복합체, 사람 혈청 알부민 및 염화나트륨으로 구성되며, 살균, 진공건조 형태로 포장되어 있다. 보툴리눔 독소 타입 A는, N-Z 아민 카세인 및 효모 추출물을 함유하는 배지에서 배양된 클로스트리디움 보툴리눔 홀 종(Hall strain)의 배양물로부터 제조한다(즉, 비-APF 프로세스). 배양물 용액으로부터 일련의 침전(산 침전 포함) 단계를 통하여, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체를 활성 고분자량 독소 단백질 및 관련 적혈구응집소 단백질로 구성되는 결정형 복합체로 정제한다. 결정형 복합체를 염수 및 알부민을 포함하는 용액에 재-용해하고, 살균 여과(0.2미크론)한 후, 진공건조한다. 근육내 주사 전에, BOTOX®는 살균된, 방부제없는 염수로 재구성(reconstitute)할 수 있다. 각각의 BOTOX® 바이알은 방부제없는, 살균된, 진공-건조 형태로서, 약 100 유닛(U)의 클로스트리디움 보툴리눔 독소 타입 A 복합체, 0.5 밀리그램의 사람 혈청 알부민 및 0.9 밀리그램의 염화나트륨을 함유한다.
진공-건조된 BOTOX®를 재구성하기 위해서, 방부제없는, 살균된 일반 염수; (0.9% 염화 나트륨 주사액)을 사용하여, 적정량의 희석제를 알맞은 크기의 주사기에 넣는다. BOTOX®는 거품내기 또는 유사한 격렬한 교반에 의해서 변성되므로, 희석제는 서서히 바이알에 주입한다. 재구성된 BOTOX®는 효능의 손실이 거의 없이 30일까지 효능을 유지하는 것으로 보고되었다. 이 기간 동안, 재구성된 BOTOX®는 냉장고(2 내지 8℃)에 보관한다. 재구성된 BOTOX®는 투명하고, 무색인 액체로, 입자 물질이 없다. 진공건조된 제품은 냉동고에서 -5℃이하로 보관한다.
본 발명은 미생물(클로스트리디움 보툴리눔 박테리아와 같은)의 배양 및 발효에 사용되는 동물 산물 또는 동물 부산물이 없거나 실질적으로 없이도 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 생산할 수 있는 배지 및 프로세스를 알아낸 것에 기초한다. 얻어진 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 활성 성분 약제학적 조성물을 제조하는 데 사용할 수 있다. 즉, 본 명세서에서는 상당히 감소된 레벨의 고기 또는낙농 부산물을 가지는 성장 배지를 개시하며, 바람직한 배지 실시형태는 실질적으로 이러한 동물 산물이 없다.
본 발명은 놀랍게도 동물-류 산물이 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위한 배지에 필요하지 않다는 것을 알아낸 것, 특히, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위해 이러한 배지에 전형적으로 사용되는 동물에 기초한 산물을 식물에 기초한 산물로 대체할 수 있다는 것을 알아낸 것을 포함한다.
박테리아의 성장 및 발효를 위해 현재 사용되는 배지는 보통 하나 이상의 동물 유래 성분을 포함한다. 본 발명에 따르면, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위한 바람직한 배지는 총 배지 중량의 약 5 내지 약 10% 이하로 동물 유래 산물을 포함한다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 범주에 속하는 배지는 총 배지 중량의 약 1 내지 약 5% 이하로 동물 유래 산물을 포함한다. 가장 바람직하게, 보툴리눔 독소의 생성을 위한 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위해 사용되는 모든 배지 및 배양물은 동물 유래 산물이 전혀 없다. 이러한 배지는 클로스트리디움 보툴리눔의 소량 또는 대량 발효를 위한 배지, 시드(1차) 배지 및 발효(2차) 배지를 접종하는 데 사용되는 클로스트리디움 보툴리눔의 성장 및 배양을 위한 배지뿐아니라 클로스트리디움 보툴리눔 배양물의 장기간 저장을 위해 사용되는 배지(예를 들어, 모 배양물)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 특정한 바람직한 실시형태에서, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장 및 보툴리눔 독소의 생성을 위한 배지는 동물에 기초한 산물을 대체하는 콩에 기초한 산물을 포함할 수 있다. 이와 달리, 콩에 기초한 산물 대신에, 쓴맛을 제거한 루피너스 캄페스트리스(Lupinus campestris)의 씨를 사용할 수 있다. 루피너스 캄페스트리스 씨의 단백질 성분은 콩의 단백질 성분과 매우 유사한 것으로 알려져 있다. 바람직하게, 이러한 배지는 가수분해되어 물에 용해가능한 콩 또는 루피너스 캄페스트리스 유래 산물을 포함한다. 그러나, 비용해성 콩 또는 루피너스 캄페스트리스 산물을 또한 본 발명에서 동물 산물을 대체하여 사용할 수 있다. 콩 또는 루피너스 캄페스트리스에 의해서 대체될 수 있는 일반적인 동물 유래 산물로는 비프 하트 인퓨젼(BHI), 박토-펩톤과 같은 동물 유래 펩톤 산물, 가수분해된 카세인, 및 동물의 젖과 같은 낙농 부산물이 포함된다.
바람직하게, 콩에 기초한 또는 루피너스 캄페스트리스에 기초한 산물을 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위한 배지는, 실질적으로 모든 동물-유래 산물이 식물-유래 산물로 대체되는 것을 제외하고는, 보통 사용되는 동물 산물을 포함한 배지와 유사하다. 예를 들어, 콩에 기초한 발효 배지는 콩에 기초한 산물, 글루코오스와 같은 탄소원, NaCl 및 KCl과 같은 염, Na2HP04, KH2P04와 같은 인산염-함유 성분, 철 및 마그네슘과 같은 2가 양이온, 철분말, 및 L-시스테인 및 L-티로신과 같은 아미노산을 포함하여 구성될 수 있다. 발효(2차) 배지의 접종을 위해 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물을 성장시키는 데 사용되는 배지(즉, 시드 또는 1차 배지)는 적어도 콩에 기초한 산물, NaCl과 같은 염의 공급원, 및 글루코오스와 같은 탄소원을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명은 동물-유래 산물이 실질적으로 없는 배지를 사용하여, 보툴리눔 독소의 생성을 최대화시키는 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위한 방법을 제공한다. 동물 부산물로부터 유래한 성분을 대체하는 콩 부산물을 포함하는 배지에서 발효시켜, 보툴리눔 독소의 생성을 위해 클로스트리디움 보툴리눔을 성장시킬 수 있다. 발효 배지를 위한 접종물은 유사한 스케일의 성장 배지(시드 배지)로부터 유래한 것일 수 있다. 발효 단계의 크기 및 부피에 따라, 배양물의 바이오매스(biomass)를 증가시키기 위해 시드 배지(seed medium)에서 연속되는 성장의 횟수는 다양하다. 발효 배지에 접종하기에 적합한 양의 클로스트리디움 보툴리눔을 성장시키기 위하여, 시드 배지에서의 성장을 포함하는 1단계 또는 다중 단계가 실시될 수 있다. 동물 유래 산물이 없는 클로스트리디움 보툴리눔 성장 방법에서, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장은 비-동물 유래 배지에서 보관된 배양물로부터 유래하는 것이 바람직하다. 저장된 배양물, 바람직하게는 동결건조된 배양물은 콩으로부터 유래하며 동물 부산물이 없는 단백질을 포함하는 배지에서 성장되어 제공된다. 저장된, 동결건조된 배양물로부터 직접 접종에 의해서 발효 배지의 클로스트리디움 보툴리눔이 성장된다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장은 2단계-시드 성장 및 발효로 진행된다. 이 두가지 단계 모두 혐기성 환경에서 진행된다. 시드 성장 단계는 일반적으로 저장된 배양물로부터 미생물의 양을 "스케일-업(scale-up)"하는 데 사용된다. 시드 성장 단계의 목적은 발효에 사용할 수 있는 미생물의 양을 증가시키는 것이다. 또한, 시드 성장 단계는 저장된 배양물 내의 상대적으로 휴지상태인 미생물이 원기를 회복하여 활발히 성장하는 배양물로 성장하도록 해준다. 또한, 발효 배지를 접종하는 데 사용되는 생육가능한 미생물의 부피 및 양은, 저장된 배양물에서 보다 활발히 성장하는 배양물에서 더욱 정밀하게 제어될 수 있다. 따라서, 발효 배지에 접종하기 위한 시드 배양물의 성장이 바람직하다. 또한, 발효 배지에 접종하기 위한 클로스트리디움 보툴리눔 양을 스케일-업 하는 시드 배지에서의 성장을 포함하는 연속되는 몇번의 단계들을 사용할 수 있다. 특히, 발효 단계에서의 클로스트리디움 보툴리눔의 성장은 직접 접종에 의해 저장된 배지로부터 직접 실시될 수 있다.
발효 단계에서, 시드 성장물로부터 클로스트리디움 보툴리눔을 포함하는 시드 배지의 일부분 또는 시드 배지 전체를 발효 배지를 접종하는 데 사용할 수 있다. 바람직하게, 시드 성장 단계로부터 클로스트리디움 보툴리눔을 가지는 시드 배지의 약 2-4%를 발효 배지를 접종하는 데 사용한다. 발효는 대규모의 혐기성 환경에서 최대량의 미생물을 생성시키는 데 사용된다(Ljungdahl et al., Manual of industrial microbiology and biotechnology (1986), edited by Demain et al, American Society for Microbiology, Washington, D.C. page. 84).
보툴리눔 독소는 단백질 정제 기술분야의 당업자에게 공지된 단백질 정제 방법을 사용하여 분리 및 정제할 수 있다(Coligan et al. Current Protocols in Protein Science, Wiley & Sons; Ozutsumi et al. Appl. Environ. Microbiol. 49 ; 939-943: 1985).
보툴리눔 독소의 생성시, 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물을 발효 배지의 접종을 위해서 시드 배지에서 성장시킬 수 있다. 시드 배지의 성장을 포함하는 연속되는 단계의 횟수는 발효단계에서 보툴리눔 독소 생산의 규모에 따라 다양하다. 그러나, 앞서 논의한 바와 같이, 발효 단계에서의 성장은 저장된 배양물로부터 접종하여 직접적으로 진행될 수 있다. 동물에 기초한 시드 배지는 일반적으로 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위하여, BHI, 박토-펩톤, NaCl 및 글루코오스를 포함하여 구성된다. 앞서 논의한 바와 같이, 동물에 기초한 성분이 비-동물 성분으로 대체되는 대체 시드 배지가 본 발명에 따라 제조될 수 있다. 이에 제한되지는 않지만, 예를 들어, 콩에 기초한 산물이, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장 및 보툴리눔 독소의 생성을 위한 시드 배지의 BHI 및 박토-펩톤을 대체할 수 있다. 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물은 비용해성 콩을 포함하는 배지에서 성장할 수 있지만, 콩에 기초한 산물은 물에 용해가능한 가수분해된 콩을 포함하는 것이 바람직하다. 성장 레벨 및 다음에 이어지는 독소 생성이 용해성 콩 산물로부터 유래한 배지에서 더 크다.
콩에 기초한 산물의 어떤 공급원(source)을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 바람직하게, 콩은 가수분해된 콩이며, 가수분해는 비-동물 효소를 사용하여 실시된다. 가수분해된 콩의 공급원은 다양한 상업적 공급자로부터 입수가 가능하다. 가수분해된 콩의 공급원은 Hy-Soy (Quest International), Soy peptone (Gibco) Bac-soytone (Difco), AMISOY (Quest), NZ soy (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7, SE50M (DMV International Nutritionals, Fraser, N. Y. ), 및 SE50MK (DMV)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 가장 바람직하게, 가수분해된 콩의 공급원은 Hy-Soy 또는 SE50MK이다. 가수분해된 콩의 다른 가능한 공급원들이 공지되어 있다.
본 발명에 따른 시드 배지 중의 Hy-Soy의 농도는 25-200 g/L의 범위이다. 바람직하게, 시드 배지 중의 Hy-Soy의 농도는 50-150 g/L이다. 가장 바람직하게, 시드 배지 중의 Hy-Soy의 농도는 약 100 g/L이다. 또한, NaCl의 농도는 0.1-2.0 g/L 사이의 범위이다. 바람직하게, NaCl의 농도는 0.2-1.0 g/L 사이의 범위이다. 가장 바람직하게, 시드 배지 중의 NaCl의 농도는 약 0.5 g/L 이다. 글루코오스의 농도는 0.1g/L 내지 5.0g/L 사이의 범위이다. 바람직하게, 글루코오스의 농도는 0.5-2.0g/L 사이의 범위이다. 가장 바람직하게, 시드 배지 중의 글루코오스의 농도는 약 1.0g/L이다. 시드 배지의 다른 성분들과 함께 고압멸균하여 글루코오스를 멸균하는 것이 또한 바람직하나 본 발명에 필수적인 것은 아니다. 성장 전 시드 배지의 바람직한 pH 레벨은 7.5-8.5 사이의 범위이다. 예를 들어, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장 전 시드 배지의 pH는 약 8.1이다.
시드 배지에서의 클로스트리디움 보툴리눔의 성장은 하나 이상의 단계로 진행될 수 있다. 바람직하게, 시드 배지에서의 성장은 두 단계로 진행된다. 단계 1에서, 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물을 다량의 시드 배지 중에 현탁하고, 혐기성 환경 하에 34±1℃에서 24-48시간 동안 배양한다. 바람직하게, 단계 1에서의 성장은 약 48시간 동안 진행된다. 단계 2에서, 더욱 성장시키기 위하여 클로스트리디움 보툴리눔을 함유하는 단계 1 배지의 일부분 또는 전체를 사용하여 단계 2 시드 배지를 접종한다. 접종 후에, 단계 2 배지를 역시 혐기성 환경 하에 34±1℃에서 약 1-4일 동안 배양한다. 바람직하게, 단계 2 시드 배지에서의 성장은 약 3일간 진행된다. 어떤 단계에서든 시드 배지에서의 성장은, 시드 배지에서의 최종 성장물로 발효 배지를 접종하기 전에, 세포 용해를 야기하지 않는 것이 또한 바람직하다.
클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위한 동물 부산물을 함유하는 표준 발효 배지는 Mueller 및 Miller(MM; J. Bacteriol. 67: 271,1954)의 레시피에 기초할 수 있다. 동물 부산물을 함유하는 MM 배지의 성분들은 BHI 및 NZ-CaseTT를 포함한다. NZ-CaseTT는 상업적으로 입수가능한 펩티드 및 아미노산의 공급원으로, 동물 젖에서 발견되는 단백질의 일종인 카세인의 효소 소화로부터 유래한다. 본 발명은 비-동물에 기초한 산물이 발효 배지에서 BHI 및 NZ-CaseTT를를 대체할 수 있음을 입증한다. 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 콩에 기초한 산물이, 클로스트리디움 보툴리눔의 발효에 사용되는 MM 배지의 동물에 기초한 성분들을 대체할 수 있다. 바람직하게, 콩에 기초한 산물은 물에 용해가능하며, 가수분해된 콩으로부터 유래한 것이지만, 상기에서 논의한 바와 같이, 비용해성 콩 산물을 또한 본 발명의 실시에 사용할 수 있다.
