TWI854378B - 肉毒桿菌毒素生產率的增加方法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及用於增加肉毒桿菌毒素生產率的肉毒桿菌毒素（Botulinum Toxin）生產菌株的培養方法，及通過上述方法培養菌株來有效地製備肉毒桿菌毒素的方法。通過本發明的培養方法，具有使肉毒桿菌毒素的生產率增加10倍以上來實現商用生產率的優點。
Description
本發明涉及肉毒桿菌毒素生產率的增加方法，更詳細地，涉及用於增加肉毒桿菌毒素生產率的肉毒桿菌毒素（Botulinum Toxin）生產菌株的培養方法及通過上述方法培養菌株來有效地製備肉毒桿菌毒素的方法。
肉毒桿菌毒素是由如丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、巴氏梭菌（Clostridium baraffi）和肉毒桿菌（Clostridium botulinum）的細菌產生的一種神經毒蛋白。肉毒桿菌毒素阻斷神經肌肉的傳導，並且造成人類和動物的神經麻痹疾病。肉毒桿菌毒素已經鑒定出A型、B型、C1型、D型、E型、F型、G型和H型等不同的7種肉毒桿菌毒素，每種類型的肉毒桿菌毒素都可以通過相應的類型特異性抗體來區分，不同種類的肉毒桿菌毒素所造成的麻痹的嚴重程度和受其影響的動物種類不同。
肉毒桿菌由I組至IV組的四個組組成。I組及II組導致人類肉毒桿菌中毒，III組導致動物肉毒桿菌中毒。相反，IV組不導致肉毒桿菌中毒而周知。肉毒桿菌I組包括作為蛋白水解型的A型、B型、F型毒素，肉毒桿菌II組包括作為非蛋白水解型的B型、E型、F型毒素。並且，I組及II組可分解明膠，II組可發酵如蔗糖（sucrose）、甘露糖（monnose）的各種碳水化合物。
肉毒桿菌毒素的蛋白分子的分子量約為150kDa，包括一條約為50kDa的輕鏈和一條與該輕鏈綴合的約100kDa的重鏈。然而，從肉毒桿菌釋放的肉毒桿菌毒素是以150kDa的毒素蛋白與至少一種非毒素蛋白的複合物的形式釋放的。例如，肉毒桿菌毒素以900kDa、500kDa和300kDa的複合物形式釋放。
肉毒桿菌毒素對於人類而言可能是非常致命的，但最近開發出的肉毒桿菌毒素用於治療多種症狀，包括以骨骼肌過度活動（skeletal muscle hyperactivity）為特徵的神經肌肉障礙。例如，BOTOX
®是Allergan公司商業化開發的肉毒桿菌毒素A的商標，其用於緩解或治療眼瞼痙攣、斜視、頸部肌張力障礙和眉間（面部）皺紋，並且目前正在研究開發適用於其他血清型的應用以及在臨床上利用這些血清型。
供臨床使用的肉毒桿菌毒素一般是從細胞培養物中分離出來的。傳統上，肉毒桿菌毒素主要是利用動物源性產品，通過培養、發酵和純化工藝而分離出來的。然而，當使用動物源性產品來生產肉毒桿菌毒素時，擔心的是當將肉毒桿菌毒素施用至患者時，可能也會將來自動物的多種病原體或感染性物質施用至該患者。例如，一種生產的肉毒桿菌毒素組合物中可能含有朊病毒（prion）。朊病毒是一種與細菌、病毒、真菌和寄生蟲等完全不同的疾病感染因數。感染朊病毒的動物（包括人）會經歷大腦像海綿一樣的穿孔和神經細胞死亡，導致相應的大腦功能喪失。朊病毒可以從與產生正常蛋白質相同的核酸序列中生成異常的構象同種型，感染性存在於「招募反應」期間，正常的異構體在翻譯後階段成為朊病毒蛋白質同種型。正常的固有細胞蛋白誘導錯誤折疊而致病性朊病毒病毒結構。克雅二氏病（Creutzfeldt-Jakob disease）是一種罕見的人傳播性海綿樣腦症的神經退行性疾病，並且傳染性物質是朊病毒蛋白的一種異常同種型。患有克雅二氏病的受試者可在6個月內由。健康狀況惡化為無動性緘默症。因此，施用含有使用動物源性的產品獲得的生物製劑（諸如肉毒桿菌毒素）的藥物組合物具有引起朊病毒介導的疾病（諸如克雅二氏病）的風險。
為了去除該風險，例如，已經嘗試了在生產肉毒桿菌毒素的工藝中將動物源成分從培養基中排除。作為示例性實例，Allergan公司設計了一種在含有大豆作為植物源成分的培養基中進行發酵的方法，在該方法中不使用動物源成分（韓國專利公開號10-2006-0102330），但該方法具有以下問題，即需要長時間培養菌株以產生足夠量的肉毒桿菌毒素。
