MXPA06009853A

MXPA06009853A - Medios para bacteria de clostridium y procesos para obtener una toxina clostridial.

Info

Publication number: MXPA06009853A
Application number: MXPA06009853A
Authority: MX
Inventors: Ping Wang; Stephen Donovan
Original assignee: Allergan Inc
Priority date: 2005-03-03
Filing date: 2005-03-03
Publication date: 2007-03-29
Also published as: AU2005327457B2; JP4913074B2; IL227909A0; BRPI0508374A; WO2006096164A1; US7354740B2; JP2008531046A; US20130171716A1; US20220144887A1; IL241873A0; IL177468A0; US20210222142A1; JP5006803B2; US20210079370A1; EP1853623A1; US20140178966A1; EP1853622A1; CN1930186A; CA2556796C; CA2556537A1

Abstract

Se describen medios libres de productos de origen animal (AFP) y procesos para el cultivo y fermentacion de bacterias de Clostridium botulinum productoras de toxina botulinica. La toxina botulinica obtenida puede usarse para formular y mezclar composiciones farmaceuticas de toxina botulinica. Los medios APF pueden contener niveles sustancialmente reducidos de subproductos carnicos o lacteos y usar productos no a base de animales en lugar de los productos derivados de animales. De preferencia, los medios APF usados estan sustancialmente libres o libres de productos derivados de animales.

Description

MEDIOS PARA BACTERIA DE CLOSTRIDIUM Y PROCESOS PARA OBTENER UNA TOXINA CLOSTRIDIAL Campo de la invención La presente invención se refiere a medios y procesos para obtener toxina botulínica biológicamente activa. En particular, la presente invención se refiere a medios sustáncialmente libres de productos animales, cultivo y procesos de fermentación anaeróbicos de un organismo, tal como una bacteria de Clostridium botulinum, para obtener toxina botulínica biológicamente activa y abundante.

Antecedentes de la invención Una composición farmacéutica adecuada para su administración a un humano o a un animal para un propósito terapéutico, de diagnóstico, investigación o cosmético puede comprender un ingrediente activo. La composición farmacéutica puede incluir también uno o más excipientes, reguladores de pH, vehículos, estabilizadores, conservadores y/o agentes de volumen. El ingrediente activo en una composición farmacéutica puede ser un material biológico tal como una toxina botulínica. El ingrediente activo de toxina botulínica usado para hacer una composición farmacéutica de toxina botulínica puede obtenerse a través de un 'proceso de cultivo, fermentación y mezclado de varias etapas que haga REF.? 175040 uso de uno o más productos derivados de animales (tales como caldo de carne e ingredientes de caseína en uno o más de los medios de cultivo y fermentación usados para obtener una toxina botulínica global, y una fracción de sangre o excipiente de derivado hemático en la composición farmacéutica de toxina botulínica mezclada final) . La administración a un paciente de una composición farmacéutica en la que el material biológico ingrediente activo se obtiene a través de un proceso que hace uso de productos derivados de animales puede someter al paciente a un riesgo potencial para recibir varios patógenos o agentes infecciosos. Por ejemplo, pueden estar presentes priones en una composición farmacéutica. Un prión es una partícula infecciosa proteinácea que se hipotetiza se origina como una isoforma conformacional anormal a partir de la misma secuencia de ácido nucleico que hace a la proteína normal . Se ha creado además la hipótesis de que la infectividad reside en una "reacción de reclutamiento" de la proteína de isoforma normal a la isoforma de proteína prión a un nivel post-traduccional. Aparentemente la proteína celular endógena normal se induce a una replicación inadecuada en una conformación priónica patógena. La enfermedad de Creutzfeldt-Jacob es un raro trastorno neurodegenerativo de encefalopatía espongiforme transmisible por humanos en donde el agente transmisible es aparentemente una isoforma anormal de una proteína prión. Un individuo con una enfermedad de Creutzfeldt-Jacob puede deteriorarse de aparentemente una perfecta salud a un mutismo acinético dentro de seis meses. Así, puede existir un riesgo potencial de adquirir una enfermedad mediada por priones, tal como enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, a partir de la administración de una composición farmacéutica que contenga un material biológico, tal como una toxina botulínica, obtenido o mezclado usando productos derivados de animales-.

Toxina botulínica El género Clostridium tiene más de ciento veintisiete especies, agrupadas por morfología y función. La bacteria anaeróbica y gram positiva Clostridium botulinum produce una potente neurotoxina polipéptida, toxina botulínica, que causa una enfermedad neuroparalítica en humanos y animales conocida como botulismo. La Clostridium botulinum y sus esporas se encuentran comúnmente en suelo y la bacteria puede crecer en recipientes de alimentos inadecuadamente esterilizados y sellados de fábricas caseras de conservas o enlatados, los cuales son la causa de muchos de los casos de botulismo. Los efectos de botulismo típicamente aparecen 18 a 36 horas después de comer los alimentos infectados con un cultivo o esporas de Clostridium botulinum. La toxina botulínica puede pasar aparentemente inatenuada a través del revestimiento del intestino y atacar neuronas motoras periféricas. Los síntomas de intoxicación por toxina botulínica pueden progresar de dificultad para caminar, tragar y hablar a parálisis de los músculos respiratorios y muerte. - - La toxina botulínica tipo A es el agente biológico natural más letal conocido por el hombre. Aproximadamente 50 picogramos de "toxina botulínica (complejo de neurotoxina purificado) tipo A es una LD50 en ratones. Sobre una base molar, la toxina botulínica tipo A es 1.8 billones de veces más letal que la difteria, 600 millones de veces más letal" que el cianuro de sodio, 30 millones más letal que la cobrotoxina y 12 millones de veces más letal que el cólera. Singh, Cri tical Aspects of Bacterial Protein Toxins, páginas 63-84 (capítulo 4) de Natural Toxins II, editado por B.R. Singh et al., Plenum Press, Nueva York (1976) (en donde la LD50 indicada de toxina botulínica tipo A de 0.3 ng es igual a 1 U se corrige para - el hecho de que aproximadamente 0.05 ng de BOTOX® es igual a 1 unidad) . El BOTOX® es la marca comercial de un complejo de neurotoxinas de toxina botulínica tipo A purificada disponible comercialmente de Allergan, Inc., de Irvine, California. Una unidad (U) de toxina botulínica se define como la LD50 después de inyección intraperitoneal en ratones Swiss Webster hembra que pesan aproximadamente 18-20 gramos cada uno. En otras palabras, una unidad de toxina botulínica es la cantidad de toxina botulínica que mata 50% de un grupo de ratones Swiss Webster hembra. Siete neurotoxinas botulínicas inmunológicamente distintas generalmente han sido caracterizadas, éstas siendo respectivamente los serotipos A, B, Ci, D, E, F y G de neurotoxina botulínica cada uno de los cuales se distingue por neutralización con anticuerpos de tipo específico. Los diferentes serotipos de toxina botulínica varían en la especie animal que afectan y en la severidad y duración de la parálisis que inducen. Por ejemplo, se ha determinado que la toxina botulínica tipo A es 500 veces más potente, medida por la velocidad de parálisis producida en la rata, que la toxina botulínica tipo B. Además, se ha determinado que la toxina botulínica tipo B no es tóxica en primates a una dosis de 480 U/kg que es aproximadamente 12 veces la LD50 de primates para toxina botulínica tipo A. Las toxinas botulínicas aparentemente se unen con alta afinidad a las neuronas motoras colinérgicas, son translocadas a la neurona y bloquean la liberación presináptica de acetilcolina. Las toxinas botulínicas han sido usadas en escenarios clínicos para el tratamiento de, por ejemplo, trastornos neuromusculares caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos . La toxina botulínica tipo A ha sido aprobada por la Oficina de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos para el tratamiento de blefaroespas o esencial, estrabismo y espasmo he ifacial en pacientes de más de doce años, para el tratamiento de distonía cervical y para el tratamiento de arrugas en línea glabelar (faciales) . La FDA también ha aprobado una toxina botulínica tipo B para el tratamiento de distonía cervical . Los efectos clínicos de la inyección periférica (es decir, intramuscular o subcutánea) de toxina botulínica tipo A normalmente se observan a la semana de inyección, y comúnmente a las pocas horas después de la inyección. La duración típica del alivio sintomático (es decir, parálisis de músculos flácidos) a partir de una sola inyección intramuscular de toxina botulínica tipo A puede ser de aproximadamente tres meses a aproximadamente seis meses. Aunque todos los serotipos de toxinas botulínicas aparentemente inhiben la liberación del neurotransmisor acetilcolina en la unión neuromuscular, lo hacen al afectar proteínas neurosecretoras diferentes y/o cortar esas proteínas en diferentes sitios. La toxina botulínica A es una endopeptidasa de zinc que puede hidrolizar específicamente un enlace péptido de la proteína intracelular y asociada a vesículas SNAP-25. La toxina botulínica tipo E también corta la proteína asociada sinaptosómica de 25 kiloDaltons (kD) (SNAP-25) , pero se dirige a diferentes secuencias de aminoácidos dentro de esta proteína, en comparación con la toxina botulínica tipo A. Las toxinas botulínicas tipos B, D, F y G actúan en proteína asociada a vesículas (VAMP, también llamada sinaptobrevina) , con cada serotipo cortando la proteína en un sitio diferente. Finalmente, la toxina botulínica tipo Ci ha mostrado cortar tanto sintaxina como SNAP-25. Estas diferencias en el mecanismo de acción" pueden afectar" la relativa potencia y/o duración de acción de los diferentes serotipos de toxina botulínica. No obstante el serotipo, el mecanismo molecular de intoxicación por toxina parece ser similar e implicar al menos tres etapas o pasos. En la primer etapa del proceso, la toxina se une a la membrana presináptica de la neurona objetivo a través -de una interacción específica entre la cadena pesada (cadena H) y un receptor de la superficie celular; se cree que el receptor es diferente para cada serotipo de toxina botulínica. El segmento final carboxilo de la cadena H, Hc, parece ser importante para dirigir la toxina a la superficie celular. En la segunda etapa, la toxina cruza la membrana de plasma de la célula envenenada. La toxina es primero envuelta por la célula a través de endocitosis mediada por receptor, y un endosoma que contiene la toxina se forma. La toxina escapa después del endosoma al interior del citoplasma de la célula. Esta última etapa se cree que es mediada por el segmento de extremo amino de la cadena H, HN, el cual desencadena un cambio en conformación de la toxina en respuesta a un pH de aproximadamente 5.5 o menos. Se sabe que los endosomas poseen una bomba de protones que reduce el pH intra endosómico. El desplazamiento en conformación expone residuos hidrofóbicos en la toxina, lo cual permite que la toxina se inserte a sí misma en la membrana endosó ica. La toxina se transporta después a través de la membrana éndosómica al interior del citosol. La última etapa del mecanismo de actividad de la toxina botulínica parece incluir la reducción del enlace disulfuro que une la cadena H y L. La actividad tóxica completa de la botulina y toxinas botulínicas está contenida en la cadena L de la holotoxina; la cadena L es una endopeptidasa de zinc (Zn++) que corta selectivamente proteínas esenciales para el reconocimiento y portación de vesículas que contienen neurotransmisores con la superficie citoplásmica de la membrana de plasma, y la fusión de las vesículas con la membrana de plasma. La neurotoxina botulínica, toxina botulínica B, D, F y G causa la degradación de sinaptobrevina (también llamada proteína de membrana asociada a vesículas (VAMP) ) , una proteína de membrana sinaptosómica. La mayoría de la VAMP presente en la superficie citosólica de la vesícula sináptica es retirada como resultado de cualquiera de estos eventos de corte. Cada toxina corta específicamente un enlace diferente.

