CN116874572A - 从含有肉毒杆菌毒素的溶液中分离肉毒杆菌毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了从含肉毒杆菌毒素的溶液中分离A型肉毒杆菌毒素超大复合物的方法,该方法包括进行阴离子交换色谱和阳离子交换色谱。
Description
相关申请的交叉引用
本申请是申请日为2017年11月29日、申请号为201780058610.9、标题为“从含有肉毒杆菌毒素的溶液中分离肉毒杆菌毒素的方法”的中国发明专利申请的分案申请。
上述中国发明专利申请要求于2016年10月4日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请No.10-2016-0127540的权益,其公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及从含肉毒杆菌毒素的溶液中分离肉毒杆菌毒素的方法。
背景技术
从1890年至今,已经发现了分泌具有神经毒性的毒素的梭菌属菌株,并且在过去的70年中已经对这些菌株分泌的毒素的性质进行了研究(Schant,E.J.等,Microbiol.Rev.56;80;1992)。
梭菌属包括超过127种,根据它们的形态和功能进行划分。肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)是一种厌氧菌和革兰氏阳性菌,可产生强大的多肽神经毒素,在人类和动物中引起神经麻痹性疾病,即肉毒杆菌中毒。在土壤中发现了肉毒杆菌的孢子,甚至可以在未经适当处理的食物中培养大量这些孢子。这些孢子可能导致许多形式的肉毒杆菌中毒。
根据血清学特征,肉毒杆菌毒素分为A至G七种类型。每种毒素包括约150kDa的毒素蛋白,并且天然地由与其结合的各种无毒蛋白质的复合物组成。中复合物(intermediatecomplex)(300kDa)由毒素蛋白和无毒非血凝素(HA)蛋白、大复合物(large complex)(500kDa)和超大复合物(macro complex)(900kDa)组成,每个都具有中复合物与血凝素结合于其中的结构(Sugiyama,H.,Microbiol.Rev.,44,419;1980)。已知这种无毒的非血凝素蛋白质可保护毒素免受低pH和肠内各种蛋白质水解酶的影响(Sugiyama,H.,Microbiol.Rev.,44,419;1980)。
肉毒杆菌毒素在细胞中合成为单链多肽,分子量约为150kDa,然后在距离N-末端三分之一的位置处的通过细胞内蛋白酶的作用或通过用酶如胰蛋白酶的人工处理,裂解成轻链(分子量为50kDa)和重链(分子量为100kDa)的两个亚基。与单链多肽相比,这种切割的毒素具有高度增加的毒性。这两个亚基通过二硫键相互结合,每个亚基具有不同的功能。重链与靶细胞的受体结合(FEMS Microbiol.Lett.72,243;1990),并在低pH(pH 4.0)下与生物膜反应形成通道(Mantecucco,C.et al.,TIBS 18,324;1993),并且轻链具有药理活性,因此当细胞通过表面活性剂提供渗透性或通过电穿孔将轻链引入细胞时,干扰分泌神经递质(Poulain,B.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85,4090;1988)。
A型肉毒杆菌毒素是一种天然生物制剂,已知对人类是最致命的。以摩尔计,A型肉毒毒素比白喉毒素致死高18亿倍,比氰化钠致死高6亿倍,比眼镜蛇毒素(cobratoxin)致死高3千万倍,比霍乱毒素致死高1200万倍(Singh,Critical Aspects of Bacterialprotein Toxins,page 63-84of natural toxins II,edited by B.R.Sigh et al.,Plenum Press,New York(1976))。