食物過敏是由免疫系統引起的對消化後的食物的異常應答。食物過敏通常涉及在日常生活中引起嚴重不適的症狀，諸如蕁麻疹、血管性水腫、特應性皮炎等，並且食物過敏可導致過敏性反應，器是一種嚴重且危險的過敏反應，有可能危及生命。FDA公佈的八種主要的食物過敏原因是牛奶、雞蛋、魚、甲殼類、堅果、花生、小麥和大豆，該些食物占食物過敏的總原因的85％至90％。因此需要如下的努力，即代替以往的動物源性成分的培養基，並且排除可能的過敏原，通過有效地培養肉毒桿菌毒素生產菌株來提高肉毒桿菌毒素的生產率。進而，為了將肉毒桿菌毒素用作商用，需要通過簡單且經濟的過程提高毒素生產率。
因此，通過廣泛的努力以開發出用於增加肉毒桿菌毒素生產率的肉毒桿菌毒素生產菌株的培養方法，本發明人發現，在肉毒桿菌毒素生產菌株的培養過程中，通過pH調節及適合的培養基組成成分，可有效地提高肉毒桿菌的毒素生產率，從而完成了本發明。
現有技術文獻
專利文獻
專利文獻1：韓國公開專利10-2020-0114722
發明所欲解決之問題
本發明的目的在於，提供肉毒桿菌毒素生產率的增加方法。
解決問題之技術手段
為了實現上述目的，本發明提供一種肉毒桿菌毒素生產菌株的培養方法。
上述肉毒桿菌毒素生產菌株的培養方法包括：步驟（a），在種菌培養基中培養肉毒桿菌毒素生產菌株；以及步驟（b），在本培養基中，以pH 5.0～6.0培養種菌培養完成的上述肉毒桿菌毒素生產菌株。
本發明的特徵在於，上述步驟（a）在厭氧環境中進行培養。
本發明的特徵在於，在上述步驟（a）中，種菌培養基包含3.0％(w/v)～4.0％(w/v)的馬鈴薯蛋白腖、0.5w/v％～2.5w/v％的酵母提取物及0.5 w/v％～2.5w/v％的葡萄糖作為有效成分。
本發明的特徵在於，在上述步驟（a）中，上述種菌培養基通過混合氣體進行氣體置換，上述混合氣體包含選自由N
2、CO
2及H
2組成的組中的兩種以上的氣體。
本發明的特徵在於，上述步驟（a）在28℃～32℃的溫度下培養18小時～30小時。
本發明的特徵在於，上述步驟（b）在厭氧環境下進行培養。
本發明的特徵在於，在上述步驟（b）中，本培養基包含3.0％(w/v)～4.0％(w/v)的馬鈴薯蛋白腖、0.5w/v％～2.5w/v％的酵母提取物及0.5w/v％～2.5w/v％的葡萄糖作為有效成分。
本發明的特徵在於，在上述步驟（b）中，本培養基通過將上述種菌培養基滴定成pH 6.8至7.2來製備。
本發明的特徵在於，在上述步驟（b）中，本培養基通過混合氣體進行氣體置換，上述混合氣體包含選自N
2、CO
2及H
2組成的組中的兩種以上的氣體。
本發明的特徵在於，上述步驟（b）在28℃～32℃的溫度下培養24小時～144小時。
本發明的特徵在於，上述肉毒桿菌毒素為選自由E型肉毒桿菌毒素、非蛋白水解B型肉毒桿菌毒素及非蛋白水解F型肉毒桿菌毒素組成的組中的一種以上。
本發明還提供一種用於培養菌株的培養基組合物，其包含3.0％(w/v)～4.0％(w/v)的馬鈴薯蛋白腖、0.5w/v％～2.5w/v％的酵母提取物及0.5w/v％～2.5w/v％的葡萄糖作為有效成分，用於生產選自由E型肉毒桿菌毒素、非蛋白水解B型肉毒桿菌毒素及非蛋白水解F型肉毒桿菌毒素組成的組中的一種以上的肉毒桿菌毒素。
本發明還提供一種肉毒桿菌毒素的製備方法。
上述肉毒桿菌毒素的製備方法包括：步驟（a），通過上述方法培養肉毒桿菌毒素生產菌株來生成肉毒桿菌毒素；以及步驟（b），回收生成的上述肉毒桿菌毒素。
對照先前技術之功效
在通過本發明的方法培養肉毒桿菌毒素生產菌株的情況下，菌株的生長率顯著增加，可獲得高收率的肉毒桿菌毒素。可將肉毒桿菌毒素的生產率增加10倍以上來實現商用生產率。並且，沒有動物源性產品及主要過敏原的本發明的培養基組合物具有安全性好的優點。進而，E型肉毒桿菌毒素具有注射當天表達效果且效果最長持續一個月的優點，因此，可用於製造生物醫藥品、組織縫合及面部固定提升線、脂肪分解注射劑、局部止痛劑等。