El peso molecular de la molécula de proteína de toxina botulínica, para todos los siete serotipos de toxina botulínica conocidos, es de aproximadamente 150 kD. De manera interesante, las toxinas botulínicas son liberadas por bacterias clostridiales como complejos que comprenden la molécula de proteína de toxina botulínica de 150 kD junto con una o más proteínas no tóxicas asociadas. Así, el complejo de toxina botulínica tipo A puede producirse por una bacteria clostridial como formas de 900 kD, 500 kD y 300 kD. Los tipos de toxina botulínica B y Ci se producen aparentemente como un complejo de sólo 500 kD. La toxina botulínica tipo D se produce como complejos tanto de 300 kD como de 500 kD." Finalmente, las toxinas botulínicas tipos E y F se producen como complejos de sólo aproximadamente 300 kD. Se cree que los complejos (es decir, con un peso molecular de más de aproximadamente 150 kD) contienen una proteína de hemaglutinina no tóxica y una proteína que no es hemaglutinina que no es toxina y no es tóxica. Así, un complejo de toxina botulínica puede comprender una molécula de toxina botulínica (el componente neurotóxico) y una o más proteínas de hemaglutinina no tóxicas y/o proteínas que no son hemaglutinina y no son toxinas (éstas últimas pueden ser referidas como proteínas NTNH) . Estos dos tipos de proteínas que no son toxina (las cuales junto con la molécula de toxina botulínica pueden comprender el complejo de neurotoxinas relevante) pueden actuar para proporcionar estabilidad contra la desnaturalización a la molécula de toxina botulínica y protección contra ácidos digestivos cuando la toxina sea ingerida. Además, es posible que los complejos de toxina botulínica más grandes (de más de aproximadamente .150 kD de - peso molecular) puedan dar como resultado una velocidad de difusión más lenta de la toxina botulínica lejos de un sitio de inyección intramuscular de un complejo de toxina botulínica. Los complejos de toxina botulínica pueden 0 disociarse en proteínas de toxina y proteínas de . "hemaglutinina al tratar el complejo con glóbulos rojos a un . pH de 7.3 o al someter el complejo a un proceso de separación, tal como cromatografía en columna, en un regulador de pH adecuado a un pH de aproximadamente 7-8. La 5 proteína de toxina botulínica tiene una marcada inestabilidad después de la remoción de proteína de hemaglutinina. Todos los serotipos de toxina botulínica son hechos por bacterias Clostridium botullinum nativas como proteínas de cadena individual inactivas las cuales deben ser cortadas o melladas por proteasas para volverse neuroactivas . Las cepas bacterianas que hacen los serotipos A y G de toxina botulínica poseen proteasas endógenas y los serotipos A y G pueden por lo tanto recuperarse de cultivos bacterianos predominantemente en su forma activa. En contraste, los serotipos Ci, D y E de toxina botulínica se sintetizan por cepas no proteolíticas y son por lo tanto típicamente inactivados cuando se recuperan de cultivo. Los serotipos B y F se producen por cepas tanto proteolíticas como no proteolíticas y por lo tanto pueden recuperarse ya sea en la forma activa o inactiva. Sin embargo, incluso las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, el serotipo de toxina botulínica tipo B sólo cortan una porción de la toxina producida. La proporción exacta de moléculas melladas a no melladas depende de la longitud de incubación y de la temperatura de cultivo. - Por lo tanto, cierto porcentaje de cualquier preparación de, por ejemplo, la toxina botulínica tipo B es probable que sea inactivo, posiblemente debido a la potencia significativamente más baja conocida de la toxina botulínica tipo B en comparación con la toxina botulínica tipo A. La presencia de moléculas de toxina botulínica inactivas en una preparación clínica contribuirá a la carga proteica total de la preparación, lo cual ha estado ligado a una antigenicidad incrementada, sin contribuir a su eficacia clínica. Además, se sabe que la toxina botulínica tipo B tiene, luego de la inyección intramuscular, una duración de actividad más corta y también es menos potente que la toxina botulínica tipo A al mismo nivel de dosis . Estudios in vi tro han indicado que la toxina botulínica inhibe la liberación inducida por cationes de potasio tanto de acetilcolina como de norepinefrina a partir de cultivos de células primarias de tejido de tallo cerebral. Además, se ha reportado que la toxina botulínica inhibe la liberación evocada tanto de glicina como de glutamato en cultivos primarios de neuronas de la espina dorsal y que preparaciones de sinaptosomas cerebrales la toxina botulínica inhibe la liberación de cada uno de los neurotransmisores acetilcoliná, dopamina,_ norepinefrina, CGRP y glutamato'. La toxina botulínica para usarse en una composición farmacéutica puede obtenerse mediante la fermentación anaeróbica de Clostridium botulinum usando una versión modificada del bien conocido proceso de Schantz (véase, por ejemplo, Schantz E.J., et al., Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 Mar;56 (1) : 80-99; Schantz E.J., et al., Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment, capítulo 3 en Jankovic J, ed. Neurological Disease and Therapy, Therapy with botulinum toxin (1994), Nueva York, Marcel Dekker; 1994, páginas 41-49,' y; Schantz E.J. et al., Use of cristaline type A botulinum toxin in medical research, en: Lewis GE Jr. Ed. Biomedical Aspects of Botulism (1981) Nueva York, Academic Press. Las toxinas botulinicas (la molécula de 150 kilodaltons) y los complejos de toxinas botulínicas (300 kDa a 900 kDa) pueden obtenerse de, por ejemplo, List Biological Laboratories, Inc., Campbell, California; the Centre for Applied Microbiology and Research, Portón Down, Reino Unido; Wako (Osaka, Japón) , así como de Sigma Chemicals de San Luis, Missouri. Las composiciones farmacéuticas que contienen toxina botulínica disponibles comercialmente incluyen BOTOX® (complejo de neurotoxina purificado de toxina botulínica tipo A con albúmina de suero humano y cloruro de sodio) disponible de Allergan, Inc., de Irvine, California en frascos de 100 unidades como un polvo liofilizado que será reconstituido con cloruro de sodio al 0.9% antes de usar), Dysport® (complejo de toxina tipo A de Clostridium botulinum y hemaglutinina con albúmina de suero humano y lactosa en la composición farmacéutica de toxina botulínica) , disponible de Ipsen Limited, Berkshire, Reino Unido, como un polvo que será reconstituido con cloruro de sodio al 0.9% antes de usar) y MyoBioc™ (una solución inyectable que comprende toxina botulínica tipo B, albúmina de suero humano, succináto de sodio y cloruro de sodio a un pH de aproximadamente 5.6, disponible de Solstice Neurosciences (anteriormente disponible de Elan Corporation, Dublín, Irlanda) de San Diego, California. El éxito de la toxina botulínica tipo A para tratar una variedad de condiciones clínicas ha llevado a interés en otros serotipos de toxina botulínica. Así, al menos las toxinas botulínicas tipos A, B, E y F han sido usadas clínicamente en humanos. Además, una toxina botulínica pura (aproximadamente 150 kDa) ha sido usada para tratar humanos.

Véase, por ejemplo, Col A.,- et al., Comparison of the effect of botulinum toxin A (Botox (R) ) wi th the highly-purified neurotoxin (NT 201) in th extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000; 15(Suppl 3):165. Por consiguiente, se puede preparar una composición farmacéutica de toxina botulinica usando una toxina botulínica pura (de aproximadamente 150 kDa) , a diferencia de usar un complejo de toxinas botulínicas . Se sabe que la toxina botulínica tipo A es soluble en soluciones acuosas diluidas a un pH de 4-6.8. A un pH de más de aproximadamente 7 las proteínas no tóxicas estabilizadoras se disocian de la neurotoxina, dando como resultado una pérdida gradual de toxicidad, particularmente al elevarse el pH y la temperatura. Schantz E.J., et al. Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment (en particular páginas 44-45) , siendo el capítulo 3 de Jankovic, J. , et al, Therapy with Botulinum toxin, Marcel Dekker, Inc (1994) . Al igual que con las enzimas generalmente, las actividades biológicas de las toxinas botulínicas (las cuales son peptidasas intracelulares) depende, al menos en parte, de su conformación tridimensional. De esta manera, la toxina botulínica tipo A es destoxificada por calor, estiramiento de superficie por varios químicos y secado de superficie.

Además, se conoce que la dilución del complejo de toxinas obtenido por el cultivo, fermentación y purificación conocidos hasta las concentraciones mucho, mucho más bajas usadas para la formulación de composiciones farmacéuticas da como resultado una rápida destoxificación de la toxina a menos que esté presente un agente de estabilización adecuado. La dilución de la toxina a partir de cantidades en miligramos hasta una solución que contiene nanogramos por mililitro presenta dificultades significativas debido a la pérdida de toxicidad específica después de esta gran dilución. Ya que la toxina puede usarse meses o años después de que se formule la composición farmacéutica que contiene toxina, la toxina puede estabilizarse con un agente estabilizador tal como albúmina y gelatina. Se ha reportado que una toxina botulínica ha sido usada en varios escenarios clínicos, incluyendo los siguientes : (1) aproximadamente 75-125 unidades de BOTOX® por inyección intramuscular (varios músculos) para tratar distonía cervical; (2) 5-10 unidades de BOTOX® por inyección intramuscular para tratar líneas glabelares (surcos en las cejas) (5 unidades inyectadas intramuscularmente en el músculo procero y 10 unidades inyectadas intramuscularmente en cada músculo de las cejas corrugadoras ) ; (3) aproximadamente 30-80 unidades de BOTOX® para tratar constipación mediante inyección intraesfínter del músculo puborrectal; (4) aproximadamente 1-5 unidades por músculo de BOTOX® inyectado intramuscularmente para tratar blefaroespas o al inyectar el músculo ocular orbicular pre- tarsal lateral del párpado superior y los óculos orbiculares pre-tarsal laterales del párpado inferior. (5) para tratar estrabismo, músculos extraoculares han sido inyectados intramuscularmente con entre alrededor de 1-5 unidades de BOTOX®, la cantidad inyectada variando con base tanto en el tamaño del músculo que será inyectado como el grado de parálisis muscular deseado (es decir, cantidad de corrección dióptera deseada) . (6) Para tratar espasticidad de las extremidades superiores luego de una embolia por inyecciones intramusculares de BOTOX® en cinco músculos flexores de extremidades superiores diferentes, como sigue: (a) digi torum profundus flexor: 7.5 U a 30 U (b) digi torum sublimus flexor: 7.5 U a 30 U (c) carpí ulnaris flexor: 10 U a 40 U (d) carpí radialis flexor: 15 U a 60 U (e) braquias del bíceps: 50 U a 200 U. Cada uno de los cinco músculos indicados ha sido inyectado en la misma sesión de tratamiento, de tal forma que el paciente reciba de 90 U a 360 U de músculo flexor de extremidad superior de BOTOX® medíante inyección intramuscular en cada sesión de tratamiento. (7) Para tratar migraña, una inyección inyectada pericraneal (inyectada simétricamente en músculos glabelares, frontales y temporales) de 25 U de BOTOX® ha demostrado un beneficio significativo como un tratamiento profiláctico de migraña en comparación con vehículo medido por mediciones reducidas de frecuencia de migraña, severidad máxima, vómito asociado y medicación aguda durante el periodo de tres meses después de la inyección de 25 U. Se sabe que la toxina botulínica tipo A puede tener una eficacia durante hasta 12 meses {European J. Neurology 6 (Supp 4): S111-S1150 :1999) , y en algunos casos durante hasta 27 meses. The Laryngoscope 109:1344-1346:1999. Sin embargo, la duración normal de inyección intramuscular de Botox® es de típicamente de alrededor de 3 a 4 meses . Una composición farmacéutica que contiene toxina botulínica comercialmente disponible se vende con la marca comercial BOTOX® (disponible de Allergan, Inc., de Irvine, California) . BOTOX® consiste en un complejo de toxina botulínica tipo A purificado, albúmina de suero humano y cloruro de sodio empacado en una forma estéril y secada al vacío. La toxina botulínica tipo A se hace a partir de' un cultivo de la cepa Hall de Clostridium botulinum cultivada en un medio que contiene N-Z amina caseína y extracto de levadura. El complejo de toxina botulínica tipo A se purifica de la solución de cultivo por medio de una serie de precipitaciones con ácido o de precipitaciones con ácido y etanol para cristalizar un complejo que consista en la proteína de toxina activa con alto peso molecular y una proteína de hemaglutinina asociada. El complejo cristalino es redisuelto en una solución que contiene salina y albúmina y se filtra estérilmente (0.2 mieras) antes del secado al "vacío. El BOTOX® puede reconstituirse con solución salina estéril y no preservada antes de la inyección intramuscular.

'Cada frasco de BOTOX® contiene aproximadamente 100 unidades (U) de complejo de toxina botulínica tipo A de Clostridium botulinum, 0.5 miligramos de albúmina de suero humano y 0.9 miligramos de cloruro de sodio en una forma estéril y secada al vacío sin un conservador. Para reconstituir BOTOX® secado al vacío solución salina estéril normal sin un conservador (inyección de cloruro de sodio al 0.9%) se usa al extraer la cantidad adecuada de diluyente en la jeringa de tamaño adecuado. Ya que el BOTOX® se desnaturaliza mediante burbujeo o agitación violenta similar, el diluyente se inyecta suavemente en el frasco. El BOTOX® reconstituido puede almacenarse en un refrigerador (2o a 8°C) y es un líquido transparente e incoloro y libre de materia en partículas. Hay reportes de que el BOTOX® reconstituido conserva su potencia durante hasta treinta días. Véase, por ejemplo, Guttman C, Bstox retains its efficacy for blepharospasm treatment after freezing and storage, New York invest igators find, EuroTimes 2000 Nov/Dec,-5 (8) :16. El producto secado al vacío se congela en un congelador a o -5°C. En general, cuatro grupos fisiológicos de C. botulinum se reconocen (I, II, III, IV) . Los organismos capaces de producir una toxina serológicamente distinta pueden provenir de más de un grupo fisiológico. Por ejemplo, las toxinas tipo B y F pueden producirse or cepas del"' grupo I ó II. Además, se han identificado otras cepas ' de especies clostridiales (C. baratii , tipo F; C. butyricum, tipo E; C. novyi , tipo Ci o D) que pueden producir neurotoxinas de botulina. Los grupos fisiológicos de los tipos de Clostridium botulinum se listan en la tabla 1.