肉毒杆菌毒素在神经肌肉接头的胆碱能突触前抑制乙酰胆碱的胞吐作用,从而导致虚弱。考虑到即使暴露于极少量的肉毒杆菌毒素也表现出毒性,已经认为该毒素可能具有酶活性(Simpson,L.L.等,Ann.Rev.Pharmaeol.Toxicol.26,427;1986)。根据最近的报道,肉毒杆菌毒素具有金属肽酶活性,其底物是胞吐机制复合物的单位蛋白,如突触小泡蛋白、突触融合蛋白、25kDa的突触体相关蛋白(SNAP 25)等。每种类型的肉毒杆菌毒素都使用三种蛋白质中的一种作为底物,并且已知B型、D型、F型和G型肉毒杆菌毒素在特定位点切割突触小泡蛋白,A型和E型肉毒杆菌毒素在特定位点切割SNAP25,和C型肉毒杆菌毒素在特定位点切割突触融合蛋白(Binz,T.等,J.Biol.Chem.265,9153;1994)。
韩国专利公开号10-2012-0105417公开了一种从肉毒杆菌培养物中分离肉毒杆菌毒素的方法,该方法包括通过使发酵培养基与阴离子交换色谱介质接触然后使阴离子交换色谱介质的洗脱液与阳离子交换色谱介质接触,从发酵培养基中回收生物活性的肉毒杆菌神经毒素。在该方法中,在将毒素结合到阴离子交换色谱介质之后进行洗脱,但该方法没有公开未结合到介质上的毒素液流。
根据该方法,存在的问题是在肉毒杆菌毒素蛋白的纯化过程中,神经毒成分(即约150kDa的神经毒性分子),中复合物(300kDa)或大复合物(500kDa)离解并从肉毒杆菌毒素蛋白中移除。
发明内容
技术问题
一方面,提供了从含肉毒杆菌毒素的溶液中分离A型肉毒杆菌毒素超大复合物(macro complex)的方法。
技术方案
一方面,提供了从含肉毒杆菌毒素的溶液中分离A型肉毒杆菌毒素超大复合物的方法,该方法包括使含有肉毒杆菌毒素的溶液与阴离子交换色谱介质在低于肉毒杆菌毒素等电点(PI)的pH下接触;使未与阴离子交换色谱介质结合的溶液与阳离子交换色谱介质在低于肉毒杆菌毒素等电点(PI)的pH下接触;并从阳离子交换色谱介质中分离A型肉毒杆菌毒素超大复合物。或者
使含有肉毒杆菌毒素的溶液与阳离子交换色谱介质在低于肉毒杆菌毒素等电点(PI)的pH下接触;从该阳离子交换色谱介质中分离肉毒杆菌毒素;使分离自该阳离子交换色谱介质的含毒素的溶液与阴离子交换色谱介质在低于肉毒杆菌毒素等电点(PI)的pH下接触;并从未与该阴离子交换色谱介质结合的溶液中分离A型肉毒杆菌毒素超大复合物。
该方法包括使含有肉毒杆菌毒素的溶液与阴离子交换色谱介质在低于肉毒杆菌毒素的等电点(PI)的pH下接触;使未与阴离子交换色谱介质结合的溶液与阳离子交换色谱介质在低于肉毒杆菌毒素PI的pH值下接触;并从阳离子交换色谱介质中分离A型肉毒杆菌毒素超大复合物。
如本文所用,“A型肉毒杆菌毒素超大复合物”可以是通过HA1连接的两个16S毒素的二聚体,该HA1是HA蛋白之一,每个16S毒素,即约500kDa的毒素,由肉毒杆菌毒素(BoNT)、无毒非HA(NTNHA)和HA组分组成。
该方法包括使含肉毒杆菌毒素的溶液与阴离子交换色谱介质在低于肉毒杆菌毒素PI的pH下接触。
在上述方法中,含有肉毒杆菌毒素的溶液可以是肉毒杆菌培养物或由其衍生的溶液。由其衍生的溶液可以是通过从培养物中部分纯化毒素而获得的溶液。肉毒杆菌的培养可以通过已知方法进行。培养可以在含有植物来源组分的培养基中进行。与现有技术不同,通过使用含有植物来源组分的培养基进行培养,从而在细胞外表达毒素。如本文所用,“在细胞外表达毒素”是指在细胞产生毒素后,细胞自发排出毒素,并且其中表达的含有毒素的细胞也被裂解,由此毒素暴露于培养溶液中,而不是在培养的细胞内。