以下，詳細說明本發明。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所涉及的領域中技術人員所理解的含義相同的含義。一般來說，本文使用的命名法是本領域中眾所周知的，並且也是常用的。
在本發明中，術語「肉毒桿菌毒素」不僅是指由肉毒桿菌產生的神經毒素，還指由非肉毒桿菌菌種重組所產生的肉毒桿菌毒素（或輕鏈或重鏈）。如本文所用，肉毒桿菌毒素還包括：肉毒桿菌毒素複合物（即300kDa、600kDa和900kDa複合物）以及純肉毒桿菌毒素（即，約150kDa）。上述“純肉毒桿菌毒素”被定義為從其他蛋白質中分離或基本上分離的肉毒桿菌毒素，這些蛋白質包括形成該肉毒桿菌毒素複合物的蛋白質。純肉毒桿菌毒素可以具有95％或更高的純度，優選為99％或更高的純度。肉毒桿菌C2及C3細胞毒素並不是神經毒，從本發明的範疇排除。
在本發明中，產生毒素的肉毒桿菌菌株可以是肉毒桿菌或其變種，但並不限定於此，對於本領域技術人員而言，顯然可以使用能夠產生肉毒桿菌毒素的任何菌株。
因此，在一方面，本發明涉及一種肉毒桿菌毒素生產菌株的培養方法。
上述肉毒桿菌毒素生產菌株的培養方法包括：步驟（a），在種菌培養基中培養肉毒桿菌毒素生產菌株；以及步驟（b），在本培養基中，以pH 5.0～6.0，優選地，以pH 5.2～5.8，更優選地，以pH 5.3～5.7培養種菌培養完成的上述肉毒桿菌毒素生產菌株。
本發明的特徵在於，上述步驟（a）在厭氧環境中進行培養，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，在上述步驟（a）中，種菌培養基包含馬鈴薯蛋白腖（potato peptone）、酵母提取物（yeast extract）及葡萄糖（glucose）作為有效成分，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，以3.0％(w/v)～4.0％(w/v)的濃度包含上述馬鈴薯蛋白腖，優選地，以3.3％(w/v)～3.8％(w/v)的濃度包含上述馬鈴薯蛋白腖，更優選地，以3.5％(w/v)的濃度包含上述馬鈴薯蛋白腖，以0.5w/v％～2.5w/v％的濃度包含酵母提取物，優選地，以1.0w/v％～1.5w/v％的濃度包含酵母提取物，更優選地，以1.2w/v％的濃度包含酵母提取物，以0.5w/v％～2.5w/v％的濃度包含葡萄糖，優選地，以1.0w/v％～1.5w/v％的濃度包含葡萄糖，更優選地，以1.2w/v％的濃度包含葡萄糖，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，在上述步驟（a）中，種菌培養基通過混合氣體進行氣體置換，上述混合氣體包含選自由N
2、CO
2及H
2組成的組中的兩種以上的氣體，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，上述步驟（b）在28℃～32℃的溫度下培養24小時～144小時，優選地，培養48小時～96小時，但並不局限於此。
在本發明中，為了保持上述pH 5.0～6.0的範圍，優選地，為了保持pH 5.2～5.8的範圍，更優選地，為了保持pH 5.3～5.7的範圍，在本培養4小時後，在調節成不超出上述pH範圍的同時培養24小時～144小時，優選地，可培養48小時～96小時，但並不局限於此。更詳細地，開始超出上述pH範圍就進行滴定，直到pH無變化為止進行滴定。上述pH滴定可利用鹼性物質進行，優選地，可利用氫氧化鈉（Sodium hydroxide）進行，但並不局限於此。
