KR20240041474A - 보툴리눔 독소 생산성을 증가시키는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 보툴리눔 독소 생산성을 증가시키기 위한 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin) 생산 균주의 배양 방법 및 상기 방법으로 균주를 배양하여 효과적으로 보툴리눔 독소 (Botulinum Toxin)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 배양 방법을 통해 보툴리눔 독소의 생산성을 10배 이상 증가시켜 상업용 생산성을 가능하게 하는 장점이 있다.

Description

보툴리눔 독소 생산성을 증가시키는 방법{Method of Increasing Botulinum Toxin Productivity}
본 발명은 보툴리눔 독소 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 보툴리눔 독소 생산성을 증가시키기 위한 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin) 생산 균주의 배양 방법 및 상기 방법으로 균주를 배양하여 효과적으로 보툴리눔 독소 (Botulinum Toxin)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
보툴리눔 독소(Botulinum Toxin)는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum), 클로스트리디움 바라티(Clostridium baratii) 및 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)과 같은 박테리아에 의해서 생산되는 신경독소 단백질이다. 보툴리눔 독소는 신경근육 전달을 차단하고, 인간 및 동물에게 신경-마비성 질환을 일으킨다. 보툴리눔 독소는 7가지 다른 A, B, C1, D, E, F, G 및 H형의 보툴리눔 독소가 규명되었으며, 각각의 유형은 각 유형 특이적 항체에 의해 구별될 수 있으며, 이들이 유발하는 마비의 중증도 및 이들이 영향을 미치는 동물 종은 서로 상이하다.
보툴리눔은 그룹 I부터 IV까지 네개의 그룹으로 이루어져 있다. 그룹 I과 그룹 II는 인간 보툴리누스 중독을 유래하며, 그룹 III은 동물에서 보툴리누스 중독을 유래한다. 반면, 그룹 IV는 보툴리누스 중독을 유래하지 않는 것으로 알려져 있다. 보툴리눔 그룹 I은 단백분해형인 A, B, F형 독소를 포함하며, 보툴리눔 그룹 II는 비-단백분해형 B, E, F형 독소를 포함한다. 또한, 그룹 I 및 그룹 II는 젤라틴을 분해할 수 있으며, 그룹 II는 sucrose, monnose와 같은 다양한 탄수화물을 발효시킬 수 있다.
보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은, 약 50 kDa 경쇄에 접합된 약 100 kDa의 중쇄로 구성되어, 약 150 kDa이다. 그러나, 클로스트리디움 박테리아에 의해 방출되는 보툴리눔 독소는 150 kDa 독소와 하나 또는 그 이상의 비-독소 단백질(nontoxin protein)이 복합체를 형성하여 방출된다. 예를 들어, 보툴리눔 독소는 900 kDa, 500 kDa 및 300 kDa 복합체로 방출된다.
보툴리눔 독소는 인간에게 매우 치명적일 수 있으나, 최근에는 골격근 활동항진을 특징으로 하는 신경근육 장애를 포함하여 다양한 증상을 치료하기 위한 목적으로 보툴리눔 독소가 개발되고 있다. 예를 들어 보톡스(BOTOX ®)는 알러간사(Allergan, Inc.)로부터 상업적으로 개발한 보툴리눔 독소 A의 상표로, 이는 안검경련, 사시, 경부 근긴장이상 및 미간(안면) 주름 개선 치료에 활용되고 있고, 다른 혈청형들도 그에 적합한 용도를 개발하여 임상적으로 활용하고자 하는 연구가 계속되고 있다.
임상적 용도의 보툴리눔 독소는 일반적으로 세포 배양물에서 분리되는데, 종래에는 주로 동물 유래 산물을 사용하는 배양, 발효 및 정제 공정을 통하여 보툴리눔 독소를 분리하였다. 그러나 동물 유래 산물을 사용하여 보툴리눔 독소를 생산하는 경우, 이를 환자에게 투여시 환자가 동물 유래의 다양한 병원체 또는 감염성 물질을 함께 투여하게 되는 우려가 있다. 예를 들어, 프리온(prion)이 생산된 보툴리눔 독소 조성물에 함께 포함될 수 있는데, 프리온은 박테리아나 바이러스·곰팡이·기생충 등과는 전혀 다른 종류의 질병 감염인자로, 사람을 포함해 동물에 감염되면 뇌에 스펀지처럼 구멍이 뚫려 신경세포가 죽음으로써 해당되는 뇌기능을 잃게 된다. 프리온은 정상적인 단백질을 만드는 동일한 핵산 서열로부터 비정상적인 구조 이형체(abnormal coformational isoform)를 발생시킬 수 있으며, 번역후 단계에서 정상적인 이형체가 프리온 단백질 이형체로 되는 "리크루트먼트 반응(recruitment reaction)"시 감염성이 존재한다. 정상적인 내재성 세포 단백질이 병원체성 프리온 구조로 잘못 폴딩되는 것(misfold)을 유도한다. 크로이츠펠트-야콥병은 사람 전염성 해면양 뇌증(transmissable spongiform encephalopathies)의 드문 신경퇴행성 질환으로, 전염성 물질은 프리온 단백질의 비정상적인 이형체이다. 크로이츠펠트-야콥병이 있는 개체는 건강한 상태에서 6개월 이내에 무동성무언증(akinetic mutism)으로 악화될 수 있다. 그러므로 동물 유래 산물을 사용하여 얻어지는 보툴리눔 독소와 같은 생물제제를 포함하는 약제학적 조성 물을 투여하는 경우, 크로이츠펠트-야콥병과 같은, 프리온 매개 질환을 얻게 될 위험성이 존재한다.