Tabla 1 Grupos fisiológicos de Clostridium botulinum Estos tipos de toxinas pueden producirse mediante - selección a partir del grupo fisiológico adecuado de organismos de Clostridium botulinum . Los organismos designados como grupo I normalmente son conocidos como proteolíticos y producen toxinas botulínicas de tipos A, B y F. Los organismos designados como grupo II son sacarolíticos y producen toxinas botulínicas de los tipos B, E y F. Los organismos designados como grupo III producen sólo la toxina botulínica tipo C y D y se distinguen de los organismos de los grupos I y II por la producción de ' cantidades significativas de ácido propiónico. Los organismos del grupo IV sólo producen neurotoxina de tipo G. Se conoce obtener una toxina tetánica usando medios específicos sustancialmente libres de productos animales. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. 6,558,926. Sin embargo, notablemente, incluso los medios "libres de productos animales" descritos por esta patente usan Bacto- peptona, un digestor de carne. Significativamente, la producción de toxina tetánica por Clostridium tetan! contra la producción de una toxina botulínica por una bacteria de Clostridium botulinum implica diferentes parámetros y consideraciones de crecimiento, medios y fermentación. Véase, por ejemplo, Johnson, E.A., et al., Clostridium botulinum. and its neurotoxins : a metabolic and cellular perspective, Toxicon 39 (2001), 1703-1722.

Lo que se requiere por lo tanto son medios y proceso que "estén libres o sustancialmente libres de productos animales, tales como proteínas derivadas de animales, para obtener o producir toxina botulínica biológicamente activa.

Breve descripción de la invención La presente invención satisface esta necesidad y proporciona medios y procesos que están libres o sustancialmente libres de productos animales, tales como proteínas derivadas de animales, para obtener o producir una toxina botulínica biológicamente activa. La toxina botulínica obtenida puede usarse para hacer composiciones farmacéuticas con ingrediente activo de toxina botulínica.

Definiciones Según se usa en la presente, las palabras o términos descritos a continuación tienen las siguientes definiciones . "Aproximadamente" significa que el artículo, parámetro o término calificado así abarca una gama de más o menos diez por ciento arriba y abajo del valor del artículo, parámetro o término indicado. "Administración" o "administrar" significa la etapa de dar (es decir administrar) una composición farmacéutica a un sujeto. Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente son "administradas localmente" mediante por ejemplo las rutas de administración intramuscular (i.m.), intradérmica, administración subcutánea, administración intratecal, intracraneal, intraperitoneal (i.p.),: administración tópica (transdérmica) e implantación (es decir, un dispositivo de liberación lenta tal como un implante polimérico o bomba miniosmótica) . "Libre de productos animales" o "sustancialmente libre de productos animales" abarca, respectivamente, "libre de proteínas animales" o "sustancialmente libre de proteínas animales" y significa la ausencia o ausencia sustancial de productos o compuestos derivados de la sangre, extraídos con la sangre y otros productos o compuestos derivados de animales. *Animal" significa un mamífero (tal como un humano) , ave, reptil, pez, insecto, arácnido u otra especie animal. "Animal" excluye microorganismos, tales como bacterias. Así, un medio o proceso libre de productos animales o un medio o proceso sustancialmente libre de productos animales dentro del alcance de la presente invención puede incluir una toxina botulínica o una bacteria de botulina clostridial. Por ejemplo, un proceso libre de productos animales o un proceso sustancialmente libre de productos animales significa un proceso que está ya sea sustancialmente libre o esencialmente libre o completamente libre de proteínas derivadas de animales, tales como inmunoglobulihas, digestor de carne, subproductos de carne y leche u otros productos lácteos o digestores. Así, un ejemplo de un proceso libre de productos animales es un proceso (tal como un proceso de cultivo bacteriano o de fermentación bacteriana) que excluye productos cárnicos y lácteos o subproductos cárnicos o lácteos . "Toxina botulínica" significa una neuorotoxina producida por Clostridium botulinum, así como toxinas botulínicas modificadas, recombinantes, híbridas y quiméricas . Una toxina botulínica recombinante puede tener ' la cadena ligera y/o la cadena pesada de la misma hecha recombinantemente por una especie que no sea clostridial.

"Toxina botulínica", según se usa en la presente, abarca los serotipos A, B, C, D, E, F y G de toxina botulínica. "Toxina botulínica", según se usa en la presente, abarca también tanto un complejo de toxina botulínica (es decir, los complejos de 300, 600 y 900 kDa) así como una toxina botulínica pura (es decir, la molécula neurotóxica de aproximadamente 150 kDa) , todas las cuales son útiles en la práctica de la presente invención. Una "toxina botulínica purificada" significa una toxina botulínica pura o un complejo de toxinas botulínicas que es aislado, o sustancialmente aislado, de otras proteínas e impurezas que pudieran acompañar a la toxina botulinica tal cual se obtiene de un proceso de cultivo o fermentación. De esta manera, una toxina botulínica purificada puede tener al menos 90%, de preferencia más de 95% y muy preferiblemente más de 99% de las proteínas de toxina no botulínica e impurezas removidas. Las citotoxinas botulínicas C2 y C3, que no son neurotoxinas, se excluyen del alcance de la presente invención. "Neurotoxina clostridial" significa una neurotoxina producida de, o nativa de, una bacteria clostridial, tal como Clostridium botulinum, Clostridium butyricum o Clostridium beratti , así como una neurotoxina clostridial hecha recombinantemente por una especie no clostridial . "Completamente libre" (es decir, terminología "que consiste en") significa que dentro de la escala de detección del instrumento o proceso que se esté usando, la sustancia no puede ser detectada o su presencia no puede confirmarse. "Esencialmente libre" (o "que consiste esencialmente de") significa que sólo cantidades residuales de la sustancia pueden detectarse. "Toxina botulínica modificada" significa una toxina botulínica que ha tenido al menos uno de sus aminoácidos suprimido, modificado o reemplazado, en comparación con una toxina botulínica nativa. Además, la toxina botulínica modificada puede ser una neurotoxina producida recombinantemente, o un derivado o fragmento de una neurotoxina hecha recombinantemente. Una toxina botulínica modificada conserva al menos una actividad biológica de la toxina botulínica nativa, tal como la capacidad de unirse a un receptor de toxina botulínica, o la capacidad de inhibir la liberación de neurotransmisores de una neurona. Un ejemplo de una toxina botulínica., modificada es una toxina botulínica que tiene una cadena ligera de un serotipo,. de toxina botulínica (tal como serotipo A) , y una cadena pesada de un serotipo de toxina botulínica diferente (tal como serotipo - B).. Otro ejemplo de una toxina botulínica modificada es una toxina botulínica acoplada a un neurotransmisor, tal co o sustancia P. "Paciente" significa un sujeto humano o no humano que recibe cuidado médico o veterinario. En consecuencia, como se describe en la presente, las composiciones pueden usarse para tratar cualquier animal, tal como mamíferos. "Composición farmacéutica" significa una formulación en la cual un ingrediente activo puede ser una toxina botulínica. La palabra "formulación" significa que hay por lo menos un ingrediente adicional (tal como una albúmina y/o cloruro de sodio) en la composición farmacéutica aparte de uh ingrediente activo neurotóxico. Una composición farmacéutica es por lo tanto una formulación que es adecuada para administración de diagnóstico, terapéutica o cosmética (es decir, mediante inyección intramuscular o subcutánea o mediante inserción de un depósito o implante) a un sujeto, tal como un paciente humano. La composición farmacéutica puede estar: en una condición liofilizada o secada al vacíe- una solución formada después de la reconstitución de la composición farmacéutica liofilizada o secada al vacio con solución salina o agua, o como una solución que no requiera de su reconstitución. El ingrediente activo puede ser uno de los serotipos _de toxina botulínica A, B, Ci, D, E, F o G o una toxina botulínica, todos los cuales pueden hacerse nativamente por bacterias clostridiales. Como se indicó, una composición farmacéutica puede ser líquida o sólida, por ejemplo secada al vacío. Los ingredientes constituyentes de una composición farmacéutica pueden incluirse en una sola composición (es decir todos los ingredientes constituyentes, excepto cualquier fluido de reconstitución requerido, están presentes en el momento de la mezcla inicial de la composición farmacéutica) o como un sistema de dos componentes, por ejemplo una composición secada al vacío reconstituida con un diluyente tal como solución salina, diluyente que contenga un ingrediente no presente en la mezcla inicial de la composición farmacéutica. Un sistema de dos componentes proporciona el beneficio de permitir la incorporación de ingredientes que no sean suficientemente compatibles para su almacenamiento en mostrador a largo plazo con el primer componente del sistema de dos componentes. Por ejemplo, el vehículo o diluyente de reconstitución puede incluir un conservador que proporcione protección suficiente contra crecimiento microbiano durante el periodo de uso, por ejemplo una semana de almacenamiento refrigerado, pero que no esté presente durante el periodo de almacenamiento en congelador de dos años, tiempo durante el cual podría degradar la toxina. Otros ingredientes, los cuales podrían no ser compatibles con una toxina clostridial u otros ingredientes durante largos periodos de tiempo, pueden incorporarse de esta manera, es decir, añadirse en un segundo vehículo (es decir, en el fluido de reconstitución) en el -momento de uso aproximado. Los métodos para formular una composición farmacéutica con ingrediente activo de toxina- botulínica se describen en la publicación de patente de E.U.A. 2003 0118598 Al. "Sustancialmente libre" significa presente a un nivel de menos de uno por ciento en peso de la composición farmacéutica . "Formulación terapéutica" significa una formulación que puede usarse para tratar y de esta manera aliviar un trastorno o una enfermedad, tal como un trastorno o una enfermedad caracterizado por hiperactividad (es decir, espasticidad) de un músculo periférico. La presente invención proporciona medios que comprenden al menos niveles reducidos de subproductos animales o lácteos y están de preferencia sustancialmente libres de subproductos animales o lácteos. "Subproductos animales o lácteos" significa cualquier compuesto o combinación de compuestos que se haya producido en o por una célula animal (excluyendo una bacteriana) , ya sea in vivo o in vi tro . Las fuentes no animales preferidas de ingredientes de medios tales como proteínas, aminoácidos y "nitrógeno, incluyen vegetales, microbios (tales como levadura) y compuestos sintéticos. La presente invención proporciona también métodos para obtener toxina botulínica usando al menos un medio que está sustancialmente libre de subproductos animales o lácteos. Por ejemplo, la toxina botulínica puede obtenerse ál cultivar Clostridium botulinum en un medio de fermentación que esté sustancialmente libre de productos animales'. La presente invención abarca también una toxina botulínica obtenida al cultivar Clostridium botulinum en un medio de fermentación sustancialmente de productos animales y que comprende productos derivados de vegetales. Además, una toxina botulínica puede obtenerse al cultivar Clostridium botulinum en un medio de fermentación que esté sustancialmente libre de productos animales y que comprenda algunos productos a base de soya. En otra modalidad preferida, una toxina botulínica puede obtenerse al cultivar Clostridium botulinum en un medio de fermentación sustancialmente libre de productos animales y que contenga soya hidrolizada, como un sustituto de productos derivados de animales. De preferencia, el crecimiento en un medio de fermentación procede hasta que al menos ocurra la lisis celular. La fuente de Clostridium botulinum usada para la inoculación del medio de fermentación, puede obtenerse a partir de un medio de siembra que contenga Clostridium botulinum. De preferencia, la Clostridium botulinum cultivada en un medio de siembra y usada como un inoculo para un medio de fermentación en su fase de crecimiento exponencial. La fuente de Clostridium botulinum usada para la inoculación del medio de siembra puede obtenerse de un cultivo liofil-izado. Clostridium botulinum se puede liofilizar como un cultivo en leche animal o leche de soya. De preferencia, la Clostridium botulinum se liofiliza como un cultivo en leche de soya. La presente invención proporciona también una composición que comprende un medio sustancialmente libre de productos derivados de animales para cultivar Clostridium botulinum. En una modalidad, la composición comprende un medio sustancialmente libre de productos derivados de animales que contiene al mismo tiempo al menos un producto derivado de una fuente no animal, y que comprende también una Clostridium botulinum. En otra modalidad, la composición comprende un medio sustancialmente libre de productos derivados de animales que contiene al mismo tiempo por lo menos un producto derivado de un vegetal, y que comprende también una Clostridium botulinum. Una modalidad más- de la invención puede ser una composición que comprenda un medio que esté sustancialmente libre de productos derivados de animales mientras que contenga al menos un producto derivado de frijoles de soya, y que comprenda también una Clostridium. botulinum. La presente invención incluye un método para obtener- una toxina clostridial biológicamente activa (tal como una neurotoxina botulínica en un medio APF) al: (1) proporcionar un medio de fermentación (el medio de fermentación está al menos sustancialmente libre de un producto derivado de animal y comprende entre alrededor de 4-8% en peso de un derivado de soya) ,- (2) fermentar una bacteria de Clostridium botulinum en el medio de fermentación bajo condiciones que permitan la producción en una toxina botulínica; y (3) recuperar una toxina botulínica biológicamente activa del medio de fermentación. En este método, el medio de fermentación también puede incluir entre aproximadamente 0-3% en peso de al menos un extracto de levadura y entre alrededor de 0.5 a 5% en peso de glucosa. De preferencia, el medio de fermentación incluye aproximadamente 1-2% en peso de glucosa. La etapa de fermentación puede llevarse a cabo a un pH de entre alrededor de 5.0 y 5.5, durante entre alrededor de 45 horas y aproximadamente 75 horas, a una temperatura de entre aproximadamente 33° y 36°C en una atmósfera anaeróbica. Este método para obtener una toxina clostridial biológicamente activa puede comprender las dos etapas adicionales (antes de la etapa (1) anterior de proporcionar un medio de fermentación) de (a) obtener un medio de cultivo que esté sustancialmente libre de un producto derivado de animales y que comprenda entre aproximadamente 4-8% en peso de un derivado de soya y (b) cultivar una bacteria de Clostridium botulinum en el medio de cultivo. De manera significativa, la etapa (3) en este método de recuperar una toxina botulínica biológicamente activa del medio de fermentación puede ser o incluir un proceso de purificación APF. Una modalidad detallada de este método para obtener una toxina botulínica biológicamente activa puede comprender las etapas de: (a) obtener un medio de cultivo que esté sustancialmente libre de un producto derivado de animales y que comprenda entre alrededor de 4-8% en peso de un derivado de soya y cultivar una bacteria de Clostridium botulinum en el medio de cultivo; (b) proporcionar un medio de fermentación que esté sustancialmente libre de un producto derivado de animales y que comprenda: -, - (i) entre alrededor de 4-8% en peso de un derivado de soya, (ii) entre alrededor de 0-3% en peso de un extracto de levadura, (iii) entre aproximadamente 1-2% en peso de glucosa, (c) fermentar una bacteria de Clostridium botulinum en el medio de fermentación bajo condiciones que permitan la producción de una toxina botulínica, incluyendo: (i) llevar a cabo la etapa de fermentación a un pH de entre alrededor de 5.0 y 5.5, (ii) llevar a cabo la etapa de fermentación durante entre aproximadamente 45 horas y 75 horas, (iii) llevar a cabo la etapa de fermentación a una temperatura de entre alrededor de 33° y 36°C, (iv) llevar a cabo la etapa de fermentación en una atmósfera anaeróbica, y (d) recuperar una toxina botulínica biológicamente activa del medio de fermentación, en donde la etapa de recuperación es un proceso de purificación APF. La presente invención incluye también un medio para cultivar o para fermentar una toxina botulínica, en donde el medio está sustancialmente libre de un producto derivado de animal y comprende un producto de proteína derivado de un vegetal . El medio puede comprender entre alrededor de 4-8% en peso de un derivado de soya, entre aproximadamente 0-3% en peso de un extracto de levadura y entre aproximadamente 1-2% en peso de glucosa. La presente invención abarca también un método para fabricar una composición farmacéutica sustancialmente libre de productos animales en la cual el ingrediente activo es una toxina botulínica, el método comprende las etapas de: (a) obtener una toxina botulínica biológicamente activa al: (i) proporcionar un medio de fermentación que esté sustancialmente libre de un producto derivado de animales; (ii) cultivar una Clostridium botulinum en el medio de fermentación bajo condiciones que permitan la producción de una toxina botulínica y (iii) recuperar una toxina botulínica biológicamente activa del medio de fermentación y (b) mezclar la toxina botulínica con un excipiente adecuado, haciendo de esta manera una composición farmacéutica sustancialmente libre de productos animales en la cual el ingrediente activo sea una toxina botulínica. Además, la presente invención abarca también un método para obtener una toxina botulínica biológicamente activa al : (a) proporcionar un medio de fermentación que esté sustancialmente libre de un producto derivado de animal y que comprenda entre alrededor de 4-8% en peso de un derivado de soya; (b) fermentar una bacteria de Clostridium botulinum en el medio de fermentación, en donde el medio de fermentación se mantiene a un pH de entre pH 5.0 y 5.5, y (c) recuperar una toxina botulínica biológicamente activa del medio de fermentación. ;- Finalmente, la presente invención abarca también un medio libre de proteínas animales -para cultivar y/o fermentar una .toxina de la bacteria de Clostridium botulinum. De preferencia, el medio está sustancialmente libre de un producto derivado de animal y comprende entre aproximadamente 4-8% en peso de un derivado de soya; entre aproximadamente 0-3% en peso de un extracto de levadura y entre aproximadamente 1-2% en peso de glucosa.