콩에 기초한 산물의 어떤 공급원이든 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 바람직하게, 가수분해된 콩은 상표명 Quest International (Sheffield), Hy-Soy로 부터, 또는 상표명 DMV International Nutritionals (Fraser, N. Y. ), SE50MK로부터 얻는다. Soy peptone (Gibco) Bac-soytone (Difco), AMISOY (Quest), NZ soy (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7, 및 SE50MK (DMV International Nutritionals, Fraser, N. Y.)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 공급원으로부터 용해가능한 콩 산물을 또한 얻을 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시형태에서, 클로스트리디움 보툴리눔의 발효에 사용되는 배지는 동물 부산물이 없으며 가수분해된 콩, 글루코오스, NaCl, Na2HP04, MgSO47H2O, KH2P04, L-시스테인, L-티로신 및 철분말을 포함하여 구성된다. 시드 배지에서 설명한 바와 같이, 가수분해된 콩은 발효배지의 동물 부산물을 대체할 수 있다. 이러한 동물 부산물로는 BHI 및 NZ-CaseTT(효소적으로 소화된 카세인)이 포함된다.
보툴리눔 독소의 생성을 위한 발효 배지 중의 Hy-Soy의 농도는 바람직하게 약 10-100g/L 사이의 범위이다. 바람직하게, Hy-Soy의 농도는 약 20-60 g/L 사이의 범위이다. 가장 바람직하게, 발효 배지 중의 Hy-Soy의 농도는 약 35 g/L이다. 보툴리눔 독소의 최대 생성을 위하여, 발효 배지 중의 성분들의 특히 바람직한 농도는 약 7.5g/L 글루코오스; 5.0 g/L NaCl; 0.5g/L Na2HPO4 ; 175 mg/L KH2PO4; 50 mg/L MgS047H20; 125 mg/L L-시스테인; 및 125 mg/L L-티로신이다. 사용되는 철분말의 양은 50mg/L 내지 2000mg/L의 범위일 수 있다. 바람직하게, 철분말의 양은 약 100mg/L 내지 1000 mg/L 사이의 범위이다. 더욱 바람직하게, 발효 배지에 사용되는 철분말의 양은 약 200mg/L 내지 600mg/L의 범위이다.
독소 생성의 최적 레벨을 위하여, 콩에 기초한 발효 배지의 초기 pH(고압멸균 전)는 바람직하게 약 5.0 내지 7.1 사이의 범위이다. pH 제어가 보툴리눔 회수를 향상시킨다는 것을 알아내었다. 바람직하게, 발효 배지의 초기 pH는 약 7이다. 실시예 7에서 설명한 바와 같이, 그 후에 pH를 감소시켜 pH 5-5.5로 유지시키면, 고수율의 안정한 보툴리눔 독소를 얻을 수 있다는 것을 알아내었다. 시드 배지에서 설명한 바와 같이, 글루코오스 및 철을 포함한 발효 배지의 성분들은 멸균을 위하여 함께 고압멸균하는 것이 바람직하다.
바람직하게, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위해 사용된 두번째 단계 시드 배지의 일부분을 사용하여 발효 배지를 접종한다. 발효는 약 34±1℃의 혐기성 챔버에서 약 7 내지 9일간 일어난다. 배지의 광학 밀도(O.D.)를 측정하여 성장을 모니터한다. 성장 측정(광학 밀도)에 의해서 결정될 때, 적어도 48시간동안 세포 용해가 진행된 후에, 발효를 중단하는 것이 바람직하다. 세포가 용해될 때, 배지의 O.D.가 감소한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 클로스트리디움 보툴리눔의 장기간 보관 및 시드 배지의 접종을 위해 사용되는 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물은 4℃에서 저장되기 전에, 두유 중에서 성장 및 동결건조된다. 저장을 위해 동결건조된 동물 젖 중의 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물이 또한 보툴리눔 독소의 생성을 위해 사용될 수 있다. 그러나, 보툴리눔 독소의 생성 전체에 걸쳐 동물 부산물이 실질적으로 없는 배지를 유지하기 위해서, 클로스트리디움 보툴리눔의 초기 배양물을 동물의 젖이 아니라 두유에서 보존하는 것이 바람직하다.
본 발명의 실시형태를 하기의 도면으로 설명 및 도해한다.
도 1은 "N-공급원(즉, Hysoy + YE)% 대 효능 및 pH"에 대한 것으로, 결정한 보툴리눔 독소 활성을 나타내는 그래프이다: X 축에 표시된 wt% 양의 가수분해된 콩 농축물 및 효모 추출물 농도를 가진 APF 배지에 대해, 바(bar)의 상단에 표시된 경과된 발효 시간에서 다양한 APF 배지의 (1) 마우스 치사량 50(MLD 50)(속이 빈 바)이 왼쪽 Y 축에, 및; (2) SNAP 25 활성(빗금 바)이 왼쪽 Y 축에, APF 배지 pH에 대해서는 오른쪽 Y 축에 표시되어 있다. 도 1의 모든 배지는 또한 1 중량%의 글루코오스를 포함한다.
도 2는 세포 은행 생성, 배양 및 발효 단계에 걸쳐, 보툴리눔 독소를 얻기 위한 비-APF 프로세스(도 2의 위쪽)를본 발명의 범주에 속하는, 보툴리눔 독소를 얻기 위한 APF 프로세스(도 2의 아래쪽)와 비교한 요약 플로우 차트이다. 도 2는 채취 및 정제 단계는 생략하였다.
도 3은 부틸 세파로오스 패스트 플로우 컬럼에서 APF 정화 배양물(3:1:1 배양)의 소수성 상호작용 크로마토그래피로부터 얻어진 크로마토그래프이다. 도 3의 X 축은 컬럼을 통과한 액체(용리액)의 부피를 ml로 나타낸다. Y 축은 280nm에서의 흡광도를 mAU로 나타낸다.
도 4는 SP 세파로오스 고성능 컬럼에서 도 3의 부틸 컬럼으로부터 얻은 용리액의 이온 교환 크로마토그래피로부터 얻은 크로마토그래프이다. 도 4의 축들은 도 2의 축들과 동일하다.
도 5A는 도 3의 부틸 컬럼의 작동시 얻은 다양한 분취액들의 환원 SDS-PAGE 의 이미지이다. 도 5A의 좌측은 내림차순으로 분자량을 1000 달톤(kDa) 단위로 나타낸다. 도 5A의 아래쪽에 있는 1 내지 8의 숫자는 분취액이 로딩된 래인을 나타낸다.
도 5B는 도 4의 SP 컬럼 작동시 얻은 다양한 분취액들의 환원 SDS-PAGE의 이미지이다. 도 5B의 좌측 및 아래쪽은 도 5A에서와 동일하다.
도6은 후 컬럼 단계(도 6 참조), 즉, UF/DF 단계, 멸균 여과 단계, 및 암모늄 설페이트 침전단계에 얻어진 다양한 분취액들의 환원 SDS-PAGE의 이미지이다. 도 6의 좌측 및 아래쪽은 도 5A에서와 동일하다.
도 7은 본 발명의 범주에 속하는 APF 크로마토그래피 보툴리눔 독소 정제 프로세스의 순서도이다.
도 8은 APF 발효 프로세스에서 보툴리눔 독소 타입 A 복합체 생성에 대한 콩 단백질 농도의 효과를 비교한 그래프로, 여기서, 발효 배지는 1 wt%의 글루코오스 및 1 wt%의 효모 추출물을 포함한다. 도 8에서, X 축은 발효 배지에서 특정 가수분해 콩 단백질(HySoy)의 중량% 농도를 나타내며, 왼쪽 Y축은 최종 정제된 보툴리눔 독소 복합체의 효능을 나타내며, 오른쪽 Y 축은 다음 방정식으로 결정되는 완료된 세포 용해의 퍼센트를 나타낸다.
Figure 112006063785627-PCT00002
여기서, OD 600 max은 최대 성장 시점에 600nm에서 측정된 광학 밀도를 나타내 고, OD600 종료점은 발효 채취 시점에서의 광학밀도를 나타낸다.
다음 실시예는 본 발명에 포함되는 특정한 방법을 설명하며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 이들 실시예에서 달리 설명이 없는 한, "독소" 또는 "보툴리눔 독소"는 분자량 약 900 kDa을 갖는 보툴리눔 독소 타입 A 복합체를 의미한다. 본 발명은 분자량 약 900 kDa을 갖는 보툴리눔 독소 타입 A 복합체의 정제 시스템 및 방법에 제한되지 않으며, 150kDa, 300kDa, 500kDa과 다른 분자량 독소, 복합체 및 보툴리눔 독소 세로타입의 정제에 쉽게 적용가능하다.
실시예 1
클로스트리디움 보툴리눔을 위한 동물 산물이 없는 시드 배지의 제조
배지 각 1 리터당 하기의 성분들을 사용하여, 대조구 시드 배지를 제조할 수 있다: NaCl(5g), 박토-펩톤(Bacto-peptone; 10g), 글루코오스(10g), BHI(1 리터가 될때까지), pH 8.1 (5 N NaOH로 조절).
배지 각 1 리터당 하기의 성분들을 사용하여, 테스트(동물 산물이 없는) 시드 배지를 제조할 수 있다: NaCl(5g), 소이-펩톤(Soy-peptone; 10g), 글루코오스(10g), Hy-Soy (35g/리터, 배지 유액 1 리터를 만들도록), pH 8.1 (5 N NaOH로 조절).
실시예 2
동물 산물이 없는 시드 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 배양하기
클로스트리디움 보툴리눔의 동결건조된 배양물을 각각 1ml의 실시예 1의 대조구 및 테스트 시드 배지에 현탁하고, 각각의 시드 배지를 10ml 담을 수 있는 두개의 튜브로 나누고(각각의 시드 배지를), 34℃에서 약 24-48시간 동안 배양할 수 있다. 그리고 나서, 1ml의 배양물을, 40ml의 (각각의) 시드 배지를 포함하는 125ml DeLong Bellco Culture Flask를 접종하는 데 사용할 수 있다. 접종된 배양물을 코이 혐기성 챔버(Coy Anaerobic Chamber; Coy Laboratory Products Inc., Grass Lake, Mich.)에서 33℃ ± 1℃에서 24시간 동안 배양할 수 있다.
실시예 3
클로스트리디움 보툴리눔을 위한, 동물 산물이 없는 발효 배지의 제조
배지 각 2 리터당 하기의 성분들을 사용하여, 기본 발효 배지를 제조할 수 있다: 글루코오스(15g), NaCl(10g), NaH2P04(1g), KH2P04(0.350g), MgS047H20(0.1g), 시스테인-HC(0.250g), 티로신-HCl(0.250g), 철분말(1g), ZnCl2 (0.250g), 및 MnCl2 (0.4 g).
배지 각 2 리터당 하기의 성분들을 사용하여, 대조구 발효 배지를 제조할 수 있다: BHI (500ml; 건조중량 약 45.5g의 비프 하트 인퓨젼에 상응한다.), NZ-CaseTT (30g), 및 기본 배지(2리터가 될때까지), pH 6.8.
일차로 기본 발효 배지를 제조하고, pH 6.8로 조절할 수 있다. 그리고 나서, 비프 하트 인퓨젼(BHI)을 제조하고, 5N NaOH를 사용하여 pH 8로 조절한다. 그리고 나서, BHI를 기본 배지에 가한다. 다음으로, NZ-CaseTT를 제조한다. 그리고 나서, NZ-CaseTT를, 이미 비프 하트 인퓨젼을 가한 기본 배지에 가하고, HCl을 가하여 용해시킨다. 그리고 나서, 5N NaOH를 사용하여 pH를 6.8로 조절할 수 있다. 이어서 이 배지를 각각 16개의 100mm 테스트 튜브에 8ml씩 나누어 담은 후, 120℃에서 25분간 고압멸균(autoclaving)한다.
대조구 발효 배지에 존재하는 BHI를 테스트 질소원으로 대체하여 테스트 발효 배지(동물 산물이 없는)를 제조할 수 있다. 적합한 테스트 발효 배지 질소원으로는, Hy-Soy (Quest), AMI-Soy (Quest), NZ-Soy (Quest), NZ- Soy BL4 (Quest), NZ-Soy BL7 (Quest), Sheftone D (Sheffield), SE50M (DMV), SE50 (DMV), SE%) MK (DMV), Soy Peptone (Gibco), Bacto- Soyton (Difco), Nutrisoy 2207 (ADM), Bakes Nutrisoy (ADM) Nutrisoy flour, Soybean meal, Bacto-Yeast Extract (Difco) Yeast Extract (Gibco), Hy-Yest 412 (Quest), Hy-Yest 441 (Quest), Hy-Yest 444 (Quest), Hy-Yest (455 (Quest) Bacto-Malt Extract (Difco), Corn Steep, and Proflo (Traders)이 포함된다.
BHI를 빼고, 상응하는 질소원은 3N HCl 또는 5N NaOH를 사용하여 일차로 pH 6.8로 조절하는 것을 제외하고는 대조구 발효 배지에 대하여 설명한 바와 같이 테스트 발효 배지를 제조할 수 있다. 16개의 100ml 테트스 튜브에 배지를 8ml씩 배분한 다음, 120℃에서 20-30 분간 고압멸균할 수 있다.
실시예 4
동물 산물이 없는 발효 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 성장시키기
테스트 시드 배지 배양물(동물 산물이 없는) 40㎕를 사용하여, 8ml 16 X 100mm 테스트 튜브에 들어있는 각각 8ml의 대조구 또는 테스트 발효 배지를 접종할 수 있다. 그리고 나서, 배양물을 33±1℃에서 24시간동안 배양한다. 그리고 나서, 튜브들을 혐기성 챔버에서 배양하여 박테리아가 성장하게 한다. 각각의 배지 에세이를 3중으로 실시한다(즉, 동일한 배지를 독립적으로 3회 접종하는 것을 포하며, 또한 분광광도계 사용시 바탕값으로 사용할 수 있는 비-접종 배지를 포함할 수 있다). 660 nm에서 Turner Spectrophotometer(Model 330)를 사용하여 24시간마다 성장정도(광학 밀도에 의해서 결정됨, OD)를 측정할 수 있다. 세포 용해가 약 48시간 동안 지속된 후에는 배양을 중단하여야 하며, 그 후, 보툴리눔 독소 생성을 측정할 수 있다.
배지 각 500ml 당 하기의 성분들을 포함하는, Hy-Soy 발효 배지를 사용하여 추가적인 실험을 실시한다: Hy-Soy(17.5g), 글루코오스(3.75g); NaCl(2.5g); Na2HP04 (0.25g), MgS047H20 (0.025g), KH2P04 (0.0875g), L-시스테인 (0.0625g), L- 티로신 (0.0625g), 철분말 (0.25 g), pH 6.8
실시예 5
동물 산물이 없는 발효 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔을 성장시켜 얻은 보툴리눔 독소 생성의 결정
실시예 4에서 배양된 세포를 원심분리한 다음, 상청액의 pH를 결정한다. 표준 항독소를 가하고 응집전 경과시간을 측정하여, 주어진 샘플에서 보툴리눔 독소의 레벨을 측정할 수 있다. Kf(응집이 나타나는 데 필요한 시간, 분) 및 Lf(응집 한계(the limit of flocculation); 응집에 의해 정해질 때, 표준 항독소의 1 국제 유닛(1 international unit)과 동등함)을 결정할 수 있다. 주어진 배양을 위해 각각의 발효 튜브로부터 4ml의 발효 브로스(fermentation broth)를 취하여, 함께 합하여 총 12ml를 15ml 원심분리 튜브에서 섞을 수 있다. 튜브들을 5000rpm(3400g)으로 4℃에서 30분간 원심분리할 수 있다. 상청액 1ml씩을 0.1-0.6ml의 표준 보툴리눔 독소 항혈청을 포함하는 튜브에 가하고, 튜브들을 조심스럽게 흔들어서 내용물들을 섞을 수 있다. 그리고 나서, 튜브들을 45±1℃ 수조에 넣고, 시작 시간을 기록할 수 있다. 튜브들을 자주 체크하여, 응집이 시작될 수 있는 시간을 Kf로 기록할 수 있다. 응집이 처음 시작될 수 있는 튜브내 독소의 농도를 LfFF로 나타낼 수 있다. 응집이 두번째로 시작되는 튜브내 독소의 농도를 LfF로 나타낼 수 있다.
