MXPA06009854A

MXPA06009854A - Sistema libre de productos de origen animal y proceso para purificar una toxina botulinica.

Info

Publication number: MXPA06009854A
Application number: MXPA06009854A
Authority: MX
Inventors: Ping Wang; Stephen Donovan; Hui Xiang; Mingjiang Luo
Original assignee: Allergan Inc
Priority date: 2005-03-03
Filing date: 2005-03-03
Publication date: 2007-03-29
Also published as: AU2005327457B2; JP4913074B2; IL227909A0; BRPI0508374A; WO2006096164A1; US7354740B2; JP2008531046A; US20130171716A1; US20220144887A1; IL241873A0; IL177468A0; US20210222142A1; JP5006803B2; US20210079370A1; EP1853623A1; US20140178966A1; EP1853622A1; CN1930186A; CA2556796C; CA2556537A1

Abstract

Se describen procesos y sistemas cromatograficos para purificar una toxina botulinica de un medio de fermentacion APF.

Description

SISTEMA LIBRE DE PRODUCTOS DE ORIGEN ANIMAL Y PROCESO PARA PURIFICAR UNA TOXINA BOTULINICA Campo de la invención La presente invención se refiere a sistemas y procesos para purificar una toxina de Clostridium. En particular, la presente invención se refiere a un proceso cromatográfico para purificar una neurotoxina botulínica.

Antecedentes de la invención Una composición farmacéutica adecuada para su aó?tdnistración a un humano o animal para un propósito terapéutico, de diagnóstico, investigación o cosmético puede comprender un ingrediente activo. La composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede incluir también uno o más excipientes, reguladores de pH, vehículos, estabilizadores, conservadores y/o agentes de volumen. El ingrediente activo en una composición farmacéutica puede ser un material biológico tal como una toxina botulínica. El ingrediente activo de toxina botulínica usado para hacer una composición farmacéutica de toxina botulínica puede obtenerse a través de un proceso de cultivo, fermentación y mezclado de varias etapas que haga uso de uno o más productos derivados de animales (tales como caldo de carne e ingredientes de caseína en uno o más de los medios de cultivo y fermentación usados para obtener una toxina botulínica global, y una fracción de sangre o excipiente de derivado hemático en la REF. : 175168 composición farmacéutica de toxina botulínica mezclada final) . La administración a un paciente de una composición farmacéutica en la que el material biológico ingrediente activo se obtiene a través de un proceso que hace uso de productos derivados de animales puede someter al paciente a un riesgo potencial para recibir varios patógenos o agentes infecciosos. Por ejemplo, pueden estar presentes priones en una composición farmacéutica. Un prión es una partícula infecciosa proteinácea que se hipotetiza se origina como una isoforma conformacional anormal a partir de la misma secuencia de ácido nucleico que hace a la proteína normal. Se ha creado además la hipótesis de que la infectividad reside en una "reacción de reclutamiento" de la proteína de isoforma normal a la isoforma de proteína prión a un nivel post-traduccional. Aparentemente, la proteína celular endógena normal se induce a una replicación inadecuada en una conformación priónica patógena. La enfermedad de Creutzfeldt-Jacob es un raro trastorno neurodegenerativo de encefalopatía espongiforme transmisible por humanos en donde el agente transmisible es aparentemente una isoforma anormal de una proteína prión. Un individuo con enfermedad de Creutzfeldt-Jacob puede deteriorarse de aparentemente de una perfecta salud a un mutismo acinético dentro de seis meses. Así, puede existir un riesgo potencial de adquirir una enfermedad mediada por priones, tal como enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, a partir de la administración de una composición farmacéutica que contenga un material biológico, tal como una toxina botulínica, obtenido, purificado o mezclado usando productos derivados.de animales.

Toxina botulínica El género Clostridium tiene más de- ciento veintisiete especies, agrupadas por morfología y función. La bacteria anaeróbica y gram positiva Clostridium- ..botulinum produce una potente neurotoxina polipéptida, toxina botulínica, que causa una enfermedad neuroparalítica en humanos y animales conocida como botulismo. La Clostridium botulinum y sus esporas se encuentran comúnmente en suelo y la bacteria puede crecer en recipientes de alimentos inadecuadamente esterilizados y sellados de fábricas caseras de conservas o enlatados, los cuales son la causa de muchos de los casos de botulismo. Los efectos del botulismo típicamente aparecen 18 a 36 horas después de comer los alimentos infectados con un cultivo o esporas de Clostridium botulinum. La toxina botulínica puede pasar aparentemente inatenuada a través del revestimiento del intestino y atacar neuronas motoras periféricas. Los síntomas de intoxicación por toxina botulínica pueden progresar de dificultad para caminar, tragar y hablar a parálisis de los músculos respiratorios y muerte. La toxina botulínica tipo A es el agente biológico natural más letal conocido por el hombre. Aproximadamente 50 picogramos de toxina botulínica (complejo de neurotoxina purificado) tipo A es una LD50 en ratones. Sobre una base molar, la toxina botulínica tipo A es 1.8 billones de veces más letal que la difteria, 600 millones de veces más letal que el cianuro de sodio, 30 millones más letal que la cobrotoxina y 12 millones de veces más letal que el cólera. Singh, Cri tical Aspects of Bacterial Protein Tox:ins, páginas 63-84 (capítulo 4) de Natural Toxins II, editado por B.R. Singh et al.-, Plenum Press, Nueva York (1976) (en donde la LD50 indicada de toxina botulínica tipo A de 0.3 ng es igual a 1 U se corrige para el hecho de que aproximadamente 0.05 ng de BOTOX® es igual a 1 unidad) . El BOTOX® es la marca comercial de un complejo de neurotoxinas de toxina botulínica tipo A purificada disponible comercialmente de Allergan, Inc., de Irvine, California. Una unidad (U) de toxina botulínica se define como la LD50 después de inyección intraperitoneal en ratones Swiss Webster hembra que pesan aproximadamente 18-20 gramos cada uno. En otras palabras, una unidad de toxina botulínica es la cantidad de toxina botulínica que mata 50% de un grupo de ratones Swiss Webster hembra. Siete neurotoxinas botulínicas inmunológicamente distintas generalmente han sido caracterizadas, éstas siendo respectivamente los serotipos A, B, Ci, D, E, F y G de neurotoxina botulínica cada uno de los cuales se distingue por neutralización con anticuerpos de tipo específico. Los diferentes serotipos de toxina botulínica varían en la especie animal que afectan y en la severidad y duración de la parálisis que inducen. Por ejemplo, -se ha determinado que la toxina botulínica tipo A es 500 veces más potente, medida por la velocidad de parálisis producida en la rata, que la toxina botulínica tipo B. Además, se ha determinado que la toxina botulínica tipo B no es tóxica en primates a una dosis de 480 U/kg que es aproximadamente 12 veces la LD50 de primates para toxina botulínica tipo A. Las toxinas botulínicas aparentemente se unen con alta afinidad a las neuronas motoras colinérgicas, son translocadas a la neurona y bloquean la liberación presináptica de acetilcolina. Las toxinas botulínicas han sido usadas en escenarios clínicos para el tratamiento de, por ejemplo, trastornos neuro usculares caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos . La toxina botulínica tipo A ha sido aprobada por la Oficina de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos para el tratamiento de blefaroespasmo esencial, estrabismo y espasmo hemifacial en pacientes de más de doce años, para el tratamiento de distonía cervical y para el tratamiento de arrugas en línea glabelar (faciales) . La FDA también ha aprobado una toxina botulínica tipo B para el tratamiento de distonía cervical . Los efectos clínicos de la inyección periférica (es decir, intramuscular o subcutánea) de toxina botulínica tipo A normalmente se observan a la semana de inyección, y comúnmente a las pocas . horas después de la inyección. La duración típica del alivio sintomático (es decir, parálisis de músculos flácidos) a partir de una sola inyección intramuscular de toxina botulínica tipo A puede ser de aproximadamente tres meses a aproximadamente seis meses . _ . Aunque todos los serotipos de toxinas botulínicas aparentemente inhiben la liberación del neurotransmisor acetilcolina en la unión neuromuscular, lo hacen al afectar proteínas neurosecretoras diferentes y/o cortar esas proteínas en diferentes sitios. La toxina botulínica A es una endopeptidasa de zinc que puede hidrolizar específicamente un enlace péptido de la proteína intracelular y asociada a vesículas SNAP-25. La toxina botulínica tipo E también corta la proteína asociada sinaptosómica de 25 kiloDaltons (kD) (SNAP-25) , pero se dirige a diferentes secuencias de aminoácidos dentro de esta proteína, en comparación con la toxina botulínica tipo A. Las toxinas botulínicas tipos B, D, F y G actúan .en proteína asociada a vesículas (VAMP, también llamada sinaptobrevina) , con cada serotipo cortando la proteína en un sitio diferente. Finalmente, la toxina botulínica tipo Ci ha mostrado cortar tanto sintaxina como SNAP-25. Estas diferencias en el mecanismo de acción pueden afectar la relativa potencia y/o duración de acción de los diferentes serotipos de toxina botulínica. No obstante el serotipo, el mecanismo molecular de intoxicación por toxina parece ser similar e implicar al menos tres etapas o pasos. En la primer etapa del proceso, la toxina se une a la membrana presináptica de la neurona objetivo a través de una interacción específica entre la cadena pesada (cadena H) y un receptor de la superficie celular; se cree que el .receptor es diferente para cada serotipo de toxina botulínica. El segmento final carboxilo de la cadena H, Hc, parece ser importante para dirigir la toxina a la superficie celular . En la segunda etapa, la toxina cruza la membrana de plasma de la célula envenenada. La toxina es primero envuelta por la célula a través de endocitosis mediada por receptor, y un endosoma que contiene la toxina se forma. La toxina escapa después del endosoma al interior del citoplasma de la célula. Esta última etapa se cree que es mediada por el segmento de extremo amino de la cadena H, HN, el cual desencadena un cambio en conformación de la toxina en respuesta a un pH de aproximadamente 5.5 o menos. Se sabe que los endosomas poseen una bomba de protones que reduce el pH intra endosó ico. El desplazamiento en conformación expone residuos hidrofóbicos en la toxina, lo cual permite que la toxina se inserte a sí misma en la membrana endosómica . La toxina se transporta después a través de la membrana endosómica al interior del citosol. La última etapa del mecanismo de actividad de la toxina botulínica parece incluir la reducción del enlace disulfuro que une la cadena H y L. La actividad tóxica completa de la botulina y toxinas botulínicas está contenida en la cadena L de la holotoxina; la cadena L es una éndopeptidasa de zinc . (Zn++) que corta selectivamente proteínas esenciales para el reconocimiento y portación de vesículas que contienen neurotransmisores con la superficie citoplásmica de la membrana de plasma, y la fusión de las vesículas con la membrana de plasma. La neurotoxina botulínica, toxina botulínica B, D, F y G causa la degradación de sinaptobrevina (también llamada proteina de membrana asociada a vesículas (VAMP) ) , una proteína de membrana sinaptosómica. La mayoría de la VAMP presente en la superficie citosólica de la vesícula sináptica es retirada como resultado de cualquiera de estos eventos de corte. Cada toxina corta específicamente un enlace diferente. El peso molecular de la molécula de proteína de toxina botulínica, para todos los siete serotipos de toxina botulínica conocidos, es de aproximadamente 150 kD. De manera interesante, las toxinas botulínicas son liberadas por bacterias clostridiales como complejos que comprenden la molécula de proteína de toxina botulínica de 150 kD junto con una o más proteínas no tóxicas asociadas. Así, el complejo de toxina botulínica tipo A puede producirse por una bacteria clostridial como formas de 900 kD, 500 kD y 300 kD (pesos moleculares aproximados) . Los tipos de toxina botulínica B y Ci se producen aparentemente como un complejo de sólo 500 kD. La toxina botulínica tipo D se produce como complejos tanto de 300 kD como de 500 kD. Finalmente, las toxinas botulínicas tipos E y F se producen como complejos de sólo aproximadamente 300 kD. Se cree que los complejos (es decir, con un peso molecular de más de aproximadamente 150 kD) contienen una proteína de hemaglutinina no tóxica y una proteína que no es hemaglutinina que no es toxina y no es tóxica. Así, un complejo de toxina botulínica puede comprender una molécula de toxina botulínica (el componente neurotóxico) y una o más proteínas de hemaglutinina no tóxicas y/o proteínas que no son hemaglutinina y no son toxinas (éstas últimas pueden ser referidas como proteínas NTNH) . Estos dos tipos de proteínas que no son toxina (las cuales junto con la molécula de toxina botulínica pueden comprender el complejo de neurotoxinas relevante) pueden actuar para proporcionar estabilidad contra la desnaturalización a la molécula de toxina botulínica y protección contra ácidos digestivos cuando la toxina sea ingerida. Además, es posible que los complejos de toxina botulínica más grandes (de más de aproximadamente 150 kD de peso molecular) puedan dar como resultado una velocidad de difusión más lenta de la toxina botulínica lejos de un sitio de inyección intramuscular de un complejo de toxina botulínica. Los complejos de toxina botulínica pueden disociarse en proteínas de toxina y proteínas de hemaglutinina al tratar el complejo con glóbulos rojos a un pH de 7.3 o al someter el complejo a un proceso de separación, tal como cromatografía en columna, en un regulador de pH adecuado a un pH de aproximadamente 7-8. La proteína de toxina botulínica tiene una marcada inestabilidad después de la remoción de la proteína de hemaglutinina. Todos los serotipos de toxina botulínica son hechos por bacterias Clostridium botullinum nativas como proteínas de cadena individual inactivas las cuales deben ser cortadas o melladas por proteasas para volverse neuroactivas . Las cepas bacterianas que hacen los serotipos A y G de toxina botulínica poseen proteasas endógenas y los serotipos A y G pueden por lo tanto recuperarse de cultivos bacterianos predominantemente en su forma activa. En contraste, los serotipos Ci, D y E de toxina botulínica se sintetizan por cepas no proteolíticas y son por lo tanto típicamente inactivados cuando se recuperan de cultivo. Los serotipos B y F se producen por cepas tanto proteolíticas como no proteolíticas y por lo tanto pueden recuperarse ya sea en la forma activa o inactiva. Sin embargo, incluso las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, el serotipo de toxina botulínica tipo B sólo cortan una porción de la toxina producida. La proporción exacta de moléculas melladas a no melladas depende de la longitud de incubación y de la temperatura de cultivo. Por lo- tanto, cierto porcentaje de cualquier preparación de, por ejemplo, la toxina botulínica tipo B es probable que sea inactivo, posiblemente debido a la potencia significativamente más baja conocida de la toxina botulínica tipo B en comparación con la toxina botulínica tipo A. La presencia de moléculas de toxina botulínica inactivas en una preparación clínica contribuirá a la carga proteica total de la preparación, lo cual ha estado ligado a una antigenicidad incrementada, sin contribuir a su eficacia clínica. Además, se sabe que la toxina botulinica tipo B tiene, luego de la inyección intramuscular, una duración de actividad más corta y también es menos potente que la toxina botulínica tipo A al mismo nivel de dosis . Estudios in vi tro han indicado que la toxina botulínica inhibe la liberación inducida por cationes de potasio tanto de acetilcolina como de norepinefrina a partir de cultivos de células primarias de tejido de tallo cerebral. Además, se ha reportado que la toxina botulínica inhibe la liberación evocada tanto de glicina como de glutamato en cultivos primarios de neuronas de la espina dorsal y que preparaciones de sinaptosomas cerebrales la toxina botulínica inhibe la liberación de cada uno de los neurotransmisores acetilcolina, dopamina, norepinefrina, CGRP y glutamato. El éxito de la toxina botulínica tipo A para tratar una variedad de condiciones clínicas ha llevado a interés en otros serotipos de toxina botulínica. Así, al menos las toxinas botulinicas tipos A, B, E y F han sido usadas clínicamente en humanos. Además, una toxina botulínica pura - (aproximadamente 150 kDa) ha sido usada para tratar humanos.

".Véase, por ejemplo, Kohl A., et al., Comparison of the effect - of botulinum toxin A (Botox (R) ) wi th the highly-purified neurotoxin (NT 201) in th extensor digi torum brevis muscle test, Mov Disord 2000; 15(Suppl 3):165. Por consiguiente, se puede preparar una composición farmacéutica de toxina botulínica usando una toxina - botulínica pura (de aproximadamente 150 kDa) , a diferencia de usar un complejo de toxinas botulínicas . Se sabe que la toxina botulínica tipo A es soluble en soluciones acuosas diluidas a un pH de 4-6.8. A un pH de más de aproximadamente 7 las proteínas no tóxicas estabilizadoras se disocian de la neurotoxina, dando como resultado una pérdida gradual de toxicidad, particularmente al elevarse el pH y la temperatura. Schantz E.J., et al. Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment (en particular páginas 44-45) , siendo el capítulo 3 de Jankovic, J., et al, Therapy with Botulinum toxin, Marcel Dekker, Inc (1994) . Al igual que con las enzimas generalmente, las actividades biológicas de las toxinas botulínicas (las cuales son peptidasas intracelulares) depende, al menos en parte, de su conformación tridimensional. De ésta manera, la toxina botulínica tipo A es destoxificada por calor, estiramiento de superficie por varios químicos y secado de superficie. Además, se conoce que la dilución del complejo de toxinas obtenido por el cultivo, fermentación y purificación conocidos hasta las concentraciones mucho, mucho más bajas usadas para la formulación de composiciones farmacéuticas da como resultado una rápida destoxificación de la toxina a menos que esté presente un agente de estabilización adecuado. La dilución de la toxina a partir de cantidades en miligramos hasta una solución que contiene nanogramos por mililitro presenta dificultades significativas debido a la pérdida de toxicidad específica después de esta gran dilución. Ya que la toxina puede usarse meses o años después de que se formule la composición farmacéutica que contiene toxina, la toxina puede estabilizarse con un agente estabilizador tal como albúmina y gelatina. Se ha reportado que una toxina botulínica ha sido usada en varios escenarios clínicos, incluyendo los siguientes : (1) aproximadamente 75-125 unidades de BOTOX® por inyección intramuscular (varios músculos) para tratar distonía cervical; (2) 5-10 unidades de BOTOX® por inyección intramuscular para tratar líneas glabelares (surcos en las cejas) (5 unidades inyectadas intramuscularmente en el músculo procero y 10 unidades inyectadas intramuscularmente en cada músculo de las cejas corrugadoras ) ; (3) aproximadamente 30-80 unidades de BOTOX® para tratar constipación mediante inyección intraesfínter del músculo puborrectal ; (4) aproximadamente 1-5 unidades por músculo de BOTOX® inyectado intramuscularmente para tratar blefaroespasmo al inyectar el músculo ocular orbicular pre-tarsal lateral ,del párpado superior y los óculos orbiculares pre-tarsal laterales del párpado inferior; (5) para tratar estrabismo, músculos extraoculares han sido inyectados intramuscularmente con entre alrededor • de 1-5 unidades de BOTOX®, la cantidad inyectada variando con base tanto en el tamaño del músculo que será inyectado como el grado de parálisis muscular deseado (es decir, cantidad de corrección dióptera deseada) ; (6) para tratar espasticidad de las extremidades superiores luego de una embolia por inyecciones intramusculares de BOTOX® en cinco músculos flexores de extremidades superiores diferentes, como sigue: (a) digi torum profundus flexor: 7.5 U a 30 U (b) digi torum sublimus flexor: 7.5 U a 30 U (c) carpí ulnaris flexor: 10 U a 40 U (d) carpi radialis flexor: 15 U a 60 U (e) braquias del bíceps: 50 U a 200 U. Cada uno de los cinco músculos indicados ha sido ' inyectado en la misma sesión de tratamiento, de tal forma que el paciente reciba de 90 U a 360 U de músculo flexor de extremidad superior de BOTOX® mediante inyección intramuscular én cada sesión de tratamiento. (7) para tratar migraña, una inyección inyectada pericraneal (inyectada simétricamente en músculos glabelares, frontales y temporales) de 25 U de BOTOX® ha demostrado un beneficio significativo como un tratamiento profiláctico de migraña en comparación con vehículo medido por mediciones reducidas de frecuencia de migraña, severidad máxima, vómito asociado y medicación aguda durante el periodo de tres meses después de la inyección de 25 U. Se sabe que la toxina botulínica tipo A puede tener una eficacia durante hasta 12 meses {European J. Neurology 6 (Supp 4): S111-S1150 :1999) , y en algunos casos durante hasta 27 meses. The Laryngoscope 109:1344-1346:1999. Sin embargo, la duración normal de inyección intramuscular de Botox® es de típicamente de alrededor de 3 a 4 meses . Una composición farmacéutica que contiene toxina botulinica comercialmente disponible se vende con la marca comercial BOTOX® (disponible de Allergan, Inc., de Irvine, California) . BOTOX® consiste en un complejo de toxina botulínica tipo A purificado, albúmina de suero humano y cloruro de sodio empacado en una forma estéril y secada al vacío. La toxina botulínica tipo A se hace a partir de un cultivo de la cepa Hall de Clostridium botulinum cultivada en un medio que contiene N-Z amina caseína y extracto de levadura. El complejo de toxina botulínica tipo A se purifica de la solución de cultivo por medio de una serie de precipitaciones con ácido o de precipitaciones con ácido y etanol para cristalizar un complejo que consista en la proteína de toxina activa ' con alto peso molecular y una proteína de hemaglutinina asociada. El complejo cristalino es redisuelto en una solución que contiene salina y albúmina y se filtra estérilmente (0.2 mieras) antes del secado al vacío. El BOTOX® puede reconstituirse con solución salina estéril y no preservada antes de la inyección intramuscular.