Breve descripción de las figuras Los aspectos de la invención se explican o se ilustran por las siguientes figuras. La figura 1 titulada "Fuente de N (es decir, HySoy más YE) % vs Potencia y pH" es una gráfica que muestra la actividad de la toxina botulínica como se determina: (1) en la dosis letal 50 (MLD 50) para ratón del eje Y del lado izquierdo (barras azules) y (2) la actividad de SNAP 25 en el eje Y del lado izquierdo (barras rojas), de varios medios APF a los tiempos de fermentación transcurridos mostrados en la parte superior de las barras, para pH de medio APF como el mostrado en el eje Y del lado derecho, para medio APF-, con la cantidad % en peso de concentrado de soya hidrolizado y concentrado de extracto de levadura como se muestra por el eje X. Todos los medios de la figura 1 también contenían 1% en peso de glucosa . La figura 2 es una gráfica de flujo de resumen que compara un proceso no APF para obtener una toxina botulínica (la mitad superior de la figura 1) con un proceso APF, dentro del alcance de la presente invención, para obtener una toxina botulínica (la mitad inferior de la figura 2) , a través de las etapas de creación, cultivo y fermentación de un banco de células . La figura 2 omite las etapas de cosecha y purificación. La figura 3 es una gráfica que compara el efecto de una concentración de proteína de soya en una producción de complejo de toxina botulínica tipo A en un proceso de fermentación APF, en donde el medio de fermentación contenía 1% en peso de glucosa y 1% en peso de un extracto de levadura. En la figura 3 el eje X representa la concentración de porcentaje en peso en el medio de fermentación de una proteína de soya hidrolizada particular (HySoy) , el eje Y del lado izquierdo representa la potencia del complejo de toxina botulínica purificado final y el -eje Y del lado derecho representa el porcentaje de lisis celular completado, como se determina por la ecuación: Lisiscelular(%) = 0Dm P«n«,ßna? ?? QQ en donde OD eoo ax corresponde a la densidad óptica medida a 600 nm en el momento de crecimiento máximo, y OD60o punto final es en el momento de la cosecha de la fermentación.

Descripción detallada de la invención • La presente invención se basa en el descubrimiento de medios y procesos que están libres o sustancialmente libres de un producto animal o un subproducto animal, útiles para el cultivo y fermentación de un organismo (tal como una bacteria de Clostridium botulinum) capaz de producir toxina botulínica biológicamente activa. La toxina botulínica obtenida puede usarse para fabricar composiciones farmacéuticas que contengan como ingrediente activo toxina botulínica. Así, se describen medios de crecimiento en la presente que tienen niveles sustancialmente reducidos de subproductos cárnicos o lácteos y modalidades de medios preferidas que están sustancialmente libres de estos productos animales.