발효, 성장 및 독소 생성에 대하여 병렬 에세이를 실시할 수 있다:(a) 대조구 시드 배지(대조구 발효 배지를 접종하는 데 사용) 및 대조구 발효 배지, 및; (2) (동물 산물이 없는) 테스트 시드 배지(테스트 발효 배지를 접종하는 데 사용) 및 (동물 산물이 없는) 테스트 발효 배지. 특히, 동물 산물이 없으며, 또한 동물 산물이 없는 배양물로 접종되는 배지(동물 산물 대신에 콩에 기초한 산물로 대체)에서 클로스트리디움 보툴리눔의 발효는 약 50 이상의 Lftoxin의 결과를 얻을 수 있는 것으로 결정할 수 있다. 최소로, Lftoxin은 약 10이다. 바람직하게, Lftoxin은 적어도 20이다. 가장 바람직하게, Lftoxin는 50이상이다.
또한, 다양한 콩 산물이 BHI가 배제된 발효 배지에서 클로스트리디움 보툴리 눔의 성장을 지원하는 것으로 결정할 수 있다. 따라서, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장에 있어서 용해성 콩 제품이 BHI를 대체할 수 있다. 가장 좋은 농도는 12.5 또는 25g/L이다. Hy-Soy(Sheffield)가 가장 높은 성장정도를 제공한다. 비용해성 콩 제품은 덜 효과적이다.
또한, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장에 있어서 BHI를 대체하는 능력에 있어서 Quest Hy-Soy, DMV SE50MK, 및 Quest NZ-Soy가 효과적인 콩 산물이라는 것을 보여주는 결과를 얻을 수 있다. 결과는 성장에 있어 최적인 콩 산물(Quest Hy-Soy, DMV SE50MK, 및 Quest NZ-Soy와 같은)이 또한 독소 생성을 위한 BHI를 대체하는 데 있어서도 효과적이라는 것을 입증한다. 독소 생성에 있어서 최상의 콩 산물은 22.75 g/l의 Quest Hy-Soy이다. 이 산물의 더 높은 농도에서는 성장이 더 좋으나, 독소 생성이 향상되지 않는다. 제안된 SE50MK를 사용시, 농도가 더 높으면 성장이 증가되나 독소 생성이 증가되지는 않는다는 유사한 결과를 얻을 수 있다. 다른 한편, NZ-Soy는 더 높은 농도에서 더 높은 성장 및 더 높은 독소 생성을 제공한다.
마지막으로, 콩 산물이 효과적으로 BHI뿐아니라 NZ-CaseTT를 대체할 수 있다고 결정할 수 있다. 콩에 기초한 배지에서 NZ-CaseTT를 제거하면 약 2-4배 성장이 감소된다. NZ-CaseTT의 존재 및 부재 모두에 있어서 성장을 위한 최상의 콩 산물은 SE50MK이다. Hy-soy는 독소 생성을 위한 BHI와 NZ-CaseTT를 모두 대체할 수 있다. 그러나, 1 또는 2일이 걸리는 장기간의 발효 사이클이 필요하다. Hy-Soy는 독소 생성을 위한 배지에서 BHI와 NZ-CaseTT를 모두 대체할 수 있다. 그러나, 효 모 추출물은 독소 생성을 억제할 수 있는 것으로 결정할 수 있다.
22.75 g/l의 Hy-Soy가 독소 생성을 위한 BHI 및 Hy-CaseTT 모두를 완전히 대체할 수 있는 것으로 결정할 수 있다. 성장에 대한 효과에 있어서는 56.88 g/l의 Hy-Soy가 최상인 것과 달리, 독소 생성 단계에서는 34.13g/l의 Hy-Soy가 최상일 수 있다.
따라서, 놀랍게도 Hy-Soy 또는 [Hy-Soy + Hy-Yeast]가 클로스트리디움 보툴리눔의 시드 성장을 위한 배지에서 BHI 및 박토-펩톤을 대체할 수 있는지 결정하였다. 또한, 클로스트리디움 보툴리눔에 의한 보툴리눔 독소 생성의 최대 레벨을 제공하는 시드 배지 성분들의 최적 농도를 결정하도록 실험을 설계할 수 있다. BHI 및 NZ-CaseTT가 없는 시드 배지 및 발효 배지에서의 클로스트리디움 보툴리눔 성장에 의한 독소 생성은 BHI 및 NZ-CaseTT를 포함하는 배지에서 얻어지는 레벨과 같거나 그 이상일 수 있다.
시드 배지에서의 성장을 위한 Hy-Soy 또는 [Hy-Soy + Hy-Yeast]의 최적 농도를 결정할 수 있다. 실험들은 Hy-Soy가 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위한 시드 배지에서 질소원으로서 및 이어지는 발효 단계에서 보툴리눔 독소의 생성을 위한 질소원으로서 BHI 및 박토-펩톤을 대체할 수 있다는 것을 확인시켜 준다. 또한, 시드 배지에서의 질소원으로서의 Hy-Soy는, Hy-Soy + Hy-Yeast와 비교할 때, 이어지는 발효 단계에서 더 높은 레벨의 보툴리눔 독소를 제공할 수 있다. 최적 레벨의 독소를 생성하는 시드 배지에서의 Hy-Soy의 농도는 약 62.5g/l 내지 100g/l범위이다.
추가적인 실험들은 클로스트리디움 보툴리눔 발효에 의한 보툴리눔 독소의 최대 생성을 위한 시드 배지에서의 Hy-Soy의 최적 농도를 결정하기 위하여 설계될 수 있다. 즉, 시드 배지에서 30g, 50g, 75g 및 100g의 Hy-Soy가 모두 클로스트리디움 보툴리눔의 발효에 의한 보툴리눔 독소의 생성을 가져왔으며, 이는 질소원으로서 BHI 및 박토-펩톤을 함유하는 시드 배지에서 만들어지는 보툴리눔 독소의 레벨과 동등하거나 넘어서는 것이다.
시드 배지에서 100g/l 농도의 Hy-Soy가 이어지는 발효 단계에서 최대 레벨의 독소 생성을 가져온다는 것을 알 수 있다. 또한, 데이터는 시드 단계-1의 Hy-Soy 시드 배지가 24시간 후보다는 48시간 후에 더 큰 성장을 제공한다는 것을 나타낸다.
실시예 6
보툴리눔 독소를 얻기 위한 비-APF 프로세스
클로스트리디움 보툴리눔 박테리움을 발효시켜 클로스트리디움 독소를 얻었다. 따라서, 고도로 강력하고 고도로 정제된 클로스트리디움 보툴리눔 독소(즉, 벌크 독소)를 얻기 위해 변형된 Schantz(비-APF) 프로세스를 실시하였다. 변형된 Schantz(비-APF) 프로세스는 고수율의 보툴리눔 독소를 제공할 수 있다. Schantz 및 변형된 Schantz 프로세스는 모두 모든 발효 배지에 카제인을 사용한다.
모 배양물(stock culture) 제조
다양한 클로스트리디움 박테리아는 ATCC(American Type Culture Collection)(Manassas, Verginia)로부터 이용가능하다. 선택적으로, 클로스트리디 움 보툴리눔을 토양을 포함하는 다양한 소스로부터 분리함으로써, 또는 부패 동물 시체의 (혐기성(anaerobic) 또는 유사-혐기성(quasi-anaerobic) 위치에서의) 디프(deep) 샘플링을 통해, 클로스트리디움 보툴리눔 세포 뱅크 바이알을 제조할 수 있다. 일반적으로, 클로스트리디움 보툴리눔은 보툴리즘으로 진단된 환자의 생리학적 유체 샘플(즉 상처 보툴리즘을 갖는 환자료부터의 상처 교환물)로부터 얻을 수 있다. 도 1의 최상부 반은 세포 뱅크 바이알을 제조하기 위해 및 보툴리눔 독소의 배양 및 발효를 위해 사용된 비-APF 프로세스를 요약한다.
자연 또는 환자 소스(source)로부터 얻어진 클로스트리디움 보툴리눔을 혈액 아가 플레이트 상에서 배양하고, 이어서 세포 뱅크 바이알 배지 내에 고도 성장 콜로니들을 접종한다. 클로스트리디움 보툴리눔에 사용된 세포 뱅크 바이알 배지는 다진 신선한 소고기를 포함하는 익힌 고기 배지였다. 활발히 성장하는 배지를 글리세롤 과 혼합하여, 이후에 사용하기 위해 동결된 클로스트리디움 보툴리눔 박테리움의 세포 뱅크 바이알(즉 모 배양물)을 제조하였다.
배양(cultivations)
클로스트리디움 보툴리눔 세포 뱅크 바이알을 실온에서 녹인 후 네 배양 단계가 뒤따랐다. (1) 적합한 모르폴로지를 갖는 콜로니를 선택하기 위해, 녹인 세포 뱅크 바이알로부터의 분취액(aliquots)을, 예비-환원된(pre-reduced) 콜롬비아 혈액 아가 플레이트 상에서 박테리아를 스트리킹(streaking)하고 혐기적으로(anaerobically) 30-48시간동안 34℃±1°에서 배양하여 배양하였다. (2) 이어서 선택된 콜로니들을 카제인 성장 배지를 포함하는 테스트 튜브에 6-12시간동안 34℃ 에서 접종하였다. 이어서, 가장 빠른 성장 및 가장 높은 밀도를 갖는 튜브(성장 선택 단계)의 내용물을 두 셋-업(set-up) 혐기성 배양을 통해 더 배양하였다: (3) 1 리터 시드 배양 용기(bottle) 내의 34℃에서의 12-30 시간의 제 1 배양 후, (4) 카제인 성장 배지를 포함하는 25 리터 시드 발효기 내에서의 35℃에서의 6-16시간동안의 제 2 배양하였다. 이들 두 셋-업 배양은 pH 7.3의 물 중의 2% 카제인 가수분해물(카제인[우유 단백질] 소화물), 1% 효모 추출물 및 1% 글루코오스(덱스트로스)를 포함하는 영양 배지 내에서 실시되었다.
발효(fermentation)
셋-업 배양 후 60-96℃ 시간동안 35℃에서 카제인 함유 배지 내에서 상업적 규모(즉 115 리터) 발효기 내에서 조절된 혐기성 대기 하에 추가 배양하였다. 박테리아의 성장은 일반적으로 24-36 시간 후에 완료되며, 60-96 시간 발효 동안에 대부분의 세포는 용해(lysis)되어 보툴리눔 독소를 방출한다. Schantz 또는 변형된 Schantz 프로세스에서는 발효 배지 pH 의 조절이 요구되지 않는다. 세포 용해에 의해 방출된 독소는 배양 브로스 내에 존재하는 프로테아제에 의해 할성화된다. 선택적으로, 정화된 배양물이라고 하는 맑은 용액을 얻기 위해, 단일층 깊이 필터를 사용하여 이러한 배양 배지를 여과하여 전체 불순물(즉 전(whole) 세포 및 파열된 세포)을 제거할 수 있다.
채취(Harvest)
독소의 채취는, 황산을 사용하여 pH를 3.5까지 낮추어 원료(raw) 독소를 20℃에서 침전시킴으로써 수행될 수 있다. 이어서, 원료 독소는 한외미세여 과(ultramicrofiltration) 후 투석여과하여 농축되었다.
정제
이어서 채취된 조(crude) 독소를 소화(digestion) 용기에 옮기고 프로테아제 저해제 벤즈아미딘 하이드로클로라이드를 첨가하여 안정화시켰다. 핵산을 소화시키기 위해 DNase 및 RNase를 첨가하였다. 한외여과 및 투석여과 후, 독소를 세 침전 단계, 즉 산 침전, 차가운 에탄올 침전 및 황산암모늄 침전으로 정제하였다. 정제된 보툴리눔 신경독소 복합체(벌크 독소)를 2-8℃에서 인산나트륨/황산암모늄 내 현탁액으로서 저장하였다.
얻어지는 벌크 독소는 특이적 효과(potency)≥3×107 U/mg, A260/A278 0.60 이하 및 구별되는 젤 전기영동 상의 밴딩 패턴을 갖는 클로스트리디움 보툴리눔의 홀 A(Hall A) 균주로 만들어지고, 보툴리눔 독소 약제학적 조성물의 합성(compounding)에 사용하기 적합한 고품질 결정질 900 kD 보툴리눔 독소 타입 A 복합체였다.
합성은, 벌크 독소를 수배 희석하고, 하나 이상의 부형제(알부민 및 염화나트륨 등)와 혼합하여 독소 조성물을 형성하고, 조성물의 감압동결건조(lyophilizing), 동결 건조 또는 진공 건조에 의해서와 같이, 독소 조성물의 저장 및 선적에 안정한 형태를 제조하는 것을 포함할 수 있다.
Schantz 또는 변형된 Schantz 프로세스로부터 얻어진 정제된 보툴리눔 독소 복합체는, pH 7-8 완충액 내 이온 교환 컬럼으로부터 용리시켜 보툴리눔 독소 분자 로부터 비 독소 복합체 단백질을 분리시킴으로써, (발효된 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아의 타입에 따라) 약 150 kD의 분자량 및 1-2×108 LD50 U/mg 이상의 특이적 효과를 갖는 순수한 보툴리눔 독소 타입 A; 또는 약 156 kD의 분자량 및 1-2×108 LD50 U/mg 이상의 특이적 효과를 갖는 정제된 보툴리눔 독소 타입 B, 또는 약 155 kD의 분자량 및 1-2×107 LD50 U/mg 이상의 특이적 효과를 갖는 정제된 보툴리눔 독소 타입 F를 얻을 수 있다.
앞서 설명된 바와 같이, 한 측면에서 본 발명은, RNase 및 DNase와 같은 동물 유래 산물의 사용의 제거를 포함하여, 정화된 배양물 상에서 실시된 이러한 실시예 6에 설명된 채취 정제 단계가 제거된다.
실시예 7
보툴리눔 독소를 얻기 위한 APF 배지 및 프로세스
이 실시예 7은 고도로 강력하고 고도로 정제된 클로스트리디움 보툴리눔 독소 타입 A(즉 벌크 독소)를 얻기 위해 실시된 APF 프로세스를 설명한다. 상기 프로세스는 다른 보툴리눔 독소 세로타입(serotypes)과 함께 사용될 수 있다.
