CN108144586B - 对氨基苯甲脒仿生亲和配基的仿生亲和纯化方法 - Google Patents

对氨基苯甲脒仿生亲和配基的仿生亲和纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种对氨基苯甲脒仿生亲和配基的仿生亲和纯化方法，包括仿生亲和材料的制备及其采用对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶柱对金属蛋白酶MP的仿生亲和纯化。该纯化方法流程简单，周期短，效率高，纯度高达98.7％。

Description

对氨基苯甲脒仿生亲和配基的仿生亲和纯化方法
技术领域
本发明涉及海洋微生物技术领域，特别是涉及对氨基苯甲脒仿生亲和配基的仿生亲和纯化方法。
背景技术
海洋微生物酶的仿生亲和配基通常来源于该酶的特异性抑制剂。前期研究中，基于海洋低温碱性蛋白酶MP的晶体结构信息由海洋细菌Y S-80发酵制备而得(海洋细菌YS-80分离自深海海泥海洋细菌(YS-80)，保藏在中国武汉CCTCC，保藏号为CCTCC NO:M209177，见专利申请号200910177301.0，通过虚拟筛选构建了海洋低温碱性蛋白酶MP的小分子抑制剂库。经过精细筛选预测得到的15个最有效的小分子可逆抑制剂中有5个为苯甲脒衍生物，是理性设计仿生亲和配基的理想材料。
苯甲脒琼脂糖凝胶柱也被广泛应用于胰蛋白酶的亲和纯化，尚未有文献报道其用于金属蛋白酶的纯化。
传统的金属蛋白酶纯化需要经过5个步骤:超滤，65％的硫酸铵沉淀，脱盐，Q柱离子交换层析，Sephacryl S-200凝胶柱层析。整个纯化过程需要超过48h才能完成，回收率只有8.9％。前期研究中我们利用金属螯合配基(Cu-IDA)建立了MP的仿生亲和纯化方法，活性回收率高达74％。但是由于金属螯合配基的特殊性，每种金属蛋白酶仿生亲和方法的建立都需要重新去筛选配基以及对应的金属离子。而且，金属螯合层析过程中，洗脱过程中需要利用具有一定毒性的咪唑，会影响金属蛋白酶作为医药品的利用，利用脱盐柱对咪唑进行处理会增加额外的步骤和成本。因此，需要开发更为特异性的仿生亲和材料去建立适用于整个金属蛋白酶家族的仿生亲和方法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在诸多不足，基于开发海洋低温碱性蛋白酶MP的晶体结构基础上，开发提供一种新的对氨基苯甲脒仿生亲和配基的仿生亲和纯化方法。
本发明提供的对氨基苯甲脒仿生亲和配基的仿生亲和纯化方法：包括以下步骤：
1、合成仿生亲和材料
1)、表氯醇活化琼脂糖凝胶
用双蒸水按1：10V/V的比例对琼脂糖凝胶(Sepharose 6B)进行彻底洗涤，直到流出的溶液的pH达到7.0，洗涤过的琼脂糖凝胶风干后再溶解在活化溶液(1M的氢氧化钠，2.5g二甲基亚砜以及10ml表氯醇)中，在40℃摇床中100rpm震荡2.5h进行活化，得到表氯醇活化琼脂糖凝胶6B(见过程a)。
2)、表氯醇活化琼脂糖凝胶的氨基化
将35％饱和氨添加到活化琼脂糖凝胶6B中，再加入一定量双蒸水，在30℃摇床中100rpm孵化过夜，使得活化琼脂糖凝胶6B加入氨基，得到氨基化活化琼脂糖凝胶6B(见过程b)。
3)、连接氰尿酰氯连接臂
将氨基化活化琼脂糖凝胶6B按等体积加入50％(V/V)丙酮，在冰浴搅拌的条件下以0.5ml/min的流速缓慢加入氰尿酰氯溶液(融入70ml丙酮)，用1M的氢氧化钠溶液调节该溶液的pH值至7.0，再用50％(V/V)丙酮洗涤去除多余的浮游氨基基团，氰尿酰氯(连接臂)连接至活化琼脂糖凝胶6B上，得到连接氰尿酰氯连接臂的对氨基苯甲脒配基(见过程c)。