La presente invención abarca el sorprendente descubrimiento de que los productos a base de animales no se requieren en medios para el crecimiento de Clostridium botulinum, y particularmente qué productos a base de vegetales pueden reemplazar los productos a base de animales empleados típicamente en estos medios para el crecimiento de Clostridium botulinum. Los medios que están en uso actual para el. crecimiento y fermentación de bacterias normalmente comprenden uno o más ingredientes derivados de animales, tales como carne cocida. De acuerdo con esta invención, los medios que se prefieren para el crecimiento de Clostridium botulinum contienen ingredientes derivados de animales que comprenden no más de aproximadamente cinco a aproximadamente diez por ciento del peso total de los medios. Muy preferiblemente, los medios dentro del alcance de la presente invención comprenden no más de aproximadamente uno a menos de aproximadamente cinco por ciento del peso total de los medios, de productos derivados de animales. De manera muy preferible, todos los medios y cultivos usados para el crecimiento de Clostridium botulinum para la producción de toxina botulínica están completamente libres de productos derivados de animales . Estos medios incluyen pero no están limitados a medios para la fermentación a pequeña y gran escala de Clostridium botulinum, medios para el crecimiento de cultivos de Clostridium botulinum usados para inocular los medios de siembra (primeros) y medios de fermentación (segundos) , así como medios usados para el almacenamiento a largo plazo de cultivos de Clostridium botulinum (por ejemplo, cultivos de abastecimiento) . En ciertas modalidades preferidas de la presente invención, los medios para el crecimiento de Clostridium botulinum y la producción de toxina botulínica pueden comprender productos a base de soya para reemplazar productos derivados de animales. Como alternativa, en lugar- de un producto a base de soya puede usarse una semilla désamargada de Lupinus campestris . Se conoce el contenido proteínico de la semilla de L . campestris es muy similar al de la soya. De preferencia, estos medios incluyen soya o productos derivados de L. campestris que se hidrolizan y que son solubles en agua. Sin embargo, la soya insoluble o de productos de L . campestris también se puede usar en la presente invención para reemplazar productos animales . Los productos derivados de animales comunes que pueden ser sustituidos por soya o productos de L. campestris incluyen la infusión de corazón de res (BHI) , productos de peptona derivados de animales, tales como Bacto-peptona, caseínas hidrolizadas y subproductos lácteos tales como leche animal . De preferencia, los medios que contienen productos a base de soya o de L. campestris para el crecimiento de Clostridium botulinum son similares a los medios de crecimiento usados comúnmente que contienen productos derivados de animales, excepto que sustancialmente todos los productos derivados de animales se reemplazan con productos derivados de vegetales. Por ejemplo, los medios de fermentación a base de soya pueden comprender un producto a base de soya, una fuente de carbono tal como glucosa, sales tales como NaCl y KCl, ingredientes que contengan fosfato tales como Na2HP04, KH2P0 , cationes divalentes tales como hierro y magnesio, hierro en polvo y aminoácidos tales como L-cisteína y L-tirosina. Los -medios usados para hacer crecer cultivos de Clostridium botulinum para la inoculación (es decir, el medio de siembra o el primer medio) de los medios de fermentación (segundos) contienen de preferencia al menos un producto a base de soya, una fuente de sal tal como NaCl, y una fuente de carbono tal como glucosa. La presente invención proporciona un método para el crecimiento de Clostridium botulinum que maximiza la producción de una toxina botulínica usando medios que están sustancialmente libres de productos derivados de animales. El crecimiento de Clostridium botulinum para la producción de toxina botulínica puede tener lugar mediante fermentación en medios que contengan subproductos de soya que reemplacen ingredientes derivados de subproductos animales. El inoculante para el medio de fermentación puede derivarse de un medio de crecimiento a escala más pequeña (un medio de siembra) dependiendo del tamaño y volumen de la etapa de fermentación, el número de crecimientos sucesivos en medios de siembra para incrementar la biomasa del cultivo puede variar. Para cultivar una cantidad adecuada de Clostridium botulinum para inocular el medio de fermentación, una o varias etapas que incluyan crecimiento en un medio de siembra pueden llevarse a cabo . Para un método de crecimiento de Clostridium botulinum que esté libre de productos derivados de animales, se prefiere que el crecimiento de Clostridium botulinum se origine de un cultivo almacenado en un medio no derivado de animales. El cultivo almacenado, de preferencia liofilizado, se produce mediante crecimiento en medios que contienen proteínas derivados de soya y que carecen de subproductos animales. El crecimiento de Clostridium botulinum en un medio de fermentación puede tener lugar mediante inoculación directamente de un cultivo almacenado y liofilizado. En una modalidad preferida de la presente invención, el crecimiento de Clostridium botulinum procede en crecimiento de dos fases de siembra y fermentación. Ambas de estas fases se llevan a cabo en ambientes anaeróbicos. La fase de crecimiento de siembra se usa generalmente para "escalar hacia arriba" la cantidad del microorganismo a partir de un cultivo almacenado. El propósito de la fase de crecimiento de siembra es el de incrementar la cantidad del microorganismo disponible para fermentación. Además, la fase de crecimiento de siembra permite que microbios relativamente latentes en cultivos almacenados se rejuvenezcan y crezcan para crear cultivos de crecimiento activo. Más aún, el volumen y cantidad de microorganismos viables usados para inocular el cultivo de fermentación se puede controlar en forma más precisa a partir de un cultivo que crezca en forma activa que de un cultivo almacenado. Así, se prefiere el crecimiento de un -cultivo de siembra para la inoculación del medio de fermentación. Además, puede usarse cualquier número de etapas consecutivas que incluyan crecimiento en medios de siembra para escalar hacia arriba la cantidad de Clostridium botulinum para la inoculación del medio de fermentación. Se hace notar que el crecimiento de Clostridium botulinum en la fase de fermentación puede proceder directamente a partir del cultivo almacenado mediante inoculación directa. En la fase de fermentación, una porción de un miembro de siembra o todo un medio de siembra que contiene Clostridium botulinum del crecimiento de siembra se usa para inocular un medio de fermentación. De preferencia, aproximadamente 2-4% de un medio de siembra que tiene Clostridium botulinum de la fase de crecimiento de siembra se usa para inocular el medio de fermentación. Se usa la fermentación para producir la cantidad máxima de microbios en un ambiente anaeróbico a gran escala (Ljungdahl et al., Manual of industrial microbiology and biotechnology (1986) , editado por Demain et al., American Society for Microbiology, Washington, D.C. página 84) . Una toxina botulínica puede aislarse y purificarse usando métodos de purificación de proteínas bien conocidos por aquellos expertos en la técnica de purificación de proteínas. Véase, por ejemplo, Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, Wiley & Sons; Ozutsumi et al., Appl. Environ. Microbiol. 49 ; 939-943 : 1985. Para la producción de toxina botulínica, cultivos de Clostridium 'botulinum pueden -hacerse crecer en un medio de siembra para la inoculación del medio de fermentación. El. número de etapas sucesivas que incluyen el crecimiento en un medio de siembra puede variar dependiendo de la escala de la producción de toxina botulínica en la fase de fermentación. Sin embargo, como se describió anteriormente, el crecimiento en la fase de fermentación puede proceder directamente de la inoculación a partir de un cultivo almacenado. Los medios de siembra a base de animales generalmente comprenden BHI, bacto-peptona, NaCl y glucosa para crecimiento de Clostridium botulinum . Como se describió anteriormente, de acuerdo con la presente invención, pueden prepararse medios de siembra alternativos en los cuales 'los componentes a base de animales se sustituyan con componentes no a base de animales. Por ejemplo pero sin limitación, productos a base de soya pueden sustituir BHI y bacto-peptona en el medio de siembra para el crecimiento de Clostridium botulinum y la producción de toxina botulínica. De preferencia, el producto a base de soya es soluble en agua y comprende soya hidrolizada, aunque cultivos de Clostridium botulinum pueden crecer en medios que contengan soya insoluble. Sin embargo, los niveles de crecimiento y producción de toxina subsecuentes son mayores en medios derivados de productos de soya solubles. Cualquier fuente de productos a base de soya puede usarse de acuerdo con la presente invención. De preferencia, la soya es soya hidrolizada y la hidrolización ha sido llevada a cabo usando enzimas no animales . Fuentes de soya hidrolizable están disponibles a partir de una variedad de vendedores comerciales. Éstas incluyen pero no están limitadas a Hy-Soy (Quest International) , peptona de soya (Gibco) Bac-soytone (Difco) , AMISOY (Quest), NZ soy (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7, SE50M (DMV International Nutritionals, Fraser, N.Y.) y SE50MK (DMV). Muy preferiblemente, la fuente de soya hidrolizada es Hy-Soy o SE50MK. Se conocen otras ' fuentes potenciales de soya hidrolizada. Las concentraciones de Hy-Soy en el medio de siembra de acuerdo con la presente invención varían entre 25-200 g/L. De preferencia, la concentración de Hy-Soy en el medio de siembra varía entre 50-150 g/L. En forma muy preferible la concentración de Hy-Soy en el medio de siembra es de aproximadamente 100 g/L. Además, la concentración de NaCl varía entre 0.1-2.0 g/L. De preferencia, la concentración de NaCl varía entre 0.2-1.0 g/L. Muy preferiblemente, la concentración dé NaCl _en el medio de siembra es" de aproximadamente 0.5 g/L. La concentración de glucosa varía entre 0.1 g/L y 5.0 g/L. De.-, preferencia, la concentración de glucosa varía entre ~0\5-2."0 g/L. Muy preferiblemente, la concentración de glucosa en el medio de siembra es de aproximadamente 1.0 g/L. También se prefiere pero no es necesario para la presente " invención que la glucosa sea esterilizada mediante autoclave junto con los demás componentes del medio de siembra. El nivel de pH del medio de siembra antes del crecimiento puede ' ser de 7.5-8.5.

Por ejemplo, el pH del medio de siembra antes del crecimiento de Clostridium botulinum puede ser de aproximadamente 8.1. El crecimiento de Clostridium botulinum en el medio de siembra puede proceder en una o más etapas . De preferencia, el crecimiento en el medio de siembra procede en dos etapas. En la etapa uno, un cultivo de Clostridium botulinum es suspendido en una cantidad de medio de siembra e incubada a 34+l°C durante 24-48 horas en un ambiente anaeróbico . De preferencia, el crecimiento en la etapa uno procede durante aproximadamente 48 horas. En la etapa dos, una porción o todo el medio de la etapa uno que contiene Clostridium botulinum se usa para inocular un medio de siembra de etapa dos para el crecimiento adicional. Luego de la inoculación, el medio de la etapa dos se incuba a 34±1°C durante alrededor 1-4 días también en un ambiente anaeróbico. De preferencia, el crecimiento en el medio de siembra de la etapa dos procede durante alrededor de 3 días . También es. preferible que el crecimiento en medios de siembra en cualquier etapa no dé como resultado la lisis de las células antes de la inoculación de los medios de fermentación con el crecimiento final en el medio de siembra. Los medios de fermentación estándares que contienen subproductos animales para el crecimiento de Clostridium botulinum pueden basarse en una receta de Mueller y Miller (MM; J. Bacteriol . 67:271, 1954). Los ingredientes en medios MM que contienen subproductos animales incluyen BHI y NZ-CaseTT. NZ-CaseTT es una fuente de péptidos y aminoácidos disponible comercialmente que se deriva de la digestión enzimática de caseínas, un grupo de proteínas encontradas en leche animal. La presente invención demuestra que los productos no a base de animales pueden sustituir BHI y NZ-CaseTT en medios de fermentación. Por ejemplo pero sin limitación, los productos a base de soya pueden reemplazar los componentes a base de animales de los medios MM usados para la fermentación de Clostridium botulinum. De preferencia, los productos a base de soya son hidrosolubles y derivados de soya hidrolizada, aunque como se describió anteriormente, los productos de soya insolubles también pueden usarse para llevar a la práctica la presente invención. Puede usarse de acuerdo con la presente invención cualquier fuente de productos a base de soya. De preferencia, la soya hidrolizada se obtiene de Quest International (Sheffield) con el nombre comercial Hy-Soy o de DMV International Nutritionals (Fraser, N.Y. ) con el nombre comercial SE50MK. Los productos de soya solubles también se pueden obtener de una variedad de fuentes incluyendo pero no limitadas a peptona de soya (Gibco) , Bac-soytone (Difco) , AMISOY (Quest), NZ soy (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7, y SE50MK (DMV International Nutritionals, Fraser, N.Y.). En otra modalidad preferida de la presente invención, el medio usado para la fermentación de Clostridium botulinum está libre de subproductos animales y comprende soya hidrolizada, glucosa, NaCl, Na2HP0 , MgS047H20, KH2P04, L-cisteína, L-tirosina y hierro en polvo. Como se describió para el medio de siembra, la soya hidrolizada puede reemplazar subproductos animales en el medio de fermentación. Estos subproductos animales incluyen BHI y NZ-CaseTT (caseína digerida enzimáticamente) . La concentración de Hy-Soy en el medio de fermentación para la producción de toxina botulinica varía de preferencia entre alrededor de 10-100 g/L. De preferencia, la concentración de Hy-Soy varía entre aproximadamente 20-60 g/L. Muy preferiblemente, la concentración de Hy-Soy en el medio de fermentación es de alrededor de 35 g/L. Para una producción máxima de toxina botulinica, las concentraciones de componentes en el medio de fermentación que se prefieren ^particularmente son de alrededor de 7.5 g/L de glucosa; 5.0 g/L de NaCl; 0.5 g/L de Na2HP04; 175 mg/L de KH2P04; 50 mg/L de MgS07H20; 125 mg/L de L-cisteina y 125 mg/L de L-tirosina.

La cantidad de hierro en polvo usada puede variar de 50 mg/L a 2,000 mg/L. De preferencia, la cantidad de hierro en polvo varía entre alrededor de 100 mg/L y 1,000 mg/L. De manera muy preferible, la cantidad de hierro en polvo usada en los medios de fermentación varía entre aproximadamente 200 mg/L y 600 mg/L. Para niveles óptimos de producción de toxina, el pH inicial (antes de someter a autoclave) de los medios de fermentación a base de soya varía de preferencia entre aproximadamente 5.0 a 7.1. Los presentes inventores han encontrado que el control del pH mejora la recuperación de toxina botulínica. De preferencia, el pH inicial del medio de fermentación es de aproximadamente 7. Como se explica en el ejemplo 7, los presentes inventores han encontrado que un alto rendimiento de toxina botulínica estable puede obtenerse si el pH es reducido posteriormente hasta y mantenido entre pH 5-5.5. Como se describió para el medio de siembra, los componentes del medio de fermentación, incluyendo glucosa y hierro, se someten de preferencia a autoclave juntos para su esterilización. De preferencia, una porción del medio de siembra de segunda etapa usada para el crecimiento de Clostidium botulinum se usa para inocular el medio de fermentación. La fermentación ocurre en una cámara anaeróbica a aproximadamente 34±1°C_ durante alrededor de 7 a 9 días. El crecimiento bacteriano puede monitorearse al medir la densidad óptica (O.D.) del medio. La fermentación se detiene de preferencia después de que la lisis ha procedido durante al menos 48 horas como se determina por la medición de crecimiento (densidad óptica) . Al lisarse las células, la O.D. del medio se reduce. En una modalidad preferida de la presente invención, cultivos de Clostridium botulinum usados para el almacenamiento a largo plazo de Clostridium botulinum y la inoculación del medio de siembra se hacen crecer y se liofilizan en leche de soya antes de su almacenamiento a 4°C. Cultivos de Clostridium botulinum en leche animal liofilizada para almacenamiento también pueden usarse para la producción de la toxina botulínica. Sin embargo, para mantener medios que estén sustancialmente libres de subproductos animales a lo largo de la producción de la toxina botulínica, se prefiere que el cultivo inicial de Clostridium botulinum sea conservado en leche de soya y no en leche animal.

Ejemplos Los siguientes ejemplos describen métodos específicos abarcados por la presente invención y no están destinados a limitar el alcance de la invención. Cultivos de Clostridium botulinum se pueden obtener de varias fuentes, incluyendo List Laboratories, Campbell, California. En todos los ejemplos siguientes " Clostridium botulinum" significa la • cepa Hall A (número de designación 3502 de la ATCC) de Clostridium botulinum tipo A.

Ejemplo 1 Preparación de un medio de siembra libre de productos animales para Clostridium botulinum Un medio de siembra de control puede prepararse usando los siguientes ingredientes por cada 1 litro de medio: NaCl (5 g) , Bacto-peptona (10 g) , • glucosa (10 g) , BHI (a 1 litro), pH 8.1 (ajustado con NaOH 5N) . Un medio de siembra de prueba (libre de productos animales) puede prepararse usando los siguientes ingredientes por cada 1 litro de medio: NaCl (5 g) , Soya-peptona (10 g) , glucosa (10 g) , Hy-Soy (35 g/litro, para hacer 1 litro de fluido de medio), pH 8.1 (ajustado con NaOH 5N) .