모 배양물 제조
실시예 6에서 설명된 바와 같이, ATCC로부터, 자연의 다양한 소스로부터 또는 보툴리즘 환자로부터 클로스트리디움 보툴리눔을 얻을 수 있다. 도 1의 최저부 반은 셀 뱅크 바이알을 제조하기 위해 및 보툴리눔 독소의 배양 및 발효를 위해 사 용된 APF 프로세스를 요약한다. APF 세포 뱅크 바이알은 플랜트(plant) 아가 플레이트 상에서 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하여 제조하였다. 플랜트 아가 플레이트는 콩(soy) 유도체 HySoy(Quest)를 효모 추출물 및 글루코오스와 3:1:1(중량%) 비율로 아가와 함께 혼합하고 세팅시킴으로써 제조되었다. 다른 시판 APF 아가 플레이트 또는 플레이트 제조용 탈수된 분말이 또한 적합한 것으로 밝혀졌다. 이어서 선택된 고성장 콜로니를 APF 셀 뱅크 바이알 배지 내에 접종하였다. 사용된 APF 세포 뱅크 바이알 배지는 가수분해된 콩 단백질, 효모 추출물(효모의 배양이나 이로부터 얻는 효모 추출물의 제조 프로세스에 어떤 동물 산물도 사용되지 않았다. 영양성분의 다른 비율(즉, 6:1:1, 6:0:1 및 6:3:1)이 또한 적합한 것으로 밝혀졌다.) 및 글루코오스를 3:1:1의 비율로 포함하였다. 사용된 가수분해된 콩 및 효모 추출물 농축물은 Quest International로부터 입수하였다. APF 배지 내 클로스트리디움 보툴리눔 배양물을 글리세롤과 결합시키고, 냉동바이알(cryovials)에 분취하고, 이후에 사용하기 위해 동결하였다. 생존능력의 손실 없이 1년 이상동안 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 저장하기 위하여 진보된 APF 배지가 사용될 수 있다. 냉동바이알 내의 이들 동결된 배양물 및 글리세롤 혼합물은 APF 세포 뱅크 바이알이다.
배양
APF 세포 뱅크 바이알을 실온에서 녹인 후 단일 배양 단계가 뒤따랐다: 이어서 1 리터 시트 배양 용기는 동일한 APF 배지(APF 세포 뱅크 바이알[저장] 배지는 APF 발효[성장] 배지와 상이할 수 있다)를 사용하여 APF 세포 뱅크 바이알 내용물로 직접(즉 혈액 아가 배양물 또는 튜브 성장 단계를 개재시키지 않고) 접종되었 고, 혐기성(질소) 대기에서 7.0의 초기 배지 pH로 35℃에서 15 내지 24시간동안 유지되었다.
발효(fermentation)
다음으로 시드 용기 배양물을, 혐기성(질소) 대기에서 최초 배지 pH를 7.0으로 하여, 35℃에서 52-72시간동안 유지된 APF 배지(가수분해된 콩 단백질, 효모 추출물 및 1% 글루코오스)를 포함하는 상업 규모 10 리터 제조 발효기로 옮겼다. 이후에(발효 개시 후 1-2시간 이내), pH를 낮춰 pH 5-5.5의 좁은 pH 범위로 유지하였다. 활성 보툴리눔 독소의 허용가능한 수율을 얻기 위하여 APF 발효 배지의 pH를 좁은 범위 이내로 조절할 필요가 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, pH 5-5.5 사이로 이와 같이 pH를 조절하면 보툴리눔 독소의 효과의 열화 및 손실이 실질적으로 방지되는 것으로 밝혀졌다. 발효동안에 세포의 대부분이 용해되고 보툴리눔 독소를 방출하며, 세포 용해에 의해 방출된 독소는 배양물 브로스 내에 존재하는 프로테아제에 의해 활성화되는 것으로 생각된다. 이러한 배양 배지를 단일층 깊이 필터를 사용해 여과하면 전체 불순물(즉 전 세포 및 파열된 세포)이 제거되고 그 결과 정화된 배양물이라고 하는 맑은 용액이 얻어진다.
채취(Harvest)
이어서 보툴리눔 독소의 채취는 실시예 6에서와 같이 프로세스될 수 있다(즉, 황산 침전 후 미세여과에 이어서 투석여과).
정제
이어서 독소의 정제는 실시예 6에서 설명된 바와 같이 프로세스될 수 있다: 즉 벤즈아미딘 하이드로클로라이드, 및 DNase 및 RNase의 첨가, 황산 침전, 차가운 에탄올 침전, 포스페이트 완충액 추출, 염산 침전, 포스페이트 완충액 추출 및 벌크 독소 저장.
실시예 6의 채취 및 정제 프로세스에 대한 대안으로서, 본 발명의 컬럼 크로마토그래피 프로세스가 실시될 수 있다.
얻어지는 벌크 독소는 특이적 효과(potency)≥3×107 U/mg, A260/A278 0.60 이하 및 구별되는 젤 전기영동 상의 밴딩 패턴을 갖는 클로스트리디움 보툴리눔의 홀 A(Hall A) 균주로 만들어지고, 보툴리눔 독소 약제학적 조성물의 합성(compounding)에 사용하기 적합한 고품질 결정질 900 kD 보툴리눔 독소 타입 A 복합체이다. 따라서, 보툴리눔 독소의 이러한 APF 프로세스는 고품질 독소를 생성할 수 있다.
APF 프로세스로부터 얻어진 정제된 보툴리눔 독소 복합체는, pH 7-8 완충액 내 이온 교환 컬럼을 통과시켜 이로부터 용리시켜 보툴리눔 독소 분자로부터 비 독소 복합체 단백질을 분리시킴으로써, (발효된 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아의 세로타입에 따라) 약 150 kD의 분자량 및 1-2×108 LD50 U/mg 이상의 특이적 효과를 갖는 보툴리눔 독소; 또는 약 156 kD의 분자량 및 1-2×108 LD50 U/mg 이상의 특이적 효과를 갖는 정제된 보툴리눔 독소 타입 B, 또는 약 155 kD의 분자량 및 1-2× 107 LD50 U/mg 이상의 특이적 효과를 갖는 정제된 보툴리눔 독소 타입 F를 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명자의 APF 배지를 사용함으로써 본 발명자는 보툴리눔 독소의 1.02×108 LD50 U/mg 의 특이적 효과를 갖는 보툴리눔 독소 타입 A 복합체를 얻을 수 있었다.
이 실시예 7에서, 1 wt% 또는 2 wt% 글루코오스를 갖는 APF 배지를 사용하였고(1% 글루코오스는 배양 배지 100ml당 글루코오스 1g을 의미하고, 2% 글루코오스는 배양 배지 각 100ml에 대해 글루코오스 2g이 존재하는 것을 의미한다), 1% 글루코오스 APF 배지 내에서 약 20시간 발효 후 vs 2% 글루코오스 APF 배지 내 약 40시간 발효 후에, (배양물의 피크 광학 밀도[광학 밀도는 600nm에서 측정되었다]로 결정되는 바와 같이) 최대 박테리아 성장이 일어나지만, 배지의 글루코오스 함량이 그렇게 변화됨에 따라 피크 광학 밀도는 크게 변하지 않은 것으로 결정되었다. 세포 자가분해 및 독소 방출의 결과, 약 55 시간의 발효 후 (활성 독소에 대하여 SNAP-25 어세이로 결정되는 바와 같이) 1% 글루코오스 APF 배지 내에서 최대량의 활성 보툴리눔 독소가 얻어졌으나, 2% 글루코오스 APF 배지에서는 이후에 (활성 독소에 대하여 SNAP-25 어세이로 결정되는 바와 같이) 배지 내에서 상기 양의 활성 보툴리눔 독소가 존재하였고, 65 시간의 발효 후에 여전히 증가하는 것으로 생각되었다. 따라서, 더 신속한 보툴리눔 독소 방출은 보다 적은(1%) 글루코오스 APF 배지 존재량을 사용하여 일어났으며, 더 효율적인 독소 제조 프로세스(즉 시간 단위 당 더 많은 양의 독소가 얻어짐)는 보다 적은(1%) 글루코오스 APF 배지를 사용하여 실시될 수 있는 것으로 나타났다.
도 1로 알 수 있는 바와 같이, APF 배지 내 보툴리눔 독소를 제조하기 위한 최적의 파라미터는 다음 파라미터: (1) APF 발효 배지 내의 가수분해된 콩 단백질 약 6 중량%(도 1의 "HySoy Conc."), (6 중량% 콩은 배양 배지 100ml 당 콩 단백질 6g을 의미한다); (2) APF 발효 배지 내 0% 내지 3% 효모 추출 농축물(도 1의 "YE Conc."); (3) 혐기성(질소 대기) 조건 하 33-35℃의 온도에서 50-72 시간의 발효; (4) 발효 기간 전반에 걸쳐 약 pH 5.0 내지 5.5로 유지된 발효 배지의 pH, 및 (5) APF 발효 배지 내 1 중량% 글루코오스를 결합시킨 것으로 또한 결정되었다. 본 발명자는, 배양 및/또는 발효 배지 내의 1-2 중량% 글루코오스가 우수한 것으로 결정하였다.
발효 배지 내 글루코오스 및 효모 농도가 모두 1 중량%로 각각 일정하게 유지되지만 발효 배지 내 (HySoy와 같은) 콩 단백질 영양분 함량이 1 내지 6 중량%로 다양하였을 때, 세포 용해는 66-100%로 다양하였고 보툴리눔 독소 복합체 효과는 마우스 LD50 어세이를 사용하여 결정되는 바와 같이, 1.3x106 단위/mL 내지 4.7x106 단위/mL 로 다양한 것으로 밝혀졌다(도 8 참조).
따라서, 보다 많은 단백질이 (APF 배지 내 HySoy 및 YE의 총량으로서) 존재함에 따라 도 1에 도시된 바와 같이, 배지의 pH는, 얻어지는 낮은 독성 안정성과 함께 증가하는 경향이 있으며, 배지 내 동일한 총 단백질 영양분 함량으로 pH가 낮 춰졌을 때 독소 산물 수율은 급격하게 증가하였다. 비-APF 프로세스에서, 총 단백질 함량은, pH가 상승하는 경향이 없도록 낮춰지고, 따라서 독소 산물에 유해한 효과를 갖도록 pH가 상승되지 않는다. 도 1은, 배지의 pH가 약 5.3 내지 5.5의 좁은 범위 이내로 조절되었을 때 (MLD50 및 SNAP-25 어세이로 결정된 바와 같이) 일관되게 더 활성이었다는 것을 도시한다. 도 1은 또한, 6% 가수분해된 콩 및 1% 효모 추출물을 포함한 배지를 사용하여 더 높은 독소 수율(SNAP 25 어세이로 결정된 바와 같이)이 얻어졌다는 것을 보여준다.
사용된 SNAP-25 어세이는, 보툴리눔 독소의 SNAP-25 단백질 가수분해 활성을 측정하기 위한 ELISA 계 방법이었다. SNAP-2는 25kDa 분자량의 시냅토솜 관련 단백질에 대한 약자이다. SNAP-25는 뉴런 엑소시토시스(neuronal exocytosis)에 관여하는 206 아미노산 원형질막 단백질이다. 어세이는 문헌(Ekong T., et al., Recombinant SNAP-2 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro, Microbiology(1997), vol 143, pages 3337-3347)에 개시된 방법에 기초한다. 어세이는, 폴리스티렌 96 웰 미량역가 플레이트에 결합된 끝을 자른(truncated) SNAP-2 단백질(206 아미노산 잔기 단백질) 및 환원된 보툴리눔 독소 타입 A에 의한 SNAP-25의 아미노산들 197 및 197 간의 효소 가수분해로 만들어진 분해 산물(197 아미노산 잔기 펩티드)을 인식하는 모노클로날 항체를 사용한다. 이어서 분해된 산물에 결합된 모노클로날 항체는 이차 항체(호오스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제[HRP]에 컨쥬게이트된 염소 항마우스 IgG)로 검출되고, 이는 발색성 기판(TMB)의 존재시 색이 변화한다.
MLD50(마우스 50% 치사량) 어세이는 어세이 시작시 각각 17-22g이 나가는 암놈 마우스들(약 4주령)에 보툴리눔 독소를 복강내 주입하여 보툴리눔 독소의 효과를 측정하는 방법이다. 각 마우스는 머리를 아래로 기울인 반듯이 드러누운 위치로 유지되며, 염수 내 보툴리눔 독소의 수회 일련 희석물 중 하나가 25 내지 27 게이지 3/8" 내지 5/8" 니들을 사용하여 약 30도의 각으로 오른쪽 하무 복부 내에 복강내 주입된다. 각 희석물에 대하여 뒤이은 72시간에 걸쳐 치사율이 기록된다. 희석물은, 가장 많이 농축된 희석물이 주입받은 마우스의 약 80%의 치사율을 나타내고 가장 낮은 농도의 희석물이 주입받은 마우스의 20% 이하의 치사율이 되도록 제조된다. 치사율 감소 범위가 단조로운 희석물이 적어도 네개가 되어야 한다. 단조로운 감소 범위는 80% 이상의 치사율과 함께 개시된다. 넷 이상의 단조로운 감소율 내에서, 가장 큰 두 비율 및 가장 작은 두 비율들이 감소되어야 한다(즉, 등가가 아니다). 마우스의 50%가 주입 관찰 기간 후 3일 이내에 사망하는 희석물은 보툴리눔 독소의 일 단위(1U)를 포함하는 희석물로 정의된다.
유의적으로, 이 실시예 7의 APF 프로세스는, 적어도: (1) 세포 뱅크 바이알 익힌 고기 배지를 APF 배지로대체하고; (2) 혈액 아가 콜로니 선택 단계를 없애고; (3) 연이은 카제인 배지 계 튜브 성장 단계를 없애고; (4) 비-APF 발효 배지를 APF 배지로 완전히 대체함으로써 실시예 6의 비-APF 프로세스와 상이하다.
도 2는 산업 규모(비-APF) Schantz 프로세스(실시예 6) 및 실시예 7의 산업 규모의 APF 프로세스 간의 세포 뱅크 형성, 배양 및 발효 단계를 통한 차이를 요약해 나타낸다. 도 2는 채취 및 정제 단계는 생략한다.
APF 배지는 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아에 대해 선별하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 실시예 6 및 실시예 7의 초기 배양 단계의 동시 실행으로, APF 배지 내 또는 상의 보툴리눔 독소의 성장 및 생산에 도움이 되는 특성을 갖는 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 분리 및 성장시킬 수 있다. 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아의 비-APF 배지로부터 APF 배지로의 이동은, 새로운 환경에 적합화될 수 있는 박테리아를 풍부하게 하고 선택하거나 새로운 환경에서 성장 및 생산될 수 없는 박테리아를 선택성 소멸시킨다.