4)、螯合对氨基苯甲脒配基
将上述步骤3)、的过饱和的连接氰尿酰氯连接臂的对氨基苯甲脒配基(一般为凝胶的两倍质量)溶解在2M的碳酸钠溶液中，然后在碳酸钠溶液中缓慢添加琼脂糖凝胶6B。室温搅拌24h，用双蒸水洗涤凝胶，保存在0.02％(W/V)的叠氮钠，得到仿生亲和材料(见过程d)。
上述对氨基苯甲脒仿生亲和配基的仿生亲和材料的合成过程为：
Figure GDA0002435010020000031
本发明纯化方法中仿生亲和材料与MP解离常数测定如下：
利用斯卡查德方程法(Scatchard)对上述5种仿生亲和材料进行解离常数(Kd)及最大结合能力(Qmax)进行评价，从而筛选最适的仿生亲和材料。具体测定方法为：取1ml不同浓度(0.1-0.9mg/ml，20mM Gly-NaOH缓冲液，pH 8.6)的金属蛋白酶MP与0.5g不同的仿生亲和材料混合，在4℃条件下100rpm摇2h，达到吸附平衡。混合液1500g离心5min，检测上清中剩余的蛋白酶活性及蛋白含量。所检测数据按照斯卡查德方程法计算：
Figure GDA0002435010020000032
其中，Q代表吸附在仿生亲和材料中的蛋白量(mg/g)，Qmax代表理论上可以与亲和材料吸附的最大蛋白量(mg/g)，[C*]溶液中剩余的蛋白量(mg/mL)，Kd代表吸附常数。经计算所得合成配基的解离常数(Kd)为18.5μg/mL最大结合能力(Qmax)为27.6mg/g。
2、仿生亲和材料的纯化
(1)洗涤并平衡苯甲脒琼脂糖凝胶预装柱
上样缓冲液为100mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液，上样前用5-10个柱体积的用0.22μm过滤过的双蒸水洗涤琼脂糖凝胶，然后用5-10个柱体积的100mM pH7.4的Tris-HCl缓冲液的上样缓冲液平衡柱子，流速不大于3ml/min，柱子压力不超过0.3mPa；
(2)洗涤去除杂蛋白
取10mg/ml的金属蛋白酶MP粗品1ml，上样至按2)、(1)中平衡过的苯甲脒琼脂糖凝胶预装柱，上样时流速不大于1ml/min。用洗脱缓冲液1(包含有100mM的NaCl的100mM pH7.4的Tris-HCl缓冲液)洗涤5-10个柱体积，去除杂蛋白，流速不大于3ml/min，柱子压力不超过0.3mPa；
(3)获得蛋白酶纯蛋白
按照步骤2)、(2)去除杂蛋白之后，用洗涤缓冲液2洗脱，收取活性峰，为金属蛋白酶MP的纯酶，流速不大于3ml/min，柱子压力不超过0.3mPa，所述洗涤缓冲液2为500mM的NaCl的100mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液；
(4)洗涤并保存柱子
在获得蛋白酶纯酶之后，用洗涤缓冲液3洗涤柱子，去除牢固结合在柱子上的蛋白，再用0.22μm过滤过的双蒸水冲洗5-10个柱体积，去除洗涤缓冲液中的各种盐离子，再用20％乙醇保存柱子，所述洗涤缓冲液3为2M的NaCl的100mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液；
经上述步骤后，蛋白酶活性回收率为35.7％，蛋白纯度为98.7％。
本发明提供的对氨基苯甲脒仿生亲和配基建立的海洋生物蛋白酶仿生亲和纯化方法的特点为：流程简单，纯度高达98.7％，整个纯化周期小于1小时，远低于传统柱层析的方法(大于48小时)；活性回收率高，最高可达35.7％，远高于传统柱层析方法(8.9％)；纯化所得金属蛋白酶MP的比活力达到95.6U/mg，与传统柱层析法所得蛋白比活力(96.2U/mg)基本一致，说明亲和层析方法过程中对蛋白酶活性没有破坏作用。
