JP2012125251A - クロストリジウム・バクテリアの培地およびクロストリジウム毒素を得るための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】得られたボツリヌス毒素はボツリヌス毒素医薬組成物を製剤化し、配合するために用いることができる。APF培地は有意に減少するレベルの肉製品または乳製品副産物を含み、動物由来産物の代わりに非動物性から作られた産物を用いることができる。好ましくは、用いられるAPF培地は動物由来産物不含であるか、または実質的に不含である。
【選択図】図1
Description
本出願は、2003年9月25日に出願された米国出願番号10/672,876の一部継続出願であり、該出願の完全な内容が本明細書に引用される。
本発明は、生物学的に活性なボツリヌス毒素を得るための培地および方法に関する。特に本発明は、十分な生物学的に活性なボツリヌス毒素を得るための、実質的に動物性産物不含の培地、培養物、およびクロストリジウム・ボツリヌス・バクテリアなどの有機物の嫌気性発酵方法に関する。
クロストリジウム属は、形態および機能によりグループ分けされる127以上の種を有する。嫌気性グラム陽性菌クロストリジウム・ボツリヌス菌は、潜在的ポリペプチド神経毒、ボツリヌス毒素を産生し、これはヒトおよび動物にボツリヌス中毒症として知られている神経麻痺性疾病を引き起こす。クロストリジウム・ボツリヌス菌およびその胞子は一般に、土壌に見られ、そのバクテリアは在宅の缶詰工場での不適切に滅菌され、封をされた食品容器中にて増殖することができ、これが多くのボツリヌス中毒症の場合の原因である。ボツリヌス中毒症の影響は典型的に、クロストリジウム・ボツリヌス菌培養物または胞子に感染した食料を食べた後18〜36時間後に現れる。ボツリヌス毒素は明らかに、内臓の内層を希釈されずに通ることができ、末梢運動神経細胞を攻撃することができる。ボツリヌス毒素中毒の症状は、歩行困難、嚥下困難および会話困難から呼吸筋の麻痺および死まで進行しうる。
(1)頸部ジストニアを治療するために、筋肉注射(複数筋肉)あたりBOTOX(登録商標)約75〜125ユニット;
(2)眉間のしわ(深いしわ)を治療するために、筋肉注射あたりBOTOX(登録商標)5〜10ユニット(鼻根筋への5ユニット筋肉注射および各皺眉筋への10ユニット筋肉注射);
(3)恥骨直腸筋の括約筋内注射により便秘を治療するために、BOTOX(登録商標)約30〜80ユニット;
(4)上眼瞼の側部瞼板前眼輪筋および下眼瞼の側部瞼板前眼輪筋を注射することにより眼瞼痙攣を治療するために、筋肉あたり約1〜5ユニットの筋肉注射されたBOTOX(登録商標);
(5)斜視を治療するために、注射すべき筋肉の大きさおよび所望の筋麻痺の程度(すなわち所望のジオプター補正の量)の両方に基づき変化する注射量である、約1〜5ユニットのBOTOX(登録商標)を外眼筋に筋肉注射;
(6)発作後の上肢痙縮を治療するために、次の5つの異なる上肢屈筋へのBOTOX(登録商標)の筋肉注射:
(a)深指屈筋:7.5U〜30U
(b)浅指屈筋(flexor digitorum sublimus):7.5U〜30U
(c)尺側手根屈筋:10U〜40U
(d)とう側手根屈筋:15U〜60U
(e)上腕二頭筋:50U〜200U。
5つの指示筋のそれぞれは、各治療セッションにて患者が90U〜360Uの上肢屈筋BOTOX(登録商標)を筋肉注射されるように、同じ治療セッションにて注射されている。
(7)片頭痛を治療するための、25UのBOTOX(登録商標)の頭蓋骨膜注射(眉間の筋肉、前頭筋および側頭筋に対照的に注射)は、25U注射後3ヶ月間にわたる片頭痛頻度、最大重篤度、関連嘔吐および急性投薬使用の尺度の減少により測定されるように、ビヒクルと比べて片頭痛の予防的治療としての有意な利点を示している。