실시예 8
보툴리눔 독소를 정제하기 위한 크로마토그래피 시스템 및 방법
실험에 사용된 화학물질을 실시예 8에 개시하며, 이하의 것이 포함되었다:
10 N NaOH(Mallinckrodt, VWR Cat# MKH38505)
아세트산, USP/FCC 등급, 99.5-100.5%(J.T.Baker, Cat# JT9522-2)
황산암모늄, 초순수, 99%(ICN, Cat# IC808211)
시트르산, USP/FCC 등급, 99.5-100.5%(J.T.Baker, Cat# JT119-1)
에탄올, 무수, 변성됨(JT Baker, Cat# 9299-1)
염산, NF/FCC 등급, 36.5-38%-Mallinckrodt-MK2612-14
인산, NF/FCC, 85%-88%(Mallinckrodt, Cat# MK278814)
나트륨 아세테이트 트리하이드레이트, 99%-101%, USP/FCC(Mallinckrodt, Cat# MK735602)
염화나트륨, USP/FCC 등급, 99.0-101.0(J.T.Baker, Cat # MK753204)
시트르산 나트륨, USP/FCC 등급, 99.0-100.5% (J.T.Baker, Cat # JT3650-1)
수산화나트륨, NF/FCC 등급, 95.0-100.5%-Mallinckrodt-MK768004
인산나트륨, 이염기 헵타하이드레이트, USP(Mallinckrodt, Cat# MK789604)
인산나트륨, 일염기 모노하이드레이트, USP/FCC(Mallinckrodt, Cat# MK786812)
실험에서 크로마토그래피 수지는 이하 포함된 것을 사용한다:
-베이커본드 ABx 프레프스케일(Bakerbond ABx Prepscale)(JT Baker, Cat # 7269-02)
- 부틸 세파로오스 FF(Amersham Biosciences, Cat# 17-0980-02)
- 세라믹 하이드록시아파타이트(Ceramic Hydroxyapatite), 타입 I(Bio-Rad, Cat# 158-4000)
- 세라믹 하이드록시아파타이트(Ceramic Hydroxyapatite), 타입 II(Bio-Rad, Cat# 157-4200)
- 하이트랩 HIC 선택 키트(HiTrap HIC Selection Kit)(Amersham Biosciences, Cat # 17-1349-01)
- 하이트랩 IEX 선택 키트(Amersham Biosciences, Cat # 17-6002-33)
- MEP 하이퍼셀(MEP Hypercel) (Ciphergen, 샘플)
- SP Sepharose HP (Amersham Biosciences, Cat # 17-1087-03)
실험에서 사용된 장비 및 부속은 이하에 포함된다:
AKTA 정제기(Purifier) 및 AKTA FPLC 크로마토그래피 시스템(Amersham Biosciences)
용기-최상부 0.22㎛ 진공 멸균 필터 (Nalgene)
랩스케일(labscale) TFF 시스템 및 Biomax 100 막을 갖는 펠리콘(Pellicon) XL50 (Millipore)(이는 한외여과 장비임)
마스터플렉스(masterflex) L/S 펌프 모델 #77201-62(Cole-Parmer)
펠리콘 2 미니 홀더(Millipore)
XK 및 HR 컬럼(Amersham Biosciences)
본 발명자의 실험에 사용된 완충액은 표 2에 나타낸다.
APF 정제 프로세스에 사용된 완충액
정제 단계 사용된 완충액
부틸 세파로오스 FF 크로마토그래피 1. 50mM, NaPi, 4M NaCl, pH6.0
2. 50mM, NaPi, 2M NaCl, pH6.0
3. 50mM, NaPi, 1M NaCl, pH6.0
4. 50mM, NaPi, pH6.0
SP 세파로오스 HP 크로마토그래피 5. 20mM, 시트르산나트륨, pH4.0
6. 20mM, 시트르산나트륨, 300mM NaCl, pH4.0
7. 20mM, 시트르산나트륨, 400mM NaCl, pH4.0
8. 20mM, 시트르산나트륨, 1M NaCl, pH4.0
정제 후 단계 사용된 용액
후 컬럼 프로세스 9. 50mM NaAc, pH4.0
10. 3.5M 황산암모늄
다방면(Miscellaneous) 11. 0.1N NaOH
12. 1N NaOH
표 2에서: 완충액 1 및 2를 사용하여 컬럼에서 불순물을 세척해내었다; 완충액 3 및 4를 사용하여 컬럼으로부터 결합된 독소를 용리하였다; 완충액 5를 사용하여 부틸 컬럼으로부터 용리액을 희석하였다; 완충액 6을 사용하여 컬럼으로부터 불순물을 세척해내었다; 완충액 7 및 8을 사용하여 컬럼으로부터 결합된 독소를 용리하였다; 완충액 8은 UF/DF 투석 완충액이었다; 용액 9를 사용하여 독소를 침전시켰고, 용액 10 및 11을 사용하여 사용 후 컬럼 내에 남아있는 어떤 독소를 불활성화(제거)하였다.
실시예 9
APF 컬럼 크로마토그래피 보툴리눔 독소 정제(포획 단계) 프로세스에 사용하기 위한 바람직한 크로마토그래피 컬럼의 선택
이 실험은, 발효 배지 내에서 부수적인 불순물로부터 보툴리눔 독소 타입 A를 초기 정제하기 위한 바람직한 크로마토그래피 컬럼 및 기법을 확립하였다.
공급(feed) 물질
APF 프로세스 발효로부터 얻어진 여과된 세포 배양물(정화된 배양물) 및 염산 침전으로 얻어진 이의 추출물을 모두 크로마토그래피 컬럼 공급 물질로서 평가하였다. 정화된 배양물을 컬럼 상에 직접 로딩하면 독소 침전이 방지되고 정화된 배양물 공급 물질이 취급 및 확인하기 훨씬 더 쉬운 것으로 밝혀졌다. 한편, 산 침전으로 제조된 정화된 배양물 추출물을 공급 재료로서 사용하면 부가적인 불순물이 제거되고 바이러스 불활성화가 제공되었다. 프로세스 확고함(robustness)의 특성과 관련하여, 벌크 보툴리눔 독소 복합체 크로마토그래피 수지 공급 재료로서 염산 침전 제제를 사용하는 것과 반대로, 정화된 배양물은 바람직한 공급 물질로 결정되었다. 따라서, 정화된 배양물은 바람직한 공급 물질이었다.
본 발명자의 연구에 따르면, pH가 낮춰짐에 따라 단백질(즉 보툴리눔 독소 복합체)은 약 pH 5에서 침전하기 시작하고, 약 pH4.0에서 (대부분이 침전되었음에 따라) 소량의 독소가 추출되었고, 본질적으로 독소의 모두가 pH 3.5 내지 3.8에서 용액에서 침전된 것으로 나타났다. 한편, 본 발명자는 (예를 들어 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅에 기초하여) 대부분의 불순물이 pH6.8에서 보툴리눔 독소와 공동-추출되었다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 본 발명자의 정제 프로세스 발명을 실시하기 위한 바람직한 공급 액체 pH는 약 pH 5-6.8이었고, 가장 바람직한 pH는 추출, 즉 부수적인 불순물로부터 보툴리눔 독소의 분리에 대해 약 pH 5.5였다.
포획 단계
포획 단계를 위하여, 보툴리눔 독소 타입 A(Hall 균주) 세포 배양 여과액을 다수의 크로마토그래피 수지(이하 참조)를 사용하여 각 특정 컬럼에 사용하기 위한 제조자 특정된 조건 하에서 배양하였다.
컬럼을 세척한 후, 컬럼 결합된 단백질을 특정 용리 완충액으로 용리하였다. 모든 용리된 분획을 수집하고 SDS-PAGE로 분석하였다. 얻어진 결과(표 3)는 1ml HiTrap 또는 HR5/5 컬럼을 사용하여 크로마토그래피로 확인하였다.
포획 단계 결과의 요약
분리 기술 수지 플로우스루(flowthru) 내 독소 용리액 내 독소 관찰된 분리
소수성 상호작용 페닐 FF(HS) - + +
옥틸 FF - + +
부틸 FF - + +
이온 교환 Q FF + - +
SP FF + - -
혼합 모드 HA 타입 I + - -
HA 타입 II + - -
Abx + - -
소수성 전하-유도 MEP - + -
고정된 금속-이온 친화도 킬레이팅 FF + - -
이 실험은, 보툴리눔 독소의 존재하는 다른 물질로부터의 원하는 분리는 소수성 타입 컬럼 크로마토그래피를 사용함으로써 가장 잘 달성되었다는 것을 명백히 보여주었다. 따라서, 본 발명자는 보툴리눔 독소가 소수성 컬럼에 결합되었으나 Q 세파로오스 FF 컬럼과 같은 이온 교환 컬럼에는 결합되지 않았다는 것을 밝혀냈다.
평가된 소수성 컬럼 중에, 약하게 소수성인 부틸 세파로오스 FF는 가장 좋은 분해능(resolution)을 나타냈다. 따라서 결합 모드의 부틸 세파로오스 FF 또는 플로우스루 모드의 Q 세파로오스 FF는 바람직한 보툴리눔 독소 포획 단계를 제공하였다.
따라서, 본 발명자는 효과적인 포획 단계는 부틸 세파로오스 컬럼 크로마토그래피와 같은 소수성 컬럼을 사용하여 실시될 수 있는 것으로 결정하였다. 아마도, 독소는 소수성 상호작용을 통해 부틸 컬럼에 결합한다. 이러한 실험 이전에, 보툴리눔 독소 복합체는 소수성 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정화된 배양물으로부터 직접 독소를 정제할 수 있는 것은 알려지지 않았다. 본 발명자는, 부틸 세파로오스 고속 흐름(Butyl Sepharose Fast Flow) 컬럼은 고도의 결합 능력을 가지며, 낮은 백 프레셔(back pressure)를 갖는 고속 흐름 속도가 가능하고, 따라서 불순물의 고속 제거를 요구하는 포획 단계에 적합하다는 것을 밝혀냈다.
실시예 10
보툴리눔 독소 복합체를 정제하기 위한 네 컬럼 APF 크로마토그래피 시스템 및 프로세스
중간 및 폴리싱(polishing) 정제 단계
부가적인(중간 및 폴리싱) 독소 정제 단계를 실시예 9의 바람직한 Q 및 부틸 컬럼으로부터 얻어진 독소-함유 분획을 사용하여 실시하였다.
세 타입의 크로마토그래피 컬럼이 보툴리눔 독소 복합체의 이러한 추가적인 정제에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 하이드록시아파타이트(HA) 타입 I 컬럼은 분리를 보였기 때문에 본 발명자가 사용한 바람직한 컬럼이었으나, 일부 독소는 플로우스루에서 발견되었다. 수퍼덱스(Superdex) 200 컬럼을 사용한 젤 여과는, 불순물로부터 900 kDa 보툴리눔 독소 복합체의 정제가 가능하므로 사용하기에 더 바람직한 컬럼이었으나, 소량의 불순물 밴드가 SDS-PAGE 상에 여전히 존재하였다.
가장 바람직한 컬럼은, 본 발명자가 매우 우수한 분해능으로 불순물로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 것으로 알아낸 SP 세파로오스 HP 컬럼이었다. 보툴리눔 독소는 SDS-PAGE를 사용한 분석에 기초하여, SP 세파로오스 HP 크로마토그래피 후에 순수하였다.
컬럼 크로마토그래피 정제 단계의 요약
분리 기술 수지 요약
혼합 모드 하이드록시아파타이트 타입 I 플로우스루 모드의 독소, 일부 불순물로부터 분리
젤 여과 수퍼덱스 200 부분적으로 정제된 독소, 규모 증가(scale-up)가 어려움, 낮은 전도도
이온 교환 SP 세파로오스 HP 높은 분해능 분리, 순수한 독소 얻어짐
실시예 8 및 9의 결과에 기초하여, 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 다음의 네 컬럼 크로마토그래피 정제 프로세스가 전개되었다:
1. 정화된 배양물의 초기 정제를 위한 Q 세파로오스 FF 컬럼의 사용. 이 단계에서, 불순물은 컬럼에 결합되고 독소는 컬럼을 통해 흐름;
2. 이어서 Q 세파로오스 단계 1로부터의 용리액을 부틸 세파로오스 FF 컬럼에 통과시킴. 독소는 컬럼에 결합되고 적합한 완충액으로 용리됨;
3. 이어서 부틸 세파로오스 FF로부터의 용리액을 하이드록시아파타이트 타입 I 컬럼에 통과시킴. 불순물은 컬럼에 결합되고 독소는 컬럼을 통해 흐름;
4. 이어서 하이드록시아파타이트 타입 I로부터의 용리액을 SP 세파로오스 컬럼에 통과시킴. 독소는 컬럼에 결합되고 적합한 완충액으로 용리됨.
이 네 컬럼 독소 정제 프로세스는 다음과 같이 요약될 수 있다:
APF 정화된 배양물(플로우스루) ⇒ Q(플로우스루) ⇒ 부틸(결합) ⇒ HA(플로우스루) ⇒ SP(결합) ⇒ 정제된 독소 복합체
이 네 컬럼 벌크 보툴리눔 독소 복합체 프로세스를 통해 여과된 배양물 상청액을 Q 컬럼 상에 직접 로딩할 수 있다(단계 1). 플로우스루는 부틸 컬럼 상에 로딩하는 제 2 단계 전에 황산암모늄을 사용하여 0.8M로 보충되었다. 제 3 단계를 위하여, 부틸 용리액을 HA 컬럼에 직접 로딩한 반면, HA의 플로우스루는 탈이온수로 4배 희석되었고, pH는 4.0으로 조정된 후, 제 4 컬럼 단계를 위해 SP 컬럼 상에 로딩되었다. 이 네 컬럼 프로세스는 각 단계에서 최소의 샘플 취급을 요구하였고, 이 정제프로세스의 네 단계 전반에 걸쳐 독소가 약한 완충 조건(buffering conditions)에 노출되었음을 보장하였다.
네 컬럼 정제 프로세스의 정률 증가는 APF 보툴리눔 독소 타입 A 발효 프로세스로부터 얻어진 여과된 배양 상청액 680ml 상에 실시되었다. 결과(표 5 참조)는, 이 네 컬럼 프로세스를 통해 고도로 정제된 보툴리눔 독소 타입 A 복합체가 상당히 고수율로 얻어졌다는 것을 보여준다.
네 컬럼 정제 프로세스를 사용한 스케일 업 정제의 결과
독소 수율 UV 및 Hc-ELISA 에 기초한 배양물 L 당 ∼30mg.
독소 순도 >98%, 단일분산, SEC-HPLC 및 LS에 기초한 900KDa 복합체. SDS-PAGE 상에서 순수함, 웨스턴 블로팅은 표준에 따름.
독소 효과 마우스 독성 어세이에 기초한 mg 당 3-5 x 107 MLD50 단위
실시예 11
보툴리눔 독소 복합체를 정제하기 위한 부가적인 다중-컬럼 APF 크로마토그래피 프로세스
실시예 9 및 10에 설명된 동일한 방법을 사용하여 부가적인 컬럼 조합을 평가하였다. 다음 네 부가적인 컬럼 조합은 각각, SDS-PAGE로 결정된 바와 같이, 고도로 정제된 보툴리눔 독소 복합체를 얻기 위한 APF 방법을 제공하는 것으로 결정되었다.
1. Q(플로우스루) ⇒ 부틸 ⇒ SP
2. 부틸 ⇒ Q 또는 HA(플로우스루) ⇒ SP
3. 부틸 ⇒ SP ⇒ Q 또는 HA(플로우스루)
4. 부틸 ⇒ SP
정제된 독소는 광산란을 갖는 SEC-HPLC, 모세관 전기영동, 잔류물 DNA 어세이, Hc-ELISA, 및 MLD50에 의해 더 분석되었다. 상기 설명된 네개의 상이한 프로세스로부터 독소들 간에 어떤 유의적인 차이도 밝혀지지 않았다. 결과를 표 6에 요약한다.
상기 상이한 APF 프로세스 1. 4.로 정제된 독소 샘플의 품질 요약
SEC-HPLC/LS 순도>99%, BCC2030 보다 더 순수, BCC2030보다 덜 균질함.
모세관 전기영동 서로에게 동일함, 19P 및 20P 리서치 등급 APF 독소와 유사하지만, BCC2030과 약간 상이함.
피코그린 DNA 어세이 2-6ng/ml, BCC2030보다 상당히 낮음.
마우스 독성 어세이, Hc-ELISA 독소 효과 3.1-4.8 x 107 MLD50 단위/mg 독소(UV에 의함), 또는 3.8-12 x 107 MLD50 단위/mg 독소(Hc-ELISA).
