CN105753975A - 一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法。具体来说，首先对乌司他丁粗品进行沉淀、过滤、调pH等前处理，通过疏水柱层析对乌司他丁进行分离纯化，除掉杂蛋白和有色基团，特别是有效的减少了乌司他丁中人尿激肽原酶的含量；本发明可将总收率提高至75％以上，产品比活达到4000U/mg·pr。

Description

一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法。
背景技术
乌司他丁，又名人尿胰蛋白酶抑制剂(Urinarytrypsininhibitor，简称为UTI)是一种从人尿中分离纯化的由143个氨基酸组成的糖蛋白，等电点在2.6左右，分子量67000Da左右，具有抑制多种蛋白酶、糖酶和脂酶等水解酶的活性；从而抑制炎症介质的过度释放；改善微循环和组织灌注。而在机体受到严重损伤时起抑制全身性炎症反应(SIRS)的发生发展、继而阻断多脏器功能障碍(MODS)，保护脏器功能等作用。
人尿中含有三百多种蛋白质，目前已开发提取的主要有尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制剂和人尿激肽原酶等，这些组分在临床上具有重要的治疗价值。
人尿激肽原酶(UrinaryKallidinogenase，简称为KN)，是从人尿中分离提取的一种由238个氨基酸组成的糖蛋白，等电点在4左右，分子量约54000D左右，属于丝氨酸蛋白酶。它能够激活人血浆激肽原转化为激肽。目前，已经被开发成用于治疗急性脑梗死的药物。
目前临床使用的乌司他丁产品，由于存在杂蛋白及一些有色基团，导致其效价低，稳定性不好，特别是存在少量人尿激肽原酶(KN)而使产品有潜在的副作用。尤其是KN和UTI，二者分子大小相近，且均为酸性蛋白，常规的纯化方法对其较难分离，后续纯化困难。
目前国内纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法主要为经典的气泡提取法结合亲和层析、离子交换法、亲和层析法、分子筛层析、金属螯合层析和疏水层析法等，以及尿胰蛋白抑制剂和尿激肽释放酶联产工艺，这些方法由于纯化方法吸附效率低，往往需要结合多步层析，造成工艺步骤多，产品收率低，生产周期长，不易放大；另外，多步层析使用的纯化介质成本昂贵，不利于工业生产。特别是针对分离除去人尿激肽原酶(KN)的纯化技术还是靠反复的层析，对产品损失比较大。因此，除掉人尿激肽原酶(KN)及其他杂质进一步提高乌司他丁的质量是十分必要的，也是急需待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有乌司他丁纯度不高、收率过低、不稳定的缺陷，采用基于疏水柱层析来纯化乌司他丁，从而提高了乌司他丁收率和纯度。提供了一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法。
近年来，随着疏水层析介质在蛋白分离中应用的研究，和对人尿胰蛋白酶抑制剂和人尿激肽原酶的疏水特性的研究发现，利用疏水层析柱的特殊吸附性可一步纯化人尿胰蛋白酶抑制剂。
为了解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：
将乌司他丁粗品经过前处理，通过疏水柱层析进行纯化，洗脱液超滤，即得高纯度的乌司他丁，所得纯化后的乌司他丁总收率提高到75％以上，产品比活达到4000U/mg·pr以上。
所述的疏水柱层析包括以下步骤：