상기와 같은 위험성을 제거하고자, 보툴리눔 독소를 생산하는 공정에서, 예를 들면 배양용 배지에서 동물 유래 성분을 배제하고자 하는 시도가 있었다. 대표적으로 Allergan 사는 동물 유래 성분을 대체하기 위하여 식물로부터 유래한 단백질로서 대두를 포함하는 배지에서 발효를 진행하는 방법을 고안하였으나(대한민국 공개특허 10-2006-0102330), 충분한 양의 보툴리눔 독소를 생산하기 위하여 균주를 오랜 시간 배양하여야 하는 문제점이 있었다.
식품 알레르기는 식품 섭취 후 발생하는 이상 반응 중 면역반응에 의해 일어나는 경우를 말한다. 일반적으로 두드러기, 혈관부종, 아토피피부염 등 일상생활에 많은 불편함을 초래하는 증상뿐만 아니라 심한 경우 아나필락시스는 생명을 위협할 정도로 위험하다. FDA에서 발표한 8가지 주요 원인에는 우유, 달걀, 생선, 갑각류, 견과류, 땅콩, 밀, 대두가 있고, 이 8가지 원인이 전체 중 85~90%를 차지한다. 따라서, 종래 동물 유래 성분의 배지를 대체하고 가능한 알레르기 원인물질을 배제하면서 보툴리눔 독소 생산 균주를 효과적으로 배양하여 보툴리눔 독소의 생산성을 향상시키기 위한 노력이 필요한 실정이다. 나아가, 보툴리눔 독소를 상업용으로 사용하기 위해서는 간단하고 경제적인 과정을 통해 독소 생산성을 높일 필요성이 있다.
이에, 본 발명자들은 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin) 생산성을 증가시키기 위한 보툴리눔 독소 생산 균주의 배양 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 보툴리눔 독소 생산 균주의 배양 과정에서 pH 조절 및 적합한 배지 조성을 통해 효과적으로 보툴리눔의 독소 생산성을 향상시킬 수 있다는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 10-2020-0114722
본 발명의 목적은 보툴리눔 독소 생산성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin) 생산 균주의 배양 방법을 제공한다.
(a) 보툴리눔 독소 생산 균주를 종배양 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 종배양이 완료된 보툴리눔 독소 생산 균주를 본배양 배지에서 pH 5.0 ~ 6.0로 배양하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 혐기성 환경에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계에서 종배양 배지는 3.0 ~ 4.0%(w/v)의 포테이토 펩톤, 0.5 ~ 2.5 w/v%의 효모 추출물 및 0.5 ~ 2.5 w/v%의 글루코스를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계에서 상기 종배양 배지는 N2, CO2 및 H2로 구성된 군에서 선택되는 둘 이상의 가스를 포함하는 혼합가스를 통해 가스 치환한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 28℃ ~ 32℃의 온도에서 18 ~ 30시간 동안 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 혐기성 환경에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 본배양 배지는 3.0 ~ 4.0%(w/v)의 포테이토 펩톤, 0.5 ~ 2.5 w/v%의 효모 추출물 및 0.5 ~ 2.5 w/v%의 글루코스를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 본배양 배지는 상기 종배양 배지를 pH 6.8 내지 7.2로 적정하여 제조한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 본배양 배지는 N2, CO2 및 H2로 구성된 군에서 선택되는 둘 이상의 가스를 포함하는 혼합가스를 통해 가스 치환한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 28℃ ~ 32℃의 온도에서 24 ~ 144 시간 동안 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 보툴리눔 독소는 E형 보툴리눔 독소, 비-단백분해형 B형 보툴리눔 독소 및 비-단백분해형(Non-proteolytic) F형 보툴리눔 독소로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 3.0 ~ 4.0%(w/v)의 포테이토 펩톤, 0.5 ~ 2.5 w/v%의 효모 추출물 및 0.5 ~ 2.5 w/v%의 글루코스를 유효성분으로 포함하는 E형 보툴리눔 독소, 비-단백분해형(Non-proteolytic) B형 보툴리눔 독소 및 비-단백분해형(Non-proteolytic) F형 보툴리눔 독소로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 보툴리눔 독소를 생산하는 균주 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin)의 제조방법을 제공한다.