第I表.クロストリジウム・ボツリヌス菌の生理学的群
本発明は、この必要性に合い、生物学的に活性なボツリヌス毒素を得るか、または産生するために、動物由来タンパク質などの動物性産物が不含または実質的に不含である培地および方法を提供する。得られたボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素活性成分医薬組成物を製造するために用いることができる。
本明細書において、以下の単語または用語は次の定義を有する。
(a)実質的に動物由来産物不含であり、約4〜8重量%の大豆誘導体を含有する培地を得、該培地中にてクロストリジウム・ボツリヌス・バクテリアを培養し;
(b)実質的に動物由来産物不含であり、
(i)約4〜8重量%の大豆誘導体、
(ii)約0〜3重量%の酵母エキス、
(iii)約1〜2重量%のグルコース
を含有する発酵培地を準備し、
(c)(i)約5.0〜5.5のpHにて発酵工程を行い、
(ii)約45時間〜75時間の発酵工程を行い、
(iii)約33℃〜36℃の温度にて発酵工程を行い、
(iv)嫌気性雰囲気下、発酵工程を行う
などのボツリヌス毒素の産生を可能にする条件下、該発酵培地中にてクロストリジウム・ボツリヌス・バクテリアを発酵させ、そして
(d)該発酵培地から生物学的に活性なボツリヌス毒素を回収(ここに、回収工程はAPF精製工程である)する
工程を含むことができる。
(a)(i)実質的に動物由来産物不含である発酵培地を準備し;
(ii)ボツリヌス毒素の産生を可能にする条件下、該発酵培地中にてクロストリジウム・ボツリヌス菌を培養し;そして
(iii)該発酵培地から生物学的に活性なボツリヌス毒素を回収する
ことにより生物学的に活性なボツリヌス毒素を得;
(b)ボツリヌス毒素と適切な賦形剤とを配し、それにより実質的に動物性産物不含医薬組成物(ここに、活性成分はボツリヌス毒素である)を製造する
ことを特徴とする、実質的に動物性産物不含医薬組成物(ここに、活性成分はボツリヌス毒素である)を製造する方法を包含する。
本発明の態様は、以下の図面により説明し、または例示する。
本発明は、生物学的に活性なボツリヌス毒素を産生することが可能な有機物(クロストリジウム・ボツリヌス・バクテリアなど)の培養および発酵に有用な動物性産物または動物性副産物が不含であるか、または実質的に不含である培地および工程の発見に基づく。得られたボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素活性成分医薬組成物を製造するために用いることができる。従って、有意に減少したレベルの肉製品または乳製品副産物を有する増殖培地が、本明細書にて開示され、好ましい培地の具体的態様は、そのような動物性産物が実質的に不含である。
次の実施例は、本発明により包含される具体的な方法を記載し、本発明の範囲を限定するものではない。クロストリジウム・ボツリヌス菌培養物は、カリフォルニア州キャンベルのリスト研究所などのいくつかの業者より得ることができる。以下のすべての実施例において、「クロストリジウム・ボツリヌス菌」は、クロストリジウム・ボツリヌス菌A型のホールA(ATCC指定番号3502)菌株を意味する。
クロストリジウム・ボツリヌス菌についての動物性産物不含種培地の調製
対照種培地は、それぞれの培地1リットルごとに次の成分を用いて調製することができる:塩化ナトリウム5g、バクトペプトン10g、グルコース10g、BHI(1リットルまで)、pH8.1(5N水酸化ナトリウムで調節)。
動物性産物不含種培地におけるクロストリジウム・ボツリヌス菌の培養