Ejemplo 2 Cultivo de Clostridium botulinum en un medio de siembra libre de productos animales Un cultivo liofilizado de Clostridium 'botulinum puede suspenderse en 1 ml de cada uno del medio de siembra de control y prueba del ejemplo 1, dividirse (cada medio de siembra) en dos tubos de los cuales cada uno puede contener 10 ml de los medios de siembra respectivos, y luego incubarse a 34°C durante aproximadamente 24-48 horas. Un ml de cultivo puede usarse entonces para inocular un matraz de cultivo DeLong Bélico de 125 ml que contenga 40 ml de medio de siembra (el respectivo) . El cultivo inoculado puede incubarse a 33°C±1°C durante 24 horas en una cámara anaeróbica Coy (Coy Laboratory Products Inc., Grass Lake, Mich. ) .

Ejemplo 3 Preparación de un medio de fermentación para Clostridium botulinum libre de productos animales Se puede preparar un medio de fermentación basal usando los siguientes ingredientes por cada dos litros de medio : glucosa (15 g) , NaCl (10 g) , NaH2P04 (1 g) , KH2P04 (0.350 g) , MgS047H20 (0.1 g) , cisteína-HC (0.250 g) , tirosina- HCl (0.250 g) , hierro en polvo (1 g) , ZnCl2 (0.250 g) , y MnCl2 (0.4 g) . Un medio de fermentación de control puede prepararse usando los siguientes ingredientes por cada dos litros de medio preparados: BHI (500 ml; esto corresponde a alrededor de 45.5 gramos de infusión de corazón de res en peso seco) , NZ-CaseTT (30 g) y medio basal (hasta 2 litros) , pH 6.8. El medio de fermentación basal puede prepararse primero y su pH ajustarse a pH 6.8. La infusión de corazón de res (BHI) BHI puede ser después preparada y su pH ajustarse a .8 con NaOH 5N. La BHI puede ser después añadida al medio basal. Luego se puede preparar la NZ-CaseTT. La NZ-CaseTT se añade después al medio basal al cual se le ha añadido ya la infusión de corazón de res, y se disuelve mediante adición de HCl. El pH se puede ajustar después a 6.8 con NaOH 5N. Este medio puede separarse después en porciones de 8 ml en cada uno de dieciséis tubos de ensayo de 100 mm, después de someterlos a autoclave durante 25 minutos a 120°C. Un medio de fermentación de prueba (libre de productos animales) puede prepararse al sustituir una fuente de nitrógeno de prueba por la BHI presente en el medio de fermentación de control. Las fuentes de nitrógeno para medio de fermentación de prueba adecuadas incluyen: Hy-Soy (Quest) , AMI-Soy (Quest) , NZ-Soy (Quest) , NZ-Soy BL4 (Quest) , NZ-Soy BL7 (Quest), Sheftone D (Sheffield) , SE50M (DMV), SE50 (DMV), SE%)MK (DMV), Soy Peptone (Gibco), Bacto-Soyton (Difco) , Nutricio 2207 (ADM) , Bakes Nutrisoy (ADM) Nutrisoy flour, harina de soya, Bacto-Yeast Extract (Difco) Extracto de Levadura (Gibco), Hy-Yest 412 (Quest), Hy-Yest 441 (Quest), Hy-Yest 444 (Quest) , Hy-Yest (455 (Quest) Bacto-Extracto de Malta ÍDifco) , Corn Steep, y Proflo (Traders) . El medio" de fermentación de prueba puede prepararse como se describió arriba para un medio " de fermentación de control excepto que se excluye la BHI y la fuente de nitrógeno relevante puede ser primero ajustada a pH 6.8 con HCl 3N o con. NaOH 5N. Los medios pueden ser asignados en porciones de 8 ml a dieciséis tubos de ensayo de 100 mm, seguidos por sometimiento a autoclave durante 20-30 minutos a 120°C.

Ejemplo 4 Crecimiento de Clostridium botulinum en un medio de fermentación libre de productos animales Una porción de 40 µl del cultivo de medio de siembra de prueba (libre de productos animales) se puede usar para inocular cada alícuota de medio de fermentación de control o de prueba de 8 ml en un tubo de ensayo de 16 X 100 mm con capacidad de 8 ml . Los cultivos pueden ser después incubados a 33±1°C durante 24 horas. Los tubos pueden ser después incubados en una cámara anaeróbica para permitir el crecimiento de la bacteria. Cada ensayo de medio puede llevarse a cabo por triplicado (es decir, puede incluir tres inoculaciones independientes del mismo medio) , y también puede incluir un control no inoculado, el cual se puede usar como el blanco para el espectrofotómetro) . El crecimiento (como se determina por la densidad óptica, OD) puede medirse cada 24 horas con un espectrofotómetro Turner (modelo 330) a 660 nm. El cultivo se debe detener después de que la lisis haya durado alrededor de 48 horas y la producción de toxina botulínica puede medirse entonces . Experimentos adicionales pueden llevarse a cabo con un medio de fermentación Hy-Soy que contenga los siguientes ingredientes por cada 500 ml del medio: Hy-Soy (17.5 g) , glucosa (3.75 g) ; NaCl (2.5 g) ; Na2HP04 (0.25 g) , MgS047H20 (0.025 g) , KH2P04 (0.0875 g) , L-cisteína (0.0625 g) , L-tirosina (0.0625 g) , hierro en polvo (0.25 g) , pH 6.8.

Ejemplo 5 Determinación de la producción de toxina botulínica por Clostridium botulinum cultivada en un medio de fermentación libre de productos animales Las células cultivadas del ejemplo 4 pueden centrifugarse, y el pH del sobrenadante determinarse después.

Los niveles de toxina botulinica en una muestra dada puede medirse al agregar una antitoxina estándar y midiendo el tiempo transcurrido antes de- la floculación. Tanto Kf (el tiempo requerido para que ocurra la floculación, en minutos) como Lf (el límite de floculación; equivalente a 1 unidad internacional de antitoxina estándar, establecido por floculación) pueden determinarse. Después se pueden tomar 4 ml de- caldo de fermentación de cada tubo de fermentación para un cultivo . dado, y luego pueden combinarse juntos de tal manera que 12 ml totales puedan mezclarse en un tubo centrífugo de 15 ml . Los tubos- pueden ser centrifugados a 5,000 rpm (3,400 g) durante 30 minutos a 4°C. Se pueden añadir alícuotas de 1 ml de sobrenadante a los tubos que contienen 0.1-0.6 ml de antisuero de toxina botulínica estándar, y los tubos pueden ser agitados cuidadosamente para mezclar sus contenidos . Los tubos pueden ponerse después en un baño de agua a 45+1°C y el tiempo inicial puede registrarse. Los tubos pueden revisarse frecuentemente, y el tiempo en el cual haya empezado la floculación puede registrarse como Kf . La concentración de toxina en el tubo en el cual la floculación puede iniciarse primero puede designarse LfFF. La concentración de toxina en el tubo en el cual la floculación puede iniciarse segundo puede designarse LfF. Ensayos paralelos de fermentación, crecimiento y producción de toxinas pueden llevarse a cabo tanto para ambos de: (a) el medio de siembra de control (usado para inocular el medio de fermentación de control) y el medio de fermentación de control, y (2) el medio de siembra de prueba (libre de productos animales) (usado para inocular el medio de fermentación de prueba) y el medio de fermentación de prueba (libre de productos animales) . De manera significativa, se puede determinar que la fermentación de Clostridium botulinum en medios libres de productos animales e inoculados a partir de cultivos también libres de productos animales (con productos a base de soya reemplazando los productos animales) puede dar como resultado una Lft0?ina de alrededor de 50 o más. Como mínimo, la Lf0?ina es igual a aproximadamente 10. De preferencia, la Lftoxina es de al menos 20. Muy preferiblemente la Lftoxina es de más de 50. Además, se puede determinar que varios productos de soya soporten el crecimiento de Clostridium botulinum en medios de fermentación que carezcan de BHI . . Así, las preparaciones de soya solubles pueden reemplazar BHI para el crecimiento de Clostridium botulinum. La mejor concentración puede ser de 12.5 ó 25 g/L. Hy-Soy (Sheffield) puede dar el crecimiento más alto. Preparaciones de soya insolubles pueden ser menos efectivas . Más aún, pueden obtenerse resultados para demostrar que Quest Hy-Soy,. DMV SE50MK y Quest NZ-Soy pueden ser efectivos como productos de soya en términos de su capacidad para reemplazar BHI para el crecimiento de Clostridium botulinum. Los resultados pueden revelar que los productos de soya (tales como Quest Hy-Soy, DMV SE50MK y Quest NZ-Soy) que pueden ser óptimos para el crecimiento también pueden ser efectivos para reemplazar BHI en la producción de toxina. El mejor producto de soya para la producción de toxinas puede ser Quest Hy-Soy a 22.75 g/1. Concentraciones más altas de este producto pueden producir mejor crecimiento pero no mejorar la producción de toxinas. Se propone que resultados similares pueden obtenerse con SE50MK, para el cual una concentración más alta puede generar crecimiento incrementado, pero ningún incremento en la producción de toxinas. NZ-Soy, por otro lado, puede dar crecimiento más alto y producción de toxinas más alta a su concentración más alta. Finalmente, se puede determinar que los productos de soya pueden reemplazar efectivamente BHI así como la NZ-CaseTT. La remoción de NZ-CaseTT de medios a base de soya puede reducir el crecimiento de aproximadamente 2-4 veces. El mejor producto de soya para el crecimiento tanto en presencia como en ausencia de NZ-CaseTT puede ser SE50MK. HY-Soy puede reemplazar tanto BHI como NZ-CaseTT para la producción de toxinas. Sin embargo, un ciclo de fermentación más largo de 1 ó 2 días puede ser necesario. Hy-Soy podría reemplazar tanto BHI como NZ-CaseTT en medios para la producción de toxinas. Sin embargo, se puede determinar qué extractos de levadura pueden ser inhibidores para la producción de toxinas . -- Puede determinarse que Hy-Soy a 22.75 g/1 puede reemplazar completamente tanto BHI como HY-CaseTT en la producción de toxinas . A _diférencia del efecto en el crecimiento en donde 56.88 g/1 de HY-Soy puede ser lo mejor, 34.13 g/1 de HYSoy puede ser lo mejor para la fase de producción de toxinas. De esta manera, se ha determinado sorprendentemente que Hy-Soy o [Hy-Soy+Hy-Yest] puede reemplazar BHI y Bactfó-peptona en medios para crecimiento de cultivo de Clostridium botulinum . Además, se pueden diseñar experimentos para determinar las concentraciones óptimas de componentes en medios de siembra para producir los niveles máximos de producción de toxina botulínica por la Clostridium botulinum. La producción de toxina por Clostridium botulinum cultivada en medio de siembra y medio de fermentación que está libre de BHI y NZ-CaseTT puede alcanzar o exceder los niveles logrados en medios que contienen BHI y NZ-CaseTT. Pueden determinarse las concentraciones óptimas de Hy-Soy o [Hy-Soy+Hy-Yest] para el crecimiento en el medio de siembra. Los experimentos pueden confirmar que Hy-Soy puede reemplazar BHI y Bacto-peptona como la fuente de nitrógeno en medio de siembra para el crecimiento de Clostridium botulinum y para la producción de toxina botulínica en la fase de fermentación subsecuente. Asimismo, Hy-Soy como fuente de nitrógeno en el medio de siembra, en comparación con Hy-Soy más Hy-Yest, puede producir niveles más aLtos de toxina botulínica en la etapa de fermentación subsecuente. Las concentraciones de Hy-Soy en el medio de siembra que producen los mejores niveles de toxina varían de alrededor de 62.5 g/L a 100 g/L. Pueden diseñarse experimentos adicionales para determinar las concentraciones óptimas de. Hy-Soy en el medio - de siembra para la producción máxima de toxina botulínica por Clostridium botulinum mediante fermentación. Así, 30 g, 50 75 g y 100 g de Hy-Soy en el medio de siembra pueden dar como resultado todos la producción de toxina botulínica por fermentación de Clostridium botulinum y esto es comparable o excede los niveles de la toxina botulínica hecha en medio de siembra que contiene BHI y Bacto-peptona como una fuente de nitrógeno. Se puede encontrar que una concentración de 100 g/L de Hy-Soy en el medio de siembra dé como resultado los niveles más altos de producción de toxina en la etapa de fermentación subsecuente. Además, los datos indican que la etapa de siembra 1 de medio de siembra Hy-Soy produjo mayor crecimiento luego de 48 horas que después de 24 horas.