含有植物来源组分的培养基可包括植物蛋白胨,优选植物蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖。此外,含有植物来源组分的培养基还可包含一种或多种选自植物胰蛋白胨、大豆胨和硫代乙醇酸钠的组分。此外,含有植物来源成分的培养基可以是选自含有葡萄糖、酵母提取物和植物蛋白胨的培养基;含有葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨和植物胰蛋白胨的培养基;含有葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨和大豆胨的培养基;含有葡萄糖、酵母提取物、大豆胨和植物胰蛋白胨的培养基;含有葡萄糖、酵母提取物、硫代乙醇酸钠、植物蛋白胨、植物胰蛋白胨和大豆胨的培养基;和含有葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨、植物胰蛋白胨和大豆胨的培养基。
此外,在描述为含有植物来源成分的培养基的每种培养基中葡萄糖、酵母提取物、巯基乙酸钠、植物蛋白胨、植物胰蛋白胨和大豆胨基于介质总重量的量可以是分别是0.2%至2%、0.5%至5%、0.05%至2%、0.5%至2%、0.5%至2%和0.5%至2%。含有植物来源成分的培养基可以选自含有葡萄糖、酵母提取物和植物蛋白胨的培养基;含有葡萄糖和酵母提取物的培养基;含有葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨和植物胰蛋白胨的培养基;含有葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨和大豆胨的培养基;含有葡萄糖、酵母提取物、大豆胨和植物胰蛋白胨的培养基;含有葡萄糖、酵母提取物、硫代乙醇酸钠、植物蛋白胨、植物胰蛋白胨和大豆胨的培养基;和含有葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨、植物胰蛋白胨和大豆胨的培养基。基于介质的总重量,上述每种培养基中葡萄糖、酵母提取物、硫代乙醇酸钠、植物蛋白胨、植物胰蛋白胨和大豆胨的量分别为0.2%至2%、0.5%至5%、0.05%至2%、0.5%至2%、0.5%至2.0%和0.5%至2%,并且培养基的其余部分可以由水组成。
毒素可以选自肉毒杆菌毒素A、B、C、D、E、F和G,并且优选地,毒素可以是A型毒素。肉毒杆菌毒素A的等电点可为约6.06。因此,“低于等电点的pH”可以根据待分离的毒素的类型而不同。例如,在A型毒素的情况下,pH可以是6.06或更低、6.05或更低、6.00或更低、5.7或更低、5.5或更低、5.0或更低、4.5或更低、4.0或更低、或3.5或降低。在A型毒素的情况下,pH可以是2.5至6.05、3.0至6.00、3.5至5.5、3.5至5.0、3.5至4.5、3.5至4.0、3.5至6.00、4.0至6.0、4.5至6.0、5.5至6.0、4.0到5.5或4.5到5.5。
用于阴离子交换色谱的阴离子交换树脂可以是被二乙基氨基乙基(DEAE)基团或季铵(Q)基团取代的树脂,但不限于此。例如,可使用如美国专利5,696,077、国际专利公开WO96/05222和美国专利5,846,929描述的DEAE-Sephadex。优选地,可以使用选自具有强碱性季铵基团或弱碱性二乙基氨基乙基(DEAE)基团的阴离子交换树脂中的任何一种。