クロストリジウム・ボツリヌス菌の凍結乾燥培養は、それぞれ1mlの実施例1の対照および試験種培地に懸濁させ、各種培地10mlを含むことができる二つのチューブに分け(種培地ごと)、次いで34℃にて約24〜48時間インキュベートすることができる。次いで培養物1mlを、種培地40ml(それぞれ)を含む125mlDeLong Bellco培養フラスコを植菌するために用いることができる。植菌された培養物は、Coy Anaerobicチャンバー(Coy Laboratory Products Inc., Grass Lake, Mich.)中33℃±1℃にて24時間インキュベートすることができる。
クロストリジウム・ボツリヌス菌のための動物性産物不含発酵培地の調製
基本発酵培地は、それぞれの培地2リットルごとに次の成分を用いて調製することができる:グルコース15g、塩化ナトリウム10g、硫酸水素二ナトリウム1g、硫酸水素カリウム0.350g、硫酸マグネシウム七水和物0.1g、システイン−HC 0.250g、チロシン−HCl 0.250g、粉末鉄1g、塩化亜鉛0.250gおよび塩化マンガン0.4g。
動物性産物不含発酵培地におけるクロストリジウム・ボツリヌス菌の増殖
試験種培地培養物(動物性産物不含)40μl分を、8ml 16×100mm試験管に各8mlの対照または試験発酵培地アリコートを植菌するために用いることができる。次いで培養物を33±1℃にて24時間インキュベートすることができる。次いでチューブをバクテリアの増殖を可能にするために嫌気性チャンバー中にてインキュベートすることができる。各培地アッセイは、三重に行うことができ(すなわち同じ培地の三つの独立した植菌を含むことができる)、非植菌対照を含むこともでき、これは分光光度計のためのブランクとして用いることができる。増殖(光学密度、ODにより測定される)は、ターナー(Turner)分光光度計(モデル330)で660nmにて24時間ごとに測定することができる。細胞溶解が約48時間続いた後に培養は終わるべきであり、次いでボツリヌス毒素産生を測定することができる。
動物性産物不含発酵培地にて増殖したクロストリジウム・ボツリヌス菌によるボツリヌス毒素産生の測定
実施例4の培養細胞を遠心分離し、次いで上清のpHを測定することができる。与えられたサンプルにおけるボツリヌス毒素のレベルは、標準抗毒素を加え、凝集前の経過時間を測定することにより測定することができる。Kf(凝集が起こるのに要する時間(分))およびLf(凝集の上限;凝集により確立される1国際単位の標準抗毒素と等価)の両方を測定することができる。発酵培養液4mlを、与えられた培養物のための各発酵チューブから取り出すことができ、全12mlを15ml遠心分離管中にて混合することができるように一緒にすることができる。チューブは4℃にて30分間5000rpm(3400g)にて遠心分離することができる。上清のアリコート1mlを標準ボツリヌス毒素抗血清0.1〜0.6mlを含むチューブに加え、注意深く振盪してその内容物を混合させることができる。次いでチューブを水浴中45±1℃に置き、初期時間を記録することができる。チューブを頻繁にチェックし、凝集が開始される時間をKfとして記録することができる。凝集が最初に開始されるチューブ中の毒素の濃度はLfFFと表すことができる。凝集が二番目に開始されるチューブ中の毒素の濃度はLfFと表すことができる。
ボツリヌス毒素を得るための非APF工程
クロストリジウム毒素は、クロストリジウム・ボツリヌス・バクテリアの発酵により得た。従って改変シャンツ(非APF)工程は、次のように高有効性および高精製クロストリジウム・ボツリヌス毒素(すなわちバルク毒素)を得るために行った。改変シャンツ(非APF)工程は高収率のボツリヌス毒素を提供することができる。シャンツおよび改変シャンツ工程の両方は、すべての発酵培地中にてカゼインを用いる。