Cada frasco de BOTOX® contiene aproximadamente 100 unidades (U) de complejo de toxina botulínica tipo A de Clostridium botulinum, 0.5 miligramos de albúmina de suero humano y 0.9 miligramos de cloruro de sodio en una forma estéril y secada al vacío sin un conservador.

Para reconstituir BOTOX® secado al vacío solución salina estéril normal sin un conservador (inyección de cloruro de sodio al 0.9%) se usa al extraer la cantidad adecuada de diluyente en la jeringa de tamaño adecuado. Ya que el BOTOX® se desnaturaliza mediante burbujeo o agitación violenta similar, el diluyente se inyecta suavemente en el frasco. El BOTOX® reconstituido puede almacenarse en un refrigerador (2o a 8°C) y es un -líquido transparente e incoloro y libre de materia en partículas . Hay reportes de que el BOTOX® reconstituido conserva su potencia durante hasta treinta días. Véase, por ejemplo, Guttman C, Botox retains i ts efficacy for blepharospasm treatment after freezing and storage, New York investigators find, EuroTimes 2000 Nov/Dec; 5 (8) :16. El producto secado al vacío se congela en un congelador a o debajo de -5°C. En general, cuatro grupos fisiológicos de C. botulinum se reconocen (I, II, III, IV) . Los organismos capaces de producir una toxina serológicamente distinta pueden provenir de más de un grupo fisiológico. Por ejemplo, las toxinas tipo B y F pueden producirse or cepas del grupo I ó II. Además, se han identificado otras cepas de especies clostridiales (C. baratii , tipo F; C. butyricum, tipo E; C. novyi , tipo Ci o D) que pueden producir neurotoxinas de botulina. Los grupos fisiológicos de los tipos de Clostridium botulinum se listan en la tabla 1 Tabla 1 Grupos fisiológicos de Clostridium botulinum . Estos tipos de toxinas pueden producirse mediante selección a partir del grupo fisiológico adecuado de organismos de Clostridium botulinum. Los organismos designados como grupo I normalmente son conocidos como proteolíticos y producen toxinas botulínicas de tipos A, B y F. Los organismos designados como grupo II son sacarolíticos y producen toxinas botulínicas de los tipos B, E y F. Los organismos designados como grupo III producen sólo la toxina botulínica tipo C y D y se distinguen de los organismos de los grupos I y II por la producción de cantidades significativas de ácido propiónico. Los organismos del grupo IV sólo producen neurotoxina de tipo G. Se conoce obtener una toxina tetánica usando medios específicos sustancialmente libres de productos animales. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. 6,558,926. Sin embargo, notablemente, incluso los medios "libres de productos animales" descritos por esta patente usan Bacto- peptona, un digestor de carne. Significativamente, la producción de toxina tetánica por Clostridium tetan! contra la producción de una toxina botulínica por una bacteria de Clostridium botulinum implica diferentes parámetros y consideraciones de crecimiento, medios y fermentación. Véase, por ejemplo, Johnson, E.A., et al., Clostridium botulinum and i ts neurotoxins : a metabolic and cellular perspective, Toxicon_39 (2001), 1703-1722.

Producción de neurotoxina botulínica activa La toxina botulínica para usarse en una composición farmacéutica puede obtenerse mediante la fermentación anaeróbica de . Clostridium botulinum usando una versión modificada del bien conocido proceso de Schantz (véase, por ejemplo, Schantz E.J., et al., Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 Mar; 56 (1) : 80-99 ; Schantz E.J., et al., Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment, capítulo 3 en Jankovic J, ed. Neurological Disease and Therapy, Therapy with botulinum toxin (1994), Nueva York, Marcel Dekker; 1994, páginas 41-49, y; Schantz E.J. et al., Use of cristaline type A botulinum toxin in medical research, en; Lewis GE Jr. Ed. Biomedical Aspects of Botulism (1981) Nueva York, Academic Press, páginas 143-50) . Una neurotoxina de Clostridium botulinum (como toxina pura o como un complejo de toxina botulínica) también puede obtenerse mediante fermentación aeróbica de una célula huésped recombinante que • porte el gen adecuado. Véase por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,919,665 titulada Vaccine for clostridium botulinum neurotoxin, publicada el 6 de julio de 1999 a Williams y la solicitud de patente de E.U.A._ 20030215468 titulada Soluble recombinant botulinum toxin proteins por Williams et al . , publicada el 20 de noviembre de 2003. Adicionalmente, las toxinas botulínicas (la molécula de 150 kilodaltons) y los complejos de toxinas botulínicas (300 kDa a 900 kDa) pueden obtenerse de, por ejemplo, List Biological Laboratories, Inc., Campbell, California; the Centre for Applied Microbiology and Research, Portón Down, Reino Unido; Wako (Osaka, Japón) , así como de Sigma Chemicals de San Luis, Missouri. Las composiciones farmacéuticas que contienen toxina botulínica disponibles comercialmente incluyen BOTOX® (complejo de neurotoxina purificado de toxina botulínica tipo A con albúmina de suero humano y cloruro de sodio) disponible de Allergan, Inc., de Irvine, California en frascos de 100 unidades como un polvo liofilizado que será reconstituido con cloruro de sodio al 0.9% antes de usar), Dysport® (complejo de toxina tipo A de Clostridium botulinum y hemaglutinin'a con albúmina de suero humano y lactosa en la composición farmacéutica de toxina botulínica) , disponible de Ipsen Limited, Berkshire, Reino Unido, como un polvo que será reconstituido con cloruro de sodio al 0.9% antes de usar) y MyoBioc™ (una solución inyectable que comprende toxina botulínica tipo B, albúmina de suero humano, succinato de sodio y cloruro de sodio a un pH de aproximadamente 5.6, disponible de Solstice Neurosciences (anteriormente disponible de Elan Corporation, Dublín, Irlanda) de San Diego, California. Se requiere de un número de etapas para hacer una composición ' farmacéutica de toxina clostridial adecuada para su administración a un humano o animal para un propósito terapéutico, de diagnóstico, investigación o cosmético. Estas etapas pueden incluir obtener una toxina clostridial purificada y luego mezclar la toxina clostridial purificada. Una primera etapa puede ser cultivar. una bacteria clostridial, típicamente sobre placas de agar, en un ambiente que conduzca al crecimiento bacteriano, tal como en una atmósfera anaeróbica tibia. La etapa de cultivo permite obtener colonias clostridiales con morfología deseable y otras características. En una segunda etapa seleccionada las colonias clostridiales cultivadas pueden fermentarse en un medio adecuado . Después de cierto periodo de fermentación las bacterias clostridiales típicamente lisan y liberan toxina clostridial en el medio. Tercero, el medio de cultivo puede purificarse para obtener así una toxina global o cruda. Típicamente, la purificación del medio de cultivo para obtener toxina global se lleva a cabo usando, entre otros reactivos, enzimas derivadas de animales, tales como DNasa y RNasa, las cuales se usan para degradar y facilitar la remoción de ácidos nucleicos. La toxina global resultante puede ser una toxina altamente -purificada con una alta actividad específica. Después de la estabilización en un regulador de pH adecuado, la toxina global puede mezclarse con uno o más excipientes para hacer una composición farmacéutica de toxina clostridial adecuada para su administración a un humano. La composición farmacéutica de toxina clostridial puede comprender una toxina clostridial como un ingrediente farmacéutico activo. La composición farmacéutica también puede incluir uno o más excipientes, reguladores de pH, vehículos, estabilizadores, conservadores y/o agentes de volumen. La etapa de fermentación de toxina de Clostridium puede dar como resultado una solución de cultivo que contenga bacterias de Clostridium enteras, bacterias Usadas, nutrientes de medios de cultivo y subproductos de fermentación. La filtración de esta solución de cultivo, para remover así elementos grandes, tales como bacterias enteras y Usadas, proporciona un cultivo aclarado. La solución de cultivo aclarado comprende una clostridial y varias impurezas y puede procesarse para obtener así una toxina clostridial concentrada, la cual es llamada toxina global. Se conocen los procesos de fermentación y purificación para obtener una toxina clostridial global usando uno o más productos derivados de animales (tales como la caseína digestora de leche, DNasa y RNasa) . Un ejemplo de este proceso no APF conocido para obtener un complejo de toxina botulínica es el proceso de Schantz. El proceso de Schantz (a partir del cultivo de células inicial hasta la fermentación y purificación de toxinas) hace uso de un número de productos derivados de fuentes animales tales como por ejemplo Medio Bacto de Carne Cocida derivado de animal en el frasco de cultivo, placas de Agar Hemático Columbia para el crecimiento y selección de colonias y caseína en el medio de fermentación. Además, el proceso de purificación de toxina global de Schantz hace uso de DNasa y RNasa de fuentes bovinas para hidrolizar ácidos nucleicos presentes ' en el medio de cultivo fermentado que contiene toxina. Se conoce un proceso de fermentación para obtener un toxoide tetánico que usa cantidades reducidas de productos derivados de animales (referidos como libre de proteínas animales o procesos de fermentación) . Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. 6,558,926 titulada Method for production of tetanus toxin using media substantially free of animal products, expedidia a Demaín et al., mayo 6,2003. Un proceso de fermentación APF para obtener una toxina clostridial, tiene la ventaja potencial de reducir la posibilidad de contaminación (que ya es muy baja) de la toxina global con virus, priones y otros elementos no deseables que pudieran acompañar entonces al ingrediente farmacéutico activo toxina clostridial cuando es mezclado en una composición farmacéutica para su administración a humanos . Se conoce usar cromatografía para purificar una toxina clostridial. Así: 1. -Ozutsumi K., et al., Rapid, simplified meted for production and purif ication of ~ tetanus toxin, App & Environ Micro, Apr. 1985, págs. 939-943, vol. 49, No. 4 (1985) describen el uso de filtración en gel por cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC) para purificar toxina del tétanos. 2. Schmidt J.J. , et al., Purif ication of type E Botulinum neurotoxin by high-performance ion exchange chromatography, Anal Biochem 1986 Jul; 156 (1) : 213-219 describe el uso de cromatografía de exclusión de tamaño o cromatografía de intercambio iónico para purificar toxina botulínica tipo E. También se describe el uso de sulfato de protamina en lugar de ribonucleasa (RNasa) . 3. Simpson L.L., et al., Isolation and characterization of the botulinum neurotoxins Simpson LL; Schmidt JJ; Middlebrook JL, En: Harsman S, Ed. Methods in Enzymology. Vol. 165, Microbial Toxins : Tools in Enzymology San Diego, CA: Academic Press; vol. 165: páginas 76-85 (1988) describe la purificación de neurotoxinas botulínicas usando cromatografía por flujo de gravedad, HPLC, etapas de captura usando una resina de afinidad, cromatografía de exclusión de tamaño y cromatografía de intercambio iónico (aniones y cationes) , incluyendo el uso de dos columnas de intercambio iónico diferentes. Se describen varias columnas Sephadex, Sephacel, Trisacryl, S y Q. 4. Zhou L. , et al . , Expression and purif ication of the light chain of botulinum neurotoxin A: A single mutation abolishes i ts cleavage of SNAP-25 and neurotoxici ty after reconsti tution wi th the heavy chain, Biochemistry 1995;34(46) :15175-81 (1995) describe el uso de una columna de afinidad de amilosa para purificar proteínas de fusión de cadena ligera de neurotoxina botulínica. 5. annan K. , et al., Methods development for the biochemical assessment of Neurobloc (botulinum toxin type B) , Mov Disord 2000; 15 (Suppl 2):20 (2000) describe el uso de cromatografía de exclusión de tamaño para ensayar una toxina botulínica tipo B. 6. Wang Y-c, The preparation and quali ty of botulinum toxin type A for injection (BTXA) and i ts clinical use, Dermatol Las Faci Cosm Surg 2002; 58 (2002) describe cromatografía de intercambio iónico para purificar una toxina botulínica tipo A. Esta referencia describe una combinación de. técnicas de precipitación y cromatografía. 7. Jonson S.K., et al., Scale-up of the fermentation and purif ication of the recombination heavy Caín fragment C of botulinum neurotoxin serotype F, expressed in Pichia pastoris, Protein Expr and Purif 2003;32:1-9 (2003) describe el uso de columnas de intercambio iónico y de interacción hidrofóbica para purificar un fragmento de cadena pesada recombinante de una toxina botulínica tipo F. 8. . La solicitud de patente de E.U.A. publicada 2003 0008367 Al (Ogu a) describe el uso de columnas de intercambio iónico y lactosa para purificar una toxina botulínica. Los métodos de purificación resumidos arriba se refieren generalmente a la investigación o a métodos a escala de laboratorio los cuales no son escalables en procesos industriales o comerciales. Se conoce bien que las técnicas de cromatografía tales como, por ejemplo, filtración en gel y cromatografía de flujo por gravedad no son aplicables para usarse como procesos de fabricación de cGMP a gran escala y que puedan validarse. Como alternativa o además, el método de purificación resumido arriba se refiere a la purificación a pequeña escala de la toxina pura (és decir, la molécula neurotóxica de aproximadamente 150 kDa) , un componente específico del neurotóxico, a diferencia del complejo de toxina botulínica de 900 kDa completo. Como se conoce también muy bien, obtener un complejo de toxina botulínica purificado y biológicamente activo es considerablemente más complejo y difícil que purificar sólo un componente del complejo. Esto se debe, por ejemplo, a una molécula de tamaño más grande, fragilidad, naturaleza lábil y a conformaciones secundarias, terciarias y cuaternarias particulares y conformaciones complejas requeridas para obtener un complejo de toxina botulínica biológicamente activo y estable. Más aún, los procesos existentes, incluyendo procesos a escala comercial, para obtener una toxina botulínica adecuada para mezclarse en una composición farmacéutica de toxina botulínica incluyen típicamente una serie de etapas de precipitación para separar el complejo de toxinas de impurezas que acompañen a la toxina botulínica del proceso de fermentación. Notablemente, las técnicas de precipitación se usan ampliamente en la industria biofarmacéutica para la purificación de una toxina botulínica. Por ejemplo, fraccionado con alcohol frío (método de Crohn) o la precipitación se usan para remover proteínas del plasma. Desafortunadamente, las técnicas de precipitación para purificar una toxina botulínica tienen las desventajas de una baja resolución, baja productividad, dificultad para operar, dificultad para controlar y/o y validar, dificultad para escalar hacia arriba o escalar hacia abajo . Lo que se requiere por lo tanto es un proceso APF para purificar un medio de fermentación de toxina clostridial para obtener así una toxina clostridial global sin hacer uso de • productos derivados de animales en el proceso de purificación.

Breve descripción de la invención La presente invención proporciona varios sistemas APF cromatográficos y procesos para purificar una toxina clostridial. Los sistemas y procesos de la presente invención son escalables y cumplen con cGMP. La toxina clostridial es de preferencia una toxina botulínica, y muy preferiblemente un complejo de toxina botulínica tipo A de 900 kDa. La presente invención puede usarse como un proceso de purificación APF comercial y de escala industrial, para purificar la toxina clostridial (tal como toxina botulínica) obtenida a partir de una fermentación APF separada (es decir, usando soya en lugar de caseína en el medio dé fermentación) de una bacteria clostridial. La presente invención permite por lo tanto el reemplazo de la purificación no APF (es decir, uso de DNasa y RNasa) , el cual se lleva típicamente a cabo después de una fermentación no APF, para purificar la toxina botulínica. La presente invención también puede tener utilidad subsecuente a una fermentación de Schantz de una bacteria clostridial, para, reemplazar el proceso de purificación de Schantz (no APF) , con el proceso de purificación de toxina APF descrito en la presente. No se prefiere practicar la presente invención después de un proceso de fermentación no APF, a diferencia de practicar la presente invención después de un proceso de fermentación APF, toda vez que la presente invención ha sido optimizada para usarse después de un proceso de fermentación APF. Así, los procesos dentro del alcance de la presente invención se usan de preferencia en conjunto con (subsecuente a) una fermentación APF para de esta manera reducir más, y en ciertas modalidades eliminar, el uso de productos derivados de animales de las etapas requeridas para obtener una toxina clostridial global . Claramente la práctica de la presente invención subsecuente a un proceso de fermentación APF permite que se lleve a cabo una metodología APF esencialmente completamente (fermentación y purificación) . Una modalidad de la presente invención proporciona un sistema y proceso para obtener alto rendimiento de toxina clostridial biológicamente activa y de alta purificación. La presente invención logra esto a través del uso de un sistema y proceso cromatográfico libre o sustancialmente libre de productos animales para purificar un cultivo . clarificado obtenido a partir del proceso de fermentación de una bacteria de Clostridium, tal como una bacteria de Clostridium botulinum.

Definiciones Según se usa en la presente, las palabras o términos descritos abajo tienen las siguientes definiciones. "Aproximadamente" _ significa que el artículo, parámetro o término calificado así abarca una gama de más o menos diez por ciento arriba y abajo del valor del artículo, parámetro o término indicado . "Administración" o "administrar" significa la etapa de dar (es decir administrar) una composición farmacéutica a un sujeto. Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente son "administradas localmente" mediante por ejemplo rutas de administración intramuscular (i.m.), intradérmica, administración subcutánea, administración tecal, intracraneal. Administración intraperitoneal (i.p.), tópica (transdérmica) e implantación (es decir, de un dispositivo de lenta liberación tal como un implante polimérico o bomba miniosmótica) . "Libre de productos animales" o "sustancialmente libre de productos animales" abarca, respectivamente, "libre de proteínas animales" o "sustancialmente libre de proteínas animales" y significa la ausencia o ausencia sustancial de productos o compuestos derivados de sangre, acumulados en sangre y otros derivados de animales. "Animal" significa un mamífero (tal como un humano) , ave, reptil, pez, insecto, araña, u otra especie animal. "Animal" excluye microorganismos, tales como bacterias. Así, un medio o proceso libre de productos animales o un medio o proceso sustancialmente libre de productos animales dentro . del alcance de la presente invención puede incluir una toxina botulínica o una bacteria de Clostridial botulinum. Por ejemplo, un proceso libre de productos animales o un proceso sustancialmente libre de productos animales significa un proceso que está ya sea sustancialmente o esencialmente libre o completamente libre de proteínas derivadas de animales, tales como inmunoglobulinas, digestor de carne, subproductos cárnicos y productos o digestores lácteos o de leche. De esta manera, un ejemplo de un proceso libre de productos animales es un proceso (tal como un proceso de fermentación bacteriana o cultivo bacteriano) que excluye productos cárnicos y lácteos o subproductos cárnicos o lácteos . "Toxina botulínica" significa una neurotoxina producida por Clostridium botulinum, así como toxinas botulínicas modificadas, recombinantes, híbridas y quiméricas . Una toxina botulínica recombinante puede tener la cadena ligera y/o la cadena pesada de la misma hecha recombinantemente por medio de una especie no clostridial. "Toxina botulínica", según se usa en la presente, abarca los serotipos de toxina botulínica A, B, C, D, E, F y G. "Toxina botulínica", según se usa en la presente, abarca también tanto un complejo de toxina botulínica (es decir, los complejos de 300, 600 y 900 kDa) así como toxina botulínica pura (es decir, la molécula neurotóxica de aproximadamente 150 kDa) , todas las cuales son útiles en la práctica de la presente invención. "Toxina bótulínica purificada" significa una toxina botulínica pura o un ' complejo de toxinas botulínicas que es aislado, o sustancialmente aislado, de otras proteínas e impurezas que puedan acompañar a • la toxina botulínica como se obtiene de un proceso de - cultivo o fermentación. Así, una toxina botulínica purificada puede tener al menos 90%, de preferencia más de 95% y muy preferiblemente más de 99% de las proteínas de toxina no botulínica e impurezas removidas . Las citotoxinas botulínicas C2 y C3, que no son neurotoxinas, se excluyen del alcance de la presente invención. "Neurotoxina clostridial" significa una neurotoxina producida a partir de, o nativa de, una bacteria clostridial, tal como Clostridium botulinum, Clostridium butyricum o Clostridium beratti , así como una neurotoxina clostridial hecha recombinantemente por medio de una especie no clostridial.

"Completamente libre" (es decir, "que consiste en") significa que dentro de la escala de detección del instrumento o proceso que se esté usando, no puede detectarse la sustancia o su presencia no puede confirmarse. "Esencialmente libre" (o "que consiste esencialmente en") significa que sólo cantidades residuales de la sustancia pueden detectarse. "Toxina botulínica modificada" significa una toxina botulínica que ha tenido al menos uno de sus aminoácidos suprimidos, modificados o reemplazados, en comparación con una toxina botulínica nativa. Además, la toxina botulínica modificada puede ser una neurotoxina producida recombinantemente, o un derivado o fragmento de una neurotoxina hecha recombinantemente. Una toxina botulínica modificada conserva al menos una actividad biológica de la toxina botulínica nativa, tal como la capacidad de unirse a un receptor de toxina botulínica, o la capacidad de inhibir la liberación de neurotransmisores de una neurona. Un ejemplo de una toxina botulínica modificada es una toxina botulínica que tiene una cadena ligera de un serotipo de toxina botulínica (tal como serotipo A) , y una cadena pesada de un serotipo de toxina botulínica diferente (tal como serotipo B) . Otro ejemplo de una toxina botulínica modificada es una toxina botulínica acoplada a un neurotransmisor, tal como sustancia P.