例如,强碱性阴离子交换基团可以Q Sepharose Fast Flow、Q Sepharose HighPerformance、Resource Q、Source 15Q、Source 30Q、Mono Q、Mini Q、Capto Q、Capto QImpRes、Q HyperCel、Q Cermic HyperD F、Nuvia Q、UNOsphere Q、Macro-Prep High Q、Macro-Prep 25 Q、Fractogel EMD TMAE(S)、Fractogel EMD TMAE Hicap(M)、FractogelEMD TMAE(M)、Eshmono Q、Toyopearl QAE-550C、Toyopearl SuperQ-650C、ToyopearlGigaCap Q-650M、Toyopearl Q-600C AR、Toyopearl SuperQ-650M、Toyopearl SuperQ-650S、TSKgel SuperQ-5PW(30)、TSKgel SuperQ-5PW(20)、TSKgel SuperQ-5PW等,但不限于此。可以使用本领域已知的任何阴离子交换树脂。
通过阴离子交换色谱,肉毒杆菌毒素可以在不结合介质的情况下流出,并且杂质与介质结合。色谱法流出的液体可用于进一步分离。
在上述方法中,接触可以包括使含肉毒杆菌毒素的溶液流入介质中,例如,在预定条件下使含肉毒杆菌毒素的溶液流入填充在柱中的介质中。可以控制诸如流速、温度、时间等的条件。在接触中,磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或乙酸盐缓冲溶液可用作柱缓冲溶液。柱缓冲溶液的浓度可以控制在5mM至30mM,例如,7mM至27mM,10mM至25mM,或15mM至20mM。流动相的流速可以是0.5ml/min至5.0ml/min,1.0ml/min至30.0ml/min,10ml/min至30.0ml/min,或15ml/min至25.0ml/min。在这方面,在将缓冲溶液的电导率调节为3mS/cm至30mS/cm并且完成柱平衡之后,可以注入样品。
此外,该方法可包括使未与介质结合的溶液与阳离子交换色谱介质在低于肉毒杆菌毒素的PI的pH下接触。“低于PI的pH”和“接触”与上述相同。
在上述方法中,阳离子交换色谱介质可以是具有强酸性阳离子交换基团的介质,例如磺丙基(SP)和甲基磺酸盐(S),或弱酸性阳离子交换基团,例如羧甲基(CM)。
此外,该方法包括从阳离子交换色谱介质中分离肉毒杆菌毒素。分离毒素可包括通过使介质与洗脱溶剂接触从而从洗脱溶剂中回收肉毒杆菌毒素。可以使用任何洗脱溶剂,只要它可以将毒素与介质分离即可。洗脱溶剂可以是,例如,用于缓冲柱的缓冲溶液或可以适当控制盐浓度或电导率的缓冲溶液。盐可以是Na或K的盐。柱缓冲溶液可以是磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或乙酸盐缓冲溶液。柱缓冲溶液的浓度可以控制在5mM至100mM,例如10mM至100mM、20mM至100mM、或30mM至70mM。作为流动相的洗脱溶剂的流速可以是0.5ml/min至5.0ml/min、1.0ml/min至150.0ml/min、50.0ml/min至150.0ml/min、或75.0ml/min至125.0ml/min。在这方面,洗脱溶剂的电导率可以是3mS/cm至30mS/cm。洗脱溶剂可以是含有0.5M至2.0M NaCl(例如1.0MNaCl)的磷酸盐缓冲液(50mM,pH5.0)。