種々のクロストリジウム・バクテリアは、バージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から入手可能である。あるいは、クロストリジウム・ボツリヌス菌細胞バンクバイアルは、土壌、または腐敗した動物の死骸の深いサンプリング(嫌気性または疑似嫌気性場所にて)などの種々の源からクロストリジウム・ボツリヌス菌を単離することにより調製することができる。一般に、クロストリジウム・ボツリヌス菌は、ボツリヌス中毒症と診断された患者の生理液のサンプル(すなわち創傷ボツリヌス中毒の患者からの創傷交換)から得ることができる。図2の上半分は、細胞バンクバイアルの調製およびボツリヌス毒素の培養および発酵に用いられる非APF工程を概略する。
クロストリジウム・ボツリヌス菌細胞バンクバイアルを室温にて解凍した後、四つの培養工程を行った。(1)適切な形態学でコロニーを選択するために、予め減少させたコロンビア血液寒天平板上にてバクテリアをストリーキングし、34℃±1℃にて30〜48時間嫌気的にインキュベートすることにより、解凍された細胞バンクバイアルからのアリコートを培養した。(2)次いで選択されたコロニーを34℃にて6〜12時間カゼイン増殖培地を含む試験管中に植菌した。次いで最も急速な増殖および最も高密度(増殖選択工程)でのチューブの内容物をさらに二つの漸増的嫌気的インキュベーションにより培養した。(3)1リットル種培養ボトル中34℃にてまず12〜30時間のインキュベーション、次いで(4)35℃にて6〜16時間カゼイン増殖培地を含む25リットル種発酵槽における種培養。これら二つの漸増的培養は、pH7.3における水中にて2%カゼイン加水分解物(カゼイン[ミルクタンパク質]消化物)、1%酵母エキスおよび1%グルコース(デキストロース)を含む栄養培地中にて行った。
漸増的培養の後、工業規模(すなわち115リットル)の発酵槽中、制御された嫌気性雰囲気下、培地を含むカゼイン中、35℃にて60〜96時間さらにインキュベーションした。バクテリアの増殖は通常、24〜36時間後に完了し、60〜96時間の発酵中、細胞のほとんどが溶解し、ボツリヌス毒素を放出する。発酵培地pHの制御はシャンツまたは改変シャンツ工程において不要である。毒素が細胞溶解により解放され、培養液中に存在するプロテアーゼにより活性化されると考えられる。適宜、全不純物(すなわち全細胞および破裂性細胞)を除去するために単一層深度フィルターを用いてこの培地のろ過を行い、精製培養液と称される透明溶液を得ることができる。
毒素の集菌は、硫酸でpH3.5まで低下させ、粗毒素を20℃にて析出させることにより達成することができる。次いで粗毒素を超精密ろ過、次いでダイアフィルトレーション(diafiltration)により濃縮した。
次いで集菌された粗製の毒素を消化容器に移し、プロテアーゼ阻害剤ベンズアミジン塩酸塩の付加により安定化させた。DNアーゼおよびRNアーゼを加えて核酸を消化させた。原料を含む毒素にUF/DFおよび三つの析出工程(冷エタノール、塩酸および硫酸アンモニウム析出)を行った。精製ボツリヌス神経毒素複合体(バルク毒素)を2〜8℃にてリン酸ナトリウム/硫酸アンモニウム緩衝液中の懸濁液として保存した。
ボツリヌス毒素を得るためのAPF培地および工程
本実施例は、高有効性および高精製クロストリジウム・ボツリヌス毒素A型(すなわちバルク毒素)を得るために実行されるAPF工程を記載する。工程は、他のボツリヌス毒素抗原型と用いることができる。