"Paciente" significa un sujeto humano o no humano que recibe cuidado médico o veterinario. En consecuencia, como se describe en la presente, las composiciones pueden usarse para tratar cualquier animal, tal como mamíferos. "Composición farmacéutica" significa una formulación en la cual un ingrediente activo puede ser una toxina botulínica. La palabra "formulación" significa que hay por lo menos un ingrediente adicional (tal como una albúmina y/o cloruro de sodio) en la composición farmacéutica aparte de un ingrediente activo de neurotoxina. Una composición farmacéutica es por lo tanto una formulación que es adecuada para la administración de diagnóstico, terapéutica o cosmética (es ' decir, mediante inyección intramuscular o subcutánea o mediante la inserción de un depósito o implante) a un sujeto, tal como un paciente humano. La composición farmacéutica puede estar: en una condición liofilizada o secada al vacío; una solución formada después de la reconstitución de la composición farmacéutica liofilizada o secada al vacío con solución salina o agua, o como una solución que no requiera constitución. El ingrediente activo puede ser uno de los serotipos de toxina botulínica A, B, Ci, D, E, F o G o una toxina botulínica, todos los cuales pueden hacerse nativamente por bacterias clostridiales. Como se indicó, una composición farmacéutica puede ser líquida o sólida, por ejemplo secada al vacío. Los ingredientes constituyentes de una composición farmacéutica pueden incluirse en una sola composición (es decir todos los ingredientes .constituyentes, excepto por cualquier fluido de constitución requerido, están presentes en el momento de la mezcla inicial de la composición farmacéutica) o como un sistema de dos componentes, por ejemplo una composición secada al vacío reconstituida con un diluyente tal como solución salina diluyente que contenga un diluyente no presente en la mezcla inicial de la composición farmacéutica. Un sistema de dos componentes proporciona el beneficio de permitir la incorporación de ingredientes que no son suficientemente compatibles para su almacenamiento en mostrador a largo plazo con el primer componente del sistema de dos componentes. Por ejemplo, el vehículo o diluyente de reconstitución puede incluir un conservador que proporcione suficiente protección contra el crecimiento microbiano para el periodo de uso, por ejemplo una semana de almacenamiento refrigerado, pero no está presente durante el periodo de almacenamiento en congelador de dos años, tiempo durante el cual pudiera degradar la toxina. Otros ingredientes, los cuales podrían no ser compatibles con una toxina clostridial u otros agentes durante largos periodos de tiempo, pueden incorporarse de esta manera; es decir, añadirse en un segundo vehículo (es decir, tener- fluido de reconstitución) en el momento de uso aproximado. Los métodos para formular una composición farmacéutica con ingrediente activo de toxina botulínica se describen en la publicación de patente de E.U.A. 2003 0118598 Al. "Sustancialmente libre" significa que está presente a un nivel de menos de uno por ciento en peso de la composición farmacéutica. "Formulación terapéutica" significa una formulación que puede usarse para tratar y de esta manera aliviar un trastorno o una enfermedad, tal como un trastorno o una enfermedad caracterizada por hiperactividad (es decir, espasticidad) de un músculo periférico. Se usan en la presente las siguientes abreviaturas: Cultivo 3:1:1 un cultivo de toxina botulínica/medio de fermentación que contiene 3% de HySoy, 1% de HyYeast, y 1% de glucosa. HySoy (Quest producto No. 5X59022) es una fuente de péptidos hecha mediante hidrólisis enzimática de soya. HyYeast (HyYest, producto Quest No. 5Z10102 o 5Z10313 es un extracto de levadura de repostería. Cultivo 5:1:1 un cultivo de toxina botulínica/medio de fermentación que contiene 5% de HySoy, 1% de HyYeast y 1% de glucosa. API ingrediente farmacéutico activo APF libre de productos animales BCA ácido bicinchonínico CV volumen de la columna DF diafiltración ELISA ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. "He" en "Hc-ELISA" significa una cadena pesada de toxina botulínica MLD50 la cantidad de una toxina botulínica que es una dosis letal para 50% de ratones Swiss-Weber de 8-23 gramos inyectados intraperitonealmente SDS-PAGE electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida SEC-HPLC cromatografía de líquidos de alto rendimiento de exclusión de tamaño UF ultrafiltración UV ultravioleta La presente invención incluye un proceso para purificar una toxina de Clostridium. El proceso puede tener las cuatro etapas de obtener una muestra de un cultivo de fermentación de toxina botulínica; poner en contacto una primera resina de columna de cromatografía con la muestra de cultivo para permitir así la captura de una toxina botulínica por la primera columna; eluir la toxina botulínica de la primera columna y cargar una segunda resina de columna de cromatografía en columna con el eluyente proveniente de la primera columna de cromatografía, obteniendo de esta manera una toxina botulínica purificada. Por "cultivo de fermentación de toxina botulínica" se intenta decir un medio de fermentación en el cual una bacteria de Clostridium botulinum ha sido fermentada de tal forma que la bacteria libere toxina botulínica en el medio. La muestra de un cultivo de fermentación de toxina botulínica (medio) es de preferencia una muestra de un cultivo clarificado del medio de fermentación. La primera columna de cromatografía y la segunda columna de cromatografía pueden ser columnas diferentes, y las dos columnas diferentes pueden actuar para purificar una toxina botulínica a través de diferentes mecanismos de purificación. Por ejemplo, la primera columna de cromatografía puede ser una columna de interacción hidrofóbica y la segunda columna de cromatografía puede ser una columna de intercambio iónico. Un proceso para purificar una toxina de Clostridium dentro del alcance de la presente invención también puede tener la etapa después de la etapa de contacto y antes de la etapa de elución, de lavar las impurezas de laprimera columna. Además, un proceso para purificar una toxina de Clostridium dentro del alcance de la presente invención también puede tener la etapa después de la etapa de carga, de lavar las impurezas de lasegunda columna. Más aún, un proceso para purificar una toxina de Clostridium dentro del alcance de la presente invención puede tener también, después de la etapa de lavar impurezas de lasegunda columna, la etapa de eluir la toxina botulínica de la segunda columna. De preferencia, un proceso para purificar una toxina de Clostridium dentro del alcance de la presente invención es un proceso APF, muy preferiblemente es un proceso sustancialmente libre de proteínas animales ("APF") y más preferiblemente es un proceso esencialmente APF para purificar una toxina clostridial, tal como un complejo de toxina botulínica. El cultivo "de fermentación de toxina botulínica usado en un proceso para purificar una toxina de Clostridium dentro del alcance de la presente invención resulta preferiblemente de un proceso APF, muy preferiblemente resulta de un proceso sustancialmente APF y más preferiblemente resulta de un proceso esencialmente APF. De manera significativa, un proceso para purificar una toxina de Clostridium dentro del alcance de la presente invención puede proporcionar un rendimiento de complejo de toxina botulínica purificado mayor que aproximadamente 50 mg por lote para cada 10 litros del cultivo de fermentación de toxina botulínica. Un complejo de toxina botulínica purificado obtenido mediante la práctica de un proceso para purificar una toxina de Clostridium dentro del alcance de la presente invención puede tener las siguientes características: una apariencia como una suspensión blanca a blanquecina; una concentración de 2.0-3.6 mg de complejo de toxina botulínica por ml de eluyente; la relación de absorbancia a 260 nm a absorbancia a 278 nm (A260/A278) es menor que o igual a 0.6; una potencia específica en unidad/mg MLD50 de entre 2.4 x 107 a 5.9 x 107 unidades MLD50 por mg de la toxina botulínica purificada; una identidad inmunológica para el complejo de neurotoxina botulínica tipo A; una característica de SDS-PAGE que. se conforme al parámetro; una característica de SEC-HPLC de un complejo de toxina de 900 kDa de > 95% del pico total y el proceso usado para obtener -este complejo de toxina botulínica purificado es robusto, escalable, validable y/o cumple con cGMP. Un proceso APF para purificar un complejo de toxina botulínica dentro del alcance de la presente invención puede tener las etapas de: (a) obtener una muestra de un cultivo de fermentación de toxina botulínica, en donde el cultivo de fermentación de toxina botulínica resulte de un proceso sustancialmente APF; (b) poner en contacto una resina de columna de cromatografía de interacción hidrofóbica con la muestra de cultivo para permitir así la captura de una toxina botulínica por la primera columna; (c) lavar las impurezas de la columna de cromatografía de interacción hidrofóbica; (d) eluir la toxina botulínica de la columna de interacción hidrofóbica (la etapa de elución puede ser seguida por la etapa de diluir el eluyente de la columna de cromatografía de interacción hidrofóbica para una cromatografía de intercambio iónico subsecuente) ; (e) cargar una resina de columna de cromatografía en columna de intercambio iónico con el eluyente (tal como el eluyente diluido de la columna de cromatografía de interacción hidrofóbica) de la columna de cromatografía de interacción hidrofóbica; (f) lavar" las impurezas de la columna de cromatografía de intercambio iónico, y (g) eluir la toxina botulínica de la columna de cambio de iones, obteniendo de esta manera una toxina botulinica purificada a través de un proceso para purificar una toxina botulínica que es un proceso de purificación sustancialmente APF. El proceso APF descrito en el párrafo anterior puede comprender además, después de la etapa de obtener una muestra de un cultivo de fermentación de toxina botulínica y antes de la etapa de poner en contacto una resina de columna de cromatografía de interacción hidrofóbica con la muestra de cultivo, la etapa adicional de acondicionar el cultivo clarificado para cromatografía de interacción hidrofóbica. Además, el proceso APF descrito en el párrafo anterior puede comprender además, después de la etapa de eluir la toxina botulínica de la columna de interacción hidrofóbica y antes de la etapa de cargar una resina para columna de cromatografía de columna de intercambio iónico con el eluyente de la columna de cromatografía de interacción hidrofóbica, la etapa de acondicionar el eluyente a partir de la columna de interacción hidrofóbica para la cromatografía de intercambio iónico . En una modalidad detallada de un proceso APF para purificar una toxina botulínica, el proceso puede comprender las etapas de: (a) obtener una muestra de un cultivo de fermentación de toxina botulínica, en donde el cultivo de fermentación de toxina botulínica sea el resultado de un proceso sustancialmente APF; (b) acondicionar el cultivo clarificado para cromatografía de interacción hidrofóbica; (c) poner en contacto una resina para columna de cromatografía de interacción hidrofóbica con la muestra de cultivo para permitir así la captura de una toxina botulínica por la primera columna; (d) lavar las impurezas de la columna de cromatografía de interacción hidrofóbica; ' (e) eluir la toxina botulínica de la columna de interacción hidrofóbica; (f) acondicionar el eluyente proveniente de .la columna de interacción hidrofóbica para la cromatografía de intercambio iónico; (g) cargar una resina para columna de cromatografía en columna de intercambio iónico con el eluyente acondicionado proveniente de la columna de cromatografía de interacción hidrofóbica; (h) lavar las impurezas de la cromatografía de columna de intercambio iónico; y (i) eluir la toxina botulínica de la columna de intercambio iónico, obteniendo de esta manera una columna de toxina botulínica purificada a través de un proceso para purificar una toxina botulínica que es un proceso de purificación sustancialmente APF. También dentro del alcance de la presente invención está un sistema para purificar una toxina de Clostridium, tal como un complejo de toxina botulínica tipo A. Este sistema puede comprender: una primera resina de columna de cromatografía para capturar una toxina» botulínica proveniente de un cultivo de fermentación; un regulador de pH de elución para eluir la toxina botulínica de la primera columna; una segunda resina de columna de cromatografía en columna para capturar una toxina botulínica de un eluyente proveniente de la primera columna de cromatografía y un segundo regulador de pH de elución para eluir la toxina botulínica de la segunda columna de cromatografía .

Breve descripción de las figuras Los aspectos de la invención se' explican o se ilustran por las siguientes figuras. La figura 1 titulada Fuente de N (es decir HySoy plus YE) % vs Potencia y pH* es una gráfica que muestra la actividad- de toxina botulínica como se determina: (1) sobre la dosis 50 por ciento letal para ratones del eje Y del lado izquierdo (MLD 50) (barras azules) y (2) actividad SNAP del eje Y 25 del lado izquierdo (barras rojas) , de varios medios APF en los tiempos de fermentación transcurridos mostrados en la parte superior de las barras, para el pH del medio APF como el que se muestra en el eje Y del lado derecho el pH, para medios APF con la cantidad % en peso de concentrado de soya hidrolízado y concentrado de extracto de levadura como se muestra por el eje X. Todos los medios de la figura 1 también contenían 1% en peso de glucosa. La figura 2 es una gráfica de flujo de resumen que compara n proceso no APF para obtener una toxina botulínica (la mitad superior de la figura 1) con un proceso APF, dentro del alcance de la presente invención, para obtener una toxina botulínica (la mitad inferior de la figura 2) , a través de las etapas de creación, cultivo y fermentación de bancos de células . La figura 2 omite las etapas de cosecha y purificación. La figura 3 es un cromatógrafo obtenido de una cromatografía de interacción hidrofóbica de un cultivo clarificado APF (un cultivo 3.1.1) en una columna Butyl Sepharose Fast Flow. El eje X en la figura 2 representa el volumen en ml de líquido (efluente) que ha pasado a través de la columna. El eje Y representa la absorbancia a 280 nm en mAU. La figura 4 es un cromatógrafo obtenido de cromatografía de intercambio iónico del eluyente de la columna butilo de la figura 2 en una columna de alto rendimiento de SP Sepharose. Los ejes en la figura 3 son los mismos que los de la figura 2. La figura 5A es una imagen de la SDS-PAGE reducida de varias fracciones obtenidas a partir de la operación de la columna de butilo de la figura 2. El lado izquierdo de la figura 4A está marcado verticalmente con pesos moleculares cada vez más bajos en miles de daltons (kDa) . Los números 1 a 8 a lo largo del límite inferior de la figura 4A representan las líneas en las cuales fueron cargadas las fracciones . La figura 5B es una imagen de la SDS-PAGE reducida de varias fracciones obtenidas de la operación en la columna SP de la figura 3. Los lados izquierdo e inferior de la figura 4B están marcados como están en la figura 4A.

La figura 6 es una imagen de la SDS-PAGE reducida de varias tracciones obtenidas en etapas post-columna (véase figura 6) , en particular fracciones provenientes de la etapa UF/DF, la etapa de filtración estéril y de la etapa de precipitación con sulfato de amonio. Los lados izquierdo e inferior de la figura 5 están marcados como están en la figura 4A. La figura 7 es una gráfica de flujo de un proceso de purificación de toxina botulínica cromatográfico APF dentro del alcance de la presente invención. La figura 8 es una gráfica que compara el defecto de una concentración de proteína de soya en una producción de complejo de toxina botulínica tipo A en un proceso de fermentación APF, en donde el medio de fermentación contenía 1% en peso de glucosa y 1% en peso de un extracto de levadura. En la figura 3 el eje X representa la concentración de por ciento en peso en el medio de fermentación de una proteína de soya hidrolizada (HySoy) particular, el eje Y del lado izquierdo representa la potencia del complejo de toxina botulínica purificado final y el eje Y del lado derecho representa el porcentaje de lisis celular completado, como se determina por la ecuación: Lisiscelular(%) = 0?>m 0D™??>»' 100 OD, 600max en donde OD 6oo max corresponde a la densidad óptica medida a 600 nm en el momento de crecimiento máximo, y ODßoo puntofinai es en el momento de la cosecha de la fermentación.

Descripción detallada de la invención La presente invención se basa en el descubrimiento de que una toxina clostridial puede purificarse mediante el uso de un sistema y proceso libres de productos animales (APF) . La presente invención abarca un sistema y proceso libre de productos animales para purificar una neurotoxina de Clostridium botulinum. La neurotoxina de Clostridium botulinum puede ser una toxina botulínica tipo A, tal como un complejo de. 300 kD, 500 kD o 900 kD (pesos moleculares aproximados) o mezclas .de los mismos. La neurotoxina de Clostridium botulinum puede ser cualquiera de los serotipos A, B, C, D, E, F o G o mezclas de los mismos. Además, el sistema y proceso pueden llevarse a la práctica en conjunto con una toxina botulínica recombinante, híbrida, quimérica o modificada (cadena ligera, cadena pesada o ambas cadenas juntas) . En forma significativa, el sistema y proceso descritos en la presente son escalables, significando que pueden usarse para purificar las cantidades de toxina botulínica obtenida de un proceso industrial o comercial, como uso para producción farmacéutica. Además, el sistema y proceso también cumple con las CGMP (prácticas de fabricación adecuadas y certificadas), como se requiere por el U.S. CFR (código de regulaciones federales de los Estados Unidos) , significando que puede cumplir con requerimientos regulatorios . A través de experimentación se ' desarrollaron sistemas y procesos APF para purificar una toxina clostridial, tal como un complejo de neurotoxina de Clostridium botulinum tipo A (cepa Hall) . La toxina clostridial se purifica del medio de fermentación resultando ya sea de un proceso de fermentación de Schantz (no APF) o de un proceso de fermentación APF. Los procesos de Schantz usan productos derivados de animales. En forma significativa, aunque un proceso de fermentación APF puede reducir o eliminar productos derivados de animales (tales como caseína y caldo de carne) como nutrientes de los medios usados para cultivar y fermentar bacterias clostridiales, los procesos de fermentación APF son típicamente seguidos por una o más etapas de purificación que hacen uso de productos derivados animales, tales como las enzimas DNasa y RNasa. La purificación del medio de fermentación se requiere para obtener toxina clostridial global . La toxina clostridial global (toxina pura o complejo de toxinas) se puede usar para mezclar una composición farmacéutica de toxina clostridial. De preferencia, la presente invención se lleva a la práctica en conjunto con un proceso de fermentación APF. El llevar a la práctica la presente invención en conjunto con un proceso de fermentación APF proporciona un proceso de fermentación APF y un proceso de purificación APF combinados . Además, los sistemas y métodos de la presente invención se optimizan para su operación después de un medio de fermentación APF, a diferencia de un medio de fermentación a base de caseína o de otra proteína animal. El llevar a la práctica la presente invención después de una fermentación no APF puede dar como resultado un rendimiento más bajo y/o una potencia más baja de la toxina botulínica purificada obtenida . Así, aunque ambos procesos de purificación de toxina botulínica de Schantz y APF usan productos derivados de animales tales como benzamidina para estabilizar la toxina botulínica y DNasa y RNasa para remover los ácidos nucleicos presentes con la toxina botulínica en el medio de fermentación (véanse, por ejemplo, . ejemplos 6 a 7) , la presente invención permite una toxina botulínica que puede ser purificada sin el uso de estos productos derivados de animales . La presente invención abarca sistemas y procesos para purificar una toxina clostridial, tal como un complejo de toxina botulínica. Típicamente un sistema particular dentro del alcance de la presente invención es operado en conjunto con un proceso particular dentro del alcance de la presente invención. Un sistema dentro del alcance de la presente invención puede comprender una pluralidad (de preferencia como una serie consecutiva) de etapas ' de cromatografía. Un proceso dentro del alcance de la presente invención puede comprender pasar un medio de fermentación de toxina clostridial a través de la pluralidad de columnas de cromatografía para obtener así una toxina clostridial altamente purificada y altamente potente. Esta toxina clostridial purificada es adecuada para la mezcla de una composición farmacéutica de toxina clostridial. Los parámetros importantes de los sistemas y procesos dentro del alcance de la presente invención incluyen las columnas, reguladores de pH y condiciones operativas particulares usadas (de columna) . Una primera etapa amplia de una modalidad particular de la invención puede ser cargar un cultivo clarificado con medio de fermentación sobre una columna de interacción hidrofóbica (tal como una columna Butyl Sepharose Fast Flow ["FF"]). Esta primera columna captura la toxina clostridial (tal como un complejo de toxina botulínica) y permite que las impurezas fluyan a través de la columna. Se encontró que una columna de interacción hidrofóbica proporcionaba una captura eficiente de un complejo-- de toxina botulínica (una gran proteína con una estructura terciaria y cuaternaria particular) del medio de fermentación con la retención de la actividad biológica del complejo de toxina botulínica, en tanto que también separaba (a través del flujo) muchas impurezas presentes con la toxina botulínica en el medio de fermentación. Se usa un regulador de pH adecuado para eluir la toxina clostridial capturada (unida) de la columna de interacción hidrofóbica. En una segunda etapa amplia de una modalidad particular de la presente invención, el eluyente de la primera columna se carga sobre una segunda columna para purificar más la toxina clostridial. Se encontró que de preferencia, si la segunda columna proporciona un mecanismo de separación diferente de la toxina clostridial de impurezas, entonces una segunda etapa de cromatografía en columna puede proporcionar una etapa de purificación eficiente adicional. De esta manera, de preferencia, la segunda etapa de cromatogrfía implica el uso de una columna diferente, tal como una columna de alto rendimiento SP Sepharose ["HP"] . En las etapas de post-cromatografía (columna) el eluyente proveniente de la segunda columna puede procesarse después más para obtener un complejo de toxina botulínica global altamente purificado. Estas etapas de procesamiento adicionales pueden incluir el intercambio con regulador de pH mediante ultrafiltración y diafiltración, filtración estéril y preparación de una suspensión de sulfato de amonio del complejo de toxina botulínica purificado. La presente invención abarca un sistema y proceso escalable y que cumple con cGMP para purificar una toxina botulínica, el cual puede dar como resultado la obtención de una toxina botulínica global con las características establecidas en la tabla 1.