Ejemplo 6 Proceso no APF para obtener una toxina botulínica Una toxina clostridial se obtuvo mediante la fermentación de una bacteria de Clostridium botulinum. Así, un proceso de Schantz modificado (no APF) se llevó a cabo para obtener toxina de Clostridium botulinum altamente potente y altamente purificada (es decir, toxina general) como sigue. Un proceso de Schantz modificado (no APF) puede proporcionar un alto rendimiento de toxina botulínica. Ambos procesos de Schantz y de Schantz modificado usan caseína en todos los medios de fermentación.

Preparación del cul tivo de abastecimiento Varias bacterias clostridiales están disponibles de la Colección Americana de Tipos de Cultivos (ATCC) , Manassas, Virginia. Como alternativa, un frasco de banco de células de Clostridium botulinum puede prepararse al aislar Clostridium botulinum de varias fuentes, incluyendo suelo o mediante muestreo profundo (en lugares anaeróbicos o casi anaeróbicos) de cadáveres de animales en putrefacción. Comúnmente, Clostridium botulinum puede obtenerse a partir de una muestra de un fluido fisiológico (es decir, un hisopo para heridas de un paciente con botulismo de heridas) de un paciente diagnosticado con botulismo. La mitad superior de la figura 2 resume el proceso no APF usado para la preparación de un frasco de banco de células, y para el cultivo y fermentación de una toxina botulínica. La Clostridium botulinum obtenida de una fuente natural o de paciente se cultiva sobre placas de agar hemático, seguida por la inoculación de colonias de alto crecimiento en un medio para frasco de banco de células . El medio para frasco de banco de células µsado para Clostridium botulinum era un medio de carne cocida que contenía carne de res fresca picada. Los cultivos que crecían en forma activa se mezclaron con glicerol para preparar un frasco de banco de células (es decir, un cultivo de abastecimiento) de la bacteria de Clostridium botulinum que se congeló para uso posterior.

Cul tivos de siembra El frasco de banco de células de Clostridium botulinum se descongeló a temperatura ambiente, seguido por cuatro etapas de cultivo. (1) Para seleccionar colonias con una morfología adecuada, alícuotas del frasco de banco de células descongelado se cultivaron al rayar la bacteria sobre placas de agar hemático Columbia pre-reducidas ' e incubando anaeróbicamente durante 30-48 horas a 34°C ± 1°C. (2) Colonias seleccionadas fueron después inoculadas en tubos de ensayo que contenían un medio de crecimiento de caseína durante 6-12 horas a 34°C. Los contenidos del tubo con el crecimiento más rápido y la densidad más alta (etapa de selección de crecimiento) fueron después cultivados más a través de incubaciones anaeróbicas de dos escaladas: (3) una primera incubación de 12-30 horas a 34°C en una botella de cultivo de siembra de un litro, seguida por (4) un segundo cultivo en un fermentador de siembra de 25 litros que contenía un medio de crecimiento de caseína durante 6-16 horas a 35°C. Estos cultivos de dos escaladas se llevaron a cabo en un medio nutritivo que contenía 2% de hidrolizado de caseína (un digestor de caseína [proteína láctea] )_, 1% de extracto de levadura y 1% de glucosa (dextrosa) en agua a pH 7.3, Fermentación Los cultivos de escalada fueron seguidos por una incubación adicional durante 60-96 horas a 35°C en un fermentador de escala comercial (es decir, de 115 litros) en un medio que contenía caseína bajo una atmósfera anaeróbica controlada. El crecimiento de la bacteria se completa normalmente luego de 24 a 36 horas, y durante la fermentación de 60-96 horas la mayoría de las células sufren lisis y liberan toxina botulínica. El control del pH del medio de fermentación no se requiere en un proceso de Schantz o de Schantz modificado. Se cree que la toxina es liberada por la lisis celular y se activa por proteasas presentes en el caldo de cultivo. Opcionalmente, una filtración de este medio de cultivo usando un filtro con profundidad de una sola capa para remover impurezas grandes (es decir, células enteras y rotas) puede prepararse para obtener una solución transparente referida a un cultivo clarificado.

Cosecha La cosecha de la toxina puede lograrse al reducir el pH a 3.5 con ácido sulfúrico para precipitar la toxina cruda a 20°C. La toxina cruda se concentra después mediante ultramicrofiltración seguida por diafiltración. - Puri fi ca ci ón La toxina cruda cosechada se transfirió después a un recipiente de digestión y se estabilizó por la adición del inhibidor de proteasa clorhidrato de benzamidina. Se añadieron DNasa y RNasa para digerir ácidos nucleicos . El material que contenía toxina se sometió a UF/DF y tres etapas de precipitación (precipitaciones con etanol frío, ácido clorhídrico y sulfato de amoniaco) . El complejo de neurotoxina botulínica purificado (toxina global) fue almacenado como una suspensión en un regulador de pH de fosfato de sodio/sulfato de amonio a 2-8 grados centígrados. La toxina global resultante fue un complejo de toxina botulínica tipo A de 900 kD cristalina y de alta calidad hecha a partir de la cepa Hall A de Clostridium botulinum con una potencia específica de >3 X 107 U/mg, una A6o/A278 de al menos 0.60 y un patrón distinto de bandas sobre electroforesis en gel, y adecuada para usarse para mezclarse con una composición farmacéutica de toxina botulínica. La mezcla puede abarcar una dilución de varias veces de la toxina .global, mezclado con uno o más excipientes (tales como albúmina y cloruro de sodio) para formar así una- composición de toxina, y la preparación de una forma estable en almacenamiento y transportación de la composición de toxina, tal como mediante liofilización, secado por congelación o secado al vacío de la composición. El complejo de toxina botulínica purificado obtenido a partir de un proceso de Schantz o de Schantz modificado puede ser eluido de una columna de intercambio iónico en un regulador de pH 7-8 para disociar las proteínas del complejo que no sean toxina de la molécula de toxina botulínica, proporcionando así (dependiendo del tipo de bacteria de Clostridium botulinum fermentada) toxina botulínica pura tipo A con un peso molecular de aproximadamente 150 kD, y una potencia específica de 1-2 X 108 LD50 U/mg o más; o toxina botulínica purificada tipo B con un peso molecular de aproximadamente 156 kD y una potencia específica de 1-2 X 108 LD50 U/mg o más, o toxina botulínica purificada tipo F con un peso molecular de aproximadamente 155 kD y una potencia específica de 1-2 X 107 LD50 U/mg o más.

Ejemplo 7 Medios APF y proceso para obtener una toxina, botulínica Este ejemplo describe un proceso APF llevado a cabo para obtener toxina tipo A de Clostridium botulinum altamente purificada y altamente potente (toxina general) . El proceso '"-puede usarse con otros serotipos de toxina botulínica.

Preparación del cul tivo de abastecimiento Como se describió en el ejemplo 6, Clostridial botulinum se puede obtener de la ATCC, de varias fuentes en la naturaleza o de un paciente con botulismo . La mitad inferior de la figura 1 resume el proceso APF usado para la preparación de un frasco de banco de células, y para el cultivo y fermentación de una toxina botulínica. Los frascos de banco de células APF fueron preparados al cultivar Clostridium botulinum sobre placas de agar vegetal . Las placas de agar vegetal se hicieron al mezclar el derivado de soya HySoy (Quest) con un extracto de levadura y glucosa en una relación 3:1:1 (por ciento en peso) con agar y dejando fijar. Otras placas de agar APF disponibles comercialmente o polvo deshidratado para hacer las placas también se encontró que eran adecuados . Las colonias de alto crecimiento seleccionadas fueron luego inoculadas en un medio para frasco de banco de células APF. El medio para frasco de banco de células APF usado comprendía proteína de soya hidrolizada, extracto de levadura (no se usó producto animal alguno ni en el cultivo de la levadura ni en el proceso para la preparación del extracto de levadura hecho ' a partir de la misma) y glucosa en la misma relación 3:1:1. Otras relaciones de nutrientes (es decir, 6:1:1, 6:0:1 y 6:3:1 también se encontró que eran adecuadas) . La soya hidrolizada (HySoy) y los concentrados de extracto de levadura (HyYest) usados se obtuvieron de Quest International. El cultivo de Clostridium botulinum en el medio APF se combinó con glicerol, se formó en alícuotas- ara criofráseos y se congeló para su uso posterior. Los medios APF desarrollados pueden usarse para almacenar las bacterias de Clostridium botulinum durante un periodo de un año o más sin pérdida de viabilidad. Estas mezclas de cultivo y glicerol congeladas en criofrascos son los frascos del banco de células APF.

Cultivos de siembra Un frasco de banco de células APF se descongeló a temperatura ambiente, seguido por una sola etapa de cultivo: una botella de cultivo de siembra de un litro se inoculó después directamente (es decir, sin un cultivo de agar hemático interventor o etapas de crecimiento en - tubo) con los contenidos del frasco del banco de células APF usando el mismo medio APF (el- medio para frasco de banco de células APF [almacenamiento] puede ser diferente del medio de crecimiento de fermentación APF [crecimiento] ) y se mantuvo a 35°C durante 15 a 24 horas, con un pH de medio inicial de 7.0 en una atmósfera anaeróbica (nitrógeno) .

Fermen t ación Después el cultivo de botella de siembra se transfirió a un fermentador de producción de 10 litros a escala comercial que contenía el medio APF (proteína de soya hidrolizada, extracto de levadura y 1% de glucosa) mantenido a 35°C durante 52-72 horas, con un pH de medio inicial de 7.0, en una atmósfera anaeróbica (nitrógeno). Aproximadamente 15 horas después del inicio de la • fermentación (el pH de cultivo se redujo naturalmente a menos de 6.0), un programa de control de pH a una escala de pH 5.0-5.5 es iniciado al añadir HCl al cultivo. Se encontró que era necesario controlar el pH del medio de fermentación APF dentro de la escala limitada para obtener así un rendimiento aceptable de toxina botulínica activa. Así, se encontró que este control del pH a entre 5.0-5.5 evitó sustancialmente la degradación y pérdida de potencia de la toxina botulínica. Se cree que durante la fermentación la mayoría de las células sufren lisis y liberan toxina botulínica, y que la toxina liberada por la lisis de las células es activada por las proteasas presentes en el caldo de cultivo. La filtración de este medio de cultivo usando un filtro de ' profundidad de una sola capa remueve impurezas grandes (es decir, células enteras y rotas) y da como resultado una solución transparente referida a un cultivo aclarado.

