CN107827976B - 一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法，具体步骤如下：S1:将乌司他丁粗制品和纯净水一起溶解在烧杯中，接着往烧杯中加入适量的盐类，并控制烧杯中溶液的酸碱度pH 5‑6之间，放在磁力搅拌器上均匀搅拌60min‑150min，并用滤网进行过滤，得到沉淀物，备用。S2:把疏水柱清洗并烘干，固定在操作台上，取S1步骤中制备的沉淀物溶解于1‑2倍的去离子水中混合均匀后，依次在疏水柱的上端均匀加入后反应1‑2h，接着，加入1‑2mol/L的盐类缓冲液进行清洗。本发明经过测试后发现收率平均在82％以上，纯化后的乌司他丁纯度高达99.90％以上，比活力至少为5100U/mg蛋白，以及形状为无色液体，均达到国家的标准要求，纯化工艺简单可行，值得大力推广。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法。
背景技术
乌司他丁是从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化出来的一种酸性糖蛋白，是一种广谱的蛋白酶抑制剂，主要在肝脏中合成，由肾脏代谢随尿液排出，且其分解形成的低分子量成分也具有很强的抑制水解酶的作用。乌司他丁由143个氨基酸组成，相对分子质量约37000～43000，属于蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶及粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、巯基酶、纤溶酶等多种酶有抑制作用，还具有稳定溶酶体膜、抑制溶酶体酶的释放、抑制心肌抑制因子(MDF)产生、清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用。乌司他丁还可改善手术刺激引起的免疫功能下降、蛋白代谢异常。
中国专利授权公开号：CN103864922B公开的一种亲和层析纯化乌司他丁的方法。具体的说，就是以健康成年男性新鲜尿液为原料，经过甲壳质吸附、氨水洗脱、硫酸铵盐析、吸附柱层析以及亲和层析等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的乌司他丁，可以将总收率提高到70％以上，总效价不低于5000iu/mg。但是，采用该方法纯化后的乌司他丁，在纯化工艺的过程中分别加入甲质壳、氨水、硫酸铵、五氧化二磷、洗脱液A和洗脱液B等化学试剂，不利于得到较纯净的乌司他丁，且有可能对乌司他丁的内部结构造成损害等问题。
中国专利授权公开号：CN103880951B公开了一种通过乌司他丁亲和层析介质制备纯品乌司他丁的方法，此层析介质由乌司他丁亲和配体和普通层析介质连接而成。其亲和配体为聚赖氨酸3000，普通层析介质是Sephadex，亲和配体和层析介质通过亲水间隔臂进行连接。然后利用上述的亲和层析介质对乌司他丁进行纯化生产。通过调整各种溶液的浓度、pH值，洗涤、洗脱的流速等工艺，从原料中快速分离纯化分子量为37-43kDa的乌司他丁。
综上所述，目前国内纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法主要为经典的气泡提取法结合亲和层析、离子交换法、亲和层析法、分子筛层析、金属螯合层析和疏水层析法等，以及尿胰蛋白抑制剂和尿激肽释放酶联产工艺，这些方法由于纯化方法吸附效率低，往往需要结合多步层析，造成工艺步骤多，产品收率低，生产周期长，不易放大等技术缺陷，发明一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法，去解决上述缺陷，很有应用前景。
发明内容
本发明提供一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法，具体步骤如下：