该方法可以进一步包括在与阴离子交换色谱介质接触之前、在与阳离子交换色谱介质接触之前,或者在这两个过程中的每一者之前,将肉毒杆菌毒素或含有肉毒杆菌毒素的溶液的pH调节至低于肉毒杆菌毒素的PI的pH。调节可以包括将肉毒杆菌毒素或含有肉毒杆菌毒素的溶液与pH低于肉毒杆菌毒素的PI的缓冲液混合。缓冲液可以是磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液或其混合物。缓冲液的pH可以为3.5至6.5,或3.5至5.5。缓冲液可包括10mM至100mM磷酸盐、柠檬酸盐或乙酸盐。
该方法可以进一步包括在与阴离子交换色谱介质接触之前,在与阳离子交换色谱介质接触之前,或在这两个过程中的每一个之前,对含肉毒杆菌毒素的溶液进行超滤。超滤可以通过使用截留分子量为25kDa至125kDa的膜进行。可以调节超滤,使得在与阳离子交换色谱介质接触之前的截留分子量(例如,50kDa的截留分子量)可以低于在与阴离子交换色谱介质接触之前的截留分子量(例如,截留分子量为100kDa)。
该方法包括通过在与阴离子交换色谱介质接触之前在培养基中培养肉毒杆菌在细胞外表达肉毒杆菌毒素,并且含有肉毒杆菌毒素的溶液可以是通过从获得的培养物中除去细胞而在细胞外表达的含肉毒杆菌毒素的一部分。
该方法包括通过在与阴离子交换色谱介质接触之前在培养基中培养肉毒杆菌以在细胞外表达肉毒杆菌毒素;并通过向培养液中加入酸来沉淀毒素,所述培养液是通过从培养物中除去细胞而获得的,然后分离沉淀物;将沉淀物溶解在培养基中并进行超滤,其中含有肉毒杆菌毒素的溶液可以是通过超滤获得的溶液。
在该方法中,可以通过选自深度过滤和微滤的一次或多次过滤来除去细胞,可以通过用酸将培养物保持在pH 3至pH 4来进行毒素的沉淀,并且超滤可以通过使用截留分子量为100kDa或更低的膜进行。
另一方面提供了从含肉毒杆菌毒素的溶液中分离肉毒杆菌毒素的方法,该方法包括使含有肉毒杆菌毒素的溶液与阳离子交换色谱介质在低于PI的pH下接触,从而将肉毒杆菌毒素与阳离子交换色谱介质分离,使含有与介质分离的毒素的溶液与阴离子交换色谱介质在低于PI的pH下接触,并从未与介质结合的溶液中分离出肉毒杆菌毒素。
含有肉毒杆菌毒素的溶液与阳离子交换色谱介质在低于PI的pH下的接触和从阳离子交换色谱介质中分离肉毒杆菌毒素与上述相同,除了使用含有肉毒杆菌毒素的溶液代替“未与介质结合的溶液”。此外,“含有从介质中分离的毒素的溶液与阴离子交换色谱介质在低于PI的pH下接触,并且从未与介质结合的溶液中分离出肉毒杆菌毒素”与上述相同,除了使用“含有与介质分离的毒素的溶液”代替“含有肉毒杆菌毒素的溶液”之外。
现在将详细参考实施例,其示例在附图中示出,其中,相同的标号始终表示相同的元件。在这方面,本实施例可以具有不同的形式,并且不应该被解释为限于这里阐述的描述。因此,下面仅通过参考附图来描述实施例以解释方面。
有利效果
根据一个方面的从含肉毒杆菌毒素的溶液中分离肉毒杆菌毒素的方法,可以从含有肉毒杆菌毒素的溶液中有效地分离出肉毒杆菌毒素A型超大复合物,即900kDa。
附图说明
结合以下附图对实施例的描述,这些和/或其他方面将变得显而易见并且更容易理解,其中:
图1是显示从肉毒杆菌培养物中纯化肉毒杆菌A型毒素的过程的示意图;以及
图2是显示通过阳离子交换色谱法获得的样品的SEC-HPLC结果的示意图。
具体实施方式
在下文中,将参考实施例更详细地描述本发明。然而,这些实施例仅用于说明目的,并且本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1:肉毒杆菌培养和肉毒杆菌毒素的纯化
1.肉毒杆菌的培养
在该实施例中,通过在不含动物产物的培养基中培养肉毒杆菌,在细胞外表达大量的肉毒杆菌A型毒素。
使用的培养基是基于培养基的总重量含有4%酵母提取物和0.5%葡萄糖的培养基。将培养基的组分溶解在注射用水(WFI)中,并用NaOH将pH调节至7.2。