Tabla 1 Características de la neurotoxina botulínica purificada Una composición farmacéutica que contiene toxina botulínica disponible comercialmente se vende con la marca comercial BOTOX® (disponible de Allergan, Inc., de Irvine, California) . BOTOX® tiene las características descritas arriba en la tabla 1. BOTOX® consiste en un complejo de toxina botulínica purificada tipo A, albúmina de suero humano y cloruro de sodio empacado en forma estéril y secado al vacío. La toxina botulínica tipo A se hace a partir de un cultivo de la cepa Hall~de Clostridium botulinum cultivado en un medio que contiene N-Z amina caseína y extracto de levadura (es decir, proceso no APF) . El complejo de toxina botulínica tipo A se purifica de la solución de cultivo mediante una serie de etapas de precipitación (incluyendo precipitación con ácido) hasta un complejo cristalino que consiste en la proteína de toxina de alto peso molecular activa y una proteína de hemaglutinina asociada. El complejo cristalino es redisuelto en una solución que contiene solución salina y albúmina y se filtra estéril (0.2 mieras) antes del secado al vacío. El BOTOX® puede reconstituirse con solución salina estéril no conservada antes de la inyección intramuscular. Cada frasco de BOTOX® contiene alrededor de 100 unidades (U) de complejo de toxina botulínica de Clostridium tipo A, 0.5 miligramos de albúmina de suero humano y 0.9 miligramos de cloruro de sodio en una forma estéril y secada al vacío sin un conservador. Para reconstituir solución salina normal estéril de BOTOX® secada al vacío sin un conservador (0.9% de inyección de cloruro de sodio) se usa mediante la extracción la cantidad adecuada de diluyente en el tamaño de jeringa adecuado. Ya que BOTOX® es desnaturalizado al burbujear o mediante agitación violenta similar, el diluyente se inyecta suavemente en el frasco. Se ha reportado que BOTOX® ha sido administrado treinta o más días después de su reconstitución con poca pérdida de potencia. Durante este periodo de tiempo, el BOTOX® reconstituido se almacena en un refrigerador (2o a 8°C)\ ~ El BOTOX® reconstituido es transparente, incoloro y libre de materia en partículas. El producto secado al vacío se almacena en un congelador a o debajo de -5°C. La presente invención se basa en el descubrimiento de medios y procesos que están libres o sustancialmen e libres de un producto animal o de un subproducto animal, útiles para el cultivo y fermentación de un organismo (tal como una bacteria de Clostridium botulinum) capaz de producir toxina botulínica biológicamente activa. La toxina botulínica obtenida puede usarse para hacer composiciones farmacéuticas con ingrediente activo de toxina botulínica. Así, se describen en la presente medios de crecimiento los cuales tienen niveles sustancialmente reducidos de subproductos cárnicos o lácteos y modalidades de medios preferidas están sustancialmente libres de estos productos animales .

La presente invención abarca el sorprendente descubrimiento de que los productos a base de animales no se requieren en medios para el crecimiento de Clostridium botulinum, y particularmente que los productos a base • de vegetales pueden reemplazar los productos a base de animales empleados típicamente en estos medios para el crecimiento de Clostridium botulinum. Los medios que están en uso actual para el crecimiento y fermentación de bacterias comprenden normalmente uno o más ingredientes derivados de animales, tales como carne cocida. De acuerdo con la presente invención, los medios preferidos para el crecimiento de Clostridium botulinum contienen ingredientes derivados de animales que comprenden no más de aproximadamente cinco a alrededor de diez por ciento del peso total de los medios. En forma muy preferible, los medios dentro del alcance de la invención comprenden no más de aproximadamente uno a menos de aproximadamente cinco por ciento del peso total de los medios de productos derivados de animales . De manera muy preferible, todos los medios y cultivos usados para el crecimiento de Clostridium botulinum para la producción de toxina botulínica están completamente libres de productos derivados de animales . Éstos incluyen pero no están limitados a medios para la fermentación a pequeña y gran escala de Clostridium botulinum, medios para el crecimiento de cultivos de Clostridium botulinum usados para inocular el medio de siembra (primero) y los medios de fermentación (segundo) , así como los medios usados para el almacenamiento a largo plazo de cultivos de Clostridium botulinum ' (por ejemplo cultivos globales) . En ciertas modalidades preferidas de la invención, los medios para el crecimiento de Clostridium botulinum y la producción de toxina botulínica pueden comprender productos a base de soya para reemplazar los productos derivados de animales. Como alternativa, en lugar de un producto a base de soya se puede usar una semilla desamargada de Lupinus campestris . Se conoce el contenido proteínico de la semilla de L . campestris que es muy similar al del fri ol de soya. De preferencia, estos medios incluyen frijol de soya o productos derivados de L . campestris que son hidrolizados y que son solubles en. agua. Sin embargo, la soya insoluble o los productos de L . campestris también se pueden usar en la presente invención para reemplazar productos animales. Los productos derivados de animales comunes que pueden ser sustituidos por soya o productos de L . campestris incluyen infusión de corazón de res (BHI) , productos de peptona derivados de animales, tales como Bacto-peptona, caseínas hidrolizadas y subproductos lácteos tales como leche animal. De preferencia, los medios que contienen productos a base de soya o a base de L. campestris pai el crecimiento de Clostridium botulinum son similares a los medios de crecimiento usados comúnmente que contienen productos derivados de animales excepto que sustancialmente todos .los productos derivados de animales son reemplazados con productos derivados de vegetales. Por ejemplo, los medios de fermentación a base de soya pueden comprender un producto a base de soya, una fuente de carbono tal como glucosa, sales tales como NaCl y KCl, ingredientes que contengan fosfato tales como Na2HP0 , KH2P0 , cationes divalentes tales como hierro y magnesio, hierro en polvo, y aminoácidos tales como L-cisteína y L-tirosina. Los medios usados para hacer crecer cultivos de Clostridium botulinum para inoculación (es decir, el medio de siembra o el primer medio) de los medios de fermentación (segundo) contienen de preferencia al menos un producto a base de soya, una fuente de sal tal como NaCl y una fuente de carbono tal como glucosa. La presente invención proporciona un método para el crecimiento de Clostridium botulinum que maximiza la producción de una toxina botulínica usando medios que están sustancialmente libres de productos derivados de animales . El crecimiento de Clostridium botulinum para la producción de toxina botulínica puede tener lugar mediante fermentación en medios que contengan subproductos de soya que reemplacen ingredientes derivados de subproductos animales . El inoculante para el medio de fermentación puede derivarse entre un medio de crecimiento de escala más pequeña (un medio de siembra) . Dependiendo del tamaño y volumen de la etapa de fermentación, el número de crecimientos sucesivos en medios de siembra para incrementar la biomasa del cultivo puede variar. Para crecer una cantidad adecuada de Clostridium botulinum para inocular el medio de fermentación, una etapa o varias etapas que incluyen crecimiento en un medio de siembra puede llevarse a cabo. Para un método de crecer Clostridium botulinum que esté libre de productos derivados de animales, es preferible que el crecimiento de Clostridium botulinum se origine a partir de un cultivo almacenado en un medio no "derivado de animales. El cultivo almacenado, de preferencia liofilizado, se produce mediante el crecimiento en medios que contienen proteínas derivadas de soya y que carecen de subproductos animales. El crecimiento de Clostridium botulinum en un medio de fermentación puede tener lugar mediante inoculación directamente de un cultivo almacenado y liofilizado . En una modalidad preferida de la presente invención, el crecimiento de Clostridium botulinum procede en dos fases: crecimiento de siembra y fermentación. Ambas de estas fases se llevan a cabo en ambientes anaeróbicos. La fase de crecimiento de semilla se usa generalmente para "escalar hacia arriba" la cantidad del microorganismo a partir de un cultivo almacenado. El propósito de la fase de crecimiento de siembra es el de incrementar la cantidad del microorganismo disponible para fermentación. Además, la fase de crecimiento de siembra permite que microbios relativamente latentes en cultivos almacenados se rejuvenezcan y crezcan para crear cultivos de crecimiento activo. Más aún, el volumen y cantidad de microorganismos viables usado para inocular el cultivo de fermentación se puede controlar en forma más precisa a partir - de un cultivo de crecimiento activo que de un cultivo almacenado. Así, se prefiere" el crecimiento de un cultivo de siembra para la inoculación del medio de fermentación. Además, cualquier número de etapas consecutivas que incluyen el crecimiento en medios de siembra para escalar hacia arriba la cantidad de Clostridium botulinum para la inoculación del medio de fermentación puede ser usado. Se hace notar que el crecimiento de Clostridium botulinum en la fase de fermentación puede proceder directamente del cultivo almacenado mediante inoculación directa. En la fase de fermentación, una porción de un medio de siembra o todo un medio de siembra que contiene Clostridium botulinum del crecimiento de siembra se usa para inocular un medio de fermentación. De preferencia, alrededor de 2-4% de un medio de siembra que tiene Clostridium botulinum proveniente de la fase de crecimiento de siembra se usa para inocular el medio de fermentación. La fermentación se usa para producir la cantidad máxima de microbios en un ambiente anaeróbico a una gran escala (Ljungdahl et al., Manual of industrial microbiology and biotechnology (1986) , editado por Demain et al . , American Society for Microbiology, Washington, D.C. página 84) . Una toxina botulínica puede aislarse y purificarse usando métodos de purificación de proteínas bien conocidos por los expertos de capacidad ordinaria en la técnica de purificación de proteínas. Véase, por ejemplo, Coligan et al. Current Protocols in Protein Science, Wiley & Sons; Ozutsumi et al. Appl. Environ. Microbiol. 49;939-943:1985. Para la producción de toxina botulínica, cultivos de Clostridium botulinum pueden hacerse crecer en un medio de siembra para la inoculación del medio de fermentación. El número de etapas sucesivas que incluyen crecimiento en un medio de siembra puede variar dependiendo de la escala de producción de la toxina botulínica en la fase de fermentación. Sin embargo, como se describió anteriormente, el crecimiento en la fase de fermentación puede proceder directamente de la inoculación de un cultivo almacenado. Los medios de siembra a base de animales generalmente están comprendidos de BHI, bacto-peptona, NaCl y glucosa para el crecimiento de Clostridium botulinum . Como se describió anteriormente, los medios de siembra alternativos pueden prepararse de acuerdo con la presente invención en los cuales componentes a base de animales sean sustituidos con componentes no a base de animales. Por ejemplo.,, pero sin limitación, los productos a base de soya pueden sustituir BHI y bacto-peptona en el medio de siembra para el crecimiento de Clostridium botulinum y la producción de toxina botulínica: De preferencia, el producto a base de soya es soluble en agua y comprende soya hidrolizada, aunque cultivos de Clostridium botulinum pueden crecer en medios que contengan soya insoluble. Sin embargo, los niveles ' de crecimiento y producción de toxinas subsecuentes son mayores en medios derivados de productos de soya solubles . Cualquier fuente de productos a base de soya puede usarse de acuerdo con la presente invención. De preferencia, la soya es soya hidrolizada y la hidrolización se ha llevado a cabo usando enzimas no animales. Las fuentes de soya hidrolizada están disponibles de una variedad de vendedores comerciales. Éstas incluyen pero no están limitadas a Hy-Soy (Quest International) , peptona de soya (Gibco) Bac-soytone (Difco), AMISOY (Quest), NZ soy (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7, SE50M (DMV International Nutritionals, Fraser, N.Y.) y SE50MK (DMV) . Muy preferiblemente, la fuente de soya hidrolizada es Hy-Soy o SE50MK. Se conocen otras fuentes potenciales de soya hidrolizada. Las concentraciones de Hy-Soy en el medio de siembra de acuerdo con la presente invención varían entre 25- 200 g/L. De preferencia, la concentración de Hy-Soy en el medio de siembra varía entre- 50-150 g/L. En "forma muy preferible, la concentración de Hy-Soy en el medio de siembra es de aproximadamente 100 g/L. Además, la concentración de NaCl varía entre 0.1-2.0 g/L. De preferencia, la concentración de NaCl varía entre 0.2-1.0 g/L. Muy preferiblemente, la concentración de NaCl en el medio de siembra es de alrededor de 0.5 g/L. La concentración de glucosa varía entre 0.1 g/L y 5.0 g/L. De preferencia, la concentración de glucosa varía entre 0.5-2.0 g/L. Muy preferiblemente, la concentración de glucosa en el medio de siembra es de aproximadamente 1.0 g/L. También se prefiere pero no es necesario de la presente invención que la glucosa se esterilice al someterla a autoclave junto con otros componentes del medio de siembra. El nivel de pH del medio de siembra antes del crecimiento puede ser de 7.5-8.5. Por ejemplo, el pH del medio de siembra antes del crecimiento de Clostridium botulinum, puede ser de aproximadamente 8.1 El crecimiento de Clostridium botulinum en el medio de siembra puede proceder en una o más etapas. De preferencia, el crecimiento en el medio de siembra procede en dos etapas. En la etapa uno, un cultivo de Clostridium botulinum se suspende en una cantidad de medio de siembra y se incuba a 3 ±1°C durante 24-48 horas en un ambiente anaeróbico. De preferencia, el crecimiento en la etapa uno procede durante alrededor de 48 horas. En la etapa dos, una porción o todo el medio de la etapa uno que contiene Clostridium botulinum se usa para inocular un medio de siembra de etapa dos para crecimiento adicional. Después de la inoculación, el medio de etapa, dos es incubado a 34±1°C durante alrededor de 1-4 días también en un ambiente anaeróbico. De preferencia, el crecimiento en el medio de siembra de la etapa dos procede durante aproximadamente 3 días. También es preferible que el crecimiento en medios de siembra en cualquier etapa no dé como resultado la lisis de las células antes de la inoculación de los medios de fermentación con el crecimiento final en medio de siembra. Los medios de fermentación estándares que contienen subproductos animales para el crecimiento de Clostridium botulinum pueden ser a base de una receta de Mueller y Miller (MM; J. Bacteriol. 67:271, 1954). Los ingredientes en los medios MM que contienen subproductos animales incluyen BHI y NZ-CaseTT. NZ-CaseTT es una fuente de péptidos y aminoácidos disponible comercialmente que se deriva de la digestión enzimática de caseínas, un grupo de proteínas encontradas en la leche animal. La presente invención demuestra que los productos no a base de animales pueden sustituir BHI y NZ-CaseTT en el medio de fermentación. Por ejemplo pero sin limitación, productos a base de soya pueden reemplazar los componentes a base de animales de medios MM usados para la fermentación de Clostridium botulinum. De preferencia, los productos a base de soya son hidrosolubles y se derivan de soya hidrolizada, aunque como se describió anteriormente, también se pueden usar productos de soya " insolubles para llevar a la práctica la presente invención. Cualquier fuente de productos a base de soya se puede usar de acuerdo con la presente invención. De preferencia, la soya hidrolizada se obtiene de Quest International (Sheffield) con el nombre comercial Hy-Soy o de DMV International Nutritionals (Fraser, N.Y.) con el nombre comercial SE50MK. Los productos de soya solubles también pueden obtenerse a partir de una variedad de fuentes incluyendo pero no limitadas a Soya peptona (Gibco) Bac-soytone (Difco), AMISOY (Quest), NZ soy (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7 y SE50MK (DMV International Nutritionals, Fraser, N.Y. ) . En otra modalidad preferida de la presente invención, el medio usado para la fermentación de Clostridium botulinum está libre de subproductos animales y comprende soya hidrolizada, glucosa, NaCl, Na2HP0 , MgS047H20, KH2P0 , L-cisteína, L-tirosina y hierro en polvo. Como se describió para el medio de siembra, la soya hidrolizada puede reemplazar subproductos animales en el medio de fermentación. Estos subproductos animales incluyen BHI y NZ-Case TT (caseína digerida enzimáticamente) . La concentración de Hy-Soy en el medio de fermentación para la producción de toxina botulínica varía de preferencia entre alrededor de 10-100 g/L. preferiblemente, la concentración de Hy-Soy varía entre aproximadamente 20-60 g/L. De manera muy preferible, la concentración de Hy-Soy en el medio de fermentación es de aproximadamente 35 g/L. Para una producción máxima de toxina botulínica, las concentraciones de componentes en el medio de fermentación que se prefieren particularmente son de alrededor de 7.5 g/L, glucosa; 5.0 g/L de NaCl; 0.5 g/L de Na2HP04; 175 mg/L de KH2P04; 50 mg/L MgS047H20; 125 mg/L de L-cisteína y 125 mg/L de L-tirosina. La cantidad de hierro en polvo usada puede variar de 50 mg/L y 2,000 mg/L. De preferencia, la cantidad de hierro en polvo varía entre alrededor de 100 mg/L y 1,000.

Muy preferiblemente, la cantidad de hierro en polvo usada en medios de fermentación varía entre aproximadamente 200 mg/L y 600 mg/L. Para niveles óptimos de producción de toxinas, el pH inicial (antes de someter a autoclave) de los medios de fermentación a base de soya varía de preferencia entre alrededor de 5.0 a 7.1. Los presentes inventores encontraron que el control del pH mejora la recuperación de toxina botulínica. De preferencia, el pH inicial del medio de fermentación es de aproximadamente 7. Como se explica en el ejemplo 7, los presentes inventores han encontrado que un alto rendimiento de toxina botulínica estable puede obtenerse si el pH es reducido posteriormente hasta y mantenido entre pH 5-5..5. Como se describió para el- medio de siembra, los componentes del medio de fermentación, incluyendo glucosa y hierro, se someten de preferencia a autoclave juntos para su esterilización. De preferencia, una porción del miembro de siembra de la segunda etapa usado para el crecimiento de Clostridium botulinum se usa para inocular el medio de fermentación.' La fermentación ocurre en una cámara anaeróbica aproximadamente a 3 ±1°C durante alrededor de 7 a 9 días. El crecimiento bacteriano puede monitorearse al medir la densidad óptica (O.D.) del medio. La fermentación se detiene de preferencia después de que la lisis de células ha procedido durante al menos 48 horas como se determina por la medición del crecimiento (densidad óptica). Al Usarse las células, la O.D. del medio disminuye. En una modalidad preferida de la presente invención, cultivos de Clostridium botulinum usados para el almacenamiento a largo plazo de Clostridium botulinum y la inoculación del medio de siembra se hacen crecer y se liofilizan en leche de soya antes del almacenamiento a 4°C. Cultivos de Clostridium botulinum en leche animal liofilizada para almacenamiento también se pueden usar para la producción de toxina botulínica. Sin embargo, para mantener medios que estén sustancialmente libres de subproductos animales a lo largo de la producción de toxina botulínica, se prefiere que el cultivo inicial de Clostridium botulinum sea conservado en leche de soya y no leche animal .

Ejemplos Los siguientes ejemplos describen . métodos específicos abarcados por la presente invención y no están destinados a limitar el alcance de la invención. A menos que se explique lo contrario en estos ejemplos "toxina" o "toxina botulínica" significa un complejo de toxina botulínica tipo A con un peso molecular de aproximadamente 900 kDa. La presente invención no está limitada a los sistemas y métodos para purificar un complejo de toxina botulínica tipo A con un peso molecular de aproximadamente 900 kDa, teniendo fácil aplicabilidad para la purificación de 150 kDa, 300 kDa, 500 kDa, así como otras toxinas de peso molecular, complejos y serotipos de toxina botulínica- Ejemplo 1 Preparación de un medio de siembra libre de productos animales para Clostridium botulinum Un medio de siembra de control puede prepararse usando los siguientes ingredientes por cada 1 litro de medio: NaCl (5 g) , Bacto-peptona (10 g) , glucosa (10 g) , BHI (a 1 litro) , pH 8.1 (ajustado con NaOH 5N) . Un medio de siembra de prueba (libre de productos animales) puede prepararse usando los siguientes ingredientes por cada 1 litro de medio: NaCl (5 g) , Soya-peptona (10 g) , glucosa (10 g) , Hy-Soy (35 g/litro, para hacer 1 litro de fluido de medio), pH 8.1 (ajustado con NaOH 5N) .

Ejemplo 2 Cultivo de Clostridium botulinum en un medio de siembra libre de productos animales Un cultivo liofilizado de Clostridium botulinum puede suspenderse en 1 ml de cada uno del medio de siembra de control y prueba del ejemplo 1, dividirse (cada medio de siembra) en dos tubos de los cuales cada uno puede contener 10 ml de los medios de siembra respectivos, y luego incubarse a 34°C durante aproximadamente 24-48 horas. Un ml de cultivo puede usarse entonces para inocular un matraz de cultivo DeLong Bélico de 125 ml que contenga 40 ml de medio de siembra (el respectivo) . El cultivo inoculado puede incubarse a 33°C±1°C durante 24 horas en una cámara anaeróbica Coy (Coy Laboratory Products Inc., Grass Lake, Mich. ) .

