CN108059670A - 一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种对尿液进行预处理并结合亲和层析柱对乌司他丁进行纯化方法，该方法包括以下步骤：对尿液进行冷冻、真空及微波预处理得乌司他丁粗品，然后通过疏水柱层析、亲和层析和凝胶过滤层析对乌司他丁粗品进行纯化，最后洗涤、冻干得到总收率在90％以上，总效价6700iu/mg以上的乌司他丁，对尿液进行一定程度的预处理，结合使用层析柱纯化处理，操作简单，且优选的填料和流速等参数提高了生产效率，大大降低生产成本，适合进一步开发利用。

Description

一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法。
技术背景
乌司他丁，又名人尿胰蛋白酶抑制剂(Human Urinary Trypsin Inhibitor)，是从人体尿液中分离纯化的一种胰蛋白酶抑制剂，1909年，Beurer和Reich第一次报道了人体尿液中存在这种胰蛋白酶抑制剂。他由是由143个氨基酸组成的一种糖蛋白，N端为丙氨酸，C端为亮氨酸，在第10位丝氨酸和45位天冬氨酸上有糖链。丝氨酸上的O-糖苷链包含多个硫酸软骨素单元(5个Ch4S和10个Ch0S)。乌司他丁的分子量经HPLC法测定为60～70KD，经SDSPAGE测定为40～50KD，等电点为2.6，是一种对热稳定的酸性蛋白。
乌司他丁对多种水解酶具有有效的抑制作用，对细胞膜、溶酶体膜有明显的稳定作用。乌司他丁在人体内不仅仅是一种酶抑制剂，同时还是参与细胞表达分泌调控的重要生理活性物质，在炎症等疾病状态下，乌司他丁由粒细胞酶水解释放到血液中，参与炎症反应的调控，局限炎症反应，帮助组织的修复；在机体遭遇重大打击，发生全身炎症反应时，减轻过度释放的炎症介质对机体组织造成的损伤。乌司他丁在临床上用于急性胰腺炎、急性循环障碍的治疗，以及大中型手术期的器官保护和危重症中全身性炎症反应、多器官功能障碍综合症的预防等。关于乌司他丁的纯化技术，国内有过报道比如：
中国专利CN 103073638 B公开了一种一种亲和层析纯化乌司他丁的方法，其中公开了一种亲和层析纯化乌司他丁的方法。具体的说，就是以健康成年男性新鲜尿液为原料，经过甲壳质吸附、氨水洗脱、硫酸铵盐析、吸附柱层析以及亲和层析等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的乌司他丁，可以将总收率提高到70％以上，总效价不低于5000iu/mg。经过亲和层析后含有部分镍离子，纯化程度低，从而使制备出来的乌司他丁无法满足现有技术要求，且金属离子亲和层析的成本非常高，并不适用于实际生产需求。
中国专利CN 100528898公开了一种高纯度乌司他丁及其制备方法和含有乌司他丁的药物组合物，其中的尿液经处理之后再经疏水柱吸附和亲和层析柱纯化，以及利用金属螯合柱和金属蛋白结合，通过磷酸盐缓冲液进行洗脱，使乌司他丁得以纯化，虽然得到一定纯度的乌司他丁，但是该方法在用于实际工业化生产时同样存在成本高的问题。
中国专利CN105384812公开了一种树脂再生提高柱效纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁复溶性的药物组合物，其中涉及纯化乌司他丁的方法，具体为经过甲壳质吸附、氨水洗脱、硫酸铵盐析、吸附柱层析以及亲和层析等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的乌司他丁，可以将总收率提高到70％以上，总效价不低于5000iu/mg，柱效提升约50％。该方法得到纯品虽然效价相对较高，但是收率相对不高。中国专利CN 105399819公开了一种一种亲和层析纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁稳定性的药物组合物，经过甲壳质吸附、氨水洗脱、硫酸铵盐析、吸附柱层析以及亲和层析等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的乌司他丁，可以将总收率提高到70％以上，总效价不低于5000iu/mg。该方法同样也存在收率不高的问题。
综上可知，目前的乌司他纯化方法要么在用于实际工业化生产时成本很高，要么得率和纯度活性等不能满需求，因此提高乌司他丁提取的纯度、收率和活性，同时降低生产成本是十分必要的。
发明内容
鉴于现有技术的缺陷，本发明提供了一种用层析法纯化乌司他丁的方法。所述方法包括：(1)用氮气做保护气对尿液进行真空及微波处理并进行高速离心浓缩对尿液进行预处理；(2)以亲和层析为基础，加入疏水柱层析和凝胶过滤层析来纯化乌司他丁粗品。最终得到的乌司他丁收率、比活优于现有技术，冻干乌司他丁成品的各项生化指标均优于中国药典规定。
为解决上述技术问题，具体而言，本发明过程是这样的。
首先对尿液进行预处理，将尿液在冷冻机中进行冷冻，以氮气为保护气进行真空处理；对真空处理后的尿液在40-60℃下采用微波处理，微波处理功率为200-350w，微波处理时间为每吨尿液5-10min，对微波处理后的尿液进行高速离心浓缩，收集浓缩后的离心液；然后进行吸附、洗脱、盐析、干燥处理得到乌司他丁粗品。