S1:将乌司他丁粗制品和纯净水一起溶解在烧杯中，接着往烧杯中加入适量的盐类，并控制烧杯中溶液的酸碱度pH 5-6之间，放在磁力搅拌器上均匀搅拌60min-150min，并用滤网进行过滤，得到沉淀物，备用。
S2:把疏水柱清洗后并烘干，固定在操作台上，取S1步骤中制备的沉淀物溶解于1-2倍的去离子水中混合均匀后，依次在疏水柱的上端均匀加入后反应1-2h，接着，加入1-2mol/L的盐类缓冲液进行清洗。
S3:接着，再用低浓度的缓冲液进行清洗后过滤，得到乌司他丁的样品，最后，把乌司他丁的样品放入冷冻机中进行冷冻直至冻干。
S4：把S2中用好的疏水柱用一定浓度的尿素缓冲溶液进行清洗，接着用平衡缓冲液进行清洗后，进行烘干备用。
优选的，所述S1中加入的盐类为1mol/L的NaCl溶液。
优选的，所述疏水柱的高度和直径的比值为1.0-2.5之间。
优选的，所述S2中加入的盐类缓冲液为硫酸铵或者醋酸铵中的一种。
优选的，所述S4中的尿素缓冲溶液浓度为5-8mol/L。
优选的，所述磁力搅拌器为5档位可调磁力搅拌器，转速最大为1500r/min。
优选的，所述上述步骤S1-S4需要在无菌工作室中完成。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过采用疏水柱配合缓冲液去纯化乌司他丁，既可以实现疏水柱的重复利用，有效地较低了纯化乌司他丁的经济成本，可以提高乌司他丁的纯度，疏水柱的高度和直径的比值为1.0-2.5之间，可以最大效率地提高乌司他丁的纯化效率，有助于保证乌司他丁中蛋白的结构完整性，本发明经过测试后发现收率平均在82％以上，纯化后的乌司他丁纯度高达99.90％以上，比活力至少为5100U/mg蛋白，以及形状为无色液体，均达到国家的标准要求，纯化工艺简单可行，值得大力推广。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法，具体步骤如下：
S1:将乌司他丁粗制品和纯净水一起溶解在烧杯中，接着往烧杯中加入适量的盐类，并控制烧杯中溶液的酸碱度pH为5，放在磁力搅拌器上均匀搅拌60min，并用滤网进行过滤，得到沉淀物，备用。
S2:把疏水柱清洗后并烘干，固定在操作台上，取S1步骤中制备的沉淀物溶解于1倍的去离子水中混合均匀后，依次在疏水柱的上端均匀加入后反应1h，接着，加入1mol/L的盐类缓冲液进行清洗。
S3:接着，再用低浓度的缓冲液进行清洗后过滤，得到乌司他丁的样品，最后，把乌司他丁的样品放入冷冻机中进行冷冻直至冻干。
S4：把S2中用好的疏水柱用一定浓度的尿素缓冲溶液进行清洗，接着用平衡缓冲液进行清洗后，进行烘干备用。
所述S1中加入的盐类为1mol/L的NaCl溶液。
所述疏水柱的高度和直径的比值为1.0。
所述S2中加入的盐类缓冲液为硫酸铵。
所述S4中的尿素缓冲溶液浓度为5mol/L。
所述磁力搅拌器为5档位可调磁力搅拌器，转速最大为1500r/min。
所述上述步骤S1-S4需要在无菌工作室中完成。
实施例2
一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法，具体步骤如下：
S1:将乌司他丁粗制品和纯净水一起溶解在烧杯中，接着往烧杯中加入适量的盐类，并控制烧杯中溶液的酸碱度pH为5.5，放在磁力搅拌器上均匀搅拌100min，并用滤网进行过滤，得到沉淀物，备用。
S2:把疏水柱清洗后并烘干，固定在操作台上，取S1步骤中制备的沉淀物溶解于1.5倍的去离子水中混合均匀后，依次在疏水柱的上端均匀加入后反应1.5h，接着，加入1.5mol/L的盐类缓冲液进行清洗。
S3:接着，再用低浓度的缓冲液进行清洗后过滤，得到乌司他丁的样品，最后，把乌司他丁的样品放入冷冻机中进行冷冻直至冻干。