1)前处理：将乌司他丁粗品溶解在水中，以质量g/体积ml计，乌司他丁∶水为1∶2，再用硅藻土过滤，收集滤液，加入ZnCl2使其终浓度为150mmol/L，用预冷的95％乙醇沉淀，用量以体积ml/ml比计，样品溶解液体积∶95％乙醇体积为1∶1.1，搅拌30min，板框过滤，取上清液，调电导50～55ms/cm，冰醋酸调pH4.0；样品溶解液体积∶95％乙醇体积为1∶2.3，搅拌30min，板框过滤，取沉淀物后，将沉淀物溶解于3倍体积的水。
2)上样及洗涤：用pH3.5～4.5，1.5～2.0mol/L(NH4)2SO4－0.05～0.15mol/L醋酸缓冲液平衡层析柱，上样，上样溶液的蛋白浓度为25～30mg/mL胶，用pH3.5～4.5，1.5～2.0mol/L(NH4)2SO4－0.05～0.15mol/L醋酸缓冲液洗涤；
3)洗脱：用pH4.0～6.0、0.08mol/L磷酸盐缓冲液－0.4mol/L氯化钠溶液进行洗脱；洗脱液用超滤膜超滤，即得纯化的乌司他丁原料药。
所述的疏水柱介质选自：PhenylBio-sepFF、PhenylBio-sepHP和ButylBio-sepHP中的一种。
所述的洗涤液优选pH值为4.0的1.5mol/L(NH4)2SO4－0.1mol/L醋酸缓冲液。
所述的洗脱液优选pH值为5.5的0.08mol/L磷酸盐缓冲液－0.4mol/L氯化钠溶液。
所述的超滤膜包括分子量5000～3万的超滤膜。
本发明中所用的乌司他丁粗品包括但不限于现有技术中涉及的乌司他丁粗品的制备方案制备得到的。
本发明乌司他丁产品中所含的人尿激肽原酶物质的活性测定方法(按照《中华人民共和国药典》2010年版)：将乌司他丁产品加水制成1ml中约含5万单位的溶液作为样品溶液。取试管2支，各精密加入样品溶液0.4ml，再分别加入0.2mol/LTris-HCl(三羟甲基氨基甲烷－盐酸)缓冲溶液(取三羟甲基氨基甲烷24.228g，加水800ml溶解，用6mol/L盐酸溶液调节pH至8.0，加水至1000ml)0.5ml，混匀，置37±0.5℃水浴中保温5分钟，再于第1管中加入50％醋酸溶液0.1ml，第2管中加入底物溶液(取S-2266[相当于H-D-Val-Leu-Arg-PNA·2HCl]25mg，加水制成0.0015mol/L溶液)0.1ml，立即摇匀，同时计时，置37±0.5℃水浴中准确反应30分钟，然后在第1管中加入底物(取S-2266[相当于H-D-Val-Leu-Arg-PNA·2HCl]25mg，加水制成0.0015mol/L溶液)0.1ml，第2管中加入50％醋酸溶液0.1ml，照紫外分光光度法，在405nm波长处测定，以第1管为空白，测定第2管的吸收值A。由于S-2266在人尿激肽原酶的蛋白酶水解作用下，释放出游离对硝基苯胺(PNA)。按公式9.55×A/1000计算人尿激肽原酶的含量(PNAU)。本文中，“PNAU“被定义为37℃，pH8.0的条件下，1分钟水解1μmolVal-Leu-Arg-PNA的人尿激肽原酶量为1PNA单位。本文中，乌司他丁单位被定义为2μg胰蛋白酶活性50％被抑制时乌司他丁的量为1个单位。
本发明与现有技术相比取得了如下技术效果：
1)乌司他丁粗品经疏水柱纯化后，有效的除去了杂蛋白，特别是人尿激肽原酶除去率高。
2)本发明得到的乌司他丁纯度高，收率高，稳定性好，临床使用中安全性高。
3)本发明有效解决了现有技术中多步层析，成本高，不利于工业化生产的问题。
4)通过本发明也证实了疏水柱层析在乌司他丁分离纯化中的作用；创造了巨大的经济利益和社会效益。
具体实施方式
现通过以下实施例来进一步描述本发明的有益效果，这些实施例仅用于例证的目的，不应理解为对本发明的限制，本领域技术人员对本发明所做的显而易见的改进和修饰也在本发明保护范围之内。
实施例1
乌司他丁粗品纯化步骤：