Ejemplo 3 Preparación de un medio de fermentación para Clostridium botulinum libre de productos animales Se puede preparar un medio de fermentación basal usando los siguientes ingredientes por cada dos litros de medio: glucosa (15 g) , NaCl (10 g) , NaH2P0 (1 g) , KH2P04 (0.350 g) , MgS047H20 (0.1 g) , cisteína-HC (0.250 g) , tirosina- HC1 (0.250 g) , hierro en polvo (1 g) , ZnCl2 (0.250 g) , y MnCl2 (0.4 g) . Un medio de fermentación de control puede prepararse usando los siguientes ingredientes por cada dos litros de medio preparados: BHI (500 ml; esto corresponde a alrededor de "45.5 gramos de infusión de corazón de res en peso seco) , NZ-CaseTT (30 g) y medio basal (hasta 2 litros) , pH 6.8. El medio de fermentación basal puede prepararse primero y su pH ajustarse a pH 6.8. La infusión de corazón de res (BHI) BHI puede ser después preparada y su pH -ajustarse a .8 con NaOH 5N. La BHI puede ser después añadida al medio basal. Luego se puede preparar la NZ-CaseTT. La NZ-CaseTT se añade después al medio basal al cual se le ha añadido ya la infusión de corazón de res, y se disuelve mediante adición de HCl. El pH se puede ajustar después a 6.8 con NaOH 5N. Este medio puede separarse después en porciones de 8 ml en cada uno de dieciséis tubos de ensayo de 100 mm, después de someterlos a autoclave durante 25 minutos a 120°C. Un medio de fermentación de prueba (libre de productos animales) puede prepararse al sustituir una fuente de nitrógeno de prueba por la BHI presente en el medio de fermentación de control. Las -fuentes de nitrógeno para medio de fermentación de prueba adecuadas incluyen: Hy-Soy (Quest) , AMI-Soy (Quest) , NZ-Soy (Quest) , NZ-Soy BL4 (Quest) , NZ-Soy BL7 (Quest), Sheftone D (Sheffield), SE50M (DMV), SE50~(DMV),' SE%)MK (DMV) , Soy Peptone (Gibco) , Bacto-Soyton . (Difco) , Nutricio 2207 (ADM) ,- Bakes Nutrisoy (ADM) Nutrisoy flour, harina de soya, Bacto-Yeast Extract (Difco) Extracto de Levadura (Gibco)-, Hy-Yest 412 (Quest), Hy-Yest 441 (Quest), Hy-Yest 444 (Quest) , Hy-Yest (455 (Quest) Bacto-Extracto de Malta (Difco) , Corn Steep, y Proflo (Traders) . El medio de fermentación de prueba puede prepararse como se describió arriba para un medio de fermentación de control excepto que se excluye la BHI y la fuente de nitrógeno relevante puede ser primero ajustada a pH 6.8 con HCl 3N o con NaOH 5N. Los medios pueden ser asignados en porciones de 8 ml a dieciséis tubos de ensayo de 100 mm, seguidos por sometimiento a autoclave durante 20-30 minutos a' 120°C.

Ejemplo 4 Crecimiento de Clostridium botulinum en un medio de fermentación libre de productos animales Una porción de 40 µl del cultivo de medio de siembra de prueba (libre de productos animales) se puede usar para inocular cada alícuota de medio de fermentación de control o de prueba de 8 ml en un tubo de ensayo de 16 X 100 mm con capacidad de 8 ml . Los cultivos pueden ser después incubados a 33±1°C durante 24 horas. Los tubos pueden ser después incubados en una cámara anaeróbica para permitir el crecimiento de la bacteria. Cada ensayo de medio puede llevarse a cabo por triplicado (es decir, puede incluir tres inoculaciones independientes del mismo medio) , y también puede incluir un control no inoculado, el cual se puede usar como el blanco para el espectrofotómetro) . El crecimiento (como se determina por la densidad óptica, OD) puede medirse cada 24 horas con un espectrofotómetro Turner (modelo 330) a 660 nm. El cultivo se debe detener después de que la lisis haya, durado alrededor de 48 horas y la producción de toxina botulínica puede medirse entonces. Experimentos adicionales pueden llevarse a cabo con un medio de fermentación Hy-Soy que contenga los siguientes ingredientes por cada 500 ml del medio: Hy-Soy (17.5 g) , glucosa (3.75 g) ; NaCl (2.5 g) ; Na2HP04 (0.25 g) , MgS047H20 (0.025 g) , KH2P04 (0.0875 g) , L-cisteína (0.0625 g) , L- tirosina (0.0625 g) , hierro en polvo (0.25 g) , pH 6.8.

Ejemplo 5 Determinación de la producción de toxina botulínica por Clostridium botulinum cultivada en un medio de fermentación libre de productos animales Las células cultivadas del ejemplo 4 pueden centrifugarse, y el pH del sobrenadante determinarse después.

Los niveles de toxina botulínica en una muestra dada puede medirse al agregar una antitoxina estándar y midiendo el tiempo transcurrido antes de la floculación. Tanto Kf (el tiempo requerido para que ocurra lá floculación, en minutos) como Lf (el límite de floculación; equivalente a 1 unidad internacional de antitoxina estándar, establecido por floculación) pueden determinarse. Después se pueden tomar 4 ml de caldo de fermentación de cada tubo de fermentación para un cultivo dado, y luego pueden combinarse juntos de tal manera que 12 ml totales puedan mezclarse en un tubo centrífugo de 15 ml . Los tubos pueden ser centrifugados a 5,000 rpm (3,400 g) durante 30 minutos a 4°C. Se pueden añadir alícuotas de 1 ml de sobrenadante a los tubos que contienen 0.1-0.6 ml de antisuero de toxina botulínica estándar, y los tubos pueden ser agitados cuidadosamente para mezclar sus contenidos. Los tubos pueden ponerse después en un baño de agua a 45±1°C y el tiempo inicial puede registrarse. Los tubos pueden revisarse frecuentemente, y el tiempo en el cual haya empezado la floculación puede registrarse como Kf . La concentración de toxina en el tubo en el cual la floculación puede iniciarse primero puede designarse LfFF. La concentración de toxina en el tubo en el cual la floculación puede iniciarse segundo puede designarse LfF. Ensayos paralelos de fermentación, crecimiento y producción de toxinas pueden llevarse a cabo tanto para ambos de: (a) el medio de siembra de control (usado para inocular el medio de fermentación de control) y el medio de fermentación de. control, y (2) el medio de siembra de prueba (libre de productos animales) (usado para inocular el medio de fermentación de prueba) y el medio de fermentación de prueba (libre de productos animales) . De manera significativa, se puede determinar que la fermentación de Clostridium botulinum en medios libres de productos animales e inoculados a partir de cultivos también libres de productos animales (con productos a base de soya reemplazando los productos animales) puede dar como resultado una Lft0?ina de alrededor de 50 o más. Como mínimo, la Lftoxina es igual a aproximadamente 10. De preferencia, la Lft0?ina es de al menos 20. Muy preferiblemente la Lft0?xna es de más de 50. Además, se puede determinar que varios productos de soya soporten el crecimiento de Clostridium botulinum en medios de fermentación- que carezcan de BHI . Así, las preparaciones de soya solubles pueden reemplazar BHI para el crecimiento de Clostridium botulinum. La mejor concentración puede ser de 12.5 ó 25 g/L. Hy-Soy (Sheffield) puede dar el crecimiento más alto. Preparaciones de soya insolubles pueden ser menos efectivas . Más aún, pueden obtenerse resultados para demostrar que Quest Hy-Soy, DMV SE50MK y Quest NZ-Soy pueden ser efectivos como productos de soya en términos de su capacidad para reemplazar BHI para el crecimiento de Clostridium botulinum . Los resultados pueden revelar que los productos de soya (tales como Quest Hy-Soy, DMV SE50MK y Quest NZ-Soy) que pueden ser óptimos para el crecimiento también pueden ser efectivos para reemplazar BHI en la producción de toxina. El mejor producto de soya para la producción de toxinas puede ser Quest Hy-Soy a 22.75 g/l. Concentraciones más altas de este producto pueden producir mejor crecimiento pero no mejorar la producción de toxinas. Se propone que resultados similares pueden obtenerse con SE50MK, para el cual una concentración más alta puede generar crecimiento incrementado, pero ningún incremento en la producción de toxinas. NZ-Soy, por otro lado, puede dar crecimiento más alto y -producción de toxinas más alta a su concentración más alta. Finalmente, se puede determinar que los productos de soya pueden reemplazar efectivamente BHI así como la NZ- CaseTT. La remoción de NZ-CaseTT de medios a base de soya puede reducir el crecimiento de aproximadamente 2-4 veces. El mejor producto de soya para el crecimiento tanto en presencia como en ausencia de NZ-CaseTT puede ser SE50MK. HY-Soy puede reemplazar tanto BHI como NZ-CaseTT para la producción de toxinas. Sin embargo, un ciclo de fermentación •más largo de 1 ó 2 días puede ser necesario. Hy-Soy podría reemplazar tanto BHI como NZ-CaseTT en medios para la producción de toxinas. Sin embargo, se puede, determinar qué extractos de levadura pueden ser inhibidores para la producción de toxinas . Puede determinarse que Hy-Soy a 22.75 g/l puede reemplazar completamente tanto BHI como HY-CaseTT en la producción de toxinas. A diferencia del efecto en el crecimiento en donde 56.88 g/l de HY-Soy puede ser lo mejor, 34.13 g/l de HYSoy puede ser lo mejor para la fase de producción' de toxinas. De esta manera, se ha determinado sorprendentemente que Hy-Soy o [Hy-Soy+Hy-Yest] puede reemplazar BHI y Bacto-peptona en medios para crecimiento de cultivo de Clostridium botulinum. Además, se pueden diseñar experimentos para determinar las concentraciones óptimas de componentes en medios de siembra para producir los niveles máximos de producción de toxina botulínica por la Clostridium botulinum.

La producción de toxina por Clostridium botulinum cultivada en medio de siembra y medio de fermentación que está libre de • BHI y NZ-CaseTT puede alcanzar o exceder los niveles logrados en medios que contienen BHI y NZ-CaseTT. Pueden determinarse las concentraciones óptimas de Hy-Soy o [Hy-Soy+Hy-Yest] para el crecimiento en el medio de siembra. Los experimentos pueden confirmar que Hy-Soy puede reemplazar BHI y Bacto-peptona como la fuente de nitrógeno en medio de siembra para el crecimiento de Clostridium botulinum y para la producción de toxina botulínica en la fase de fermentación subsecuente. Asimismo, Hy-Soy como fuente de nitrógeno en el medio de siembra, en comparación con Hy-Soy más Hy-Yest, puede producir niveles más altos de toxina botulínica en la etapa de fermentación subsecuente. Las concentraciones de Hy-Soy en el medio de siembra que producen los mejores niveles de toxina varían de alrededor de 62.5 g/L a 100 g/L. Pueden diseñarse experimentos adicionales para determinar las concentraciones óptimas de Hy-Soy en el medio de siembra para la producción máxima de toxina botulínica por Clostridium botulinum mediante fermentación. Así, 30 g, 50 g, 75 g y 100 g de Hy-Soy en el medio de siembra pueden dar como resultado todos la producción de toxina botulínica por fermentación de Clostridium botulinum y esto es comparable o excede los niveles de la toxina botulínica hecha en medio de siembra que contiene BHI y Bacto-peptona como una fuente de nitrógeno. Se puede encontrar que una concentración de 100 g/L de Hy-Soy en el medio de siembra dé como resultado los niveles más altos de producción de toxina en la etapa de fermentación subsecuente. Además, los datos indican que la etapa de siembra 1 de medio de siembra Hy-Soy produjo mayor crecimiento luego de 48 horas que después de 24 horas.

Ejemplo 6 Proceso no APF para obtener una toxina botulínica Una toxina clostridial se obtuvo mediante la fermentación de una bacteria de Clostridium botulinum. Así, un proceso de Schantz modificado (no APF) se llevó a cabo para obtener toxina de Clostridium botulinum altamente potente y altamente purificada (es decir, toxina general) como sigue. Un proceso de Schantz modificado (no APF) puede proporcionar un alto rendimiento de toxina botulínica. Ambos procesos de Schantz y de Schantz modificado usan caseína en todos los medios de fermentación.

Preparación del cultivo de abastecimiento Varias bacterias clostridiales están disponibles de la Colección Americana de Tipos de Cultivos (ATCC) , Manassas, Virginia. Como alternativa, un frasco de banco de células de Clostridium botulinum puede prepararse al aislar Clostridium botulinum de varias fuentes, incluyendo suelo o mediante muestreo profundo (en lugares anaeróbicos o casi anaeróbicos) de cadáveres de animales en putrefacción. Comúnmente, Clostridium botulinum puede obtenerse a partir de una muestra de un fluido fisiológico (es decir, un hisopo para heridas de un paciente con botulismo de heridas) de un paciente diagnosticado con botulismo. La mitad superior de la figura 2_ resume el proceso no APF usado para la preparación "de un frasco de banco de células, y para el cultivo y fermentación de una toxina botulínica. La Clostridium botulinum obtenida de "una fuente natural o de paciente se cultiva sobre placas de ágar hemático, seguida por la inoculación de colonias de alto crecimiento en un medio para frasco de banco de células. El medio para frasco de banco de células usado para Clostridium botulinum era un medio de carne cocida que contenía carne de res fresca picada. Los cultivos que crecían en forma activa se mezclaron con glicerol para preparar un frasco de banco de células (es decir, un cultivo de abastecimiento) de la bacteria de Clostridium botulinum que se congeló para uso posterior.

Cul tivos El frasco de banco de células de Clostridium botulinum se descongeló a temperatura ambiente, seguido por cuatro etapas de cultivo. (1) Para seleccionar colonias con una morfología adecuada, alícuotas del frasco de banco de células descongelado se cultivaron al rayar la bacteria sobre placas de agar hemático Columbia pre-reducidas e incubando anaeróbicamente durante 30-48 horas a 34°C ± 1°C. (2) Colonias seleccionadas fueron después inoculadas en tubos de ensayo que contenían un medio de crecimiento de caseína durante 6-12 horas a 34°C. Los contenidos del tubo con el crecimiento más rápido y la densidad más alta (etapa de selección de crecimiento) fueron después cultivados más a través de incubaciones anaeróbicas de dos es'caladas : (3) una primera incubación de 12-30 horas a 34°C en una botella de cultivo de siembra de un litro, seguida por (4) un segundo cultivo en un fermentador de siembra de 25 litros que contenía un medio de crecimiento de caseína durante 6-16 horas a 35°C. Estos cultivos de dos escaladas se llevaron a cabo en un medio nutritivo que contenía 2% de hidrolizado de caseína (un digestor de caseína [proteína láctea] ) , 1% de extracto de levadura y 1% de glucosa (dextrosa) en agua a pH 7.3.

Fermentación Los cultivos de escalada fueron seguidos por una incubación adicional durante 60-96 horas a 35°C en un fermentador de escala comercial (es decir, de 115 litros) en un medio que contenía caseína bajo una atmósfera anaeróbica controlada. El crecimiento de la bacteria se completa normalmente luego de 24 a 36 horas, y durante la fermentación de 60-96 horas la mayoría " de las células sufren lisis y liberan toxina botulínica. El control del pH del medio de fermentación no se requiere en un proceso de Schantz o de Schantz modificado. Se cree que la toxina es liberada por la lisis celular y se activa por proteasas presentes en el caldo de cultivo. Opcionalmente, una filtración de este medio de cultivo usando un filtro con profundidad de una sola capa para remover impurezas grandes (es decir, células enteras y rotas) puede prepararse para obtener una solución transparente referida a un cultivo clarificado.

Cosecha La cosecha de la toxina puede lograrse al reducir el pH a 3.5 con ácido sulfúrico para precipitar la toxina cruda a 20°C. La toxina cruda se concentra después mediante ultramicrofiltración seguida por diafiltración.

Pur i fi ca ci ón La toxina cruda cosechada se transfirió después a un recipiente de digestión y se estabilizó por la adición del inhibidor de proteasa clorhidrato de benzamidina. Se añadieron DNasa y RNasa para digerir ácidos nucleicos . Después de la ultrafiltración y diafiltración, la toxina se purificó mediante tres etapas de precipitación, en particular precipitación con ácido, precipitación con etanol frío y precipitación con sulfato de amonio. El complejo de neurotoxina botulínica purificado (toxina global) fue almacenado como una suspensión en un regulador de pH de fosfato de sodio/sulfato de amonio a 2-8 grados centígrados. La toxina global resultante fue un complejo de toxina botulínica tipo A de 900 kD cristalina y de alta calidad hecha a partir de la cepa Hall A de Clostridium botulinum con una potencia específica de >3 X 107 U/mg, una A26o/A27s de al menos 0.60 y un patrón distinto de bandas sobre electroforesis en gel, y adecuada para usarse para mezclarse con una composición farmacéutica de toxina botulínica. La mezcla puede abarcar una dilución de varias veces de la toxina global, mezclado con uno o más excipientes (tales como albúmina y cloruro de sodio) para formar así una composición de toxina, y la preparación de una forma estable en almacenamiento y transportación de la composición de toxina, tal como mediante liofilización, secado por congelación o secado al vacío de la composición. El complejo de toxina botulínica purificado obtenido a partir de un proceso de Schantz o de Schantz modificado puede ser eluido de una columna de intercambio iónico en un regulador de pH 7-8 para disociar las proteínas del complejo que no sean toxina de la molécula de toxina botulínica, proporcionando así (dependiendo del tipo de bacteria de Clostridium botulinum fermentada) toxina botulínica pura tipo A con un peso molecular de aproximadamente 150 kD, y una potencia específica de 1-2 X 108 LD50 U/mg o más; o toxina botulínica purificada tipo B con un peso molecular de aproximadamente 156 kD y una potencia específica de 1-2 X 108 LD50 U/mg o más, o toxina botulínica purificada tipo F con un peso molecular de aproximadamente 155 kD y una potencia específica de 1-2 X 107 LD50 U/mg o más. Como se describió arriba, en un aspecto la presente invención elimina las etapas de purificación de cosecha descritas en este ejemplo 6 llevado a cabo en cultivo clarificado, incluyendo la eliminación del uso de los productos derivados de animales, tales como RNasa y DNasa.

Ejemplo 7 Medios APF y proceso para obtener una toxina botulínica Este ejemplo 7 describe un proceso APF llevado a cabo para obtener toxina tipo A de Clostridium botulinum altamente purificada y altamente potente (toxina general) . El proceso puede usarse con otros serotipos de toxina botulínica.

Preparación del cultivo de abastecimiento Como se describió en el ejemplo 6, Clostridial botulinum se puede obtener de la ATCC, de varias fuentes en la naturaleza o- de un paciente ' con botulismo . La mitad inferior de la figura 1 resume el proceso APF usado para la preparación de un frasco de banco de células, y para el cultivo y fermentación de una toxina botulínica. Los frascos de banco de células APF fueron preparados al cultivar Clostridium botulinum sobre placas de agar vegetal. Las placas de agar vegetal se hicieron al mezclar el derivado de soya HySoy (Quest) con un extracto de levadura y glucosa en una relación 3:1:1 (por ciento en peso) con agar y dejando fijar. Otras placas de agar APF disponibles comercialmente o polvo deshidratado para hacer las placas también se encontró que eran adecuados. Las colonias de alto crecimiento seleccionadas fueron luego inoculadas en un medio para frasco de banco de células APF . El medio para frasco de banco de células APF usado comprendía proteína de soya hidrolizada, extracto de levadura (no se usó producto animal alguno ni en el cultivo de la levadura ni en el proceso para la preparación del extracto de levadura hecho a partir de la misma) y glucosa en la misma relación 3:1:1. Otras relaciones, de nutrientes (es decir, 6:1:1, 6:0:1 y 6:3:1 también se encontró que eran adecuadas) . La soya hidrolizada (HySoy) y los concentrados de extracto de levadura (HyYest) usados se obtuvieron de Quest International. El cultivo de Clostridium botulinum en el medio APF se combinó con glicerol, se formó en alícuotas para criofráseos y se congeló para su uso posterior. Los medios APF desarrollados pueden usarse para almacenar las bacterias de Clostridium botulinum durante un periodo de un año o más sin pérdida de viabilidad. Estas mezclas de cultivo y glicerol congeladas en criofrascos son los frascos del banco de células APF.

Cul tivos Un frasco de banco de células APF se descongeló a temperatura ambiente, seguido por una sola etapa de cultivo: una botella de cultivo de siembra de un litro se inoculó después directamente (es decir, sin un cultivo de agar hemático interventor o etapas de crecimiento en tubo) con los contenidos del frasco del banco de células APF usando el mismo medio APF (el medio para frasco de banco de células APF [almacenamiento] puede ser diferente del medio de crecimiento de fermentación APF [crecimiento] ) y se mantuvo a 35°C durante 15 a 24 horas, con un pH de medio inicial de 7.0 en una atmósfera anaeróbica (nitrógeno) .

Fermen t ación Después el cultivo de botella de siembra se transfirió a un fermentador de producción de 10 litros a .escala comercial que contenía el medio APF (proteína de soya hidrolizada, extracto de levadura y 1% de glucosa) mantenido a 35°C durante 52-72 horas, con un pH de medio inicial de 7.0, en una atmósfera anaeróbica (nitrógeno). Aproximadamente 15 horas después del inicio de la fermentación (el pH de cultivo se redujo naturalmente a menos de 6.0), un programa de control de pH a una escala de pH 5.0- 5.5 es iniciado al añadir HCl al cultivo . Se encontró que era necesario controlar el pH del medio de fermentación APF dentro de la escala limitada para obtener así un rendimiento aceptable de toxina botulinica activa. Así, se encontró que este control del pH a entre 5.0-5.5 evitó sustancialmente la degradación y pérdida de potencia de la toxina botulínica. Se cree que durante la fermentación la mayoría de las células sufren lisis y liberan toxina botulínica, y que la toxina liberada por la lisis de las células es activada por las proteasas presentes en el caldo de cultivo . La filtración de este medio de cultivo usando un filtro de profundidad de una sola capa remueve impurezas grandes (es decir, células enteras y rotas) y da como resultado una solución transparente referida a un cultivo aclarado.

Cosecha La cosecha de la toxina botulínica puede proceder entonces como en el ejemplo 6 (es decir, precipitación con ácido sulfúrico, seguida por la concentración por microfiltración seguida por diafiltración) .