在本發明中，當進行上述菌株的本培養時，pH值減小，在本培養4小時～8小時後，達到pH 5.3，在本培養13小時～17小時後，培養液的pH變化緩慢，從而可保持pH 5.5左右，但並不局限於此。更詳細地，在本培養4小時～8小時後，開始調節pH，在本培養13小時～17小時後，培養液的pH變化開始緩慢，就可結束pH調節，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，上述肉毒桿菌毒素為肉毒桿菌毒素II組，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，上述肉毒桿菌毒素II組可以為選自由E型肉毒桿菌毒素、非蛋白水解（Non-proteolytic）B型肉毒桿菌毒素及非蛋白水解（Non-proteolytic）F型肉毒桿菌毒素組成的組中的一種以上，但並不局限於此。
本發明的特徵在於，通過上述方法，將菌株的肉毒桿菌毒素上產率增加5倍以上，優選地，將菌株的肉毒桿菌毒素上產率增加9.5倍以上，但並不局限於此。
在另一方面，本發明涉及用於培養菌株的培養基組合物，其包含3.0％(w/v)～4.0％(w/v)的馬鈴薯蛋白腖（優選為3.3％(w/v)～3.8％(w/v)，更優選為3.5％(w/v)）、0.5w/v％～2.5w/v％的酵母提取物（優選為1.0w/v％～1.5w/v％，更優選為1.2w/v％）及0.5w/v％～2.5w/v％的葡萄糖（優選為1.0w/v％～1.5w/v％，更優選為1.2w/v％）的葡萄糖作為有效成分，且用於生產選自由E型肉毒桿菌毒素、非蛋白水解B型肉毒桿菌毒素及非蛋白水解F型肉毒桿菌毒素組成的組中的一種以上的肉毒桿菌毒素。
在另一方面，本發明涉及肉毒桿菌毒素的製備方法。
上述肉毒桿菌毒素的製備方法包括：步驟（a），通過上述方法培養肉毒桿菌毒素生產菌株來生成肉毒桿菌毒素；以及步驟（b），回收生成的上述肉毒桿菌毒素。
在本發明中，術語「排除動物源性成分」是指基本上不包括動物源性成分或基本上不包括動物蛋白，特別是指不包括或基本上不包括血源性、血液集中的（blood-pooled）其他動物源性產品或化合物。術語「動物」是指哺乳動物（諸如人）、鳥類、爬蟲類、魚類、昆蟲、蜘蛛或其他種類的動物。「動物」不包括微生物，諸如細菌。因此，屬於本發明的範圍內的不包括動物性產品的培養基或方法或基本上不包括動物性產品的培養基或方法可以包括肉毒桿菌毒素或肉毒桿菌。例如，不包括動物性產品的方法或基本上不包括動物性產品的方法是指基本上不包括、實質上不包括或完全不包括動物源性蛋白質的方法，例如免疫球蛋白、肉類消化液、肉類副產品和乳或乳製品或分解物。因此，不包括動物性產品的方法的多個實例包含不包括肉類和乳製品或肉類或乳製品副產物的方法（如細菌培養法或細菌發酵法）
本發明提供了一種培養基，該培養基包括至少降低水準的動物或乳製品副產物，基本上不含動物或乳製品副產物。術語「動物或乳製品副產物」是指在動物（不包括細菌）胞中或由動物（不包括細菌）細胞在體內或體外製備的化合物或化合物的組合物。優選的非動物源性的培養基成分如蛋白質、氨基酸和氮包括植物、微生物（諸如酵母菌）和合成的化合物。
根據本發明的培養基包括但不限於一種用於發酵少量或大量肉毒桿菌的培養基、一種用於生長和培養肉毒桿菌的培養基，該肉毒桿菌用於接種到種子（種菌培養基）培養基和發酵（本培養基）培養基中。
作為本發明的一個具體優選的實施例，用於肉毒桿菌的生長和生產肉毒桿菌毒素的培養基可以包括一種馬鈴薯來源的成分，優選為馬鈴薯蛋白腖，從而取代動物來源的成分。
本發明提供了一種生長肉毒桿菌的方法，該方法能夠使用基本上不含動物源成分的培養基，在最短的時間內最大限度地產生肉毒桿菌毒素。可以使用含有馬鈴薯蛋白腖的培養基組合物來生長肉毒桿菌，而不是使用動物來源的成分。
在本發明的一個優選的實施例中，肉毒桿菌的生長分成兩個步驟（即，種子生長和發酵）進行。優選地，這兩個步驟在厭氧環境中進行。種子生長（種菌培養）一般用於「擴大（scale-up）」儲存培養物中的微生物含量。種子生長（種菌培養）的目的是為了增加可用於發酵的微生物含量。此外，種子生長（種菌培養）步驟使儲存培養物中相對休眠的微生物重新煥發活力，並且生長為積極生長的培養物。此外，相較于儲存的培養物，在更積極生長的培養物中，用於接種到發酵培養基中的存活的微生物的體積和數量可以更精確地控制。因此，接種到發酵培養基（本培養基）中的種子培養物的生長是優選的。此外，可以使用包括在種子培養基（種菌培養基）中生長在內的多個連續步驟，以擴大接種到發酵培養基（本培養基）中的肉毒桿菌的量。