1)前处理：将乌司他丁粗品100g，加200ml水溶解，硅藻土过滤，收集滤液，加入ZnCl2使其终浓度为150mmol/L，用预冷的95％乙醇按样品溶解液∶95％乙醇为1∶1.1(ml/ml)的体积比例沉淀，搅拌30min，板框过滤，取上清液，调电导55ms/cm，冰醋酸调pH4.0。样品溶解液体积∶95％乙醇体积为1∶2.3，搅拌30min，板框过滤，取沉淀物；沉淀物溶解于3倍体积的水。
2)上样及洗涤：用pH4.0，1.5mol/L(NH4)2SO4－0.15mol/L醋酸缓冲液平衡层析柱PhenylBio-sepHP，上样，上样溶液的蛋白浓度约为30mg/mL胶，用pH4.0，1.5mol/L(NH4)2SO4－0.15mol/L醋酸缓冲液洗涤。
3)洗脱：用pH5.0、0.08mol/L磷酸盐缓冲液－0.4mol/L氯化钠溶液进行洗脱；洗脱液用分子量1万的超滤膜超滤，得纯化的乌司他丁。
实施例2
乌司他丁粗品纯化步骤：
1)前处理：将乌司他丁粗品100g，加200ml水溶解，硅藻土过滤，收集滤液，加入ZnCl2使其终浓度为150mmol/L，用预冷的95％乙醇按样品溶解液∶95％乙醇为1∶1.1(ml/ml)的体积比例沉淀，搅拌30min，5000r/min离心20min，取上清液，调电导55ms/cm，冰醋酸调pH3.5。样品溶解液体积∶95％乙醇体积为1∶2.3，搅拌30min，板框过滤，取沉淀物；沉淀物溶解于3倍体积的水。
2)上样及洗涤：用pH3.6，1.5mol/L(NH4)2SO4－0.1mol/L醋酸缓冲液平衡层析柱ButylBio-sepHP，上样，上样溶液的蛋白浓度约为30mg/mL胶，用pH3.6，1.5mol/L(NH4)2SO4－0.1mol/L醋酸缓冲液洗涤。
3)洗脱：用pH6.0、0.08mol/L磷酸盐缓冲液－0.4mol/L氯化钠溶液进行洗脱；洗脱液用分子量1万的超滤膜超滤，得纯化的乌司他丁。
实施例3
乌司他丁粗品纯化步骤：
1)前处理：将乌司他丁粗品100g，加200ml水溶解，硅藻土过滤，收集滤液，加入ZnCl2使其终浓度为150mmol/L，用预冷的95％乙醇按样品溶解液∶95％乙醇为1∶1.1(ml/ml)的体积比例沉淀，搅拌30min，5000r/min离心20min，取上清液，调电导55ms/cm，冰醋酸调pH4.5。样品溶解液体积∶95％乙醇体积为1∶2.3，搅拌30min，板框过滤，取沉淀物；沉淀物溶解于3倍体积的水。
2)上样及洗涤：用pH3.5，1.5mol/L(NH4)2SO4－0.1mol/L醋酸缓冲液平衡层析柱PhenylBio-sepFF，上样，上样溶液的蛋白浓度约为30mg/mL胶，用pH4.5，1.5mol/L(NH4)2SO4－0.1mol/L醋酸缓冲液洗涤。
3)洗脱：用pH5.5、0.08mol/L磷酸盐缓冲液－0.4mol/L氯化钠溶液进行洗脱；洗脱液用分子量1万的超滤膜超滤，得纯化的乌司他丁。
实施例4
乌司他丁粗品纯化步骤：
1)前处理：将乌司他丁粗品100g，加200ml水溶解，硅藻土过滤，收集滤液，加入ZnCl2使其终浓度为150mmol/L，用预冷的95％乙醇按样品溶解液∶95％乙醇为1∶1.1(ml/ml)的比例沉淀，搅拌30min，5000r/min离心20min，取上清液，调电导55ms/cm，冰醋酸调pH3.5。样品溶解液体积∶95％乙醇体积为1∶2.3，搅拌30min，板框过滤，取沉淀物；沉淀物溶解于3倍体积的水。
2)上样及洗涤：用pH3.5，2.0mol/L(NH4)2SO4－0.1mol/L醋酸缓冲液平衡层析柱PhenylBio-sepHP，上样，上样溶液的蛋白浓度约为30mg/mL胶，用pH3.5，2.0mol/L(NH4)2SO4－0.1mol/L醋酸缓冲液洗涤。
3)洗脱：用pH5.5、0.08mol/L磷酸盐缓冲液－0.4mol/L氯化钠溶液进行洗脱；洗脱液用分子量1万的超滤膜超滤，得纯化的乌司他丁。