(a) 상기 방법으로 보툴리눔 독소생산 균주를 배양하여 보툴리눔 독소를 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 보툴리눔 독소를 회수하는 단계.
본 발명에 따른 방법으로 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin) 생산 균주를 배양하는 경우 균주의 성장률이 유의하게 증가하고, 고수율의 보툴리눔 독소를 수득할 수 있다. 보툴리눔 독소의 생산성을 10배 이상 증가시켜 상업용 생산성이 가능하다. 또한, 동물 유래 산물과 주요 알레르기 유발물질이 없는 본 발명의 배지조성은 안정성이 우수하다는 장점이 있다. 나아가, E형 보툴리눔 독소는 주입 당일 효과가 발현되어 최대 한 달간 효과가 지속되는 장점이 있으므로 바이오 의약품, 조직 봉함 및 안면 고정 리프팅실, 지방분해주사제, 국소진통제 등을 제조하는 데 활용할 수 있다.
도 1은 배양 시간에 따른 보툴리눔 균주 OD600 값의 변화에 관한 것이다.
도 2는 배양 시간에 따른 배양액의 pH 변화에 관한 것이다.
도 3은 배양 시간에 따른 보툴리눔 독소량에 관한 것이다.
도 4는 배지 조성에 따른 독소량에 관한 것이다.
도 5 및 6은 pH 조절에 따른 독소량에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에 있어서, 용어 "보툴리눔 독소"는 클로스트리디움 보툴리눔에 의해서 생성된 신경독뿐 아니라, 비-클로스트리디움계 종에 의해서 재조합적으로 제조된 보툴리눔 독소(또는 이의 경쇄 또는 중쇄)를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, 보툴리눔 독소는 또한 보툴리눔 독소 복합체(즉, 300, 600 및 900kDa 복합체)뿐 아니라 순수한 보툴리눔 독소(즉, 약 150kDa)를 모두 포함한다. 상기 "순수한 보툴리눔 독소"는 보툴리눔 독소 복합체를 형성하는 단백질들을 포함하는, 다른 단백질들로부터 분리된, 또는 실질적으로 분리된 보툴리눔 독소로서 정의된다. 순수한 보툴리눔 독소는 순도가 95% 이상일 수 있으며, 바람직하게는 99%이상이다. 보툴리눔 C2 및 C3 사이토톡신은 신경독이 아니며, 본 발명의 범주에서 배제된다.
본 발명에서 있어서, 보툴리눔 독소 생산 균주는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 또는 이의 변이체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 보툴리눔 독소 생산이 가능한 어떠한 균주라도 사용 가능함은 통상의 기술자에게는 자명할 것이다.
따라서, 본 발명은 일관점에서 다음 단계를 포함하는 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin) 생산 균주의 배양 방법에 관한 것이다.