在發酵（本培養）步驟中，來自種子生長產物中含有肉毒桿菌的種子培養基（種菌培養基）的部分或全部可以用於接種到發酵培養基（本培養基）中。優選地，約1％至10％的來自種子生長（種菌培養）步驟中含有肉毒桿菌的種子培養基（種菌培養基）用於接種到發酵培養基（本培養基）中。發酵（本培養）用於在大規模的厭氧環境中產生最大的量的微生物。
經由上述方法所培養的菌株的培養液中所包含的肉毒桿菌毒素可以使用蛋白質純化領域中的技術人員所知的蛋白質純化方法來分離和純化。
肉毒桿菌的生長可以在一個以上的步驟中進行。優選地，生長在兩個步驟中進行。在作為第一個步驟的種子生長（種菌培養）中，將肉毒桿菌懸浮在根據本發明的培養基組合物中，並且在30±2℃的溫度、厭氧環境下培養18小時至30小時。優選地，種子生長（種菌培養）進行約24小時。優選地，在將種子培養基（種菌培養基）中的最終生長產物接種到發酵培養基（本培養基）中之前，在該種子培養基（種菌培養基）中在任何步驟下的生長都不會導致細胞自溶（cell autolysis）。
隨後，為了使肉毒桿菌進一步生長，並回收該肉毒桿菌毒素，進行作為第二步驟的發酵（本培養），即，通過使用部分或全部種子生長（種菌培養）的培養基接種本發明的培養基組合物。接種後，將肉毒桿菌在30±2℃的溫度、厭氧環境下培養48小時至96小時，並通過測定培養基的光密度（OD）來監測肉毒桿菌的生長情況。優選地，在使用根據本發明的培養基組合物的發酵步驟中，在約14小時至18小時之間獲得最大的生長水準，之後細胞裂解、OD值下降，從而在發酵步驟中在培養後96小時內，更優選為在72小時內從肉毒桿菌中回收肉毒桿菌毒素。
在下文中，將參考多個實施例以更詳細地描述本發明。然而，對於本領域技術人員而言，顯而易見的是提供這些實施例僅利用示例本發明，而不應解釋為限制本發明的範圍。
實施例
實施例1
實驗材料
本發明中使用的實驗材料如下：純水（超純水或水質等於或高於超純水）、馬鈴薯蛋白腖E210（Organotechnie，19425）、酵母提取物（BD，212750）、葡萄糖（Merck，1.37048.5000）、氫氧化鈉顆粒（Merck，1.06482.5000）、塑膠注射器路厄鎖5mL（Henke-ject，4050-X00V0）、塑膠注射器路厄鎖50mL（Henke-ject，4850003000）、0.2μm的瓶蓋篩檢程式（Merck，S2GPT05RE）、基於纖維素的深度篩檢程式（Pall，NP6PDH41）、醋酸纖維素0.2μm篩檢程式（Pall，CSS92DPRRK）
實施例2
用於培養肉毒桿菌毒素生產菌株的培養基製造方法
使用PYG培養基（馬鈴薯蛋白腖3.5％，酵母提取物1.2％，葡萄糖1.2％，pH 7.0±0.2）500mL作為種菌培養基。使用5N氫氧化鈉，將上述PYG培養基5L滴定成pH 7.0±0.2來製造本培養基。利用2μm篩檢程式除菌後，注意污染，並將上述本培養基裝在細胞袋（cellbag）並緊固在培養器中，利用混合氣體（N
2:CO
2:H
2=8:1:1）以0.2 lpm氣體置換4小時以上後使用。
實施例3
肉毒桿菌毒素生產菌株的培養方法
實施例3-1：準備菌株
取出1小瓶儲存在低溫冷凍裝置的肉毒桿菌研究細胞庫（Research Cell Bank，RCB）。確認RCB為肉毒桿菌E型NCTC8550。在BSC中解凍10分鐘。
實施例3-2：種菌培養
在生物安全工作臺上，在注意污染的同時使用魯爾式注射器（luer syringe）將解凍的RCB接種在種菌培養基中。將接種的種菌培養細胞袋裝入至設置為30℃的由混合氣體置換的厭氧腔室，並靜置培養24小時。培養24小時後，若OD600吸光度成為2～8，則結束種菌培養。
實施例3-3：本培養
在生物安全工作臺上，在注意污染的同時使用魯爾式注射器將100mL的完成種菌培養的培養液接種在本培養基中。接種後，以如表1的條件培養72小時至96小時。
表1
本培養條件
| 條件 | 設定點 |
| 溫度 | 30±2℃ |
| 氣體壓力 | 0.2±0.1 lpm |