实施例5
乌司他丁粗品纯化步骤：
1)前处理：将乌司他丁粗品100g，加200ml水溶解，硅藻土过滤，收集滤液，加入ZnCl2使其终浓度为150mmol/L，用预冷的95％乙醇按样品溶解液∶95％乙醇为1∶1.1(ml/ml)的体积比例沉淀，搅拌30min，5000r/min离心20min，取上清液，调电导55ms/cm，冰醋酸调pH3.5。样品溶解液体积∶95％乙醇体积为1∶2.3，搅拌30min，板框过滤，取沉淀物；沉淀物溶解于3倍体积的水。
2)上样及洗涤：用pH3.5，1.0mol/L(NH4)2SO4－0.1mol/L醋酸缓冲液平衡层析柱PhenylBio-sepFF，上样，上样溶液的蛋白浓度约为30mg/mL胶，用pH3.5，1.0mol/L(NH4)2SO4－0.1mol/L醋酸缓冲液洗涤。
3)洗脱：用pH5.5、0.08mol/L磷酸盐缓冲液－0.4mol/L氯化钠溶液进行洗脱；洗脱液用分子量1万的超滤膜超滤，得纯化的乌司他丁。
对比实施例1
乌司他丁粗品纯化步骤：
1)前处理：将乌司他丁粗品100g，加200ml水溶解，硅藻土过滤，收集滤液，加入ZnCl2使其终浓度为150mmol/L，用预冷的95％乙醇按样品溶解液∶95％乙醇为1∶1.1(ml/ml)的体积比例沉淀，搅拌30min，5000r/min离心20min，取上清液，调电导55ms/cm，冰醋酸调pH3.5。样品溶解液体积∶95％乙醇体积为1∶2.3，搅拌30min，板框过滤，取沉淀物；沉淀物溶解于3倍体积的水。
2)上样及洗涤：用pH4，0.5mol/LNaCl及0.1mol/L醋酸钠平衡层析柱PhenylBio-sepFF，上样，用pH4，0.5mol/LNaCl及0.1mol/L醋酸钠缓冲液梯度洗脱，收集洗脱液；
3)洗脱液用分子量1万的超滤膜超滤，得纯化的乌司他丁。
对比实施例2
乌司他丁粗品纯化步骤：
1)前处理：将乌司他丁粗品100g，加200ml水溶解，硅藻土过滤，收集滤液，加入ZnCl2使其终浓度为150mmol/L，用预冷的95％乙醇按样品溶解液∶95％乙醇为1∶1.1(ml/ml)的体积比例沉淀，搅拌30min，5000r/min离心20min，取上清液，调电导55ms/cm，冰醋酸调pH3.5。样品溶解液体积∶95％乙醇体积为1∶2.3，搅拌30min，板框过滤，取沉淀物；沉淀物溶解于3倍体积的水。
2)上样及洗涤：用pH3.5，0.5mol/L(NH4)2SO4－0.1mol/L醋酸缓冲液平衡层析柱PhenylBio-sepFF，上样，上样溶液的蛋白浓度约为30mg/mL胶，用pH3.5，0.5mol/L(NH4)2SO4－0.1mol/L醋酸缓冲液洗涤。
3)洗脱：用pH5.5、0.08mol/L磷酸盐缓冲液－0.4mol/L氯化钠溶液进行洗脱；洗脱液用分子量1万的超滤膜超滤，得纯化的乌司他丁。
对比实施例3
乌司他丁粗品纯化步骤：
1)前处理：将乌司他丁粗品100g，加200ml水溶解，硅藻土过滤，收集滤液，加入ZnCl2使其终浓度为150mmol/L，用预冷的95％乙醇按样品溶解液∶95％乙醇为1∶1.1(ml/ml)的体积比例沉淀，搅拌30min，5000r/min离心20min，取上清液，调电导55ms/cm，冰醋酸调pH3.5。
2)上样及洗涤：用pH3.5，2.5mol/L(NH4)2SO4－0.1mol/L醋酸缓冲液平衡层析柱PhenylBio-sepFF，上样，上样溶液的蛋白浓度约为30mg/mL胶，用pH3.5，2.5mol/L(NH4)2SO4－0.1mol/L醋酸缓冲液洗涤。
3)洗脱：用pH5.5、0.08mol/L磷酸盐缓冲液－0.4mol/L氯化钠溶液进行洗脱；洗脱液用分子量1万的超滤膜超滤，得纯化的乌司他丁。