(a) 보툴리눔 독소 생산 균주를 종배양 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 종배양이 완료된 보툴리눔 독소 생산 균주를 본배양 배지에서 pH 5.0 ~ 6.0, 바람직하게는 pH 5.2 ~ 5.8, 더 바람직하게는 pH 5.3 ~ 5.7로 배양하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 혐기성 환경에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계에서 종배양 배지는 포테이토 펩톤(potato peptone), 효모추출물(yeast extract) 및 글루코스(glucose)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 포테이토 펩톤은 3.0 ~ 4.0%(w/v), 바람직하게는 3.3 ~ 3.8%(w/v), 더 바람직하게는 3.5%(w/v) 농도로, 효모추출물은 0.5 ~ 2.5 w/v%, 바람직하게는 1.0 ~ 1.5 w/v%, 더 바람직하게는 1.2 w/v%의 농도로, 글루코스는 0.5 ~ 2.5 w/v%, 바람직하게는 1.0 ~ 1.5 w/v%, 더 바람직하게는 1.2 w/v%의 농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계에서 종배양 배지는 N2, CO2 및 H2로 구성된 군에서 선택되는 둘 이상의 가스를 포함하는 혼합가스를 통해 가스 치환한 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 28℃ ~ 32℃의 온도에서 24 ~ 144 시간, 바람직하게는 48 ~ 96시간 동안 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 pH 5.0 ~ 6.0, 바람직하게는 pH 5.2 ~ 5.8, 더 바람직하게는 pH 5.3 ~ 5.7 범위를 유지하기 위해 본배양 4시간 이후 상기 pH 범위를 벗어나지 않도록 조절하면서 24 ~ 144시간, 바람직하게는 48 ~ 96시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더 상세하게는 상기 pH 범위를 벗어나기 시작하면 적정하고, 이후 pH 변화가 없을 때까지 적정한다. 상기 pH 적정은 염기성 물질, 바람직하게는 Sodium hydroxide로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 균주 본배양 시 pH가 감소하게 되며, 본 배양 4 ~ 8시간 후 pH 5.3에 도달하게 되고, 본배양 13 ~ 17시간 후 배양액의 pH 변화가 둔화되어 pH 5.5 내외로 유지될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더 상세하게는 본배양 4 ~ 8시간 후 pH 조절을 시작하고, 본배양 13 ~ 17시간 후 배양액의 pH 변화가 둔화되면 pH 조절을 종료하는 것으로 할 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 그룹 II인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 보툴리눔 독소 그룹 II는 E형 보툴리눔 독소, 비-단백분해형(Non-proteolytic) B형 보툴리눔 독소 및 비-단백분해형(Non-proteolytic) F형 보툴리눔 독소로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 방법을 통해 균주들의 보툴리눔 독소 생산성을 5배 이상, 바람직하게는 9.5배 이상 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 다른 관점에서, 3.0 ~ 4.0%(w/v), 바람직하게는 3.3 ~ 3.8%(w/v), 더 바람직하게는 3.5%(w/v)의 포테이토 펩톤, 0.5 ~ 2.5 w/v%, 바람직하게는 1.0 ~ 1.5 w/v%, 더 바람직하게는 1.2 w/v%의 효모 추출물 및 0.5 ~ 2.5 w/v%, 바람직하게는 1.0 ~ 1.5 w/v%, 더 바람직하게는 1.2 w/v%의 글루코스를 유효성분으로 포함하는 E형 보툴리눔 독소, 비-단백분해형(Non-proteolytic) B형 보툴리눔 독소 및 비-단백분해형(Non-proteolytic) F형 보툴리눔 독소로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 보툴리눔 독소를 생산하는 균주 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin)의 제조방법에 관한 것이다.
(a) 상기 방법으로 보툴리눔 독소생산 균주를 배양하여 보툴리눔 독소를 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 보툴리눔 독소를 회수하는 단계.
본 발명에 있어서 "동물 유래 성분이 없는"은 "실질적으로 동물 유래 성분이 없는" 또는 "실질적으로 동물 단백질이 없는"의 의미로, 혈액 유래, 혈액 풀드(blood pooled) 및 다른 동물 유래 산물들 또는 화합물들이 없거나 실질적으로 없다는 것을 의미한다. "동물"은 포유류(사람과 같은), 조류, 파충류, 어류, 곤충, 거미 또는 다른 동물 종들을 의미한다. "동물"은 박테리아와 같은 미생물은 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 범주에 드는 동물 산물이 없는 배지 또는 방법 또는 실질적으로 동물 산물이 없는 배지 또는 방법은 보툴리눔 독소 또는 클로스트리디움계 보툴리눔 박테리아를 포함할 수 있다. 예를 들어, 동물 산물이 없는 방법 또는 실질적으로 동물 산물이 없는 방법은, 면역글로불린, 고기 소화물, 고기 부산물 및 젖 또는 낙농 산물 또는 소화물과 같은 동물 유래 단백질이 실질적으로 없거나 본질적으로 없거나 완전히 없는 방법을 의미한다. 따라서, 동물 산물이 없는 방법의 예로는 고기 및 낙농 산물 또는 고기 또는 낙농 부산물을 배제한 방법(박테리아 배양 또는 박테리아 발효 방법과 같은)이 있다.
본 발명은 적어도 감소된 수준의 동물 또는 낙농 부산물을 포함하는, 바람직하게는 동물 또는 낙농 부산물이 실질적으로 없는 배지를 제공한다. "동물 또는 낙농 부산물"은 in vivo 또는 in vitro에서, 동물(박테리아 제외) 세포 중의 또는 그에 의해서 제조된 화합물 또는 화합물들의 조합을 의미한다. 단백질, 아미노산, 및 질소와 같은 배지 성분의 바람직한 비-동물 소스(source)로는 식물, 미생물(효모와 같은) 및 합성 화합물을 포함한다.