은염색 SDS-PAGE 서로에게 동일함.
실시예 12
보툴리눔 독소 복합체를 정제하기 위한 두 컬럼 APF 크로마토그래피 프로세스
실시예 11에서 얻어진 결과에 기초하여, 추가 전개를 위해 두 컬럼(부틸⇒SP) 컬럼 크로마토그래피 프로세스를 선택하였다.
제 1 단계의 최적화: 부틸 세파로오스 FF 독소 포획
공급물: 공급물은 컬럼 상에서 로딩된 정화된 배양물에 대한 것이다. 암모늄 술페이트는 완충액 PH에 영향을 줄 수 있으므로, 부틸 컬럼 내 암모늄 술페이트를 대체하기 위한 NaCl의 사용을 평가하였다. 본 발명자들은 공급물에 NaCl을 2M NaCl로 충분히 첨가하면 보툴리눔 독소 복합체를 부틸 컬럼에 결합시킬 수 있다는 것을 알아냈다. 이어서, 본 발명자들은, Hc-ELISA에 의해 결정된 바와 같이, 2M NaCl에서의 공급물의 사용에 비해, 4M NaCl에서의 공급물은 부틸 컬럼으로부터의 독소의 수율이 30% 내지 50%까지 증가하도록 보툴리눔 독소 복합체의 부틸 컬럼으로의 결합을 증가시킨 것으로 결정했다.
정화된 배양물(공급물)에 NaCl을 첨가하는 것은 pH를 약간 이동시킨다. 그러나, 허용가능한 공급물 pH는 pH 5 내지 pH 6에서 확립되었고, NaCl 첨가 후 공급물의 최종 pH는 pH 5 및 pH 6 이내었다. 따라서, 두 컬럼 정제 프로세스의 제 1 단계에 사용하기 바람직한 공급물은 4M NaCl 농도를 가지고, pH 5-6이다. 4M NaCl 농도를 얻기 위해 고체 NaCl를 정제된 배양물에 첨가한 후, 이러한 공급물을 부틸 컬럼에 첨가하였다. 결합된 독소는 1M NaCl 용리액 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용리하였다.
놀랍게도, 대부분의 불순물 단백질은 컬럼으로부터 세척될 수 있었고, 컬럼에 결합된 대부분의 독소는 1M NaCl 완충액으로 용리될 수 있었는데, 컬럼 정제 프로세스는 일반적으로 친화도 컬럼 프로세스를 제외한 3 이상의 컬럼으로 구성되기 때문이다. 본 발명자들은, 이러한 부틸 컬럼이 불순물 단백질 다수를 제거할 능력을 가지므로 독특한 것으로 결정하였다. 따라서, 이 컬럼을 사용한 후 보툴리눔 독소 복합체 순도는 약 50%였다.
이어서 컬럼으로부터 불순물을 제거하기 위해 세척 단계가 실시되었다. 컬럼 내 불순물은 사용된 정화된 배양물 공급물(4M NaCl 포함)에 기인한다. 최적화된 세척 단계는 : 1) 세척 #1: 5CV의 50mM NaPi, 4M NaCl, pH6.0, 및 2) 세척 #2: 12CV의 50mM NaPi, 2M NaCl, pH6.0 였다. 12CV 및 5CV를 비교하였을 때, 5CV은 불순물을 제거하기에 충분하지 않은데, 이러한 경우에 정화된 배양물을 로딩한 후 불순물을 제거해야 하는 것으로 밝혀졌다.
용리(컬럼에 결합된 독소를 제거하기 위함). 1.2M, 1.0M 및 0.8M NaCl을 사용한 독소 용리를 평가하였다. 독소 회수 및 불순물 제거에 기초한 50mM NaPi, pH 6.0 중의 1M NaCl을 사용하여 독소를 용리하는 것이 선택되었다.
저도의 염 세척: 용리 후, 정제 프로세스의 특징화를 위하여 컬럼에 결합된 잔류 불순물을 제거하기 위해 컬럼을 50mM NaPi, pH 6.0을 사용하여 더 세척하였다.
세정: 컬럼을 0.1N NaOH의 3CV로 세정하여, 사용된 수지를 폐기하기 전에 임의의 잔류 독소를 불활성화한다.
유동 유량(running flow rate) : 일반적인 유량은 100cm/h였다. 유동 유량은 백 프레셔에 따라 90cm/h 내지 120m/h였다.
로딩 용량: 일반적인 로딩 용량은 ml 층(bed) 당 12.7ml 배양물이거나, 제조 규모에서 785ml 수지 층에 대해 10L 배양물(10cm 층 높이에서 BPG 100 컬럼)이었다.
베드 높이: 모든 컬럼은 표준 10cm 층 높이로 패킹되었다.
제 2 단계의 최적화: SP 세파로오스 HP 정제
공급물 컨디셔닝: 부틸 용리액을 20mM 시트르산나트륨 완충액, pH 4.0을 사용하여 5배 희석하고, 공급물 pH를 4.0으로 조절하였다. 5배 희석 단계를 실시하여 이온 교환 크로마토그래피에 사용하기 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피 용리액을 컨디셔닝하였다. 본 발명자들은, 가장 우수한 독소 회수를 위한 최적 공급물 pH가 pH 4.0±0.2 범위 이내임을 알아내었다.
세척 단계: 로딩 후, 컬럼을 1) 5 CV의 20mM 시트르산나트륨, pH 4.0 에 이어, 2) 3-5 CV의 20mM 시트르산나트륨, 300mM NaCl, pH 4.0로 세척하여, 결합된 독소를 용리하기 전에 불순물을 제거하였다.
용리 단계: 독소를 20mM 시트르산나트륨, 400mM NaCl, pH 4.0을 사용하여 용리하였다.
고도의 염 세척 단계: 용리 후, 컬럼을 20mM 시트르산나트륨, 1M NaCl, pH 4.0으로 추가 세척하여, 강하게 결합된 불순물을 제거하였다.
컬럼 세정: 컬럼을 ~3CV의 0.1N NaOH로 세정하여, 사용된 수지의 폐기 전에 잔류 독소를 불활성화하였다.
유량: 일반적인 유량은 100cm/h였다.
로딩: 전체 부틸 용리액을 SP 컬럼 상에 로딩하였다.
층 높이: 모든 컬럼들을 표준 10cm 층 높이로 패킹하였다.
이 실시예 12에 설명된 이러한 두 컬럼 보툴리눔 독소 복합체 정제 프로세스와 관련하여 실시된 상세한 작동 절차를 이하 설명한다.
1. 부틸 소수성 상호작용 컬럼
사용된 물질 및 시약
크로마토그래피 시스템: AKTA 정제기 100, Amersham Biosciences
수지 타입: 부틸 세파로오스 FF, Amersham Pharmacia
검출: UV(280nm)
평형 완충액/세척 완충액 #1: 50mM NaPi, 4M NaCl, pH 6.0
세척 완충액 #2: 50mM NaPi, 2M NaCl, pH 6.0
용리 완충액: 50mM NaPi, 1M NaCl, pH 6.0
저도 염 세척 완충액: 50mM NaPi, pH 6.0
세정 용액: 0.1N NaOH
적정 완충액: 500mM NaPi, pH 7.2
절차
컬럼 패킹 및 컨디셔닝
적어도 5-10 CV의 평형 완충액을 사용하거나 유출구 pH가 유입구 pH와 등가가 될 때까지 컬럼을 평형화한다.
샘플 제조
출발 물질의 pH를 측정한다.
4M로의 최종 NaCl 농도까지 고체 NaCl을 정화된 배양물에 첨가한다. 4M NaCl의 첨가는, 소수성 상호작용 크로마토그래피 내 공급액체로서 정화된 배양물을 사용하기 위해 정화된 배양물을 컨디셔닝하는 방법을 일례이다. 적정 완충액을 사용하여 필요시에 pH를 5.0 내지 6.0까지 조절한다.
컬럼 로딩
정화된 배양물(4M NaCl 포함)을 로딩하고 분석용 플로우 스루 분획을 수집한다.
컬럼 세척 #1(4M NaCl 세척)
컬럼 단백질을 5CV의 평형 완충액으로 세척하여 불순물을 제거한다. 분석용 세척 분획을 수집하고 부피를 기록한다.
3.5. 컬럼 세척 #2 (2M NaCl 세척)
컬럼을 15CV의 세척 완충액 #2로 세척하여 추가적인 불순물 단백질을 제거한다. 분석용 세척 분획을 수집하고 부피를 기록한다.
용리(1M NaCl 독소 피크 용리)
결합된 독소를 5CV의 용리 완충액으로 용리한다. 용리액의 280nm 흡광도 모니터하고, 280nm 흡광도가 증가하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하고 280nm 흡광도가 베이스라인에 도달할 때 용리액 피크의 수집을 멈춘다. 독소 용리 분획의 부피를 기록한다.
저도 염 세척(0M NaCl 불순불 피크 용리)
4CV의 저도 염 세척 완충액으로 컬럼을 세척하여 잔류 불순물 단백질을 제거한다. 분석용 분획을 수집하고 부피를 기록한다.
컬럼 세정(0.1N NaOH)
3CV의 세정 완충액으로 컬럼을 세정하여 사용된 수지의 폐기 전에 잔류 독소를 불활성화한다.
2. SP 양이온 교환(부틸 후) 컬럼
사용된 물질 및 시약
크로마토 그래피 시스템: AKTA 정제기 100, Amersham Biosciences
수지 타입: 부틸 세파로오스 HP, Amersham Pharmacia
검출: UV(280nm)
희석, 평형 및 세척 완충액 #1: 20mM 시트르산나트륨, pH 4.0
세척 완충액 #2: 20mM 시트르산나트륨, 300mM NaCl, pH 4.0
용리 완충액: 20mM 시트르산나트륨, 400 mM NaCl, pH 4.0
고도 염 완충액: 20mM 시트르산나트륨, 1M NaCl, pH 4.0
세정 용액: 0.1N NaOH
절차
컬럼 패킹 및 컨디셔닝
5-10 CV의 평형 완충액을 사용하거나 유출구 pH가 유입구 pH와 등가가 될 때까지 컬럼을 평형화한다.
샘플 제조
4 부피의 희석 완충액으로 1M NaCl 부틸 용리액 1 부피를 희석한다. 로딩의 전도도 및 pH를 측정한다. 필요시 pH를 4.0으로 조절한다.
컬럼 로딩
상기 희석된 부틸 용리액을 SP 컬럼에 적용하고 플로우 스루 분획을 수집한다.
컬럼 세척 #1(평형 완충액 세척)
SP 컬럼을 5CV의 평형 완충액으로 세척하였다. 플로우 스루 분획으로서 용리액을 계속 수집한다.
컬럼 세척 #2 (300mM NaCl 세척)
SP 컬럼을 4CV의 세척 완충액 #2로 세척하여 불순물 단백질을 제거한다. 세척 #2 분획의 부피를 기록한다.
용리(400m1M NaCl 용리)
결합된 독소를 3CV의 용리 완충액으로 용리한다. 용리액의 280nm 흡광도를 모니터하고, 280nm 흡광도가 증가하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하고 280nm 흡광도가 베이스라인에 도달할 때 용리액 피크의 수집을 멈춘다. 독소 용리 분획의 부피를 기록한다.
고도 염 세척(1M NaCl)
3CV의 고도 염 완충액으로 강하게 결합된 불순물 단백질을 용리한다. 분석용 분획을 수집하고 부피를 기록한다.
컬럼 세정
3CV의 세정 용액으로 SP 컬럼을 세정하여 사용된 수지의 폐기 전에 잔류 독소를 불활성화한다.
실시예 13
보툴리눔 독소 복합체를 정제하기 위한 두 컬럼 APF 크로마토그래피 프로세스의 확고함(robustness)
실시예 12의 두 컬럼 방법의 확고함을 이하 설명된 바와 같은 일련의 실험에서 연구하였다.
배양물 pH
독소 정제 상의 배양물 pH의 효과를 평가하였다. 정제용 출발 물질로서 pH 5.5 및 pH 6.5에서 성장된 배양물을 사용하여 연구를 수행하였고, Hc-ELISA 결과에 기초하여, pH 6.5 배양물으로부터 회수는 pH 5.5 배양물으로부터의 회수보다 약간 낮은 것으로 밝혀졌다.
저장 시간
독소를 pH 5.5에서 성장된 배양물으로부터 채취일에 및 2-8℃에서 배양물을 4일 저장한 후에 정제하였다. 독소 회수, 부틸 및 SP 크로마토그램, SDS-PAGE 및 Hc-ELISA 결과에 기초하여 어떤 차이도 발견되지 않았다.
컬럼 결합 용량
부틸 컬럼 상의 제안된 로딩은 ml 수지당 12.7ml 배양물, 또는 BPG100 컬럼(10cm 층 높이를 가짐)에 대해 10L 배양물이었다. 부틸 및 SP 컬럼을 4배 더 많은 배양물을 로딩하여 테스트하였다. SDS-PAGE 및 Hc-ELISA 결과는, 부틸 및 SP 컬럼 모두에 대해 플로우스루 분획 내에 독소가 거의 없는 것으로 지시하였다. 부틸 및 SP 컬럼의 용량은 현 로딩의 경우보다 적어도 4배 이상이다. SP 용리액 내 독소는 SDS-PAGE 상에서 순수하였다. Hc-ELISA에 기초하여, 부틸 컬럼의 회수는 48%이고, SP 컬럼의 회수는 74%였다. 총 수율은 UV 결과에 기초하여 L 배양물 당 16mg 독소이다.
프로세스 유지 시간(hold time)
채취 후, 배양물을 동일한 날 또는 밤새 저장 후에 부틸 컬럼을 통해 프로세싱하였다. 부틸 용리액은 일반적으로 SP 컬럼 상으로 로딩하기 전에 밤새 저장되었다. 예비 연구를 통해, 부틸 용리액은 4일까지 안정하고, 이는 동일한 크로나토그램 및 SDS-PAGE 패턴을 보이는 것으로 나타났다. SP 용리액의 안정성은 모세관 전기영동(CE) 및 SEC-HPLC로 평가되었다. 결과는 2일까지 저장된 샘플들간에 차이가 없었다. 여과 후 독소의 회수가 또한 이러한 샘플들에 대해 평가되었다. 독소 회수는 0일에 비해 2일에 약간 감소되었지만, 이러한 감소가 저장에 기인하는지 실험 편차에 기인하는지는 명확하지 않았다.
배양물의 세포 밀도
두 배 농축된 배양물 및 2배 희석된 배양물을 부틸 컬럼 크로마토그래피로 평가하여, 독소 정제에 미치는 배양물 세포 밀도의 효과를 연구하였다. 두가지(two runs)로부터의 크로마토그램은 동일하게 보였다. 두가지로부터의 순도 및 독소 프로파일은 SDS-PAGE 상에서 동일하였다. Hc-ELISA 결과(표 7)는, 두가지로부터의 물질 밸런스(mass balance)는 >90%인 반면, 2배 농축된 배양물의 회수는 2배 희석된 배양물의 회수보다 상당히 낮은 것으로 나타났다. 2배 희석된 배양물의 4% 손실에 비해, 2배 농축된 배양물에 대해 29 % 독소가 독소 용리 전에 손실되었다.