| 氣體成分 | N 2:CO 2:H 2=8:1:1 |
培養4小時後開始，對培養液進行採樣並測定OD600值。在培養液吸光度為1以上的情況下，以1/10稀釋來測定。從pH降低至5.3以下開始，將1N的NaOH與細胞袋連接，並以470μL/分鐘～620μL/分鐘的速度注入9小時。直到培養結束為止確認pH是否保持5.5±0.2。每培養24小時，對培養液進行採樣並執行酶聯免疫吸附測定（ELISA）。培養結束後，使用深層篩檢程式、0.2μm篩檢程式來除菌，並在4℃的溫度下保存。
實施例4
通過酶聯免疫吸附測定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）確認肉毒桿菌毒素。
在酶標板-包被緩衝液稀釋5μg/mL的抗體A緩衝液:抗體A原液並準備，向96孔板的各孔接種100μL並塗敷16小時以上後，將利用洗滌緩衝液洗滌各孔的過程共反復3次。利用封閉緩衝液（Super block）封閉各孔後，將利用洗滌緩衝液洗滌各孔的過程共反復3次。
對在培養過程中採樣的培養液進行稀釋並向各孔添加100μL，反應2小時後，將利用洗滌緩衝液洗滌各孔的過程共反復3次。向各孔添加100μL的檢測抗體稀釋液，反應2小時後，將利用洗滌緩衝液洗滌各孔的過程共反復3次。向各孔添加100μL的抗IgG抗體稀釋液，反應1小時後，將利用洗滌緩衝液洗滌各孔的過程共反復5次。向各孔添加100μL的四甲基聯苯胺（TMB），反應20分鐘後，向各孔添加50μL的終止液，並適當搖晃來停止酶反應。使用微板讀卡器在各孔測定450nM吸光度。
實施例5
比較根據培養基組合物的肉毒桿菌毒素生產量
本發明人利用在現有專利（韓國公開專利10-2020-0114722）中公開的培養基組合物（馬鈴薯蛋白腖：3％，酵母提取物：1％，葡萄糖：1％）及在本發明中公開的培養基組合物（馬鈴薯蛋白腖：3.5％，酵母提取物：1.2％，葡萄糖：1.2％）分別培養E型肉毒桿菌毒素生產菌株，並比較生產的肉毒桿菌毒素量。
結果確認了，相比于在現有專利的培養基組合物中培養菌株的情況，在本發明的培養基組合物中培養菌株的情況下的毒素量增加約18％（圖4）。即，確認了，E型肉毒桿菌毒素生產菌株在包含3.5％的馬鈴薯蛋白腖、1.2％的酵母提取物、1.2％的葡萄糖的培養基培養的情況下的毒素生產量優秀。由此，確認了用於培養E型肉毒桿菌毒素生產菌株及A型肉毒桿菌毒素菌株的培養基組合物不同。
實施例6
比較根據pH滴定的肉毒桿菌毒素生產量
與以往一樣，培養後將培養液pH滴定條件設置為如表2，並調節pH在培養工藝中不超出所設置的範圍來進行培養。
表2
培養中的pH滴定條件
| 試驗組 | 條件 |
| 對照組 | 未滴定pH（現有配置） |
| pH 6.0試驗組 | 培養過程中調節為pH 6.0±0.2 |
| pH 5.5試驗組 | 培養過程中調節為pH 5.5±0.2 |
培養結果，在現有配置的對照組中，未進行pH滴定，最終回收時確認了pH為4.85，pH 6.0試驗組、pH 5.5試驗組以上述調節的範圍內的pH結束。具體地，最終回收時確認了pH 6.0試驗組為pH 5.8-6.2，pH 5.5試驗組為pH 5.3-5.7。
表3
培養中的pH滴定結果
| 試驗組 | 最大 OD | 最終 OD | 自溶 | 毒素（ mg/L ） |
| 對照組 | 5.74 | 4.79 | 17％ | 1.90 |
| pH 6.0 試驗組 | 7.54 | 2.57 | 66％ | 9.77 |
| pH 5.5 試驗組 | 6.01 | 3.66 | 39％ | 18.10 |
當比較以上述表5的條件培養的三個批次時，以pH 6.0滴定的pH 6.0試驗組的菌株的最大OD值和自溶率最高，未進行pH滴定的對照組最低。該結果支援了菌株生長時需要適當的pH調節。
並且，當比較上述表3中的三個批次的毒素量時，以pH 5.5±0.2滴定的pH 5.5試驗組為最高的18.10mg/L，由此確認了生產率優秀。因此，將滴定調節設置為pH 5.5±0.2後進行實驗。
實施例7