• Pur i fi ca ci ón La purificación de la toxina puede proceder entonces como se describe en el ejemplo 6: es decir, la adición de clorhidrato de benzamidina, una DNasa y RNasa, precipitación con ácido sulfúrico, precipitación con etanol frío, extracción "con regulador de pH de fosfato, precipitación con ácido clorhídrico, extracción con regulador de pH de fosfato y almacenamiento de la toxina general. Como una alternativa para el proceso de cosecha y purificación del ejemplo 6, un proceso de cromatografía en columna puede llevarse a cabo. La toxina general resultante es un complejo de toxina botulínica tipo A de 900 kD cristalino y de alta calidad hecho a partir de la cepa Hall A de Clostridium botulinum con una potencia específica de >3 X 107 U/mg, una A26o/A2s de menos de 0.60 y un patrón distinto de bandas sobre electroforesis en gel, y adecuado para usarse para la mezcla de una composición farmacéutica de toxina botulínica. Así, este proceso APF para una toxina botulínica puede generar toxina de alta calidad. El complejo de toxina botulínica purificado obtenido de un proceso APF puede pasarse a través de y eluirse en una columna de intercambio iónico en un regulador de pH 7-8 para disociar las proteínas del complejo no toxina de la molécula de toxina botulínica, de esta manera proporcionando (dependiendo del serotipo de bacteria de Clostridium botulinum fermentada) una toxina botulínicá con un peso molecular de aproximadamente 150 kD, y una potencia específica de 1-2 X 108 LD50 U/mg o más; o toxina botulínica tipo B purificada con un peso molecular de aproximadamente 156 kD y una potencia específica de 1-2 X 108 LD50 U/mg o más, o toxina botulínica purificada tipo F con un peso molecular de aproximadamente 155 kD y una potencia específica de 1-2 X 107 LD50 U/mg o más. Por ejemplo, mediante el uso del presente medio APF los inventores fueron capaces de obtener un complejo de toxina botulínica tipo A con una potencia específica de 1.02 X 108 LD50 U/mg de toxina botulínica. En este ejemplo 7 medios APF ya sea con 1% en peso o 2% en peso de glucosa fueron usados (nótese que 1% de glucosa significa 1 g de glucosa por 100 ml del medio de cultivo y 2% de glucosa significa 2 g de glucosa cuando está presente por cada 100 ml del medio de cultivo) y se determinó que el crecimiento de bacteria máximo (determinado por densidad óptica pico [la densidad óptica se midió a 600 nm] del cultivo) ocurrió después de aproximadamente 20 horas de fermentación en el medio APF de 1% de glucosa vs después de alrededor de 40 horas de fermentación en el medio APF de 2% de glucosa, pero que las densidades ópticas pico no difirieron significativamente al variar de esa manera el contenido de glucosa de los medios . Se cree que la autolisis de células y liberación de toxina dieron como resultado una cantidad máxima de toxina botulínica activa en el medio APF de 1% de glucosa (determinada por un ensayo SNAP-25 para toxina activa) luego de aproximadamente 55 horas de fermentación, pero que con el medio APF de 2% de glucosa la cantidad de toxina botulínica activa presente en el medio en un momento posterior (determinado por un ensayo SNAP-25 para toxina activa) y aún se incrementaba después de 65 horas de fermentación. Así, una liberación más rápida de toxina botulínica ocurrió con el uso de la cantidad más baja de medio APF de glucosa (1%) presente, indicando que un proceso de producción de toxina más eficiente (es decir, mayor cantidad de toxina obtenida por unidad de tiempo) puede llevarse a cabo con el uso del medio APF de glucosa más bajo (1%) . Como se muestra por la figura 1, también se determinó que los parámetros óptimos para la producción de toxina botulinica en un medio APF fueron la combinación de los siguientes parámetros: (1) alrededor de 6% en peso de una concentración de soya hidrolizada ("Conc. de HySoy" en la figura 1) en el medio de fermentación APF. Seis por ciento de soya significa 6 g de la proteína de soya por 100 ml del medio de cultivo; (2) 0% a 3% de concentrado de extracto de levadura ("Conc. de YE" en la figura 1) en el medio de fermentación APF; (3) 50-72 horas de fermentación a una temperatura de 33-35°C bajo condiciones anaeróbicas (atmósfera de nitrógeno) ; (4) el pH del medio de fermentación se mantuvo entre alrededor de pH 5.0 a 5.5 a lo largo del periodo de fermentación después del crecimiento de células inicial, y (5) 1% en peso de glucosa en el medio de fermentación APF. Se determinó que 1-2% en peso de glucosa en el medio de cultivo y/o fermentación funcionaron bien. Cuando las concentraciones tanto de glucosa como de levadura en el medio de fermentación se mantuvieron constantes a 1% en peso cada una, pero el contenido de nutriente de proteína de soya (como HySoy) en el medio de fermentación fue variado entre 1 a 6% en peso, se encontró que la lisis de células varió entre 68-100% y la potencia del complejo de toxina botulínica varió entre 1.3 x 106 unidad/mL a 4.7 x 106 unidad/mL, como se determina usando el ensayo LD50 de ratón (véase figura 8) . De esta manera, como se muestra por la figura 1 al estar presente más proteína en el medio APF (como la cantidad total de HySoy y YE) el pH del medio tiende a incrementarse con una estabilidad de toxina más baja resultante y que cuando el pH fue bajado con el mismo contenido de nutriente de proteína total en el medio, el rendimiento de la producción de toxina se incrementó dramáticamente. En el proceso no APF el contenido de proteína total es más bajo por lo que el pH no tiende a elevarse y por lo tanto no hay un pH elevado que tenga un efecto dañino en la producción de toxina. La figura 1 muestra que hubo consistentemente más actividad (determinada por los ensayos MLD50 y SNAP-25) cuando el pH del medio se controló a dentro de una limitada escala de aproximadamente 5.3 a 5.5. La figura 1 muestra también que el rendimiento de toxina más alto (como se determina por el ensayo SNAP 25) se obtuvo con un medio que comprendía 6% de soya hidrolizada y 1% de extracto de levadura. El ensayo SNAP-25 usado fue un método a base de ELISA para medir la actividad proteolítica SNAP-25 de la toxina botulínica. SNAP-25 es una abreviatura para proteína asociada a sinaptosoma con un peso molecular de 25 kDa.

SNAP-25 es una proteína de membrana de plasma de 206 aminoácidos implicada en la exocitosis neuronal. El ensayo se basa en el método descrito en Ekong T., et al., Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro, Microbiology (1997), vol. 143, páginas 3337-3347. El ensayo usa una proteína SNAP-25 truncada (el péptido de 206 residuos de aminoácido) unida a placas de microtitulación de 96 pocilios de poliestireno y un anticuerpo monoclonal que reconoce el producto cortado (un péptido de 197 residuos de aminoácido) que se hace mediante hidrólisis enzimática entre los aminoácidos 197 y 198- de la SNAP-25 mediante una toxina botulínica tipo A reducida. El anticuerpo monoclonal unido al producto cortado es luego detectado con un anticuerpo secundario (IgG anti-ratón de cabra conjugada a peroxidasa de rábano [HRP) ] , que produce un cambio de color en presencia de un substrato cromogénico (TMB) . El ensayo MLD50 (dosis letal para 50% de los ratones) es un método para medir la potencia de una toxina botulínica mediante inyección intraperitoneal de la toxina botulínica en ratones hembra (alrededor de cuatro semanas de edad) que pesaban 17-22 gramos cada una al inicio del ensayo. Cada ratón se mantiene en una posición supina con su cabeza inclinada hacia abajo y se le inyecta intraperitonealmente en el abdomen derecho inferior a un ángulo de • aproximadamente 30 grados usando una aguja calibre 0.95 cm a 1.59 cm con una de varias diluciones en serie de la toxina botulínica en solución salina. Los índices de mortalidad sobre las siguientes 72 horas para cada dilución se registran. Las diluciones se preparan de tal manera que la dilución más concentrada produzca un índice de mortalidad de al menos 80% de los ratones inyectados, y la dilución de concentración menor produzca un índice de mortalidad no mayor que 20% de los ratones inyectados . Debe haber un mínimo de cuatro diluciones que estén dentro de la escala de reducción monotónica de los índices de mortalidad. La escala de disminución monotónica comienza con un índice de mortalidad de no menos de 80%. Dentro de las cuatro o más velocidades de reducción monotónica, las dos velocidades más grandes y las dos más pequeñas deben estar reduciéndose (es decir, no equivalentes) . La dilución a la cual 50% de los ratones mueren dentro del periodo de observación post inyección de tres días se define como una dilución que comprende una unidad (1 U) de la toxina botulíniea. En forma significativa, el proceso APF de este ejemplo 7 difiere del proceso no APF del ejemplo 6 al menos por: (1) reemplazar el medio de carne cocida del frasco de banco de células con un medio APF; (2) eliminar la etapa de selección de colonia con agar hemático; (3) eliminar la etapa de crecimiento en tubo a base de medio de caseína subsecuente y (4) reemplazar los medios de fermentación no APF con medios de APF. La figura 2 representa un resumen de las diferencias entre un proceso de Schantz (no APF) a escala industrial (ejemplo 6) y el proceso APF a escala industrial del ejemplo 7, a través de las etapas de creación, cultivo y fermentación del banco de células . La figura 2 omite las etapas de cosecha y purificación. Los medios APF pueden usarse para seleccionar bacterias de Clostridium botulinum. Así, la práctica concurrente de las etapas de cultivo iniciales de los ejemplos 6 y 7 permiten el aislamiento y crecimiento de una bacteria de Clostridium botulinum con características que conduzcan al crecimiento y producción de toxinas botulínicas en o sobre un medio APF. La transferencia del cultivo de Clostridium botulinum de un medio no APF a un medio APF enriquece y selecciona bacterias que ya sea puedan -adaptarse al. nuevo ambiente o a través de una muerte selectiva de bacterias que no puedan crecer y producir en el nuevo ambiente .

Ejemplo 8 Sistemas y métodos cromatográficos para purificar una toxina botulínica Los químicos usados en los experimentos descritos en los ejemplos 8 y los siguiente incluyen: NaOH ION (Mallinckrodt, VWR Cat # MKH38505) ácido acético, grado USP/FCC, 99.5-100.5% (J.T. Baker, Cat #JT9522-2) sulfato de amonio, ultrapuro, 99% (ICN, Cat # IC808211) ácido cítrico, grado USP/FCC, 99.5-100.5% (J.T. Baker, Cat # JT0119-1) etanol anhidro, desnaturalizado (JT Baker, Cat # ácido clorhídrico, grado NF/FCC, 36.5 - 38%- Mallinckrodt-MK2612-14 ácido fosfórico, NF/FCC, 85% - 88% (Mallinckrodt, Cat # MK278814) acetato de sodio trihidratado, 99% - 101%, USP/FCC (Mallinckrodt, Cat # MK735602) cloruro de sodio, grado USP/FCC, 99.0 - 101.0 (Mallinckrodt, Cat # MK75-3204) citrato de sodio, grado USP/FCC, 99.0 - 100.5% (J.T. Baker, Cat # JT3650-1)" hidróxido de sodio, grado NF/FCC 99.5 -' 100.5%-Mallinckrodt-MK768004 fosfato de sodio, dibásico heptahidratado, USP (Mallinckrodt, Cat 3 MK789604) fosfato de sodio, monobásico monohidratado, USP/FCC (Mallinckrodt, Cat # MK786812) . Las resinas de cromatografía usadas en los siguientes experimentos incluyeron: - Bakerbond ABx Prepscale (JT Baker, Cat # 7269-02) - Butil Sepharose FF (Amersham Biosciences, Cat #17-0980-02) - Hidroxiapatita Cerámica, Tipo I (Bio-Rad, Cat # 158-4000) - Hidroxiapatita Cerámica, Tipo II (Bio-Rad, Cat # 157-4200) - HiTrap HIC Selection Kit (Amersham Biosciences, Cat # 17-1349-01) - HiTrap IEX Selection Kit (Amersham Biosciences, Cat # 17-6002-33) - MPE Hypercel (Ciphergen, muestra) - SP Sepharose. HP (Amersham Biosciences, Cat # 17-1087-03) El equipo y accesorios usados en los experimentos abajo incluyeron: Purificador AKTA y Sistema de Cromatografía AKTA FPLC (Amersham Biosciences) Filtro estéril al vacío de 0.22 µm para parte superior de botella (Nalgene) sistema TFF a escala de laboratorio y Pellicon XL50 con membrana Biomax 100 (Millipore) (este es el equipo de ultrafiltración) bomba Masterflex L/S Modelo #77201-62 (Cole-Parmer) Pellicon 2 Mini Holder (Millipore) columnas XK y HR (Amersham Biosciences) Los reguladores de pH usados en los presentes experimentos se listan en la tabla 2.

Tabla 2 Reguladores de pH usados en el proceso de purificación APF Etapas de purificación Reguladores de pH usados Cromatografía Butyl 1. 50mM NaPi, NaCl 4M, pH 6.0 Sepharose FF 2. 50mM NaPi, NaCl 2M, pH 6.0 3. 50mM NaPi, NaCl 1M, pH 6.0 4. 50mM NaPi, pH 6.0 Cromatografía SP Sepharose 5. 20mM citrato de Na, pH 4.0 HP 6. 20mM citrato de Na, 300 mM NaCl pH 4.0 7. 20mM citrato de Na, 400 mM NaCl pH 4.0 20mM citrato de Na, NaCl 1M, pH 4.0 Etapas post purificación Soluciones usadas Procesos post-columna 9. 50mM de NaAc, pH 4.0 10. sulfato de amonio 3.5M Misceláneos 11. NaOH 0.1N 12. NaOH ÍN En la tabla 2 : los reguladores de pH 1 y 2 se usaron para" lavar impurezas de la columna; los reguladores de pH 3 y 4 se usaron para eluir toxina unida de la columna; el regulador de pH 5 se usó para diluir el eluyente de la columna butilo; regulador de pH 6 se usó para lavar impurezas de la columna; reguladores de pH 7 y 8 se usaron para eluir toxina unida de la columna; regulador de pH 8 fue el regulador de pH de diálisis UF/DF; la solución 9 se usó para precipitar toxina y las soluciones 10 y 11 se usaron para inactivar (limpiar) cualquier toxina que permaneciera en las columnas después del uso .

Ejemplo 9 Selección de columnas de cromatografía preferidas para usarse en una columna APF Proceso cromatográfico de purificación de toxina botulínica (etapa de captura) Este experimento estableció columnas y técnicas de cromatografía preferidas para la purificación inicial de un complejo de toxina botulínica tipo A a partir de las impurezas presentes en un medio de fermentación.

Materiales de alimentación Tanto un cultivo de células filtradas (cultivo clarificado) obtenido de una fermentación de proceso APF como un extracto del mismo preparado mediante precipitación con ácido clorhídrico fueron evaluados como materiales de alimentación para columna de cromatografía. Se encontró que la carga directa del cultivo clarificado sobre una columna evitaba la precipitación de toxinas y que un material de alimentación de cultivo clarificado era mucho más fácil de manejar y validar. Por otro lado, el uso como el material de alimentación de un extracto de cultivo clarificado preparado mediante precipitación con ácido removió impurezas adicionales y proporcionó inactivación del virus. Con respecto a las características de la robustez del proceso, un cultivo clarificado se determinó que era el mejor material de alimentación, a diferencia de usar una preparación de precipitación con ácido clorhídrico como el material de alimentación de resina de cromatografía de complejo de toxina botulínica global. Por consiguiente, el cultivo clarificado fue el material de almacenamiento preferido. Los estudios demostraron que al reducir el pH las proteínas (es decir, el complejo de toxina botulínica) empezaron a precipitarse a aproximadamente pH 5, que cantidades pequeñas de toxina fueron extraídas (cuando mucho se habrían precipitado) a un pH de aproximadamente 4.0, y que esencialmente toda la toxina tuvo precipitación fuera de la solución a entre pH 3.5 a 3.8. Por otro lado, se encontró (con base por ejemplo en SBS-PAGE y Western" blotting) que la mayoría de las impurezas fueron co-extraídas con la toxina botulínica a un pH de 6.8. Por consiguiente, un pH de líquido de alimentación que se prefiere para llevar a cabo el presente proceso de purificación fue de entre alrededor de pH 5-6.8, con un pH más preferido siendo un pH de alrededor de 5.5 para extracción, es decir separación de la toxina botulínica de las impurezas presentes .

Etapa de captura Para la etapa de captura filtrados de cultivo de células de toxina botulínica tipo A (cepa Hall) fueron incubados con un número de resinas de cromatografía (véase abajo) bajo las condiciones especificadas por el fabricante para usar cada columna particular. Después de lavar las columnas , las proteínas unidas a la columna fueron eluidas con los reguladores de pH de elución especificados. Todas las fracciones eluidas se recogieron y analizaron mediante SDS-PAGE. Los resultados obtenidos (tabla 3) fueron confirmados mediante cromatografía usando columnas 1 ml HiTrap o HR5/5.

Tabla 3 Resumen de los resultados de la etapa de captura Este experimento demostró claramente que la separación deseada de la toxina botulínica de otras sustancias presentes se logró mejor mediante el uso de cromatografía en columna tipo hidrofóbico. Así, los presentes inventores encontraron que la toxina botulínica unida a columnas hidrofóbicas, pero que no se unió a una columna de intercambio iónico, tal como la columna Q Sepharose FF .

Entre las columnas hidrofóbicas evaluadas, la' Butyl Sepharose FF débilmente hidrofóbica dio la mejor resolución.

Por lo tanto, ya sea Butyl Sepharose FF en modo de unión o Q Sepharose FF en modo de paso de flujo proporcionó una etapa de captura de toxina botulínica preferida. Así, se determinó que una etapa de captura eficiente puede llevarse a cabo usando una columna hidrofóbica, tal como la cromatografía en columna Butyl Sepharose. Presumiblemente, la toxina se- une a la columna de butilo por medio de una interacción hidrofóbica. Antes de este experimento se desconocía que un complejo de toxina botulínica pudiera ser toxina purificada directamente de un cultivo clarificado usando una columna de cromatografía hidrofóbica. Se encontró que la columna Butyl Sepharose Fast Flow tiene alta capacidad de unión, permite una rápida velocidad de flujo con baja presión de retroceso y es por lo tanto adecuada para la etapa de captura que requiere la remoción rápida de impurezas.

Ejemplo 10 Sistema y proceso cromatográfico APF de cuatro columnas para purificar un complejo de toxina botulínica Etapas de purificación intermedia y de pulimentado Etapas de purificación de toxina adicionales (intermedia y de pulimentado) se llevaron a cabo usando las fracciones que contenían toxina obtenidas de las columnas Q y Butyl preferidas del ejemplo 9. Tres tipos de columnas de cromatografía se encontraron efectivas para esta purificación adicional del complejo de toxina botulínica. Una columna hidroxiapatita tipo I (HA) fue una columna preferida que se usó debido a que mostró separación, pero una parte de la toxina se encontró en el paso de flujo. La filtración en gel con una column Superdex 200 fue una columna más preferida de usar toda vez que permitió la purificación de la toxina botulínica de 900 kDa de las impurezas, pero una banda de impurezas menor aún estuvo presente en SDS-PAGE. Una columna que más se prefiere fue una columna SP Sepharose HP que se encontró separaba la toxina botulínica de impurezas con resolución muy buena. La toxina botulínica era pura después de la cromatografía SP Sepharose HP, con base en el análisis mediante SDS-PAGE.

Tabla 4 Resumen de etapas de purificación por cromatografía en columna Con base en los resultados de los ejemplos 8 y 9, y como se muestra por la tabla 4, los siguientes procesos de purificación de cromatografía en columna fueron desarrollados : 1. uso de una columna Q Sepharose FF para la purificación inicial de un cultivo clarificado. En esta etapa las impurezas unidas a la columna y la toxina fluyeron a través de la columna; 2. El eluyente de la etapa 1 de la columna Q Sepharose FF se pasó después a través de una columna Butyl Sepharose FF. La toxina unida a la columna fue eluida fuera con un regulador de pH adecuado ,- 3. El elúyente que provenía de la Butyl Sepharose FF fue luego pasado a través de una columna de hidroxiapatita tipo I . Las impurezas se unieron a la columna y la toxina fluyó a través de la columna; 4. El eluyente de la hidroxiapatita tipo I se pasó después a través de una columna SP Sepharose. La toxina unida a la columna fue eluida con un regulador de pH adecuado . Este proceso de purificación de toxina de cuatro columnas puede resumirse como: Cul tivo clarificado APF => Q (paso de flujo) => Butyl (unión => HA (paso de flujo) -> SP (unión) => complejo de toxina purificado Este proceso de complejo de toxina botulínica global de cuatro columnas permitió la carga directa de sobrenadante de cultivo filtrado sobre la columna Q (etapa 1) . El paso de flujo se complementó con sulfato de amonio a 0.8 M antes de la segunda etapa de cargar sobre la columna Butyl. Para la tercera etapa, el eluato de butilo se cargó sobre una columna HA directamente, mientras que el paso de flujo del HA se diluyó 4 veces con agua desionizada y el pH se ajustó a 4.0 antes de cargar sobre la columna SP para la etapa de cuatro columnas. Este proceso de cuatro columnas requirió de un mínimo manejo de muestras en cada etapa, y aseguró que la toxina fue expuesta a condiciones de regulación de pH leves a lo largo de las cuatro etapas de este proceso de purificación. Una escalada ascendente del proceso de purificación de cuatro columnas mostrado arriba se usó y se llevó a cabo 680 ml de sobrenadante de cultivo filtrado obtenido de un proceso de fermentación de toxina botulínica tipo A APF. Los resultados (véase tabla 5) muestran que este proceso de cuatro columnas dio como resultado altamente en un complejo de toxina botulínica tipo A de alto rendimiento altamente purificado .