具体实施方式
本发明用下列实施例对本发明进行进一步说明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
1、合成仿生亲和材料
1)、表氯醇活化琼脂糖凝胶
用双蒸水按1：10V/V的比例对琼脂糖凝胶(Sepharose 6B)进行彻底洗涤，直到流出的溶液的pH达到7.0，洗涤过的琼脂糖凝胶风干后再溶解在活化溶液(1M的氢氧化钠，2.5g二甲基亚砜以及10ml表氯醇)中，在40℃摇床中100rpm震荡2.5h进行活化，得到表氯醇活化琼脂糖凝胶6B(见过程a)。
2)、表氯醇活化琼脂糖凝胶的氨基化
将35％饱和氨添加到活化琼脂糖凝胶6B中，再加入一定量双蒸水，在30℃摇床中100rpm孵化过夜，使得活化琼脂糖凝胶6B加入氨基，得到氨基化活化琼脂糖凝胶6B(见过程b)。
3)、连接氰尿酰氯连接臂
将氨基化活化琼脂糖凝胶6B按等体积加入50％(v/v)丙酮，在冰浴搅拌的条件下以0.5ml/min的流速缓慢加入氰尿酰氯溶液(融入70ml丙酮)，用1M的氢氧化钠溶液调节该溶液的pH值至7.0，再用50％(v/v)丙酮洗涤去除多余的浮游氨基基团，氰尿酰氯(连接臂)连接至活化琼脂糖凝胶6B上，得到连接氰尿酰氯连接臂的对氨基苯甲脒配基(见过程c)。
4)、螯合对氨基苯甲脒配基
将上述步骤3)、的过饱和的连接氰尿酰氯连接臂的对氨基苯甲脒配基(一般为凝胶的两倍质量)溶解在2M的碳酸钠溶液中，然后在碳酸钠溶液中缓慢添加琼脂糖凝胶6B。室温搅拌24h，用双蒸水洗涤凝胶，保存在0.02％(w/v)的叠氮钠，得到仿生亲和材料(见过程d)。
2、仿生亲和材料的纯化
(1)洗涤并平衡苯甲脒琼脂糖凝胶预装柱
上样缓冲液为100mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液，上样前用5-10个柱体积的用0.22μm过滤过的双蒸水洗涤琼脂糖凝胶，然后用5-10个柱体积的100mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液的上样缓冲液平衡柱子，流速不大于3ml/min，柱子压力不超过0.3mPa；
(2)洗涤去除杂蛋白
取10mg/ml的金属蛋白酶MP粗品1ml，上样至按2)、(1)中平衡过的苯甲脒琼脂糖凝胶预装柱。上样时流速不大于1ml/min。用洗脱缓冲液1(包含有100mM的NaCl的100mM pH7.4的Tris-HCl缓冲液)洗涤5-10个柱体积，去除杂蛋白，流速不大于3ml/min，柱子压力不超过0.3mPa；
(3)获得蛋白酶纯蛋白
按照步骤2)、(2)去除杂蛋白之后，用洗涤缓冲液2洗脱，收取活性峰，为金属蛋白酶MP的纯酶，流速不大于3ml/min，柱子压力不超过0.3mPa，所述洗涤缓冲液2为500mM的NaCl的100mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液；
(4)洗涤并保存柱子
在获得蛋白酶纯酶之后，用洗涤缓冲液3洗涤柱子，去除牢固结合在柱子上的蛋白，再用0.22μm过滤过的双蒸水冲洗5-10个柱体积，去除洗涤缓冲液中的各种盐离子。再用20％乙醇保存柱子，所述洗涤缓冲液3为2M的NaCl的100mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液；
经上述步骤后，蛋白酶活性回收率为35.7％，蛋白纯度为98.7％。