比較根據培養時間的肉毒桿菌毒素生產量
當以24小時為單位測定培養液的毒素量時，48小時之後，毒素量類似（圖3）。確認了毒素量在48小時之後類似，從而將培養時間設置為48小時-96小時。
實施例8
比較根據培養條件的肉毒桿菌毒素生產量
通過DOE實驗設計，設置培養條件參數。以上述培養條件培養並測定毒素量的結果如表4。
表4
根據DOE實驗設計的毒素量測定結果
| 組 | 批號 | 溫度 | 滴定 pH | 氣壓 | 氣體種類 | 毒素量（ mg/L ） |
| 1 | DOE 1 | 32 | 5.2 | 100 | 混合 | 6.95 |
| DOE 2 | 28 | 5.8 | 300 | 氮氣 | 18.15 | |
| DOE 3 | 30 | 5.5 | 200 | 混合 | 27.64 | |
| 2 | DOE 4 | 32 | 5.8 | 100 | 氮氣 | 18.61 |
| DOE 5 | 28 | 5.2 | 300 | 混合 | 1.50 | |
| DOE 6 | 30 | 5.5 | 200 | 氮氣 | 15.61 | |
| 3 | DOE 7 | 28 | 5.8 | 100 | 混合 | 16.64 |
| DOE 8 | 32 | 5.2 | 300 | 氮氣 | 8.07 | |
| DOE 9 | 30 | 5.5 | 200 | 混合 | 25.04 | |
| 4 | DOE 10 | 28 | 5.2 | 100 | 氮氣 | 7.345 |
| DOE 11 | 32 | 5.8 | 300 | 混合 | 11.65 | |
| DOE 12 | 30 | 5.5 | 200 | 氮氣 | 17.09 |
通過統計程式（Minitab18）分析表4的毒素量的結果，確認了在上述設置條件下影響毒素量的因素為pH滴定值（表5）。培在設置的條件下，培養溫度、氣壓、氣體種類對於毒素量的影響不顯著。
確認了pH 5.5±0.3條件下，P值為0.016。即，pH的P值小於0.05，變數之間沒有交流，且存在曲率效應。
表5
影響毒素量的因素篩選結果
| 係數 | P | |
| 常數 | 55.57 | |
| 溫度 | 1.02 | 0.904 |
| pH | 25.75 | 0.016 |
| 氣壓 | -6.36 | 0.461 |
| 氣體種類 | ||
| 溫度*pH | ||
| 溫度*氣壓 | ||
| 溫度*氣體種類 | ||
| Ct Pt | 51.2 | 0.008 |
| S | 23.0441 | |
| R-sq | 77.24% | |
| R-sq(adj) | 64.24% | |
| R-sq(pred) | 44.43% | |
| AlCc | 131.68 | |
| BlC | 117.79 | |
| 移除 =0.05 |
具體地，根據表4的毒素量比較結果，確認了以pH 5.5滴定的中心批次的毒素量最高。並且，確認了在培養過程中，根據是否滴定pH及條件，毒素量具有顯著差異（圖5）。並且，確認了培養過程中，pH 5.5±0.2條件示出與pH 5.5培養條件相似的生產率（圖6）。因此，設置為以pH 5.5±0.2滴定（圖6）。
針對培養溫度，確認了在28℃-32℃的範圍內，不會顯著地影響毒素量，因此將培養溫度設置為30±2℃（表5）。
針對氣壓，確認了在100 lpm-300 lpm的範圍內，不會顯著地影響毒素量，因此將氣壓設置為200±100 lpm（表5）。
針對氣體種類，確認了混合氣體及氮氣均不會顯著地影響毒素量，由此判斷為兩種氣體均可使用（表5）。但是，確認毒素量的結果（表4），在中心條件下，相比于利用氮氣培養的DOE 6、DOE 12批次，利用混合氣體培養的DOE 3、DOE 9批次的平均毒素量（26.34mg/L，16.35mg/L）約高38％。因此，當進行菌株培養時，混合氣體及氮氣均可使用，但建議使用混合氣體。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
無