对比实施例4
乌司他丁粗品纯化步骤：
1)前处理：将乌司他丁粗品100g，加200ml水溶解，硅藻土过滤，收集滤液，加入ZnCl2使其终浓度为150mmol/L，用预冷的95％乙醇按样品溶解液∶95％乙醇为1∶1.1(ml/ml)的体积比例沉淀，搅拌30min，5000r/min离心20min，取上清液，调电导55ms/cm，冰醋酸调pH3.5。
2)上样及洗涤：用pH3.0，1.5mol/LNaCl－0.1mol/L醋酸缓冲液平衡层析柱PhenylBio-sepFF，上样，上样溶液的蛋白浓度约为30mg/mL胶，用pH3.0，1.5mol/LNaCl－0.1mol/L醋酸缓冲液洗涤。
3)洗脱：用pH5.5、0.08mol/L磷酸盐缓冲液－0.4mol/L氯化钠溶液进行洗脱；洗脱液用分子量1万的超滤膜超滤，得纯化的乌司他丁。
验证实施例
取实施例和对比实施例的洗脱液稀释至5万单位/ml，对人尿激肽原酶进行分析，并对乌司他丁产品进行其他理化指标的检测，结果见表1
表1各指标检测结果
由表1的检测结果可知，经前处理和疏水层析柱对乌司他丁粗品进行纯化处理，得到高纯度的乌司他丁，产品中几乎不含人尿激肽原酶物质，且经核算总收率达到75％以上。

Claims (6)

1.一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法，其特征在于，该方法包括：将乌司他丁粗品经过前处理，通过疏水柱层析进行纯化，洗脱液超滤，即得乌司他丁。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的疏水柱层析包括以下步骤：
1)前处理：将乌司他丁粗品溶解在水中，以质量g/体积ml计，乌司他丁∶水为1∶2，再用硅藻土过滤，收集滤液，加入ZnCl2使其终浓度为150mmol/L，用预冷的95％乙醇沉淀，用量以体积ml/ml比计，样品溶解液体积∶95％乙醇体积为1∶1.1，搅拌30min，板框过滤，取上清液，调电导50～55ms/cm，冰醋酸调pH4.0；样品溶解液体积∶95％乙醇体积为1∶2.3，搅拌30min，板框过滤，取沉淀物；沉淀物溶解于3倍体积的水；
2)上样及洗涤：用pH3.5～4.5，1.5～2.0mol/L(NH4)2SO4－0.05～0.15mol/L醋酸缓冲液平衡层析柱，上样，上样溶液的蛋白浓度为25～30mg/mL胶，用pH3.5～4.5，1.5～2.0mol/L(NH4)2SO4－0.05～0.15mol/L醋酸缓冲液洗涤；
3)洗脱：用pH4.0～6.0、0.08mol/L磷酸盐缓冲液－0.4mol/L氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液用超滤膜超滤，得纯化的乌司他丁原料药。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的疏水柱层析的层析介质选自：PhenylBio-sepFF、PhenylBio-sepHP和ButylBio-sepHP中的一种。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的洗涤液为pH值4.0的1.5mol/L(NH4)2SO4－0.1mol/L醋酸缓冲液。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的洗脱液pH值为5.5。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的超滤膜包括分子量5000～3万的超滤膜。
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