Cosecha La cosecha de la toxina botulínica puede proceder entonces como en el ejemplo 6 (es decir, precipitación con ácido sulfúrico, seguida por la concentración por microfiltración seguida por diafiltración) . Puri fi ca ci ón La purificación de la toxina puede proceder entonces como se describe en el ejemplo 6: es decir, la adición de clorhidrato de benzamidina, una DNasa y RNasa, precipitación con ácido sulfúrico, precipitación con etanol frío, extracción con regulador de pH de fosfato, precipitación con ácido clorhídrico, extracción con regulador de pH de fosfato y almacenamiento de la toxina general. Como una alternativa para el proceso de cosecha y purificación del ejemplo 6, un proceso de cromatografía en columna puede llevarse a cabo. La toxina general resultante es un complejo de toxina botulínica tipo A de 900 kD cristalino y de alta calidad hecho a partir de la cepa Hall A de Clostridium botulinum con una potencia específica de >3 X 107 U/mg, una A26o/A278 de menos de 0.60 y un patrón distinto de bandas sobre electroforesis en gel, y adecuado para usarse para la mezcla de una composición farmacéutica de toxina botulínica. Así, este proceso APF para una toxina botulínica puede generar toxina de alta calidad. El complejo de toxina botulínica purificado obtenido de un proceso APF puede pasarse a través de y eluirse en una columna de intercambio iónico en un regulador de pH 7-8 para disociar las proteínas del complejo no toxina de la molécula de toxina botulínica, de esta manera proporcionando (dependiendo del serotipo de bacteria de Clostridium botulinum fermentada) una toxina botulínica con un peso molecular de aproximadamente 150 kD, y una potencia específica de 1-2 X 108 LD50 U/mg o más; o toxina botulínica tipo B purificada con un peso molecular de aproximadamente 156 kD y una potencia específica de 1-2 X 108 LD50 U/mg o más, o toxina botulínica purificada tipo F con un peso molecular de aproximadamente 155 kD y una potencia específica de 1-2 X 107 LD50 U/mg o más. Por ejemplo, mediante el uso del presente medio APF los inventores fueron capaces de obtener un complejo de toxina botulínica tipo A con una potencia específica de 1.02 X 108 LD50 U/mg de toxina botulínica. En este ejemplo 7 medios APF ya sea con 1% en peso o 2% en peso de glucosa fueron usados (nótese que 1% de glucosa significa 1 g de glucosa por 100 ml del medio de cultivo y 2% de glucosa significa 2 g de glucosa cuando está presente por cada 100 ml del medio de cultivo) y se determinó que el crecimiento de bacteria máximo (determinado por densidad óptica pico [la densidad óptica se midió a 600 nm] del cultivo) ocurrió después de aproximadamente 20 horas de fermentación en el medio APF de 1% de glucosa vs después de alrededor de 40 horas de fermentación en el medio APF de 2% de glucosa, pero que las densidades ópticas pico no difirieron significativamente al variar de esa manera el contenido de glucosa .de los medios . Se cree que la autolisis de células y liberación-- de toxina dieron como resultado una cantidad máxima de toxina botulínica activa en el medio APF de 1% de glucosa (determinada por un ensayo SNAP-25 para toxina activa) luego de aproximadamente 55 horas de fermentación, pero que con el medio APF de 2% de glucosa la cantidad de toxina botulínica activa presente en el medio en un momento posterior (determinado por un ensayo SNAP-25 para toxina activa) y aún se incrementaba después de 65 horas de fermentación. Así, una liberación más rápida de toxina botulínica ocurrió con el uso de la cantidad más baja de' medio APF de glucosa (1%) presente, indicando que un proceso de producción de toxina más eficiente (es decir, mayor cantidad de toxina obtenida por unidad de tiempo) puede llevarse a cabo con el uso del medio APF de glucosa más bajo (1%). Como se muestra por la figura 1, también se determinó que los parámetros óptimos para la producción de toxina botulínica en un medio APF fueron la combinación de los siguientes parámetros: (1) alrededor de 6% en peso de una concentración de soya hidrolizada ("Conc. de HySoy" en la figura 1) en el medio de fermentación APF. Seis por ciento de soya significa 6 g de la proteína de soya por 100 ml del medio de cultivo; (2) 0% a 3% de concentrado de extracto de levadura ("Conc. de YE" en la figura 1) en el medio de fermentación APF; (3) 50-72 horas de fermentación a una temperatura de 33-35°C bajo condiciones anaeróbicas (atmósfera de nitrógeno) ; (4) el pH del medio de fermentación se mantuvo entre alrededor de pH 5.0 a 5.5 a lo largo del periodo de fermentación después del crecimiento de células inicial, y (5) 1% en peso de glucosa en el medio de fermentación APF . De esta manera, como se muestra por la figura 1 al estar presente más proteína en el medio APF (como la cantidad total de HySoy y YE) el pH del medio tiende a incrementarse con una estabilidad de toxina más baja resultante y que cuando el pH fue bajado con el mismo contenido de nutriente de proteína total en el medio, el rendimiento de la producción de toxina se incrementó dramáticamente. En el proceso no APF el contenido de proteína total es más bajo por lo que el pH no tiende a elevarse y por lo tanto no hay un pH elevado que tenga un efecto dañino en la producción de toxina. La figura 1 muestra que hubo consistentemente más actividad (determinada por los ensayos MLD50 y SNAP-25) cuando el pH del medio se controló a dentro de una limitada escala de aproximadamente 5.3 a 5.5. La figura 1 muestra también que el rendimiento de toxina más alto (como se determina por "el ensayo SNAP 25) se obtuvo con un medio que comprendía 6% de soya hidrolizada y 1% de extracto de levadura. El ensayo SNAP-25 usado fue un método a base de ELISA para medir la actividad proteolítica SNAP-25 de la toxina botul-ínica. SNAP-25 es una abreviatura para proteína asociada a sinaptosoma con un peso molecular de 25 kDa. SNAP-25 es una proteína de membrana de plasma de 206 aminoácidos implicada en la exocitosis neuronal. El ensayo se basa en el método descrito en Ekong T., et al., Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activi ty in vi tro, Microbiology (1997), vol. 143, páginas 3337-3347. El ensayo usa una proteína SNAP-25 truncada (el péptido de 206 residuos de aminoácido) unida a placas de microtitulación de 96 pocilios de poliestireno y un anticuerpo monoclonal que reconoce el producto cortado (un péptido de 197 residuos de aminoácido) que se hace mediante hidrólisis enzimática entre los aminoácidos 197 y 198 de la SNÁP-25 mediante una toxina botulínica tipo A reducida. El anticuerpo monoclonal unido al producto cortado es luego detectado con . un anticuerpo secundario (IgG anti-ratón de cabra conjugada a peroxidasa de rábano [HRP)], que produce un cambio de color en presencia de un substrato cromogénico (TMB) . El ensayo MLD50 (dosis letal para, 50% de los ratones) es un método para medir la potencia de una toxina botulínica mediante inyección intraperitoneal de la toxina botulínica en ratones hembra (alrededor de cuatro semanas de edad) que pesaban 17-22 gramos cada una al inicio del ensayo. Cada ratón se mantiene en una posición supina con su cabeza inclinada hacia abajo y se le inyecta intraperitonealmente en el abdomen derecho inferior a un ángulo de aproximadamente 30 grados usando una aguja calibre 0.95 cm a 1.59 cm con una de varias diluciones en serie de la toxina botulínica en solución salina. Los índices de mortalidad sobre las siguientes 72 horas para cada dilución se registran. Las diluciones se preparan de tal manera que la dilución más concentrada produzca un índice de mortalidad de al menos 80% de los ratones inyectados, y la dilución de concentración menor produzca un índice de mortalidad no mayor que 20% de los ratones inyectados . Debe haber un mínimo de cuatro diluciones que estén dentro de la escala de reducción onotónica de los índices de mortalidad. La escala de disminución monotónica comienza con un índice de mortalidad de no menos de 80%. Dentro de las cuatro o más velocidades de reducción monotónica, las dos velocidades más grandes y las dos más pequeñas deben estar reduciéndose (es decir, no equivalentes) . La dilución a la cual 50% de los ratones mueren dentro del periodo de observación post inyección de tres días se define como una dilución que comprende una -unidad (1 U) de la toxina botulínica. • En forma significativa, el proceso APF difiere del proceso no APF del ejemplo 6 al menos por: -(1) reemplazar el medio de carne cocida del frasco de banco de células con un medio APF; (2) eliminar la etapa de selección de colonia con agar hemático; (3) eliminar la etapa de crecimiento en tubo a base de medio de caseína subsecuente y (4) reemplazar los medios de fermentación no APF con medios de APF. La figura 2 representa un resumen de las diferencias entre un proceso de Schantz (no APF) a escala industrial (ejemplo 6) y el proceso APF a escala industrial del ejemplo 7, a través de las etapas de creación, cultivo y fermentación del banco de células . La figura 2 omite las etapas de cosecha y purificación. También se encontró que los medios APF pueden usarse para seleccionar bacterias de Clostridium botulinum. Así, la práctica concurrente de las etapas de cultivo iniciales de los ejemplos 6 y 7 permiten el aislamiento y crecimiento de una bacteria de Clostridium botulinum con características que conduzcan al crecimiento y producción de toxinas botulínicas en o sobre un medio APF. La transferencia del cultivo de Clostridium botulinum de un medio no APF a un medio APF enriquece y selecciona bacterias que ya sea puedan adaptarse al nuevo ambiente o a través de una muerte selectiva de bacterias que no puedan crecer y producir en el nuevo ambiente. Varias publicaciones, patentes y/o referencias han sido citadas en la presente, cuyos contenidos, en sus totalidades, se incorporan en la presente a manera de referencia. Aunque la presente invención ha sido descrita en detalle con respecto a ciertos métodos . preferidos , otras modalidades , versiones y modificaciones dentro del alcance de la presente invención son posibles . Por ej emplo, una amplia variedad de procesos libres de productos animales están dentro del alcance de la presente invención . En consecuencia, el espíritu y alcance de las siguientes reivindicaciones no debe ser limitado a las modalidades preferidas mostradas arriba . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para obtener una toxina botulínica biológicamente activa, caracterizado porque comprende las etapas de : (a) proporcionar un medio de fermentación que esté sustancialmente libre de un producto derivado de animal y que comprenda entre alrededor de 4-8% en peso de un derivado de soya; (b) fermentar una bacteria de Clostridium botulinum en el medio de fermentación bajo condiciones que permitan la producción de una toxina botulínica y (c) recuperar una toxina botulínica biológicamente activa del medio de fermentación.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de fermentación comprende además entre aproximadamente 0-3% en peso de un extracto de levadura.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de fermentación comprende además entre aproximadamente 1-2% en peso de glucosa.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de fermentación se lleva a cabo a un pH de entre aproximadamente 5.0 y 5.5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de fermentación se lleva a cabo durante entre alrededor de 45 horas y 75 horas. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de fermentación se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 33° y 36°C. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de fermentación se lleva a cabo en una atmósfera anaeróbica. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además las etapas de, antes de la etapa de provisión, obtener un medio de cultivo que esté sustancialmente libre de un producto derivado de animal y que comprenda entre aproximadamente 4-8% en peso de un derivado de soya y cultivar una bacteria de Clostridium botulinum en el medio de cultivo. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de recuperación es un proceso de purificación libre de proteína animal (APF) . 10. Un método para obtener una toxina botulínica biológicamente activa, caracterizado porque comprende las etapas de : (a) obtener un medio de cultivo que esté sustancialmente libre de un producto derivado de animales y que comprenda entre alrededor de 4-8% en peso de un derivado de soya y cultivar una bacteria de Clostridium botulinum en el medio de cultivo; (b) proporcionar un medio de fermentación que esté sustancialmente libre de un producto derivado de animales y que comprenda: (i) entre alrededor de 4-8% en peso de un derivado de soya,, . (ii) entre alrededor de 0-3% en peso de un extracto de levadura, (iii) entre aproximadamente 1-2% en peso de glucosa, (c) fermentar una bacteria de Clostridium botulinum en el medio de fermentación bajo condiciones que permitan la producción de una toxina botulínica, incluyendo: (i) llevar a cabo la etapa de fermentación a un pH de entre alrededor de 5.0' y 5.5 después del crecimiento de células inicial, (ii) llevar a cabo la etapa de fermentación durante entre aproximadamente 45 horas y 75 horas, (iii) llevar a cabo la etapa de fermentación a una temperatura de entre alrededor de 33° y 36°C, (iv) llevar a cabo la etapa de fermentación en una atmósfera anaeróbica, y (d) recuperar una toxina botulínica biológicamente activa del medio de fermentación, en donde la etapa de recuperación es un proceso de purificación APF. 11. Un medio para cultivar o para fermentar una toxina botulínica, caracterizado porque está sustancialmente libre de un producto derivado de animal y comprende un producto de proteína derivado de un vegetal . 12. El medio de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende entre alrededor de 4-8% en peso de un derivado de soya. 13. El medio de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende entre aproximadamente 0-3% en peso de un extracto de levadura. 14. El medio de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende además entre aproximadamente 1-2% en peso de glucosa. 15. Un medio para cultivar y/o fermentar una bacteria de Clostridium botulinum, caracterizado porque sustancialmente libre de un producto derivado de animal, y el medio comprende : (a) entre aproximadamente 4-8% en peso de un derivado de soya; (b) entre aproximadamente 0-3% en peso de un extracto de levadura y (c) entre aproximadamente 1-2% en peso de glucosa. 16. Un método para fabricar una composición farmacéutica sustancialmente libre de productos animales en la cual el ingrediente activo es una toxina botulínica, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) obtener una toxina botulínica biológicamente activa al : (i) proporcionar un medio de fermentación que esté sustancialmente libre de un producto derivado de animales; (ii) cultivar una Clostridium botulinum en el medio de fermentación bajo condiciones que permitan la producción de una toxina botulínica y (iii) recuperar una toxina botulínica biológicamente activa del medio de fermentación; (b) mezclar la toxina botulínica con un excipiente adecuado, haciendo de esta manera una composición farmacéutica sustancialmente libre de productos animales en la cual el ingrediente activo sea una toxina botulínica. 17. Un método para obtener una toxina botulínica biológicamente activa, caracterizado porque comprende las etapas de : (a) proporcionar un medio de fermentación que esté sustancialmente libre de un producto derivado de animal y que comprenda entre alrededor de 4-8% en peso de un derivado de soya; (b) fermentar una bacteria de Clostridium botulinum en el medio de fermentación, en donde el medio de fermentación se mantiene a un pH de entre pH 5.0 y
5.5 después del crecimiento de células inicial, y (c) recuperar una toxina botulínica biológicamente activa del medio de fermentación.