圖1示出根據培養時間的肉毒桿菌菌株OD600值的變化。
圖2示出根據培養時間的培養液的pH值變化。
圖3示出根據培養時間的肉毒桿菌毒素量。
圖4示出根據培養基組合物的毒素量。
圖5及圖6示出根據pH值調節的毒素量。
Claims (10)
- 一種肉毒桿菌毒素生產菌株的培養方法，包括：步驟(a)，在種菌培養基中培養肉毒桿菌毒素生產菌株；以及步驟(b)，在本培養基中，以pH 5.0~6.0培養種菌培養完成的上述肉毒桿菌毒素生產菌株，在上述步驟(a)中，種菌培養基包含3.0%(w/v)~4.0%(w/v)的馬鈴薯蛋白腖、0.5w/v%~2.5w/v%的酵母提取物及0.5w/v%~2.5w/v%的葡萄糖作為有效成分，在上述步驟(b)中，本培養基包含3.0%(w/v)~4.0%(w/v)的馬鈴薯蛋白腖、0.5w/v%~2.5w/v%的酵母提取物及0.5w/v%~2.5w/v%的葡萄糖作為有效成分，在上述步驟(b)中，本培養基通過將上述種菌培養基調整為pH 5.5±0.2來製備。
- 如請求項1所述的培養方法，其中，上述步驟(a)在厭氧環境中進行培養。
- 如請求項1所述的培養方法，其中，在上述步驟(a)中，種菌培養基通過混合氣體進行氣體置換，上述混合氣體包含選自由N2、CO2及H2組成的組中的兩種以上的氣體。
- 如請求項1所述的培養方法，其中，上述步驟(a)在28℃~32℃的溫度下培養18小時~30小時。
- 如請求項1所述的培養方法，其中，上述步驟(b)在厭氧環境下進行培養。
- 如請求項1所述的培養方法，其中，在上述步驟(b)中，本培養基通過混合氣體進行氣體置換，上述混合氣體包含選自N2、CO2及H2組成的組中的兩種以上的氣體。
- 如請求項1所述的培養方法，其中，上述步驟(b)在28℃~32℃的溫度下培養24小時~144小時。
- 如請求項1所述的培養方法，其中，上述肉毒桿菌毒素為選自由E型肉毒桿菌毒素、非蛋白水解B型肉毒桿菌毒素及非蛋白水解F型肉毒桿菌毒素組成的組中的一種以上。
- 一種用於培養菌株的培養基組合，其包含種菌培養基及本培養基，其中，該種菌培養基包含3.0%(w/v)~4.0%(w/v)的馬鈴薯蛋白腖、0.5w/v%~2.5w/v%的酵母提取物及0.5w/v%~2.5w/v%的葡萄糖作為有效成分，且該本培養基包含3.0%(w/v)~4.0%(w/v)的馬鈴薯蛋白腖、0.5w/v%~2.5w/v%的酵母提取物及0.5w/v%~2.5w/v%的葡萄糖作為有效成分，pH值為5.0~6.0的範圍，該培養基組合用於生產選自由E型肉毒桿菌毒素、非蛋白水解B型肉毒桿菌毒素及非蛋白水解F型肉毒桿菌毒素組成的組中的一種以上的肉毒桿菌毒素。
- 一種肉毒桿菌毒素的製備方法，包括：步驟(a)，通過根據請求項1至8中任一項之方法培養肉毒桿菌毒素生產菌株來生成肉毒桿菌毒素；以及步驟(b)，回收生成的上述肉毒桿菌毒素。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR10-2022-0120506 | 2022-09-23 |
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| TW202413628A TW202413628A (zh) | 2024-04-01 |
| TWI854378B true TWI854378B (zh) | 2024-09-01 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW202035679A (zh) | 2019-03-29 | 2020-10-01 | 南韓商技特瑪股份有限公司 | 培養基組合物 |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW202035679A (zh) | 2019-03-29 | 2020-10-01 | 南韓商技特瑪股份有限公司 | 培養基組合物 |
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