본 발명에 따른 배지는 클로스트리디움 보툴리눔의 소량 또는 대량 발효를 위한 배지, 시드 배지(종배양 배지) 및 발효 배지(본배양 배지)를 접종하는 데 사용되는 클로스트리디움 보툴리눔의 성장 및 배양을 위한 배지를 포함하는 것이나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 특정한 바람직한 실시 양태로서, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장 및 보툴리눔 독소의 생성을 위한 배지는 동물 유래 성분을 대체하는 포테이토 유래 성분, 바람직하게는 포테이토 펩톤을 포함할 수 있다.
본 발명은 동물 유래 성분이 실질적으로 없는 배지를 사용하여, 최단 시간 내에 보툴리눔 독소의 생성을 최대화하는 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위한 방법을 제공한다. 동물 유래 성분을 포테이토 펩톤으로 대체한 배지 조성물을 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔을 성장시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장은 2단계(시드 성장 및 발효)로 진행된다. 이 두 단계 모두 혐기성 환경에서 진행되는 것이 바람직하다. 시드 성장(종배양) 단계는 일반적으로 저장된 배양물로부터 미생물의 양을 "스케일-업(scale-up)"하는 데 사용된다. 시드 성장(종배양) 단계의 목적은 발효에 사용할 수 있는 미생물의 양을 증가시키는 것이다. 또한, 시드 성장(종배양) 단계는 저장된 배양물 내의 상대적으로 휴지상태인 미생물이 원기를 회복하여 활발히 성장하는 배양물로 성장하도록 해준다. 또한, 발효 배지를 접종하는 데 사용되는 생육 가능한 미생물의 부피 및 양은, 저장된 배양물에서 보다 활발히 성장하는 배양물에서 더욱 정밀하게 제어될 수 있다. 따라서, 발효 배지(본배양 배지)에 접종하기 위한 시드 배양물의 성장이 바람직하다. 또한, 발효 배지(본배양 배지)에 접종하기 위한 클로스트리디움 보툴리눔 양을 스케일-업 하는 시드 배지(종배양 배지)에서의 성장을 포함하는 연속되는 몇 번의 단계들을 사용할 수 있다.
발효(본배양) 단계에서, 시드 성장물로부터 클로스트리디움 보툴리눔을 포함하는 시드 배지(종배양 배지)의 일부분 또는 시드 배지 시드 배지(종배양 배지) 전체를 발효 배지(본배양 배지)에 접종하는 데 사용할 수 있다. 바람직하게, 시드 성장(종배양) 단계로부터 클로스트리디움 보툴리눔을 가지는 시드 배지(종배양 배지)의 약 1-10%로 발효 배지(본배양 배지)를 접종하는 데 사용한다. 발효(본배양)는 큰 스케일의 혐기성 환경에서 최대량의 미생물을 생성시키는 데 사용된다.
상기 방법에 의해 배양된 균주의 배양액에 포함된 보툴리눔 독소는 단백질 정제 기술분야의 당업자에게 공지된 단백질 정제 방법을 사용하여 분리 및 정제할 수 있다.
클로스트리디움 보툴리눔의 성장은 하나 이상의 단계로 진행될 수 있다. 바람직하게, 성장은 두 단계로 진행된다. 첫번째 단계인 시드 성장(종배양)에서, 클로스트리디움 보툴리눔을 본 발명에 따른 배지 조성물 중에 현탁하고, 혐기성 환경 하에 30±2℃에서 18-30시간 동안 배양한다. 바람직하게, 시드 성장(종배양) 은 약 24시간 동안 진행된다. 어떤 단계에서든 시드 배지(종배양 배지)에서의 성장은, 시드 배지(종배양 배지)에서의 최종 성장물로 발효 배지(본배양 배지)를 접종하기 전에, 세포 용해를 야기하지 않는 것이 또한 바람직하다.