将如此制备的200ml培养基通过无菌一次性微滤系统(0.2μm Sartorius2,由Sartorius制造)过滤,并注入CellbagTM(由GE healthcare制造,一次性发酵袋)。然后,通过样品注入口用1ml的密度为106细胞/ml~107细胞/ml的肉毒杆菌种子培养物接种培养基。CellbagTM是一次性生物反应器,其使用摇摆运动以在低剪切应力下引起混合。CellbagTM是包括空气入口和出口以及样品端口的袋,并且由柔性材料构成,并且袋是不透气的。此外,该袋配备有与其结合的泵,其用于袋充气和细胞供应。使用的袋的体积为2L。
进行培养使得含有200ml菌种培养物的2L CellbagTM在CellbagTM中使用摇动单元在10rpm摇动下在37℃下菌种培养12小时至30小时,并且通过由聚碳酸酯制成的无菌一次性连接器(Kleenpack连接器PALL)将所得物接种在含有20L主培养基的袋中,然后在保持厌氧条件的同时培养48小时至72小时。将无菌过滤器(0.2μm)安装在袋的样品注入口,并通过无菌过滤器将200ml物质培养基注入袋中。使用蠕动泵进行培养基的注入。
将菌种培养基注入袋中使其没有顶部空间以维持厌氧条件。菌种培养物也以相同的方式注入。另外,通过将袋子安装在CellbagTM摇臂单元的平台上并在37℃的温度下以10rpm摇动袋子来进行主培养。在主培养期间,用1800L氮气吹扫6小时以保持袋内的厌氧条件,并且培养温度可以是34℃、35℃或36℃,此外还有37℃。
在培养终止后,将作为无菌连接器的QDC连接器(由Satorious制造)连接到袋的样品端口,并将培养物通过无菌连接器转移到另一个一次性袋(柔性一次性袋)。然后,将无菌一次性深度过滤器(Sartoclear或SupraCap,PALL)和微过滤器(0.2μm,Sartopore 2,Sartorius)连接到含有培养物的一次性容器中,并通过其过滤培养物以除去细胞。然后,将获得的上清液放入另一个一次性袋中。从上清液中纯化肉毒杆菌毒素。
2.从培养物中纯化肉毒杆菌毒素
在下文中,将详细描述从去除细胞的培养物中产生A型毒素的方法。
(1)酸沉淀
将1N硫酸加入到含有20L如上获得的培养上清液的袋中,将pH调节至3.0-4.5,结果,沉淀出毒素蛋白。该过程的所有步骤也在一次性样品袋中进行而不与外部接触。
然后,当沉淀完成时,将所得溶液通过无菌一次性过滤系统(一次性片2000.2μm过滤器,由Sartorius制造)过滤而不与外部接触,从而除去上清液,并将沉淀物收集在一次性样品袋中。将5L的WFI加入到收集的沉淀物中以洗涤硫酸,并将无菌一次性微滤系统(一次性片200 0.2μm过滤器)连接到袋上,并除去上清液。结果,将沉淀物收集到一次性袋中。
(2)浓缩和过滤
将10L柠檬酸盐缓冲液(25mM,pH5.5)加入到收集的沉淀物中以重新溶解沉淀物中存在的毒素蛋白。该过程也在一次性袋中进行,而不与外部接触。将无菌一次性过滤系统(0.2μm,ULTA Cap HC,GE,USA)连接到含有重新溶解的样品的袋子上,并且在不与外部接触的情况下进行过滤。结果,将上清液收集在无菌一次性袋中,除去不溶性杂质。
将截留分子量为100kDa的无菌一次性超滤膜(一次性片200 100kDa,由Sartorius制造)连接到含有除去不溶性杂质的样品的袋子上。然后,过滤样品而不与外部接触以进行浓缩。即使在该过程中,毒素蛋白质也与无菌容器的内表面接触而不与外部接触。
(3)阴离子交换色谱
接下来,在完成浓缩和缓冲液交换之后,将一次性DEAE阴离子交换色谱系统(DEAEBPG columnTM:GE Healthcare)连接到含有样品的袋子,并且进行DEAE阴离子交换色谱而不与外部接触。具体地,使柠檬酸盐缓冲液(25mM pH 5.5)通过填充有DEAE阴离子交换树脂的柱以平衡柱,并使含有毒素的柠檬酸盐缓冲液(25mM pH 5.5)通过柱。在该过程中,肉毒杆菌A型毒素未被吸附到阴离子交换树脂上,而大多数杂质被吸附并除去。流速为20ml/min,pH保持在5.5。