Hc-ELISA로 분석된 APF 독소 물질 밸런스
런(Run) 물질 밸런스 FT 2M 세척 1M 용리 0M 용리
2배 농축 91% 11% 18% 53% 9%
2배 희석 97% 0% 4% 74% 19%
바이오버든(bioburden) 연구
프로세스의 상이한 단계에서 바이오버든을 모니터하였다. 부틸 로딩의 샘플, 3일 저장 후 부틸 용리액, SP 로딩, SP 용리액, 및 밤새 저장 후의 SP 용리액을 평가하였다. 몇가지 오염물들이 주목되었다(~<1 CFU/ml 내지 35 CFU/ml). 가장많은 수의 오염물을 갖는 샘플은 부틸 용리액이었다. 오염물은 정제 프로세스가 수행된 비조절된 환경에 기인할 수 있다.
4M NaCl의 효과
배양물 내 독소 상의 4M NaCl의 효과를 평가하기 위해, 4M NaCl을 포함하는 배양물을 4℃로 밤새 유지한 후 부틸 및 SP 컬럼을 수행하였다. 크로마토그래피 결과, SDS-PAGE 및 Hc ELISA는, 밤새 저장 후 배양물 내 독소 상에 4M NaCl의 효과는 없는 것으로 보였다.
배양 배지(3:1:1 vs 5:1:1)
2.5리터의 5:1:1 및 3:1:1 배양물을 프로세싱하였다. Hc-ELISA로 분석된 정제 각각에 대한 독소 회수는 표 8에 요약된다. 두 배양물으로부터 정제된 독소는 SDS-PAGE 상에서 순수하였으며, 이는 3:1:1 배양물으로 전개된 프로세스가 5:1:1 배양물으로부터의 독소를 정제하기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
Hc-ELISA에 기초한 독소 회수
단계 3:1:1 배양물 5:1:1 배양물
부틸 46% 43%
SP 63% 44%
SP 세파로오스 HP 크로마토그래피에 대한 작동(working) pH
SP 세파로오스 HP 크로마토그래피를 상이한 pH 값: 3.5, 4.2, 및 4.5에서 실시하였다. pH 3.5는 컬럼 내 독소 침전을 일으켰으며, 400mM NaCl로 어떤 독소도 용리되지 않았고, 1M NaCl로 매우 적은 독소가 나타난 것으로 밝혀졌다. pH 4.5에서, 독소는 SP 컬럼에 결합되지 않았다. pH 4.2에서 얻어진 예비 결과는, 독소가 pH 4.0에서와 같이 강하게 결합하지 않았고, 300mM NaCl의 세척 피크 후 넓은 피크로 용리되었음을 보였다. 결과는, 이 단계의 pH는 중요했고 최적 pH 범위는 좁았다는 것을 나타낸다.
실시예 14
보툴리눔 독소 복합체를 정제하기 위한 두 컬럼 APF 크로마토그래피 프로세스의 평가
실시예 12의 정체 프로세스의 두 컬럼 각각으로부터 다양한 용리액을 이하 설명된 바와 같이 평가하였다.
A. 부틸 세파로오스 FF 크로마토그래피
여과된 3:1:1 배양물을 이 실험에 대한 공급물로 사용하였다. 공급물(클로스트리디움 보툴리눔 타입 A[Hall 균주]의 Schantz 발효로 얻어진 정화된 배양물)을 부틸 세파로오스 FF 컬럼(XK50/10, 컬럼 직경 5cm, 층 높이 10cm, 컬럼 부피:196ml) 상에 로딩하기 전에, 584.4g의 NaCl을 ~30분동안 교반하면서 2500ml의 배양물에 첨가하였다. 비전형적으로, 공급물 pH는 5.81로 조절되었고, 유동 유량은 92cm/h(일반적인 유량은 100cm/h)로 설정되었다.
로딩 후, 컬럼을 5CV 또는 1000ml의 50mM NaPi, 4M NaCl, pH 6.0으로 세척한 후, 15CV 또는 3000ml의 50mM NaPi, 2M NaCl, pH6.0로 세척하였다. 이어서, 결합된 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 5CV 또는 1000ml의 50mM NaPi ,1M NaCl, pH 6.0을 사용하여 컬럼으로부터 용리되었다. 보툴리눔 독소 복합체의 용리 후, 강하게 결합된 불순물들은 4CV 또는 800ml의 50mM NaPi, pH 6.0을 사용하여 컬럼에서 세척되었다. 컬럼은 이어서 2CV(400ml)의 0.1N NaOH로 세척되어 사용된 수지의 폐기 전에 잔류 독소가 불활성화되었다. 독소 용리액의 크로마토그램은 도 3에 도시한다.
도 3은, 사용된 부틸 컬럼이 정화된 배양물 공급 액체 내에 함께 존재하는 불순물로부터 보툴리눔 독소 복합체를 우수하게 분리할 수 있다는 것을 보여준다. UV280nm로 측정된 바와 같이, 도 3은 2M NaCl, 1M NaCl, 0M NaCl 및 0.1N NaOH의 플로우 스루 피크 및 피크들을 도시한다. 피크 크기에 기초하여, 플로우 스루 분획 내에서 대부분의 불순물들이 제거된 것으로 결정되었다. 상당량의 불순물들이 또한 1M NaCl 분획 내 독소의 용리 전에 2M NaCl 분획에서 제거되었다.
도 3은 부틸 소수성 상호작용 컬럼을 통한 APF 정화된 배양물(3.1.1 배양물)의 통과로부터 얻어진 크로마토그래프이다. X 축은 컬럼을 통과하는 액체(용리액)의 ml 부피를 나타낸다. Y축은 280nm의 UV 흡광도를 mAU로 나타낸다. 추가적으로, 크로마토그래피동안 전도도(개별 그래프 선)를 모니터하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 많은 단백질 불순물이 첫번째 약 2000mls에서 컬럼을 통과하였다. 이어서 4M NaCl 및 2M NaCl 세척 완충액은, 더 작은 피크를 통해, 추가적인 불순물을 제거하였다. 1M NaCl(약 7000ml 부피)를 사용하면 컬럼으로부터 결합된 독소 복합체가 용리되었으며, 이것이 제 2 컬럼 상에 로딩된 분획이었다.
B. SP 세파로오스 HP 크로마토그래피
도 4의 축은 도 3에 대해서와 동일하다. 도 4 크로마토그래피를 얻기 위해 실시된 단계들은 다음과 같았다:
(1) 실시예 12(도 3으로부터 얻은 부틸 컬럼 용리액)로부터 얻어진 100ml의 부틸 용리액을 pH4.0인 400ml의 20mM 시트르산나트륨을 사용하여 희석하였다(따라서 5배 희석). 이 희석된 부틸 용리액의 pH는 4.1이었다. (2) 이어서 466ml의 이 공급물을 SP 세파로오스 HP 컬럼(XK 26/10, 컬럼 직경 2.6cm, 층 높이 10cm, 컬럼 부피: 53ml) 상에 로딩하였다.
(3) 로딩 후 컬럼을 5CV 또는 250ml의 20mM 시트르산나트륨, pH4.0으로 세척하였다(도 4의 x축 상의 부피 약 450ml 지점).
(4) 이어서 컬럼을 4CV 또는 200ml의 20mM 시트르산나트륨, 30mM NaCl, pH4.0으로 세척하였다(도 4의 x축 상의 부피 약 725ml 지점)n.
(5) 이어서 컬럼 결합된 보툴리눔 독소 복합체 독소를 3CV 또는 150ml의 20mM 시트르산나트륨, 400mM NaCl, pH4.0으로 용리하였다(도 4의 x축 상의 부피 약 925ml 지점).
(6) 컬럼 결합된 독소 복합체의 용리 후, 컬럼을 3CV 또는 150ml의 20mM 시트르산나트륨, 1M NaCl, pH 4.0으로 더 세척하여, 강하게 결합된 불순물을 용리하였다(도 4의 x축 상의 부피 약 1050ml 지점).
(7) 이어서 컬럼을 3CV 또는 150ml의 0.1N NaOH로 세정하였다(도 4의 x축 상의 부피 1200ml 지점 직후).
도 4 크로마토그램은 도 4의 x축 상의 부피 1000ml 지점 직전의 보툴리눔 독소 타입 A 복합체(약 900kDa 분자량)를 도시한다.
도 4는 고도 정제된 보툴리눔 독소 복합체를 부틸 컬럼에 이어 SP 세파로오스 컬럼을 사용하여 얻을 수 있다는 것을 도시한다. 도 3은 넓은 플로우 스루 피크, 작은 300mM NaCl 세척 피크, 400mM 독소 용리 피크 및 1M NaCl 세정 피크가 존재하였다는 것을 도시한다. 도 5B의 SDS-PAGE로 분석된 바와 같이, 일부 불순물 단백질은 300mM NaCl 세척 분획 및 1M NaCl 세정 분획에서 밴드를 나타낸다. 독소는 400mM NaCl 용리 분획에서 용리되었다.
C. 분석 결과:
SDS-PAGE: 부틸 및 SP 컬럼 크로파토그래피 컬럼으로부터의 용리 분획을 SDS-PAGE로 분석하였고, 그 결과를 도 5A(부틸 컬럼) 및 5B(SP 컬럼)에 도시한다.
도 5 및 6은 환원된 SDS-PAGAE를 사용하여 얻어진 젤 전기영동 기록이다. 도 5 및 6의 왼쪽은 수천 달톤(kDa)의 내림차순 분자량과 함께 수직으로 마크된다. 도 5및 6의 숫자 1 내지 6 또는 1 내지 8은 젤 상에 로딩된 분획을 나타낸다.
도 5A에서: 항목 1(젤 레인 1) "Mark 12"는 표준 분자 질량(molecular masses)의 Novex 분자량 마커이다; 레인 2는 정화된 배양물 공급물 액체이다; 레인 3은 플로우 스루("FT") 및 4M 세척의 부틸 컬럼 내 사용으로부터 얻어지는 세척으로부터의 분취액이다; 레인 4는 2M 세척의 사용으로부터의 분취액이다; 레인 5는 2M 세척의 말단(tail) 분획으로부터의 분취액이다; 레인 6은 1M 용리의 분획으로부터의 분취액이다; 레인 7은 1M 용리의 말단 분획으로부터의 분취액이다; 레인 8은 0M 세척으로부터의 분취액이다.
도 5A는 부틸 컬럼이 많은 불순물을 제거하였고(도 5A 내 컬럼 3-5 참조) 초기에 정제된 보툴리눔 독소를 제공하였음(도 5A 내 컬럼 6-8 참조)을 도시한다.
도 5B: 항목 1(젤 컬럼 1) "Mark 12"은 도 5A 에 사용된 것과 동일한 분자량 마커이다; 컬럼 2는 희석된 부틸 컬럼 용리액이다; 컬럼 3은 컬럼 플로우 스루의 분취액이다; 컬럼 4는 300mM 세척으로부터의 분취액이다; 컬럼 5는 컬럼으로부터의 용리액으로부터의 분취액이다; 컬럼 6은 1M 세척으로부터의 분취액이다. 도 5B는 부틸 컬럼의 사용에 연이어 SP 컬럼을 사용하면 고도로 정제된 보툴리눔 독소가 게공되었음을 보인다(도 5B 내 컬럼 5 참조).
Hc-ELISA
독소 농도(concentration)를 Hc-ELISA로 분석하였으며, ELISA 어세이는 독소 중쇄의 농도에 기초해 독소 농도를 결정하기 위한 것이고, 독소 물질 밸런스를 평가하였다. 표 9는 전형적인 정제(purification run)로부터의 부틸 및 SP 컬럼 단계동안의 독소 농도 및 단계 회수를 나타낸다. 부틸 및 SP 후 전체 회수는 28.6%였다.
SEC-HPLC
SEC-HPLC로부터의 결과는, SP 크로마토그래피에 대한 단계 회수는, Hc-ELISA로부터의 62.5%에 비해, 42.9%였다는 것을 보여주었다. 이는 SP 컬럼 단계 후의 보툴리눔 독소의 회수가 약 50%였다는 것을 보여준다.
표준화된(normalized) 수율
독소 수율은 부틸 크로마토그래피 후 L 배양물 당 22.3mg(SEC-HPLC로)으로서 또는 23.4mg(Hc-ELISA로)으로서, 및 1회 런(run)으로부터 SP 크로마토그래피 후 L 배양물 당 9.6mg(SEC-HPLC) 또는 8.9mg(Hc-ELISA)으로서 표준화되었다. 따라서, 본 명세서에 설명된 본 발명자의 두 컬럼 시스템 및 프로세스를 사용하여, 약 50mg 내지 약 90mg의 보툴리눔 독소 복합체가 각각의 10L의 발효 배지 정화된 배양물으로부터 정제될 수 있다(예를 들어 실시예 6 또는 실시예 72의 발효 프로세스로부터 얻어지는 바와 같음).
전형적인 부틸 및 SP 크로마토그래피 단계의 독소 농도 및 물질 밸런스
부틸 샘플 부피(ml) 농도(㎍/ml) 독소량(mg) % 회수
부틸 로딩 2800 45.5 127.4 100
플로우스루 및 세척 2634 N/A N/A N/A
2M NaCl 세척 피크 336 32.5 10.9 8.6
1M NaCl 용리 피크 404 144.5 58.4 45.8
1M NaCl 후 용리 443 N/A N/A N/A
0M NaCl 세척 369 19 7.0 5.5
SP 샘플 부피(ml) 농도(㎍/ml) 독소량(mg) % 회수
SP 로딩 466 19
플로우스루 708 N/A N/A N/A
300mM 세척 피크 54 N/A N/A N/A
용리 피크 35 158 5.5 62.5
1M 세척 피크 13 N/A N/A N/A
세정 피크 44 N/A N/A N/A
실시예 15
후 컬럼 크로마토그래피 독소 복합체 안정화 및 저장을 위한 프로세스
1. 전개 원리(Development rationale)
컬럼 크로마토그래 후, 정제된 보툴리눔 독소 복합체를 원하는 농도에서 안정한 완충액에 옮긴 후 멸균 여과함으로써 보툴리눔 독소 약제학적 조성물의 합성에 사용하기 적합한 독소를 얻는 것이 바람직하다. 정제된 보툴리눔은 아세테이트 완충액 내에서 용해성인 형태로 또는 황산암모늄 현택액으로서 저장되었다.
2. UF/DF 단계
폴리에테르술폰 Biomax-10 막(NMWCO: 10kDa, Millipore)을 UF/DF 단계에 사용하였다. 50mM NaAc, pH 4.0을 투석여과 완충액으로서 선택하였다. SP 용리액을 ~1mg/ml까지 투석여과한 후 8 투석여과 부피(DV)의 50mM NaAc, pH 4.0으로 투석여과하였다.
투석여과(UF)는 유체로부터 극도로 작은 입자 및 용해된 분자를 분리하기 위한 프로세스이다. 분자 형태 및 전하와 같은 이차적 인자가 역할을 할 수 있다 할지라도, 분리를 위한 일차적 근거는 분자 크기이다. 1,000 내지 1,000,000 분자량 크기 범위의 물질이 한외여과막으로 포함되며, 염 및 물은 통과한다. 콜로이드 및 미립자 물질도 포함될 수 있다.