S4：把S2中用好的疏水柱用一定浓度的尿素缓冲溶液进行清洗，接着用平衡缓冲液进行清洗后，进行烘干备用。
所述S1中加入的盐类为1mol/L的NaCl溶液。
所述疏水柱的高度和直径的比值为1.5。
所述S2中加入的盐类缓冲液为醋酸铵。
所述S4中的尿素缓冲溶液浓度为6.5mol/L。
所述磁力搅拌器为5档位可调磁力搅拌器，转速最大为1500r/min。
所述上述步骤S1-S4需要在无菌工作室中完成。
实施例3
一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法，具体步骤如下：
S1:将乌司他丁粗制品和纯净水一起溶解在烧杯中，接着往烧杯中加入适量的盐类，并控制烧杯中溶液的酸碱度pH为6，放在磁力搅拌器上均匀搅拌150min，并用滤网进行过滤，得到沉淀物，备用。
S2:把疏水柱清洗后并烘干，固定在操作台上，取S1步骤中制备的沉淀物溶解于2倍的去离子水中混合均匀后，依次在疏水柱的上端均匀加入后反应2h，接着，加入2mol/L的盐类缓冲液进行清洗。
S3:接着，再用低浓度的缓冲液进行清洗后过滤，得到乌司他丁的样品，最后，把乌司他丁的样品放入冷冻机中进行冷冻直至冻干。
S4：把S2中用好的疏水柱用一定浓度的尿素缓冲溶液进行清洗，接着用平衡缓冲液进行清洗后，进行烘干备用。
所述S1中加入的盐类为1mol/L的NaCl溶液。
所述疏水柱的高度和直径的比值为2.5。
所述S2中加入的盐类缓冲液为硫酸铵。
所述S4中的尿素缓冲溶液浓度为8mol/L。
所述磁力搅拌器为5档位可调磁力搅拌器，转速最大为1500r/min。
所述上述步骤S1-S4需要在无菌工作室中完成。
结合实施例1-3中，所制备的乌司他丁样品，其中，设有对比例1为常规方法对同样规格的乌司他丁进行纯化并采集数据，采用药典推荐的HPLC测试方法所测得的数据，依据国家标准为WS-183(X-159)-99。见下表：
由上表易知：实施例1-3中纯化的乌司他丁样品，经过测试后发现收率平均在82％以上，纯化后的乌司他丁纯度高达99.90％以上，比活力至少为5100U/mg蛋白，以及形状为无色液体，均达到国家的标准要求，且优越于对比例1中的79.3％，取得了显著的效果，值得大力推广。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1:将乌司他丁粗制品和纯净水一起溶解在烧杯中，接着往烧杯中加入适量的盐类，并控制烧杯中溶液的酸碱度pH 5-6之间，放在磁力搅拌器上均匀搅拌60min-150min，并用滤网进行过滤，得到沉淀物，备用；
S2:把疏水柱清洗后并烘干，固定在操作台上，取S1步骤中制备的沉淀物溶解于1-2倍的去离子水中混合均匀后，依次在疏水柱的上端均匀加入后反应1-2h，接着，加入1-2mol/L的盐类缓冲液进行清洗；
S3:接着，再用低浓度的缓冲液进行清洗后过滤，得到乌司他丁的样品，最后，把乌司他丁的样品放入冷冻机中进行冷冻直至冻干；
S4：把S2中用好的疏水柱用一定浓度的尿素缓冲溶液进行清洗，接着用平衡缓冲液进行清洗后，进行烘干备用；
所述疏水柱的高度和直径的比值为1.0-2.5之间；
所述S2中加入的盐类缓冲液为硫酸铵或者醋酸铵中的一种；
所述S4中的尿素缓冲溶液浓度为5-8mol/L；
所述S1中加入的盐类为1mol/L的NaCl溶液。
2.根据权利要求1所述的一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法，其特征在于，所述磁力搅拌器为5档位可调磁力搅拌器，转速最大为1500r/min。
3.根据权利要求1所述的一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法，其特征在于，所述上述步骤S1-S4需要在无菌工作室中完成。
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