(4)浓缩和过滤
接下来,从阴离子交换色谱期间未与阴离子交换树脂结合的流通溶液中收集含有肉毒杆菌A型毒素的部分。
将截留分子量为50kDa的无菌一次性超滤膜(一次性片200 100kDa,由Sartorius制造)连接至含有该级分的袋子,并通过过滤进行浓缩而不与外部接触,并且通过使用磷酸盐缓冲液(50mM pH 5.0)进行缓冲液交换。即使在该过程中,毒素蛋白质也与无菌容器的内表面接触而不与外部接触。作为缓冲液交换中使用的缓冲液,除了使用磷酸盐缓冲液(50mMpH 5.0),10mM至75mM磷酸盐缓冲液,柠檬酸盐缓冲液或pH值为3.5至6.5、或具有比肉毒杆菌毒素pI低3.5-5.5的pH的乙酸盐缓冲液,也可以使用。
(5)阳离子交换色谱
接下来,将一次性SP阳离子交换色谱系统(GE healthcare,SP sepharose FF)连接到包含通过缓冲液交换获得的样品的袋子,并进行阳离子交换色谱而不与外部接触。具体地,使磷酸盐缓冲液(75mM pH5.0)通过填充有SP阳离子交换树脂的柱以使柱平衡,并使样品通过柱。在该过程中,肉毒杆菌A型毒素被吸附到阳离子交换树脂上。该过程以100ml/min的流速进行25分钟,并将pH维持在5.0。然后,通过使用含有1M NaCl的磷酸盐缓冲液(75mM pH 5.0)进行洗脱。
将获得的样品进行尺寸排阻色谱(SEC-HPLC),并分析毒素的纯度。作为流动相,使用pH 6.5的40mM磷酸盐溶液。连接SRT SEC-500(Sepax Technologies制造,P/N 215500)柱,加载40μL A型肉毒杆菌毒素蛋白,并以0.8mL/min的速度通过柱20分钟。
图1是显示从肉毒杆菌培养物中纯化肉毒杆菌A型毒素的过程的示意图。
图2是显示通过阳离子交换色谱法获得的样品的SEC-HPLC结果的示意图。
【表1】
表1示出了图2的峰值数据。A型毒素的纯度为99.64%。具体地,在保留时间(RT)出现的HMW1为0%,表明其不存在。在表1中,HMW1和HMW2分别代表聚集体1和聚集体2,12S(300kDa)和19S(900kDa)被认为是12S毒素(也称为“M毒素”,由BoNT毒素和无毒非HA组成(NTNHA))和通过HA蛋白之一的HA1连接的两个16S毒素的二聚体,每个16S(500kDa)毒素由BoNT、NTNHA和HA组分组成。HA组分具有三种不同的蛋白质,即HA1,HA2和HA3。A型毒素具有12S、16S和19S的形式。
因此,根据该纯化方法,可以高纯度分离未解离的A型肉毒杆菌毒素的超大复合物。
应该理解的是,这里描述的实施例应该仅被认为是描述性的,而不是为了限制的目的。通常应当认为每个实施例中的特征或方面的描述可用于其他实施例中的其他类似特征或方面。
虽然已经参考附图描述了一个或多个实施例,但是本领域普通技术人员将理解,在不脱离由所附权利要求限定的精神和范围的情况下,可以在形式和细节上进行各种改变。
工业实用性
因此,根据纯化方法,可以高纯度分离未解离的A型肉毒杆菌毒素的超大复合物。
Claims (10)
1.一种从含有肉毒杆菌毒素的溶液中分离A型肉毒杆菌毒素超大复合物的方法,所述方法包括:
从通过将肉毒杆菌在不含动物产物的培养基中培养获得的培养物获得所述含有肉毒杆菌毒素的溶液;
使所述含有肉毒杆菌毒素的溶液与阴离子交换色谱介质在低于肉毒杆菌毒素等电点(PI)的pH下接触;
使所述含有肉毒杆菌毒素的溶液的未与所述阴离子交换色谱介质结合的流通部分与阳离子交换色谱介质在低于肉毒杆菌毒素PI的pH下接触;以及