이후, 클로스트리디움 보툴리눔을 더욱 성장시키며 보툴리눔 독소를 회수하기 위하여 시드 성장(종배양)한 배지의 일부분 또는 전체를 사용하여 본 발명의 배지 조성물에 접종하여 두번째 단계인 발효(본배양)를 진행한다. 접종 후에, 역시 혐기성 환경 하에 30±2 ℃에서 48~96시간 동안 배양하며, 배지의 광학 밀도(OD)를 측정하여 성장을 모니터링한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 배지 조성물을 이용한 발효 단계에서는 약 14~18시간 사이에 최대 성장을 보인 후 세포가 용해되며 OD 값이 감소하는데, 이로써 발효 단계에서의 클로스트리디움 보툴리눔을 배양 시작 후 96시간 이내에, 더욱 바람직하게 72시간 이내, 보툴리눔 독소를 회수하게 된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않은 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
[실시예]
실험 재료
본 발명에서 사용된 실험 재료는 다음과 같다: 정제수 (Ultrapure water 또는 동등 이상의 품질을 가진 물), Potato peptone E210 (Organotechnie, 19425), Yeast extract (BD, 212750), Glucose (Merck, 1.37048.5000), Sodium hydroxide pellet (Merck, 1.06482.5000), Plastic syringes Luer-Lock 5 mL (Henke-ject, 4050-X00V0), Plastic syringes Luer-Lock 50 mL (Henke-ject, 4850003000), 0.2 μm bottle top filter (Merck, S2GPT05RE), Cellulose based depth filter (Pall, NP6PDH41), Cellulose acetate 0.2 μm filter (Pall, CSS92DPRRK)
보툴리눔 독소 생산 균주를 배양하기 위한 배지 제조방법
종배양 배지로 PYG 배지(Potato peptone 3.5 %, yeast extract 1.2 %, glucose 1.2 %, pH 7.0±0.2) 500 mL를 사용하였다. 5 N Sodium hydroxide를 사용하여 상기 PYG 배지 5 L를 pH 7.0±0.2로 적정하여 본배양 배지를 제조하였다. 2 μm 필터로 제균한 뒤 오염에 주의하며 상기 본배양 배지를 cellbag에 담아 배양기에 체결하고, 혼합가스(N2:CO2:H2=8:1:1)를 이용하여 0.2 lpm으로 4시간 이상 가스 치환 후 사용하였다.
보툴리눔 독소 생산 균주의 배양 방법
(실시예 3-1) 균주 준비
Deep freezer에 저장되어 있는 클로스트리디움 보툴리눔 RCB (Research Cell Bank) 1 vial을 꺼낸다. RCB가 클로스트리디움 보툴리눔 E type NCTC8550임을 확인한다. BSC에서 10분간 해동한다.
(실시예 3-2) 종배양
해동된 RCB를 생물안전작업대에서 종배양 배지에 luer syringe를 사용하여 오염에 주의하며 접종한다. 접종한 종배양 cellbag은 30 ℃로 설정된 혼합가스로 치환된 혐기성 챔버에 넣어 24시간 정치배양한다. 24시간 배양 후 OD600 흡광도가 2-8 사이가 되면 종배양을 종료한다.
(실시예 3-3) 본배양
생물안전작업대에서 종배양이 완료된 배양액 100 mL을 본배양 배지에 luer syringe를 사용하여 오염에 주의하며 접종한다. 접종 후 <표 1>과 같은 조건으로 72-96시간 배양한다.
본배양 배양 조건
조건 setpoint
온도 30±2 ℃
가스압력 0.2±0.1 lpm
가스 조성 N2:CO2:H2=8:1:1
배양 4시간 뒤부터 배양액을 sampling하여 OD600값을 측정한다. 배양액 흡광도가 1 이상일 경우, 1/10으로 희석하여 측정한다. pH가 5.3 이하로 떨어졌을 시기부터 1N NaOH를 cellbag과 연결하여 470 ~ 620μL/min의 속도로 9시간 주입한다. pH가 5.5±0.2를 유지하는지 배양 종료시까지 확인한다. 배양 24h마다 배양액을 sampling하여 ELISA를 수행한다. 배양 종료 후 depth filter, 0.2μm filter를 사용하여 제균하고 4 ℃에 보관한다.
효소면역측정법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)을 통한 보툴리눔 독소 확인
ELISA Plate-Coating Buffer에 5 μg/mL Antibody A buffer: Antibody A 원액을 희석하여 준비하고, 96 well Microplates의 각 웰에 100μL씩 분주하여 16시간 이상 코팅한 후, 각 웰을 wash buffer로 세척하는 과정을 총 3번 반복하였다. 각 웰을 Blocking buffer(Super block)으로 blocking하고, 각 웰을 wash buffer로 세척하는 과정을 총 3번 반복하였다.
배양 중 sampling한 배양액을 희석하여 각 웰에 100μL씩 첨가하고 2시간 반응시킨 후, 각 웰을 wash buffer로 세척하는 과정을 총 3번 반복하였다. Detection antibody 희석액을 각 웰에 100μL씩 첨가하고 2시간 반응시킨 후, 각 웰을 wash buffer로 세척하는 과정을 총 3번 반복하였다. Anti IgG antibody 희석액을 각 웰에 100μL씩 첨가하고 1시간 반응시킨 후, 각 웰을 wash buffer로 세척하는 과정을 총 5번 반복하였다. 각 웰에 TMB 100μL를 첨가하고 20분을 반응시킨 후, 각 웰에 Stop Solution 50μL를 첨가하고 적절히 shaking하여 효소반응을 중지시켰다. 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 각 웰에서 450nM 흡광도를 측정하였다.