Tabla 5 . Resultados de una purificación de escalada ascendente usando el proceso de purificación de cuatro columnas Ejemplo 11 Procesos adicionales de cromatografía de PF de varias columnas para purificar un complejo de toxina botulínica. Usando los mismos procedimientos mostrados en los ejemplos 9 y 10 combinaciones de columnas adicionales fueron evaluadas . Se determinó que cada una de las cuatro combinaciones de columna adicionales proporcionaron métodos APF para obtener complejo de toxina botulínica altamente purificado, como se determina mediante SDS-PAGE. 1. Q (flowthru) => Butyl =>SP 2 . Butyl => Q o HA (flowthru) =>SP 3. Buyil => SP =>Q o HA (flowthru) 4. Butil => SP Las toxinas purificadas fueron analizadas más mediante SEC-HPLC con dispersión de luz, electroforesis capilar, ensayo de ADN residual, Hc-ELISA y MLD50. No se encontraron diferencias significativas entre las toxinas provenientes de los cuatro procesos diferentes mostrados arriba. Los resultados se resumen en la tabla 6.

Tabla 6 Resumen de calidad de muestras de toxina purificadas mediante diferentes procesos AFP 1.4. arriba Ejemplo 12 Proceso de cromatografía AFP de dos columnas para purificar un complejo de toxina botulínica Con base a los resultados obtenidos en el ejemplo 11 un proceso de cromatografía de dos columnas (Butyl =>SP) se seleccionó para un desarrollo adicional .

Optimización de la primera etapa : Captura de toxina FF Butyl Sepharose . Alimentación: La alimentación es al cultivo clarificado cargado sobre la columna. Ya que el sulfato de amonio puede afectar el pH del regulador, el uso de NaCl para reemplazar sulfato de amonio en la columna Butyl fue evaluado. Se encontró que la adición de NaCl a alimentación suficiente para NaCl 2M permitió que el complejo de toxina botulínica se uniera a la columna Butyl. Posteriormente, se determinó que la alimentación a NaCl 4M incrementó la unión de complejo de toxina botulínica a la columna Butyl, de tal manera que el rendimiento de toxina a partir de la columna Butyl se incrementara en 30% a 50%, como se determina mediante Hc-ELISA, como se compara para usar una alimentación a 2M NaCl. La adición de NaCl al cultivo clarificado (la alimentación) causó un pequeño desplazamiento de pH. Sin embargo, el pH de la alimentación aceptable se estableció entre pH 5 y pH 6 y el pH final de la alimentación después de la alimentación de NaCl estuvo dentro de un pH 5 y pH 6. Por consiguiente, la alimentación que se prefirió usar en esta primera etapa de un proceso de purificación de dos columnas tiene una concentración NaCl 4M y está a pH 5-6. Se añadió NaCl sólido al cultivo clarificado directamente para obtener la concentración de NaCl 4M y esta alimentación se añadió después a la columna butilo. La toxina unida se eluyó de la columna usando un regulador de pH de elución de NaCl 1M. Fue sorprendente que la mayoría de las proteínas de impureza pudieran ser lavadas de la columna y la mayoría de la toxina unida a la columna pudo ser eluida con un regulador de pH de NaCl 1M debido a que los procesos de purificación en columna típicamente consisten en 3 o más columnas, excepto para un proceso de columna de afinidad. Se determinó que esta columna Butyl es única toda vez que tiene la capacidad de remover muchas de las proteínas de impurezas. Así, después del uso de esta columna la pureza del complejo de toxina botulínica fue de aproximadamente 50%. Después se llevó a cabo una etapa de lavado para remover impurezas de una columna. Las impurezas de la columna provinieron de la alimentación de cultivo clarificado (que contenía NaCl 4M) usada. Las etapas de lavado optimizadas fueron: 1) Lavado #1 : 5CV de NaPi 50 mM, NaCl 4M, pH 6.0 y 2) lavado #2: 12CV de NaPi 50 mM, NaCl 2M, pH 6.0.

Cuando 12CV y 5CV fueron comparados, se encontró que 5CV no es suficiente para remover las impurezas . Aunque el lavado es para remover impurezas después de la carga el cultivo se clarificó en este caso. Elución (para remover toxina unida a una columna) . La elución de toxinas con NaCl 1.2 M, 1.0 M y 0.8 M se evaluaron. Se seleccionó eluir toxina con NaCl 1M en 50 mM de NaPi, pH 6.0, con base en recuperación de toxina y remoción de impurezas . Lavado con bajo contenido de sal: Después de la elución, la columna se lavó más con 50 mM de NaPi, pH 6.0 para remover impurezas residuales unidas a la columna para la caracterización de los procesos de purificación. Limpieza: La columna se limpió con 3CV de NaOH 0. ÍN para inactivar cualquier toxina residual antes del desecho de la resina usada. Velocidad de Flujo de Corrida: La velocidad de flujo típica fué 100 cm/h. La velocidad de: flujo de carga fue de entre 90 cm/h y 120 cm/h dependiendo de la presión de retroceso. Capacidad de carga: La capacidad de carga típica fue de 12.7 ml de cultivo por ml de lecho, o en una escala de producción, 10 1 de cultivo para lecho de resina de 785 ml (columna BPG 100 a una altura de lecho de 10 cm) . Altura de lecho: Todas las columnas se empacaron con una altura de lecho de 10 cm estándar.

Optimización de la segunda etapa : Purificación en SP Sepharose HP Acondicionamiento de la alimentación: El eluato de Butyl se diluyó 5 veces con regulador de pH de citrato de sodio 20 mM, pH 4.0, y el pH de alimentación se ajustó a 4.0.

La etapa de dilución de 5 veces se llevó a -cabo para, acondicionar el eluyente de la cromatografía de interacción hidrofóbica para usarse en cromatografía de intercambio iónico. Se encontró que el pH de alimentación óptimo para una mejor recuperación de toxina estaba dentro de la escala de pH 4.0 + 0.2. Etapa de lavado: Después de la carga, la columna se lavó con 1) 5CV de citrato de sodio 20 mM, pH 4.0, seguido por 2) 3-5 CV de citrato de sodio' 20 mM, NaCl 300 mM, pH 4.0 para remover impurezas antes de la elución de la toxina unida. Etapa de elución: La toxina fue eluida con citrato de sodio 20 mM, 400 mM de NaCl, pH 4.0. Etapa de lavado con alta cantidad de sal: Después de la elución, la columna se lavó más con 20 mM de citrato de sodio, NaCl 1M, pH 4.0 para remover impurezas fuertemente unidas . Limpieza de la columna: La columna se limpió con ~3CV de NaOH 0.1N para inactivar toxina residual antes del desecho de resina usada. Velocidad de flujo: La velocidad de flujo típica fue 100 cm/h. Carga: El eluato de butilo completo se cargó sobre la columna SP. Altura del lecho: Todas las columnas se empacaron con una altura de lecho de 10 cm estándar. Los procedimientos operativos detallados llevados a cabo con respecto a este proceso de purificación de complejo de toxina botulínica de dos columnas se describen en este ejemplo 12 a continuación. 1. Columna de Interacción Hidrofóbica de Butilo Materiales y Reactivos usados Sistema de cromatografía: Purificador AKTA 100, Amersham Biosciences Tipo de resina: Butyl Sepharose FF, Amersham Pharmacia Detección: UV (280 nm) Regulador de pH de equilibrio/regulador de pH de lavado #1: 50 mM de NaPi, NaCl 4M, pH 6.0 Regulador de pH #2: 50 mM de NaPi, NaCl 2M, pH 6.0 Regulador de pH de elución: 50 mM de NaPi, NaCl 1M, pH 6.0 Regulador de pH de lavado de bajo contenido de sal: 50 mM de NaPi, pH 6.0 Solución de limpieza: NaOH 0.1 N Regulador de pH de titulación: 500 mM de NaP , pH 7.2 Procedimiento Empaque y Acondicionamiento de la columna Se equilibra la columna con al menos 5-10 CV de regulador de pH de equilibrio o hasta que el pH de salida sea equivalente al pH de entrada.

Preparación de la muestra Se mide el pH del material -de partida Se añade NaCl sólido al cultivo clarificado hasta la concentración de NaCl final de 4 M. La adición de NaCl 4M es un ejemplo de cómo acondicionar el cultivo clarificado para usar el cultivo clarificado como un líquido de alimentación en cromatografía de interacción hidrofóbica. El pH se ajusta a 5.0 a 6.0 si se requiere con regulador de pH de titulación.

Carga de la columna Se carga el cultivo clarificado (que contiene NaCl 4M) y se colecta el flujo a través de la fracción para su análisis .

Lavado de columna # 1 (lavado con NaCl 4M) Se lavan las proteínas de la columna con 5CV de regulador de pH de equilibrio para remover impurezas . Se recoge la fracción de lavado para su análisis y se registra el volumen.

Lavado #2 de columna 3.5 (lavado con NaCl 2M) Se lava la columna con • 15 CV de regulador de pH de lavado #2 para remover proteínas de impureza adicionales. Se recoge la fracción de lavado para el análisis y se- registra el volumen.

Elución (elución pico de toxinas de 1M NaCl) Se eluye la toxina unida con 5 CV de regulador de pH de elución. Se monitorea la absorbancia a 280 nm del eluato, se comienza la recolección del eluato cuando la absorbancia a 280 nm empieza a incrementarse y se detiene la recolección del pico de eluato cuando la absorbancia de 280 nm alcanza la línea de base! Se registra el volumen de fracción de elución de toxinas .

Lavado con bajo contenido de sal (elución pico de impurezas de NaCl OM) Se lava la columna con 4 CV de regulador de pH de lavado con bajo contenido de sal para remover las proteínas de impurezas residuales . Se recoge la fracción para análisis y se registra el volumen.

Limpieza de la columna (NaOH 0.1 N) Se limpia la columna con 3 CV de regulador de pH de limpieza para inactivar la toxina residual antes del desecho de la resina usada.

Columna de intercambio catiónico SP (post-Butyl) Materiales y Reactivos usados Sistema de cromatografía: AKTA purificador 100, Amersham Biosciences •" Tipo de- resina: SP Sepharose HP, Amersham Pharmacia Detección: UV (280 nm) Dilución, regulador de pH de equilibrio y lavado #1: Citrato de sodio 20 mM, pH 4.0 Regulador de pH de lavado #2: Citrato de sodio 20 mM, 300 mM de NaCl, pH .0 Regulador de pH de elución: Citrato de sodio 20 mM, 400 mM de NaCl, pH 4.0 Regulador de pH de alto contenido de sal: Citrato de sodio 20 mM, 1 M de NaCl, pH 4.0 Solución de limpieza: NaOH 0.1 N Procedimiento Empaque y acondicionamiento de la columna Se equilibra la columna con 5-10 CV de regulador de pH de equilibrio o hasta que el pH de salida sea equivalente al pH de entrada.

Preparación de la Muestra Se diluye un volumen del eluato de NaCl 1M Butyl con 4 volúmenes de regulador de pH de dilución. Se mide la conductividad y pH de la carga. Se ajusta el pH a 4.0 si se requiere.

Carga de la Columna Se aplica el eluato de Butyl diluido anterior a la columna SP y se recoge el flujo a través de la fracción.

Lavado de columna #1 (lavado con regulador de pH de equilibrio) Se lava la columna con 5 CV de regulador de pH de equilibrio. Se continua recogiendo el eluato como fracción de paso de flujo.

Lavado de columna #2 (lavado con 300 mM de NaCl) Se lava la columna SP con 4 CV de regulador de pH de lavado #2 para remover proteínas de impureza. Se registra el volumen de la fracción de lavado #2.

Elución (elución con 400 mM de NaCl) Se eluye la toxina unida con 3 CV de regulador de pH de elución. Se monitorea la absorbancia a 280 nm de eluato, se comienza la colección de eluato cuando la absorbancia a 280 nm empieza a incrementar y se detiene la recolección del pico de eluato cuando la absorbancia a 280 nm alcanza la línea de base. Se registra el volumen de fracción de elución de toxinas .

Elución con Alto contenido de Sal (NaCl 1M) Se eluyen las proteínas de impureza fuertemente unidas con 3 CV de regulador de pH de alto contenido de sal. Se recubre la fracción para su análisis y se registra el volumen.

Limpieza de la Columna Se limpia la columna SP con 3 CV de solución de limpieza para inactivar la toxina residual antes del desecho de resina usada.

Ejemplo 13 Robustez del proceso de cromatografía APF de dos columnas para purificar un complejo de toxina botulínica La robustez del método de dos columnas del ejemplo 12 se estudió en una serie de experimentos, como se describió abajo . pH de Cul tivo El efecto del pH de cultivo en la purificación de toxinas fue evaluado. Un estudio usando cultivos crecidos a pH 5.5 y pH 6.5 como el material de partida para la purificación se llevó a cabo, y se encontró que la recuperación del cultivo de pH 6.5 era ligeramente más baja que aquella del cultivo de pH 5.5, con base a los resultados de Hc-ELISA.

Tiempo de almacenamiento La toxina se purificó de un cultivo que creció a pH 5.5 el día de la cosecha y después de almacenamiento de 4 días del cultivo a 2-8°C. No se encontró alguna diferencia, con base a la recuperación de toxinas, de cromatogramas y los resultados de los cromatogramas de Butyl y SP, SDS-PAGE y Hc-ELISA.

Capacidad de unión de columna La carga propuesta en la columna Butyl fue de 12.7 ml de cultivo por ml de resina, o 10 L de cultivo para la columna BPG100 (con una altura de lecho de 10 cm) . Las columnas Butyl y SP fueron probadas al cargar 4 x de más cultivo. Los resultados de SDS-PAGE y Hc-ELISA indicaron que muy poca toxina en las fracciones de paso de flujo para ambas columnas Butyl y SP. La capacidad de la columna Butyl y SP es de al menos cuatro veces mayor que aquella de la carga actual. La toxina es el eluato SP y fue pura en SDS-PAGE. La recuperación de la columna Butyl fue de 48% y la recuperación de la columna SP fue de 74%, con base en Hc- ELISA. El rendimiento total es de 16 mg de toxina por L de cultivo, con base en los resultados UV.

Tiempo de retención del proceso Después de cosechar, el cultivo se procesó a través de la columna de butilo el mismo día o - después de almacenamiento nocturno. El eluato de Butyl se almacenó normalmente durante la 'noche antes de cargarlo sobre la columna SP. Un estudio preliminar demostró que el eluato de Butyl era estable durante hasta 4 días, lo cual dio un cromatograma idéntico y patrones SDS-PAGE. La estabilidad del eluato SP fue evaluada mediante electroforesis capilar (CE) y SEC-HPLC. Los resultados no mostraron alguna diferencia entre las muestras almacenadas durante hasta 2 días . La recuperación de toxina después de la filtración también fue evaluada para estas muestras. La recuperación de toxina se redujo ligeramente el día 2 en comparación con el día 0, pero no fue claro si esta reducción se debió al almacenamiento o variación experimental.

Densidad de células del cultivo Un cultivo concentrado dos veces y un cultivo diluido dos veces fueron evaluados por la cromatografía en columna butilo para estudiar el efecto de la densidad de células de cultivo en la purificación de toxinas . Los cromatogramas para ambas corridas se veían idénticos . El perfil de impurezas y toxinas de ambas corridas fueron idénticos en SDS-PAGE. Los resultados de Hc-ELISA (tabla 7) mostraron que el equilibrio de masa entre ambas corridas fue > 90%, mientras que la recuperación de un cultivo concentrado dos veces fue significativamente más baja que aquella de un cultivo diluido dos veces . Veintinueve por ciento de toxinas se perdieron antes de la elución de toxina para el cultivo concentrado dos veces, comparado con 4% de pérdida para el cultivo diluido dos veces.

Tabla 7 Estudios de biocarga La biocarga se monitoreó a diferentes etapas del proceso. Las muestras de carga de Butyl, eluato de Butyl después de 3 días de almacenamiento, carga SP, eluato SP y eluato SP después del almacenamiento durante la noche fueron evaluadas. Algunos contaminantes fueron notados (~<1 CFU/ml a 35 CFU/ml) . La muestra con el número más alto de contaminantes fue el eluato de butilo . Los contaminantes pueden deberse al ambiente incontrolado en el cual se llevó a cabo el proceso de purificación.

Efecto _ de NaCl 4M Para evaluar el.' efecto de NaCl 4M en la toxina en cultivo, el cultivo que contenía NaCl 4M se mantuvo a 4aC durante la noche y luego se llevaron a cabo columnas Butyl y SP. El resultado cromatográfico, SDS-PAGE y He ELISA demostró que no hubo efecto alguno de NaCl 4M en la toxina en el cultivo después de almacenamiento durante la noche.

Medios de cul tivo (3 : 1 : 1 vs 5 : 1 : 1) Dos punto cinco litros de cultivo 5:1:1 y 3:1:1 fueron procesados . La recuperación de toxina para cada una de las purificaciones analizadas por Hc-ELISA se resume en la tabla 8. La toxina purificada de ambos cultivos fue pura en SDS-PAGE, lo cual indica, que el proceso se desarrolló con 3:1:1 de cultivo puede usarse para purificar toxina del cultivo 5:1:1.

Tabla 8 Recuperación de toxinas a base de Hc-ELISA Etapa Cultivo 3:1:1 Cultivo 5:1:1 Butyl 46% 43% S'P 63% 44% pH de trabajo para cromatografía SP Sepharose HP Se llevó a cabo la cromatografía SP Sepharose HP a diferentes valores de pH: 3.5, 4.2 y 4.5. Se encontró que el pH 3.5 causó la precipitación de las toxinas en la columna, no fue eluida alguna toxina con 400 mM de NaCl y muy poca •toxina salió con NaCl 1M. A pH 4.5, la toxina no se unió a la columna SP. Los resultados preliminares obtenidos en pH 4.2 demostraron que la toxina no se unía tan fuertemente a un pH de 4.0 y fue eluida como un pico amplio después del pico de lavado a 300 mM de NaCl. Los resultados indican que el pH en esta etapa fue crítico y que la escala de pH óptima era limitada.

Ejemplo 14 Evaluación del proceso de cromatografía APF de dos columnas para purificar un complejo de toxina botulínica Varios eluyentes de cada una de las dos columnas del proceso de purificación del ejemplo 12 se evaluaron como se describe a continuación.

A. Cromatografía Butyl Sepharose FF Un cultivo 3:1:1. filtrado se usó como la alimentación para este experimento. Antes de cargar la alimentación (cultivo clarificado obtenido de una fermentación de Schantz de una toxina de Clostridium botulinum tipo A (cepa Hall) sobre la columna Butyl Sepharose FF (columna XK50/10, diámetro 5 cm, altura de lecho 10 cm, volumen de columna: 196ml) , se le añadieron 584.4 g de NaCl a 2,500 ml de cultivo con agitación durante -30 min.' De manera atípica, el pH de alimentación se ajustó a 5.81 y la velocidad de flujo de corrida se ajustó a 92 cm/h (la velocidad de flujo normal es 10 cm/h) . El volumen de carga fue 2,800 ml. - Después de cargar, la columna se lavó con 5 CV o 1,000 ml de NaPi 50 mM, NaCl, 4M, pH 6.0, seguido por 15 CV o 3,000 ml de NaPi 50 ml, NaCl 2M, pH 6.0. El complejo de toxina botulínica tipo A unido fue después eluido de la columna con 5 CV o 1,000 ml de NaPi 50 mM, NaCl 1M, pH 6.0. Después de la elución del complejo de toxina botulínica, las impurezas fuertemente unidas se lavaron fuera de la columna con 4 CV u 800 ml de 50 mM NaPi, pH 6.0. La columna se lavó después con 2 CV (400 ml) de NaOH 0.1 N para inactivar toxina residual antes del desecho de la resina usada. El cromatograma del eluente de toxina se muestra en la figura 3. La figura 3 muestra que la columna Butyl usada puede proporcionar una adecuada separación de complejo de toxina botulínica de impurezas presentes con éste en el líquido de alimentación de cultivo clarificado. Como se mide por UV 280 nm, la figura 3 muestra el pico a través de flujo y los picos NaCl 2M, NaCl 1M, NaCl OM y NaOH 0.1 N. Con base en el tamaño del pico, se determinó que la mayoría de las impurezas eran removidas en la fracción de paso de flujo. Una cantidad significativa de impurezas también se removió en la fracción de NaCl 2M antes de la elución de toxina en la fracción NaCl 1M. La figura 3 es un cromatograma obtenido del pasaje de un cultivo clarificado APF (un cultivo 3.1.1) a través de una columna de interacción hidrofóbica de Butyl. El eje X representa el volumen en ml de líquido (efluente) que ha pasado a través de la columna. El eje Y representa la absorbancia UV a 280 nm en mAU. Además, la conductividad (línea de gráfica separada) se monitoreó durante la cromatografía. Como se muestra por la figura 3 , muchas impurezas de proteína pasaron a través de la columna en aproximadamente los primeros alrededor de 3,000 mis. El regulador de pH de lavados de NaCl 4M y NaCl 2M causan que picos más pequeños subsecuentes muestra la remoción de impurezas adicionales. El uso del NaCl 1M (aproximadamente el volumen de 7,000 ml) causó la elución del complejo de toxina unido de la columna y esto fue la fracción cargada sobre la segunda columna.