実施例6に記載するように、クロストリジウム・ボツリヌス菌はATCC、種々の天然源またはボツリヌス中毒症患者から得ることができる。図2の下半分は、細胞バンクバイアルの調製およびボツリヌス毒素の培養および発酵に用いられるAPF工程を概略する。APF細胞バンクバイアルは、植物性寒天平板上にてクロストリジウム・ボツリヌス菌を培養することにより調製した。植物性寒天平板は、3:1:1(重量%)の比にて酵母エキスおよびグルコースを含む大豆誘導体HySoy(Quest)を寒天と混合し、設定することにより調製した。プレートを作るための他の市販のAPF寒天平板または脱水粉末もまた、適切であると見出した。次いで選択された高増殖コロニーは、APF細胞バンクバイアル培地中に植菌した。用いられるAPF細胞バンクバイアル培地は、同じ3:1:1の比の加水分解大豆タンパク質、酵母エキス(非動物性産物は酵母の培養またはそれから調製される酵母エキスの調製工程にて用いられた)およびグルコースからなる。他の養分比(すなわち6:1:1、6:0:1および6:3:1)もまた適切であることを見出した。用いられる加水分解大豆(HySoy)および酵母エキス(HyYest)濃縮物は、Quest Internationalから得た。APF培地中のクロストリジウム・ボツリヌス菌培養物をグリセロールと混合し、クライオバイアルにアリコートを取り、後の使用のために凍結させた。発展させたAPF培地を用いて、一年以上の間生存率を欠乏させないでクロストリジウム・ボツリヌス・バクテリアを保存することができる。クライオバイアル中のこれらの凍結培養およびグリセロール混合物は、APF細胞バンクバイアルである。
APF細胞バンクバイアルを室温にて解凍した後、単一の培養工程を行った: 次いで1リットル種培養ボトルを同じAPF培地(APF細胞バンクバイアル[保存]培地はAPF発酵[増殖]培地と異なり得る)を用いてAPF細胞バンクバイアル内容物で直接植菌(すなわち血液寒天培地の介入またはチューブ増殖工程なし)し、嫌気性(窒素)雰囲気下pH7.0の初期培地で35℃にて15〜24時間維持した。
次に種ボトル培養物を嫌気性(窒素)雰囲気下、pH7.0の初期培地で35℃にて52〜72時間維持したAPF培地(加水分解大豆タンパク質、酵母エキスおよび1%グルコース)を含む工業規模の10リットル産生発酵槽に移した。発酵開始から約15時間後(培養物pHは自然に6.0以下に減少した)、培養物にHClを加えることによりpH5.0〜5.5の範囲にてpH制御プログラムを開始する。許容される収率の活性なボツリヌス毒素を得るために狭い範囲内でAPF発酵培地のpHを制御することが必要であったことを見出した。従ってこのpH5.0〜5.5へのpH制御はボツリヌス毒素の有効性の低下および欠乏を実質的に防ぐことを見出した。発酵の間、ほとんどの細胞が溶解を受けてボツリヌス毒素を放出し、細胞溶解により解放された毒素が培養液に存在するプロテアーゼにより活性化されると考えられる。単一層デプス・フィルターを用いたこの培地のろ過は、全不純物(すなわち全細胞および破裂性細胞)を除去し、精製培養液と称される透明溶液を生じる。
次いでボツリヌス毒素の集菌は実施例6のように進行することができる(すなわち硫酸析出、次いで精密ろ過による濃縮、それに次ぐダイアフィルトレーション)。
次いで毒素の精製を実施例6のように進行することができる: すなわちベンズアミジン塩酸塩およびDNアーゼおよびRNアーゼの付加、硫酸析出、冷エタノール析出、リン酸緩衝液抽出、塩酸析出、リン酸緩衝液抽出およびバルク毒素保存。
Claims (17)
- (a)実質的に動物由来産物不含であり、約4〜8重量%の大豆誘導体を含有する発酵培地を準備し;
(b)ボツリヌス毒素の産生を可能にする条件下、該発酵培地中にてクロストリジウム・ボツリヌス・バクテリアを発酵させ;そして
(c)該発酵培地から生物学的に活性なボツリヌス毒素を回収する