배지 조성에 따른 보툴리눔 독소 생산량 비교
본 발명자들은 선행특허(대한민국 공개특허 10-2020-0114722)에 공개된 배지 조성(Potato peptone:3%, Yeast extraction:1%, Glucose:1%)과 본 발명에서 제시한 배지 조성(Potato peptone:3.5%, Yeast extraction:1.2%, Glucose:1.2%)으로 각각 E형 보툴리눔 독소 생산 균주를 배양하고, 생산된 보툴리눔 독소량을 비교하였다.
그 결과, 본 발명의 배지 조성에서 균주를 배양한 경우 선행특허의 배지 조성에서 균주를 배양한 경우보다 독소량이 약 18% 증가한 것으로 확인하였다(도 4). 즉, E형 보툴리눔 독소 생산 균주는 Potato peptone:3.5%, Yeast extraction:1.2%, Glucose:1.2%를 함유하는 배지로 배양하는 경우에 독소 생산량이 우수한 것을 확인하였다. 이로써, E형 보툴리눔 독소 생산 균주와 A형 보툴리눔 독소 균주을 배양하기 위한 배지 조성은 상이하다는 것을 확인하였다.
pH 적정에 따른 보툴리눔 독소 생산량 비교
기존과 같이 배양 후 배양액 pH 적정 조건을 <표 2>와 같이 설정하여 배양공정 중 pH가 설정된 범위를 벗어나지 않도록 조절하며 배양하였다.
배양 중 pH 적정 조건
시험군 조건
Control pH 적정하지 않음(기존 배치)
pH 6.0 시험군 배양 중 pH 6.0±0.2 조절
pH 5.5 시험군 배양 중 pH 5.5±0.2 조절
배양 결과 기존 배치인 Control은 pH 적정을 하지 않아 최종 회수시점에 pH가 4.85으로 확인되었으며 pH 6.0 시험군, pH 5.5 시험군은 상기 조절된 범위 내 pH로 종료되었다. 구체적으로, 최종 회수시점에 pH 6.0 시험군은 pH 5.8-6.2로, pH 5.5 시험군은 pH 5.3 - 5.7로 확인하였다.
배양 중 pH 적정 결과
시험군 Max OD Final OD Autolysis Toxin(mg/L)
Control 5.74 4.79 17% 1.90
pH 6.0 시험군 7.54 2.57 66% 9.77
pH 5.5 시험군 6.01 3.66 39% 18.10
상기 <표 5>의 조건으로 배양한 세 배치 비교 시 pH 6.0으로 적정한 pH 6.0 시험군의 균주 최대 OD값과 autolysis percentage가 가장 높았고, pH 적정하지 않은 Control이 가장 낮았다. 이러한 결과는 균주가 성장하는데 적절한 pH 조절이 필요하다는 것을 뒷받침한다.
또한, 상기 <표 3>에서 세 배치의 독소량 비교 시 pH 5.5±0.2로 적정한 pH 5.5 시험군이 18.10mg/L으로 가장 높아 생산성이 우수하다는 것을 확인하였다. 따라서, pH 5.5±0.2로 적정 조건으로 설정한 후 실험을 진행하였다.
배양시간에 따른 보툴리눔 독소 생산량 비교
24시간 단위로 배양액의 독소량 측정시 48시간 이후 독소량이 유사하였다(도 3). 48시간 이후에 독소량이 유사한 것으로 확인되어 배양 시간은 48-96시간으로 설정하였다.
배양조건에 따른 보툴리눔 독소 생산량 비교
DOE 실험 설계를 통해 배양 조건 parameter를 설정하였다. 상기 배양 조건으로 배양하고 독소량을 측정한 결과는 <표 4> 같다.
DOE 실험설계에 따른 독소량 측정 결과
Block Batch no. Temp. 적정 pH 가스 압력 가스 종류 독소량(mg/L)
1 DOE 1 32 5.2 100 혼합 6.95
DOE 2 28 5.8 300 질소 18.15
DOE 3 30 5.5 200 혼합 27.64
2 DOE 4 32 5.8 100 질소 18.61
DOE 5 28 5.2 300 혼합 1.50
DOE 6 30 5.5 200 질소 15.61
3 DOE 7 28 5.8 100 혼합 16.64
DOE 8 32 5.2 300 질소 8.07
DOE 9 30 5.5 200 혼합 25.04
4 DOE 10 28 5.2 100 질소 7.345
DOE 11 32 5.8 300 혼합 11.65
DOE 12 30 5.5 200 질소 17.09
표 4의 독소량을 통계 프로그램(Minitab18)을 통해 분석한 결과, 상기 설정된 조건에서 독소량에 영향을 끼치는 요인은 pH 적정 값으로 확인하였다(표 5). 배양 온도, 가스 압력, 가스 종류는 설정된 조건에서 독소량에 미치는 영향이 유의하지 않았다.
pH 5.5±0.3 조건에서 P-Value 값이 0.016임을 확인하였다. 즉, pH의 P-Value 값은 0.05보다 작았으며, 변수끼리의 교락은 없었고, 곡률효과가 존재하는 것으로 확인하였다.