투석여과(DF)는 막을 통해 소형 분자를 세척하고 궁극적으로 농도를 변화시키지 않고 함유물(retentate) 내에 대형 분자를 남기는 분획화(fractionation) 프로세스이다. DF는 염 또는 교환 완충액을 제거하기 위해 사용될 수 있다. DF는 또한 에탄올 또는 다른 적은 용매 또는 첨가제를 제거할 수 있다. 투석여과를 실시하기 위한 몇가지 방법이 있다. 연속 투석여과에서, 투석여과 용액(물 또는 완충액)이 여과액이 생성되는 것과 동일한 속도로 샘플 공급물 저장소에 공급된다. 이런 방식으로, 샘플 저장소 내 부피는 일정하게 유지되지만, 막을 통해 자유롭게 투과될 수 있는 소형 분자(예를 들어 염)는 세척되어진다. 예로서 염 제거를 사용하여, 각 추가적인 투석여과 부피(DV)는 염 농도를 더욱 감소시킨다. (투석여과 부피는 투석여과 용액이 첨가되기 전의 샘플의 부피이다). 5 투석여과 부피를 사용하면, 연속 투석여과로 이온 강도가 ~99% 까지 감소될 것이다. 불연속 투석여과에서, 용액은 우선 희석된 후, 출발 부피까지 다시 농축된다. 이어서, 저장소 내에 남아있는 소형 분자(예를 들어 염)의 원하는 농도가 도달될 때까지 이러한 프로세스가 반복된다. 각 부가적인 투석여과 부피(DV)는 염 농도를 더욱 감소시킨다. 투석여과 부피는 희석 용액이 첨가되기 전의 샘플의 부피이다. 5 투석여과 부피를 사용하면 불연속 투석여과로 이온 강도가 ~96%까지 감소될 것이다. 연속 투석여과는 불연속 투석여과와 동일한 정도의 염 감소를 얻기 위해 여과액 부피가 덜 필요하다.
3. 0.22㎛ 여과 단계
여과 단계를 위해 저도-단백질-결합(low-protein-binding) 0.22㎛ 셀룰로오스 아세테이트(CA) 진공 용기-최상부 필터를 선택하였다.
4. 황산암모늄 침전 단계
이어서, 황산암모늄 침전을 실시하였다: 3.5M 황산암모늄을 부드럽게 교반하면서 유백광(opalescence)이 처음 나타날 때까지 0.22㎛ 여과된 독소 용액에 첨가하였다. 이어서 정제된 벌크 독소를 2-8℃에서 저장하였다.
5. 전형적인 후-컬럼 프로세스로부터의 결과
SP 용리액을 펠리콘 Biomax-10(50㎠ 표면적, Millipore)을 사용하여 랩스케일 TFF 시스템(Millipore) 상에서 70.5ml 내지 18ml로 농축하였고, 8DV의 50mM NaAc, pH 4.0으로 투석여과하였다. 함유물(후-UF/DF 분획)을 수집하고 코닝(Corning) 0.22㎛ CA 필터(Corning 431154)로 여과하였다. UF/DF 시스템을 아세테이트 완충액으로 세정하였다. 세정 분획을 수집하였다. 10ml의 후 0.22㎛ 여과액을 안정성 연구를 위해 2-8℃에서 저장하였다. 8ml의 후 0.22㎛ 여과액을 황산암모늄 침전시켰다. 총 2.8ml의 황산암모늄을 유백광을 낼 때까지 여과액 내에 첨가하였다.
UV측정에 기초하여 독소 회수를 평가하였으며, 표 10에 나타낸다. SDS-PAGE 결과는 도 4에 도시한다.
도 6에서, 레인은 다음을 나타낸다:
레인 1은 M12, 분자량 표준,
레인 2는 SP 컬럼 용리액,
레인 3은 UF/DF 함유물: SP 용리액의 UF/DF 후의 UF/DF 함유물,
비교를 위해 레인 2로서 로딩된 단백질의 동일한 양으로 희석됨.
레인 4는 UF/DF 막의 완료 후 UF/DF 막을 세정한 UF/DF 세정 용액,
레인 5는 후 0.2㎛ 여과: UF/DF 프로세스 후 및 샘플이 0.22㎛ 필터로 여과된 후.
레인 6은 후 컬럼 황산암모늄 현탁액: 0.22㎛ 필터 여과 후, 보툴리눔 독소 복합체는 황산암모늄에서 안정하므로, 샘플을 황산암모늄으로 침전시켰다.
레인 7은 UF/DF 함유물(레인 3과 동일)이되, 자세히 보기 위해 미희석함.
도 6은 본 발명자에게, UF/DF, 0.22㎛ 여과, 및 황산암모늄 침전의 후 컬럼 정제 프로세스 단계가, SDS-PAGE 분석으로 결정된 바와 같이 보툴리눔 독소 복합체의 순도에 영향을 주지 않는다는 것을 보여준다. 중요하게는, MLD50 결과는, 정제된 벌크 보툴리눔 독소 복합체의 효과가 2.9-3.7x107 MLD50 단위/mg임을 보여주었다.
UV 측정에 기초한 독소 회수
분획 UV에 의한 독소 농도(mg/ml) 부피(ml) 총 독소(mg) 회수(%)
SP 용리액 0.389 70.5 27.4 100(정의됨)
후 UF/DF 1.260 18.0 22.7 82.8
UF/DF 세정 0.220 14.0 3.1 11.3
후 여과 1.270 18.0 22.8 83.2
후 AS ppt* N/A(~0.94) ~10.8 N/A N/A
* 8ml 후 여과 분획으로부터임
도 7은 바람직한 동물 단백질이 없는, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체를 정제하기 위한 두 컬럼 크로마토그래피 방법의 플로우차트이다. 이는, 정제된 클로스트리디움 보툴리눔 독소 900kDa 복합체를 얻기 위한 확고하고 규모를 변화시킬 수 있는(scalable) cGMP 적합한 (compliant) 프로세스이다. 도 7에서, 부틸 용리액이 pH4 시트르산나트륨 완충액으로 5배 희석됨으로써 이온 교환 크로마토그래피에 대해 컨디셔닝되는 것이 주목된다.
도 7 프로세스는 또한, SP 컬럼 용리액을 pH 8 완충액 내 이온 교환 컬럼 상에 로딩하여 150kDa 보툴리눔 독소 분자로부터 비 독소 복합체 단백질을 분리하고, 이를 통해 분자량 약 150kD 및 특이적 효과 1-2x108 LD50 U/mg 이상인 보툴리눔 독소 타입 A(신경독성 성분)를 (컬럼으로부터의 플로우 스루에) 제공함으로써, 순수한 것(즉 비-독소 복합체 단백질이 없는 150kDa 보툴리눔 독소)을 얻기 위해 사용될 수 있다. 이 프로세스는 또한, 복합체를 이의 성분들로 분리하고 이어서 분리된 성분들을 정제함으로써 보툴리눔 독소 복합체의 다른 비 독소 성분(즉, 비 독소 헤마글루티닌(hemaglutinin) 단백질 및/또는 비 독소 비 헤마글루티닌 단백질)을 얻기 위해 사용될 수 있다.
본 프로세스에 의해 정제된 독소 컴플렉스는 표 1에 설명한 특성을 만족하거나 능가한다. 또한, 전형적인 수득율은 10L 세포 배양물로부터 약 100mg의 900 kDa 복합체였으며, Schantz(비-APF)프로세스로부터 얻어진 수득율보다 높았다.
본 발명은 하기의 이점을 가진다:
1. 동물 공급원으로부터 유래한 성분 또는 물질이 본 프로세스에서 전혀 사용되지 않는다. 특히, DNase 및 RNAase의 사용이 제거된다.
2. 10 리터의 발효 배지당 상기한 표 1의 특징을 가지는 정제된 보툴리눔 독소 타입 A 복합체 약 50mg 이상을 얻을 수 있다.
3. 확고(robust)하며, 규모를 변화시킬 수 있고(scalable), 입증가능하며(validatable), 및/또는 cGMP에 적합(compliant)한 프로세스로부터 정제된 독소가 얻어진다. 확고하다는 것은 하나 이상의 프로세스 파라미터가 약 ±10%로 변화할 때도 프로세스의 재현이 가능하다는 것을 의미한다. 입증가능하다는 것은 프로세스가 표 1의 특징을 가진 정제된 독소를 일관되게 수득한다는 것을 의미한다. cGMP에 적합하다는 것은 프로세스가 FDA가 요구하는 최근 우수 의약품 제조기준에 적합한 제조 프로세스로 쉽게 전환될 수 있다는 것을 의미한다.
4. 최종 정제된 보툴리눔 독소 복합체의 효능(MLD50 에세이로 결정할 때)은 Schantz 또는 변형 Schantz 프로세스로부터 얻어지는 정제된 보툴리눔 독소 복합체의 효능과 맞먹거나 이를 능가한다.
5. 보툴리눔 독소 복합체를 정제하기 위한 모든 침전 단계가 제거된다.
다
본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 특허 및/또는 인용문헌은, 그 내용 전체가 본 명세서에 참조로 병합되어 있다.
본 발명을 특정한 바람직한 방법들과 관련하여 자세히 설명하였으나, 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 한 다른 실시형태, 변형 및 수정이 가능한 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 광범위하게 다양한 동물 산물이 없는 시스템 및 프로세스(크로마토그래피 보툴리눔 독소 정제 프로세스 포함)가 본 발명의 범주에 속한다.
따라서, 하기 청구의 범위의 진의 및 범주는 상기한 바람직한 실시형태의 설명에 제한되어서는 안된다.

Claims (21)

  1. (a) 보툴리눔 독소 발효 배양물의 샘플을 얻는 단계;
    (b) 보툴리눔 독소가 제 1 컬럼에 포획될 수 있도록 제 1 크로마토그래피 컬럼 수지에 상기 배양물 샘플을 접촉시키는 단계;
    (c) 상기 제 1 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리시키는 단계;
    (d) 상기 제 1 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용리액을 제 2 컬럼 크로마토그래피 컬럼 수지에 로딩하여 정제된 보툴리눔 독소를 얻는 단계를 포함하여 이루어지는, 클로스트리디움 독소를 정제하기 위한 프로세스.
  2. 상기 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 크로마토그래피 컬럼 및 상기 제 2 크로마토그래피 컬럼이 상이한 컬럼이며, 두가지 상이한 컬럼이 상이한 정제 메카니즘을 통해 보툴리눔 독소를 정제하는 데 작용하는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 크로마토그래피 컬럼이 소수성 상호작용 컬럼인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 제 2 크로마토그래피 컬럼이 이온 교환 컬럼인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 프로세스가 상기 접촉 단계 후, 상기 용리 단계 전에, 상기 제 1 컬럼에서 불순물을 세척해 내는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 프로세스가 상기 로딩 단계 후에, 상기 제 2 컬럼에서 불순물을 세척해 내는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 프로세스가 상기 제 2 컬럼을 세척해 내는 단계 후에, 상기 제 2 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 프로세스.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 프로세스가 실질적으로 동물 단백질이 없는("APF") 프로세스인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 프로세스가 본질적으로 APF 프로세스인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 프로세스가 APF 프로세스인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소 발효 배양물이 실질적으로 APF 프로세스로부터 얻은 것임을 특징으로 하는 프로세스.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소 발효 배양물이 본질적으로 APF 프로세스로부터 얻은 것임을 특징으로 하는 프로세스.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소 발효 배양물이 APF 프로세스로부터 얻은 것임을 특징으로 하는 프로세스.
  14. 제 1 항에 있어서, 정제된 보툴리눔 독소의 수득량이 각 10리터의 보툴리눔 독소 발효 배양물에 대하여 배치(batch)당 약 50mg 이상인 것을 특징으로 하는 프로세스.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 정제된 보툴리눔 독소가 하기의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 프로세스.
    (a) 외관은 화이트 내지 오프 화이트 현탁액;
    (b) 농도는 용리액 ml당 보툴리눔 독소 복합체 2.0-3.6 mg;
    (c) 278nm에서의 흡광도에 대한 260nm에서의 흡광도 비율(A260/A278)은 0.6 이하;
    (d) MLD 50 유닛/mg로 나타낸 특이적 효능은 정제된 보툴리눔 독소 mg 당 2.4 X 107 내지 5.9 X 107의 MLD 50 유닛;
    (e) 면역학적으로 보툴리눔 신경독 타입 A 복합체와 동일함;
    (f) SDS-PAGE 특성은 표준을 따름;
    (g) SEC-HPLC 특성은 전체 피크의 >95%가 900kDa 독소 복합체;
    (h) 이러한 프로세스는 확고(robust)하며, 규모를 변화시킬 수 있고(scalable), 입증가능하며(validatable), cGMP에 적합(compliant)하다.
  16. 제 1 항의 프로세스에 의해 얻어진 정제된 보툴리눔 독소.
  17. (a) 실질적으로 APF 프로세스로부터 얻어진 보툴리눔 독소 발효 배양물의 샘플을 얻는 단계;
    (b) 보툴리눔 독소가 제 1 컬럼에 포획될 수 있도록 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 수지에 상기 배양물 샘플을 접촉시키는 단계;
    (c) 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼으로부터 불순물을 세척해 내는 단계;
    (d) 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리시키는 단계;
    (e) 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용리액을 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 컬럼 수지에 로딩하는 단계;
    (f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 불순물을 세척해 내는 단계;
    (g) 상기 이온 교환 컬럼으로부터 보눌리눔 독소를 용리시키는 단계를 포함하여, 실질적으로 APF 정제 프로세스인 보툴리눔 독소 정제 프로세스를 통하여 정제된 보툴리눔 독소를 얻는, 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 APF 프로세스.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소 발효 배양물의 샘플을 얻는 단계 후, 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 수지에 상기 배양물 샘플을 접촉시키는 단계 전에, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 위해 정화 배양물을 컨디셔닝하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 APF 프로세스.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 소수성 상호작용 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리시키는 단계 후, 상기 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 컬럼 수지에 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용리액을 로딩하는 단계 전에, 이온 교환 크로마토그래피를 위해 소수성 상호작용 컬럼으로부터의 용리액을 컨디셔닝하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 APF 프로세스.
  20. (a) 실질적으로 APF 프로세스로부터 얻어진 보툴리눔 독소 발효 배양물의 샘플을 얻는 단계;
    (b) 소수성 상호작용 크로마토그래피를 위해 정화 배양물을 컨디셔닝하는 단 계;
    (c) 보툴리눔 독소가 제 1 컬럼에 포획될 수 있도록 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 수지에 상기 배양물 샘플을 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼으로부터 불순물을 세척해 내는 단계;
    (e) 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리시키는 단계;
    (f) 이온 교환 크로마토그래피를 위해 소수성 상호작용 컬럼으로부터의 용리액을 컨디셔닝하는 단계;
    (g) 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용리액을 이온 교환 컬럼 크로마토그래피 컬럼 수지에 로딩하는 단계;
    (h) 상기 이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 불순물을 세척해 내는 단계;
    (i) 상기 이온 교환 컬럼으로부터 보눌리눔 독소를 용리시키는 단계를 포함하여, 실질적으로 APF 정제 프로세스인 보툴리눔 독소 정제 프로세스를 통하여 정제된 보툴리눔 독소를 얻는, 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 APF 프로세스.
  21. (a) 발효 배양물로부터 보툴리눔 독소를 포획하기 위한 제 1 크로마토그래피 컬럼 수지;
    (b) 상기 제 1 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리시키는 용리 완충액;
    (c) 상기 제 1 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용리액으로부터 보툴리눔 독소를 포획하기 위한 제 2 컬럼 크로마토그래피 컬럼 수지, 및;
    (d) 상기 제 2 크로마토그래피 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리시키는 제 2 용리 완충액을 포함하는, 클로스트리디움계 독소를 정제하기 위한 시스템.
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