ことを特徴とする、生物学的に活性なボツリヌス毒素を得るための方法。 - 発酵培地がさらに約0〜3重量%の酵母エキスを含有する、請求項1記載の方法。
- 発酵培地がさらに約1〜2重量%のグルコースを含有する、請求項1記載の方法。
- 発酵工程が約5.0〜5.5のpHで行われる、請求項1記載の方法。
- 発酵工程が約45時間〜75時間行われる、請求項1記載の方法。
- 発酵工程が約33℃〜36℃の温度にて行われる、請求項1記載の方法。
- 発酵工程が嫌気性雰囲気下で行われる、請求項1記載の方法。
- 準備工程の前に、実質的に動物由来産物不含であり、約4〜8重量%の大豆誘導体を含有する培地を得、該培地中にてクロストリジウム・ボツリヌス・バクテリアを培養する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 回収工程が動物性タンパク質不含(APF)精製工程である、請求項1記載の方法。
- (a)実質的に動物由来産物不含であり、約4〜8重量%の大豆誘導体を含有する培地を得、該培地中にてクロストリジウム・ボツリヌス・バクテリアを培養し;
(b)実質的に動物由来産物不含であり、
(i)約4〜8重量%の大豆誘導体、
(ii)約0〜3重量%の酵素エキス、
(iii)約1〜2重量%のグルコース
を含有する発酵培地を準備し、
(c)(i)初期細胞増殖後、約5.0〜5.5のpHにて発酵工程を行うこと、
(ii)約45時間〜75時間の発酵工程を行うこと、
(iii)約33℃〜約36℃の温度にて発酵工程を行うこと、
(iv)嫌気性雰囲気下、発酵工程を行うこと
などのボツリヌス毒素の産生を可能にする条件下、該発酵培地中にてクロストリジウム・ボツリヌス・バクテリアを発酵させ;そして
(d)該発酵培地から生物学的に活性なボツリヌス毒素を回収(ここに、回収工程はAPF精製工程である)する
ことを特徴とする、生物学的に活性なボツリヌス毒素を得るための方法。 - 培地が実質的に動物由来産物不含であり、植物由来のタンパク質産物を含有する、ボツリヌス毒素を培養または発酵させるための培地。
- 培地が約4〜8重量%の大豆誘導体を含有する、請求項11記載の培地。
- 培地が約0〜3重量%の酵母エキスを含有する、請求項11記載の培地。
- 培地がさらに約1〜2重量%のグルコースを含有する、請求項11記載の培地。
- 培地が実質的に動物由来産物不含であり、
(a)約4〜8重量%の大豆誘導体;
(b)約0〜3重量%の酵母エキス;および
(c)約1〜2重量%のグルコース
を含有することを特徴とする、クロストリジウム・ボツリヌス・バクテリアを培養し、および/または発酵させるための培地。 - (a)(i)実質的に動物由来産物不含である発酵培地を準備し;
(ii)ボツリヌス毒素の産生を可能にする条件下、該発酵培地中にてクロストリジウム・ボツリヌス菌を培養し;そして
(iii)該発酵培地から生物学的に活性なボツリヌス毒素を回収する
ことにより生物学的に活性なボツリヌス毒素を得;
(b)ボツリヌス毒素と適切な賦形剤とを配し、それにより活性成分がボツリヌス毒素である実質的に動物性産物不含医薬組成物を製造する
ことを特徴とする、活性成分がボツリヌス毒素である実質的に動物性産物不含医薬組成物を製造する方法。 - (a)実質的に動物由来産物不含であり、約4〜8重量%の大豆誘導体を含有する発酵培地を準備し;
(b)初期細胞増殖後、pH5.0〜5.5に維持されている、該発酵培地中にてクロストリジウム・ボツリヌス・バクテリアを発酵させ;そして
(c)該発酵培地から生物学的に活性なボツリヌス毒素を回収する
ことを特徴とする、生物学的に活性なボツリヌス毒素を得るための方法。
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