구체적으로, <표 4>의 독소량 비교 결과, pH 5.5로 적정한 중점 배치의 독소량이 가장 높은 것으로 확인하였다. 배양 중 pH 적정 유무 및 조건에 따라 독소량에 유의미한 차이가 발생한 것을 확인하였다(도 5). 또한, 배양 중 pH 5.5±0.2 조건은 pH 5.5 배양조건과 유사한 생산성을 나타냄을 확인하였다(도 6). 따라서, pH 5.5±0.2 적정으로 설정하였다(도6).
배양 온도는 28-32℃ 범위 내에서 독소량에 유의한 영향을 미치지 않은 것으로 확인되어 30±2℃로 설정하였다(표 5).
가스 압력은 100-300 lpm 범위 내에서 독소량에 유의한 영향을 미치지 않은 것으로 확인되어 200±100 lpm으로 설정하였다(표 5).
가스 종류는 혼합가스와 질소가스 모두 독소량에 유의한 영향을 미치지 않은 것으로 확인되어 두 종류의 가스 모두 사용이 가능한 것으로 판단된다(표 5). 다만, 독소량을 확인한 결과(표 4), 중점 조건에서 혼합가스 배양한 DOE 3, DOE 9 배치가 질소가스 배양한 DOE 6, DOE 12배치보다 평균 독소량(26.34, 16.35mg/L)이 약 38% 높은 것으로 확인되었다. 따라서, 균주 배양 시 혼합가스와 질소가스 모두 사용이 가능하나 혼합가스 사용을 권장한다.

Claims (13)

  1. 다음 단계를 포함하는 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin) 생산 균주의 배양 방법:
    (a) 보툴리눔 독소 생산 균주를 종배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 종배양이 완료된 보툴리눔 독소 생산 균주를 본배양 배지에서 pH 5.0 ~ 6.0로 배양하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 혐기성 환경에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (a)단계에서 종배양 배지는 3.0 ~ 4.0%(w/v)의 포테이토 펩톤, 0.5 ~ 2.5 w/v%의 효모 추출물 및 0.5 ~ 2.5 w/v%의 글루코스를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (a)단계에서 종배양 배지는 N2, CO2 및 H2로 구성된 군에서 선택되는 둘 이상의 가스를 포함하는 혼합가스를 통해 가스 치환한 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 28℃ ~ 32℃의 온도에서 18 ~ 30시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 혐기성 환경에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (b)단계에서 본배양 배지는 3.0 ~ 4.0%(w/v)의 포테이토 펩톤, 0.5 ~ 2.5 w/v%의 효모 추출물 및 0.5 ~ 2.5 w/v%의 글루코스를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (b)단계에서 본배양 배지는 상기 종배양 배지를 pH 6.8 내지 7.2로 적정하여 제조한 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 (b)단계에서 본배양 배지는 N2, CO2 및 H2로 구성된 군에서 선택되는 둘 이상의 가스를 포함하는 혼합가스를 통해 가스 치환한 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 28℃ ~ 32℃의 온도에서 24 ~ 144 시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 보툴리눔 독소는 E형 보툴리눔 독소, 비-단백분해형(Non-proteolytic) B형 보툴리눔 독소 및 비-단백분해형(Non-proteolytic) F형 보툴리눔 독소로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 3,0 ~ 4.0%(w/v)의 포테이토 펩톤, 0.5 ~ 2.5 w/v%의 효모 추출물 및 0.5 ~ 2.5 w/v%의 글루코스를 유효성분으로 포함하는, E형 보툴리눔 독소, 비-단백분해형(Non-proteolytic) B형 보툴리눔 독소 및 비-단백분해형(Non-proteolytic) F형 보툴리눔 독소로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 보툴리눔 독소를 생산하는 균주 배양용 배지 조성물.
  13. 다음 단계를 포함하는 보툴리눔 독소 (Botulinum Toxin)의 제조방법:
    (a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법으로 보툴리눔 독소 생산 균주를 배양하여 보툴리눔 독소를 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 보툴리눔 독소를 회수하는 단계.
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