从所述阳离子交换色谱介质中分离所述A型肉毒杆菌毒素超大复合物;或者
使所述含有肉毒杆菌毒素的溶液与所述阳离子交换介质在低于肉毒杆菌毒素PI的pH下接触;
从所述阳离子交换色谱介质中分离肉毒杆菌毒素;
使包含从所述阳离子交换色谱介质中分离的毒素的溶液与所述阴离子交换介质在低于所述PI的pH下接触;以及
从含有所述毒素的所述溶液的未与所述阴离子交换色谱介质结合的流通部分中分离所述A型肉毒杆菌毒素超大复合物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中获得所述含有肉毒杆菌毒素的溶液的步骤包括:
在不含动物产物的培养基中培养肉毒杆菌以获得培养物;
从所述培养物中除去肉毒杆菌细胞以获得包含肉毒杆菌毒素的溶液;
向所述包含肉毒杆菌毒素的溶液中添加酸以使所述肉毒杆菌毒素沉淀并获得沉淀物;
将所述沉淀物溶解于液体培养基中以获得溶液;以及
过滤所述溶液以获得含有肉毒杆菌毒素的溶液。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述低于肉毒杆菌毒素PI的pH为3.5至6.0。
4.根据权利要求1所述的方法,还包括在使所述溶液与所述阴离子交换色谱介质接触之前、在使所述溶液与所述阳离子交换色谱介质接触之前、或者在这两个过程中的每一者之前,调节所述肉毒杆菌毒素或所述含有肉毒杆菌毒素的溶液使pH低于肉毒杆菌毒素的pI。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述调节包括将所述肉毒杆菌毒素或所述含有肉毒杆菌毒素的溶液与pH低于肉毒杆菌毒素pI的缓冲液混合。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述缓冲液的pH为3.5至6.0。
7.根据权利要求5所述的方法,其中所述缓冲液包含10mM至100mM磷酸盐缓冲液、10mM至100mM柠檬酸盐缓冲液或10mM至100mM乙酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述阴离子交换色谱是DEAE或Q阴离子交换色谱,并且其中所述阳离子交换色谱是CM、S或SP阳离子交换色谱。
9.一种从含有肉毒杆菌毒素的溶液中分离A型肉毒杆菌毒素超大复合物的方法,所述方法包括:
通过向从肉毒杆菌细胞培养物获得的包含肉毒杆菌毒素的溶液中添加酸来使所述肉毒杆菌毒素沉淀,以获得所述肉毒杆菌毒素的沉淀物;
从所述沉淀物获得含有肉毒杆菌毒素的溶液;
使所述含有肉毒杆菌毒素的溶液与阴离子交换色谱介质在低于肉毒杆菌毒素等电点(PI)的pH下接触;
使所述含有肉毒杆菌毒素的溶液的未与所述阴离子交换色谱介质结合的流通部分与阳离子交换色谱介质在低于肉毒杆菌毒素PI的pH下接触;以及
从所述阳离子交换色谱介质中分离所述A型肉毒杆菌毒素超大复合物;或者
使所述含有肉毒杆菌毒素的溶液与所述阳离子交换介质在低于肉毒杆菌毒素PI的pH下接触;
从所述阳离子交换色谱介质中分离肉毒杆菌毒素;
使包含从所述阳离子交换色谱介质中分离的毒素的溶液与所述阴离子交换介质在低于所述PI的pH下接触;以及
从含有所述毒素的所述溶液的未与所述阴离子交换色谱介质结合的流通部分中分离所述A型肉毒杆菌毒素超大复合物。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述方法包括:
从通过在不含动物产物的培养基中培养获得的肉毒杆菌培养物获得所述包含肉毒杆菌毒素的溶液。
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