B. Cromatografía SP Sepharose .HP Los ejes de la figura 4 son los mismos que los de la figura 3. Las etapas llevadas a cabo para obtener la cromatografía de la figura 4 fueron las siguientes: (1) Cien ml del eluato de Butyl obtenidos del ejemplo 12. (el eluyente de- la columna butilo que resulta de la figura 3) fueron diluidos con 400 ml de regulador de pH de citrato" de sodio 20 mM a pH 4.0 (una dilución de cinco veces por lo tanto) . El pH de este eluyente de Butyl diluido fue de 4.1. (2) Cuatrocientos sesenta y seis ml de esta alimentación se cargaron después sobre la columna SP Sepharose HP (columna XK26/10, diámetro de columna 2.6 cm, altura de lecho 10 cm, volumen de columna: 53 ml) . (3) Después de cargar la columna se lavó (a aproximadamente el volumen de 450 ml sobre el eje x de la figura 4) con 5 CV o 250 ml del citrato de sodio 20 mM, pH 4.0. (4) La columna se lavó después con 4 CV o 200 ml de citrato de sodio 20 mM, NaCl 300 M, pH 4.0 (a aproximadamente el volumen de 725 puntos de ml en el eje x de la figura 4) . (5) Toxina de complejo de toxina botulínica unida a columna fue después eluida con 3 CV o 150 ml de citrato de sodio 20 mM, NaCl 400 mM, pH 4.0 (a aproximadamente el volumen del punto de 925 ml en el eje x .de la figura 4) . (6) Después de la elución del complejo de toxina unido a columna, la columna se lavó más con 3 CV o 150 ml de citrato de sodio 20 mM, NaCl 1M, pH 4.0 para eluir impurezas fuertemente unidas (a aproximadamente en el punto de volumen de 1050 ml en el eje x de la figura 4) . (7) La columna se limpió después con 3 CV o 150 ml de NaOH 0.1 N (justo después de que el volumen del punto de 1,200 ml en el eje x de la figura 4) . El cromatograma de la figura 4 muestra la elución de un complejo de toxina botulínica tipo A -(aproximadamente un peso molecular de 900 kDa) justo antes del punto de volumen de 1,000 ml en el eje x de la figura 4. La figura 4 muestra que un complejo de toxina botulínica altamente purificado puede obtenerse mediante el uso de la columna de SP Sepharose después de la columna Butyl. La figura 3 muestra que hubo un amplio flujo a través del pico, un pico de lavado de NaCl 300 mM pequeño, pico de elución de toxina 400 mM y un pico de limpieza con NaCl 1 M. Según se analiza mediante SDS-PAGE en la figura 5B, no hubo banda de proteínas visible en la fracción de paso de flujo, ciertas bandas de proteína de impurezas en la fracción de lavado 300 mM NaCl y fracción de lavado NaCl 1M. - La toxina fue eluida en una fracción de elución de NaCl 400 mM.

C. Resultados analíticos: SDS-PAGE: Las fracciones de elución de las columnas de cromatografía en columna Butyl y SP fueron analizadas por SDS-PAGE y el resultado típico se muestra en la figura 5A (columna butilo) y figura 4B (columna SP) . Las figuras 5 y 6 son los registros de electroforesis en gel obtenidos mediante el uso de SDS-PAGE reducida. El lazo izquierdo de la figura 5 y 6 y los registros de electroforesis en gel de las figuras 5 y 6 es marcado verticalmente con pesos moleculares ascendentes en miles de daltons (kDa) . Los números l a ß, I a 7 ó l a 8 son las figuras 5 y 6 representan las fracciones cargadas sobre los geles. En la figura 5A: el ítem 1 (línea de gel 1) "Mark 12" es el marcador de peso molecular Novex de masas moleculares estándares; la línea 2 es el líquido de alimentación de cultivo clarificado; la línea 3 es un alícuota de lavado que resulta del uso de paso de flujo («FT") y el lavado 4 M en la columna Butyl; la línea 4 es una alícuota del uso de lavado 2M; la línea 5 es una alícuota de-la fracción de cola de lavado 2M; la línea 6 es un alícuota de la fracción de la elución 1M; la línea 7 es un alícuota de la fracción de cola de elución 1M y la línea 8 es un alícuota de lavado OM.. La figura 5A muestra que la columna Butyl removió muchas impurezas (véanse columnas 3-5 en la figura 5A) y proporcionó toxina botulínica inicialmente purificada (véanse columnas 6-8 en la figura 5A) . - En la figura 5B: El ítem 1 (columna de gel 1) "Mark 12" es el mismo marcador de peso molecular usado en la figura 5A; la columna 2 es el eluyente de la columna Butyl diluido; la columna 3 es un alícuota del paso de flujo de columna; la columna 4 es un alícuota de lavado de 300 mM; la columna 5 es un alícuota del eluyente proveniente de la columna; la columna 6 es un alícuota de lavado 1M. La figura 5B muestra que el uso de una columna SP subsecuente al uso de una columna Butyl proporcionó toxina botulínica , altamente purificada (véase columna 5 en la figura 5B) .

Hc-ELISA La concentración de toxina se analizó mediante Hc-ELISA, un ensayo de ELISA para determinar la' concentración de toxinas con base en la concentración de cadena pesada de toxina, y el equilibrio de masa de toxina durante la purificación fue calculado. La tabla 9 muestra la concentración de toxina y la recuperación por etapas durante las etapas de la columna Butyl y SP a partir de una corrida de purificación típica. La recuperación total después de Butyl y SP fue 28.6%.

SEC-HPLC Los resultados de SEC-HPLC demostraron que la recuperación por etapas para la cromatografía SP fue de 42.9%, comparada con 62.5% de Hc-ELISA. Esto demuestra que la recuperación de toxina botulínica después de la etapa de la columna SP fue de aproximadamente 50%.

Rendimiento normalizado El rendimiento de toxina se normalizó con 22.3 mg (mediante SEC-HPLC) o 23.4 mg (mediante Hc-ELISA) por L de cultivo después de la cromatografía' de Butyl, y 9.6 mg (mediante SEC-HPLC) u 8.9 mg (mediante Hc-ELISA) por L de cultivo después de la cromatografía SP de una corrida. Así, usando el presente sistema y proceso de dos columnas descritos en la presente, entre alrededor de 50 mg a aproximadamente 90 mg del complejo de toxina botulínica pueden purificarse de cada 10 L de medio de fermentación cultivado clarificado (como se obtiene de los procesos de fermentación del ejemplo 6 o el ejemplo 72) .

TABLA 9 Concentración de toxina y equilibrio de masas en etapas de cromatografía. Butyl y SP típicas - Ejemplo 15 Proceso para la estabilización y almacenamiento de toxina en cromatografía post-columna 1 . Razones de desarrollo Después de la cromatografía en columna, se prefiere transferir el complejo de toxina botulínica purificado a un regulador de pH estable a una concentración deseada por una etapa UF/DF, seguida por la filtración estéril para obtener así una toxina adecuada para usarse en una mezcla de una composición farmacéutica de toxina botulínica. La botulina purificada se almacenó ya sea en una forma soluble en regulador de pH de acetato o como una suspensión en sulfato de amonio . 2 . Etapa UF/DF Una membrana Biomax-10 de polietansulfona (NMWCO: 10 kDa, Millipore) se usó en la etapa UF/DF. 50 mM de NaAc, pH 4.0 se seleccionaron como regulador de pH de diafiltración. El eluato de SP fue ultrafiltrado a aproximadamente 1 mg/ml, después diafiltrado con 8 volúmenes de diafiltración (DV) de 50 mM de NaAc, pH 4.0. La ultrafiltración (UF) es un proceso para separar partículas extremadamente pequeñas y moléculas disueltas de fluidos . La base primaria para la separación es el tamaño molecular aunque factores secundarios tales como la forma de la molécula y la carga pueden jugar papel. Los materiales que varían en tamaño de 1,000 a 1,000,000 de peso molecular se conservan por membranas ultrafiltradoras, mientras que las sales y agua pasan a través . La materia coloidal y en partículas también puede ser retenida. La diafiltración (DF) es el proceso de fraccionado que lava moléculas pequeñas a través de una membrana y deja moléculas más " grandes en ,el retenido sin finalmente "cambiar la concentración. La DF se puede usar para remover sales o reguladores de pH de intercambio. La DF también puede remover etanol u otros solventes o aditivos pequeños . Existen varias maneras de llevar a cabo la diafiltración. En la "diafiltración continua, la solución de diafiltración (agua o regulador de pH) se añade al receptáculo de alimentación de muestra a la misma velocidad que se genera el filtrado. De esta manera el volumen en el receptáculo de muestra permanece constante, pero las moléculas pequeñas (por ejemplo sales) que pueden permear libremente a través de la membrana son lavadas. Usando la remoción de sal como un ejemplo, cada volumen de diafiltración (DV) adicional reduce la concentración de sal más . (Un volumen de diafiltración es el volumen de muestra antes de que la solución de diafiltración se añada) . Usando 5 volúmenes de diafiltración se reducirá la potencia iónica en aproximadamente 99% con diafiltración continua. En la diafiltración discontinua, la solución es primero diluida y luego concentrada de nuevo al volumen de partida. Este proceso" es después repetido hasta que se alcance la concentración requerida de pequeñas moléculas (por ejemplo sales) que permanezcan en el depósito. Cada volumen de diafiltración adicional (DV) reduce la concentración de '"sal más . Un volumen de diafiltración es el volumen de ..muestra antes de que se añada la solución de dilución. _ Usando 5 volúmenes de diafiltración se reducirá la- potencia iónica en aproximadamente 96% con diafiltración discontinua. -- -'La diafiltración discontinua requiere de menos volumen de - filtrado para lograr el mismo grado de reducción de sal que en la diafiltración discontinua. 3 . Etapa de fil tración 0.22 um El filtro de parte superior de botella al vacío de baja unión de proteína de 0.22 um de acetato de celulosa (CA) se seleccionó para. la etapa de filtración. 4 . Etapa de precipi tación en sulfato de amonio Después se llevó a cabo la precipitación en sulfato de amonio: 3.5 M de sulfato de amonio se añadieron a la solución de toxina filtrada de 0.22 µm hasta que la primera apariencia de opalescencia. La toxina general purificada después se almacenó a 2-8SC. 5. Resul tados de un proceso post-columna típico El eluato de SP se concentró de 70.5 ml a 18 ml usando Pellicon Biomax-10 (área de superficie 50 cm2, Millipore) en un sistema TFF a escala de laboratorio (Millipore) y se diafiltró con 8DV de NaAc 50 mM, pH 4.0. El retenido (fracción post-UF/DF) se recogió y luego se filtró con un filtro de CA 0.22 µm de Corning (Corning 431154). El sistema UF/DF se enjuagó con regulador de pH de acetato. La fracción de enjuague se recogió. Diez ml del filtrado post 0.22 µm se almacenaron a 2-8aC para estudios de estabilidad. Ocho ml de filtrado se sometieron a precipitación con sulfato de amonio. Un total de 2.8 ml de sulfato de amonio de 3.5 M se añadieron al filtrado hasta que se hiciera opalescente. La recuperación de toxina se calculó con base en medición UV, lo cual se muestra en la tabla 10. los resultados de SDS-PAGE se muestran en la figura 4. En la figura 6 las líneas mostradas representan: Línea 1 es M12, estándares de peso molecular Línea 2 es eluato de columna SP Línea 3 es retenido de UF/DF: retenido UF/DF después de UF/DF del eluato SP, diluido a la misma cantidad de proteína cargada que línea 2 , para la comparación la línea 4 es solución de enjuague UF/DF a partir de enjuagar la membrana UF/DF después de la conclusión de la membrana UF/DF La línea 5 es la filtración de 0.2 µm; después del proceso UF/DF y después de que la muestra se filtrara con el filtro 0.22 µm La línea 6 es la suspensión de sulfato de amonio post-columna; después de 0.22 µm de filtración, la muestra se precipitó con sulfato de amonio debido a que el complejo de toxina botulínica es estable en sulfato de amonio Línea 7 es el retenido UF/DF (igual que línea 3), pero no diluido, para mostrar los detalles. La figura 6 indica que las etapas de proceso de purificación post-columna de UF/DF, filtración 0.22 µm y precipitación con sulfato de amonio no afectan la pureza de complejo de toxina botulínica,- como se determina por análisis SDS-PAGE. De manera significativa, los resultados MLD50 mostraron que la potencia del complejo de toxina botulínica global purificado fue de 2.9-3.7 x 107 MLD50 unidades/mg.

Tabla 10 Recuperación de toxina a base de la medición UV *a partir de 8 ml de fracción post filtración. La figura 7 es una gráfica de flujo de un método cromatográfico de dos columnas libre de proteínas animales y preferido para purificar un complejo de toxina botulínica tipo A. Este es un proceso robusto escalable y que cumple con cGMP para obtener un complejo de Clostridium botulinum purificado de 900 kDa. En la figura 7 se puede notar que el eluato de butilo es acondicionado para cromatografía de intercambio iónico por una dilución de 5 veces con regulador de pH de citrato de sodio pH 4. El proceso de la figura 7 también se puede usar para obtener toxina botulínica pura (es decir, toxina botulínica de 150 kDa libre de las proteínas de complejo no toxina) al cargar el eluyente de la columna SP sobre una columna de intercambio iónico en un regulador de pH 8 para disociar las proteínas de complejo no toxina de la molécula - de toxina botulínica de 150 kDa, proporcionando así (en el paso de flujo de la columna) una toxina botulínica tipo A (componente neurotóxico) con un peso molecular de aproximadamente 150 kD, y una potencia específica de 1-2 X 108 LD50 U/mg o más. Este proceso también se puede usar para obtener otros componentes que no sean toxina de complejo de toxina botulínica (es decir, proteínas de hemaglutinina que no sean toxina y/o proteínas que no sean hemaglutinina y no sean toxina) al disociar el complejo en sus componentes y luego purificar los componentes disociados. El complejo de toxina purificada obtenido por este proceso -satisface o excede las especificaciones descritas en la tabla 1. Además, el rendimiento típico fue de alrededor de 100 mg de complejo de toxina de 900 kDa a partir de un cultivo de célula de 10 L, lo cual es más alto que el rendimiento obtenido de un proceso de Schantz (no APF) . Las ventajas de la presente invención incluyen: 1. Ningún componente o sustancia derivado de fuente animal se usa en el proceso. Específicamente, se eliminan el uso de DNasa y RNasa. 2. Más de aproximadamente 50 mg por complejo de toxina botulínica purificada tipo A con las características mostradas en la tabla 1 pueden obtenerse por 10 litros de medio de fermentación. 3. La toxina purificada se obtiene a partir de un proceso que es robusto, escalable, validable y que cumple con cGMP. Robusto significa que el proceso se puede reproducir incluso después de un cambio de alrededor de ± 10% en uno o más de los procesos y de los parámetros del proceso. Validable significa que el proceso produjo consistentemente toxina purificada con las características de la tabla 1. cGMP significa que el proceso puede convertirse fácilmente en un proceso de fabricación que cumpla .con las prácticas de fabricación adecuada . actuales requeridas por la FDA. 4. La potencia del complejo de toxina botulínica purificado final satisface o excede la potencia (como se determina por el ensayo MLD50) de un complejo de toxina botulínica purificado obtenido a partir de un proceso de Schantz o de Schantz modificado. 5. La eliminación de cualquier etapa de precipitación para purificar un complejo de toxina botulínica. Varias publicaciones, patentes y/o referencias han sido citadas en la presente cuyos contenidos, en sus totalidades, se incorporan aquí a manera de referencia. Aunque la presente invención ha sido descrita en detalle con respecto a ciertos métodos preferidos, otras modalidades, versiones y modificaciones dentro del alcance de la presente invención son posibles. Por ejemplo, una amplia variedad de sistemas y procesos libres de productos animales (incluyendo procesos de purificación de toxina botulínica cromatográficos) están dentro del alcance de la presente invención. En consecuencia, el espíritu y alcance de las siguientes reivindicaciones no debe ser limitado a las descripciones de las modalidades preferidas mostradas arriba. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un proceso para purificar un complejo de toxina de Clostridium, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de un cultivo de fermentación de toxina botulínica; (b) poner en contacto una primera resina de columna de cromatografía con la muestra de cultivo para permitir así la captura de una toxina botulínica por la primera columna; (c) eluir la toxina botulínica de la primera columna y (d) cargar una segunda resina de columna de cromatografía ' en columna con el eluyente dé la primera columna de cromatografía, obteniendo de esta manera una toxina botulínica purificada.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera columna de cromatografía y la segunda columna de cromatografía son columnas diferentes, y las dos columnas diferentes actúan para purificar una toxina botulínica a través de diferentes mecanismos de purificación.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera columna de cromatografía es una columna de interacción hidrofóbica.

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la segunda columna de cromatografía es una columna de intercambio iónico.

5. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además después de la etapa de poner en contacto y antes de la etapa de elución, la etapa de lavar impurezas de la primera columna.

6. El proceso de confor idad - con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además después de la etapa de carga, la etapa de lavar impurezas de la segunda columna.

7. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende además después de la etapa de lavar impurezas de la segunda columna, la etapa de eluir la toxina botulínica de la segunda columna.

8. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el proceso es un proceso sustancialmente libre de proteínas animales ("APF").

9. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un proceso esencialmente APF.

10. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un proceso APF.

11. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cultivo de fermentación de toxina botulínica resulta de un proceso sustancialmente APF. Í2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cultivo de fermentación de toxina botulínica resulta de un proceso esencialmente APF. 13. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cultivo de fermentación de toxina botulínica resulta de un proceso APF. 14. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el rendimiento de toxina botulínica purificada "es de más de aproximadamente 50 mg por lote por cada 10 litros de cultivo de fermentación de toxina botulínica. 15. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la toxina botulínica purificada tiene las siguientes características: (a) una apariencia como una suspensión blanca a blanquecina; (b) una concentración de 2.0 - 3.6 mg de complejo de toxina botulínica por ml de eluyente; (c) la relación de absorbancia a 260 nm a absorbancia a 278 nm (A260/A278) es menor que o igual a 0.6; (d) una potencia específica en unidad/mg MLD50 de entre 2.4 x 107 a 5.9 x 107 unidades MLD50 por mg de la toxina botulínica purificada; (e) una identidad inmunológica para el complejo de neurotoxina botulínica tipo A; (f) una característica de SDS-PAGE que se conforma al parámetro; (g) una característica de SEC-HPLC de un complejo de toxina de 900 kDa de > 95% del pico total y (h) el proceso es robusto, escalable, validable y/o cumple con cGMP. 16. Una toxina botulínica purificada, caracterizada porque se obtiene mediante el proceso de conformidad con la reivindicación 1. 17. Un proceso APF para purificar una toxina botulínica, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de un cultivo de fermentación de toxina botulínica, en donde el cultivo de fermentación de toxina botulínica resulta de un proceso, sustancialmente APF; (b) poner en contacto una resina de columna de cromatografía de interacción hidrofóbica con la muestra de cultivo para permitir así la captura de una toxina botulínica por la primera columna; (c) lavar las impurezas de la columna de cromatografía de interacción hidrofóbica; (d) eluir la toxina botulínica de la columna de interacción hidrofóbica; (e) cargar una resina de columna de cromatografía en columna de intercambio iónico con el eluyente de la columna de cromatografía de interacción hidrofóbica; (f) lavar las impurezas de la columna de cromatografía de intercambio iónico, y (g) eluir la toxina botulínica de la columna de cambio de iones, obteniendo de esta manera una toxina botulínica purificada a través de un proceso para purificar una toxina botulínica que es un proceso de purificación sustancialmente APF. 18. El proceso APF de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende además, después de la etapa de obtener una muestra de un cultivo de fermentación de toxina botulínica y antes de la etapa de poner en contacto una resina de columna de cromatografía de interacción hidrofóbica con la muestra de cultivo, la etapa de acondicionar el cultivo clarificado para cromatografía de interacción hidrofóbica. 19. El proceso APF de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende además, después de la etapa de eluir la toxina botulínica de la columna de interacción hidrofóbica y antes de la etapa de cargar una resina para columna de cromatografía de columna de intercambio iónico con el eluyente de la columna de cromatografía de interacción hidrofóbica, la etapa de acondicionar el eluyente a partir de la columna de interacción hidrofóbica para la cromatografía de intercambio iónico. 20. Un proceso APF para purificar una toxina botulínica, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de un cultivo de fermentación de toxina botulínica, en donde el cultivo de fermentación de toxina botulínica resulta de un proceso sustancialmente APF; (b) acondicionar el cultivo clarificado para cromatografía de interacción hidrofóbica; (c) poner en contacto una resina para columna de cromatografía de interacción hidrofóbica con la muestra de cultivo para permitir así la captura de una toxina botulínica por la primera columna; (d) lavar las impurezas de la columna de cromatografía de interacción hidrofóbica; (e) eluir la toxina botulínica de la columna de interacción hidrofóbica; (f) acondicionar el eluyente proveniente de la columna de interacción hidrofóbica para la cromatografía de intercambio iónico; (g) cargar una resina para columna de cromatografía en columna de intercambio iónico con el eluyente acondicionado proveniente de la columna de cromatografía de interacción hidrofóbica; (h) lavar las impurezas de lacromatografía de columna de intercambio iónico; y (i) eluir la toxina botulínica de la columna de intercambio iónico, obteniendo de esta manera una toxina botulínica purificada a través de un proceso para purificar una toxina botulínica que es un proceso de purificación sustancialmente APF. 21. Un sistema para purificar una toxina de Clostridium, caracterizado porque- comprende: (a) una primera resina de columna de cromatografía para capturar una toxina botulínica proveniente de un cultivo de fermentación; (b) un regulador de pH de elución para eluir. la toxina botulínica de la primera columna; (c) una segunda resina de columna de cromatografía en columna para capturar una toxina botulínica de un eluyente proveniente de la primera columna de cromatografía y (d) un segundo regulador de pH de elución para eluir la toxina botulínica de la segunda columna de cromatografía.