Claims (1)

1.一种对氨基苯甲脒仿生亲和配基的仿生亲和材料对金属蛋白酶MP的纯化方法，包括以下步骤：
1)、合成对氨基苯甲脒仿生亲和材料
(1)、表氯醇活化琼脂糖凝胶
用双蒸水按1：10V/V的比例对琼脂糖凝胶进行彻底洗涤，直到流出的溶液的pH达到7.0，洗涤过的琼脂糖凝胶风干后再溶解在活化溶液中，在40℃摇床中100rpm震荡2.5h进行活化，得到表氯醇活化琼脂糖凝胶6B，所述活化溶液为1M的氢氧化钠、2.5g二甲基亚砜以及10ml表氯醇；
(2)、表氯醇活化琼脂糖凝胶的氨基化
将35％饱和氨添加到表氯醇活化后的琼脂糖凝胶6B中，再加入一定量双蒸水，在30℃摇床中100rpm孵化过夜，使得活化琼脂糖凝胶6B加入氨基，得到氨基化活化琼脂糖凝胶6B；
(3)、连接氰尿酰氯连接臂
将氨基化活化琼脂糖凝胶6B按等体积加入50V/V％丙酮，在冰浴搅拌的条件下以0.5ml/min的流速缓慢加入氰尿酰氯溶液，用1M的氢氧化钠溶液调节该溶液的pH值至7.0，再用50V/V％丙酮洗涤去除多余的浮游氨基基团，氰尿酰氯连接臂连接至活化琼脂糖凝胶6B上，得到连接氰尿酰氯连接臂的对氨基苯甲脒配基；
(4)、螯合对氨基苯甲脒配基
将上述步骤(3)的过饱和的连接氰尿酰氯连接臂的对氨基苯甲脒配基溶解在2M的碳酸钠溶液中，然后在碳酸钠溶液中缓慢添加琼脂糖凝胶，室温搅拌24h，用双蒸水洗涤凝胶，保存在0.02W/V％的叠氮钠，得到对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶柱；
2)、对氨基苯甲脒仿生亲和配基的仿生亲和材料对金属蛋白酶MP的纯化
(1)洗涤并平衡对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶柱
上样前，用5-10个柱体积的用0.22μm过滤过的双蒸水洗涤琼脂糖凝胶柱，然后用5-10个柱体积的100mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液的上样缓冲液平衡柱子，流速不大于3ml/min，柱子压力不超过0.3mPa；
(2)洗涤去除杂蛋白
取10mg/ml金属蛋白酶MP粗品1ml，上样至按2)、(1)中平衡过的苯甲脒琼脂糖凝胶预装柱，上样时流速不大于1ml/min，用洗脱缓冲液1洗涤5-10个柱体积，去除杂蛋白，流速不大于3ml/min，柱子压力不超过0.3mPa，所述洗脱缓冲液1为100mM的NaCl的100mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液；
(3)获得蛋白酶MP纯蛋白
按照步骤2)、(2)去除杂蛋白之后，用洗涤缓冲液2洗脱，收取活性峰，为金属蛋白酶MP的纯酶，流速不大于3ml/min，柱子压力不超过0.3mPa，所述洗涤缓冲液2为500mM的NaCl的100mM pH7.4的Tris-HCl缓冲液；
(4)洗涤并保存柱子
在获得蛋白酶纯酶之后，用洗涤缓冲液3洗涤柱子，去除牢固结合在柱子上的蛋白，再用0.22μm过滤过的双蒸水冲洗5-10个柱体积，去除洗涤缓冲液中的各种盐离子，再用20％乙醇保存柱子，所述洗涤缓冲液3为2M的NaCl的100mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液；
经上述步骤后，蛋白酶活性回收率为35.7％，蛋白纯度为98.7％。
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