上述每吨尿液微波处理5-10min的含义为：每增加一吨尿液处理时间增加5-10min。例如，如果微波处理1吨尿液所需要的时间为6min，则微波处理2吨尿液需要的时间为12min，微波处理3吨尿液需要的时间为18min，其次类推。
然后用层析纯化方法对乌司他丁粗品进行纯化，选用的层析柱可以为亲和层析柱、离子交换柱、疏水柱、吸附柱、金属螯合柱和凝胶过滤层析柱中的一种或几种。
优选地，上述纯化方法，选用的层析柱可以为亲和层析柱、疏水柱、离子交换柱、金属螯合住和凝胶过滤层析柱中的一种或几种。
进一步优选地，上述纯化方法，选用的层析柱选自亲和层析柱、疏水柱和凝胶过滤层析柱。
上述离子交换柱可以选自Q Sepharose H.P、Q Sepharose F.F、Q Sepharose4F.F、Q Sepharose XL、QAE Sephadex A-25、STREAMLINE Q XL、DEAE Sepharose F.F、DEAESepharose A-25、DEAE Sepharose A-50或STREAMLINE DEAE。
上述金属螯合柱的填料可以选自Chelating Sepharose Fast Flow、CoSepharose FF、Ni Sepharose FF和Cu Sepharose FF中的一种。
上述亲和层析柱的填料可以选自CM-SephadexA-25、CM-Sephadex A-50、CM-Sephadex C-25、CM-Sephadex C-50、SP-Sepharose2B、HiTrapr ProteinA FF、SP-Sepharose4B、SP-Sepharose6B、SP-Sepharose CL-2B、SP-Sepharose CL-4B、SP-SepharoseCL-6B或HiTrapr ProteinA HF中的一种。
优选地，上述亲和层析柱的填料选自CM-Sephadex C-25、CM-Sephadex C-50、SP-Sepharose2B、HiTrapr ProteinA FF、SP-Sepharose4B、SP-Sepharose6B、SP-SepharoseCL-2B、SP-Sepharose CL-4B、SP-Sepharose CL-6B或HiTrapr ProteinA HF中的一种。
进一步优选地，上述亲和层析柱的填料选自HiTrapr ProteinA FF或HiTraprProteinA HF中的一种。
更进一步优选地，上述亲和层析柱的填料为HiTrapr ProteinA FF。
在一些具体的实施方案中，上述亲和层析柱的填料为ProteinA Sepharose CL-4B或ProteinA Sepharose 4FF中的一种。
在一些优选的实施方案中，上述亲和柱的填料为ProteinA Sepharose CL-4B。
上述疏水柱的填料可以选自：Butyl Sepharose 4Fast Flow、Octyl Sepharose4Fast Flow、Phenyl Sepharose 6Fast Flow、Butyl-s Sepharose 6Fast Flow、ButylSepharose 4B或Octyl Sepharose CL-4B中的一种。
优选地，上述疏水柱的填料选自Butyl Sepharose 4Fast Flow、Octyl Sepharose4Fast Flow、Phenyl Sepharose 6Fast Flow或Butyl-s Sepharose 6Fast Flow中的一种。
进一步优选地，上述疏水柱的填料为Phenyl Sepharose6Fast Flow。
上述凝胶过滤层析柱的填料可以选自Superdex30perp grade、Superdex75perpgrade、Superdex200perp grade、Superdex6perp grade、Sephacryl S-100HR、SephacrylS-400HR、Sepharose 2B或Sephadx G-75中的一种。
优选地，上述凝胶过滤层析柱的填料选自Superdex75perp grade、Superdex6perpgrade、Sephacryl S-100HR、Sepharose 2B或Sephadx G-75中的一种。
进一步优选地，上述凝胶过滤层析柱的填料为Sephacryl S-100HR。
根据一些具体的实施方案，本发明所述的乌司他丁纯化方法，包括以下步骤：
(1)取适量pH为4-6.5的澄清尿液，首先对其进行冷冻处理，将冷冻后的尿液在氮气的保护下进行真空处理，对真空条件下的尿液在40-60℃条件下采用微波处理，微波处理功率为200-350w，微波处理时间为每吨尿液5-8min，将微波处理后的尿液进行高速离心处理，收集浓缩后的离心后的尿液中加入适量壳聚糖，并用精密pH试纸调节尿液pH为4.5-6.5；吸附完全后用氨水洗脱0.5-3h,在经过2-5kg硫酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
(2)对步骤(1)得到的乌司他丁粗品进行层析柱纯化；
(3)将步骤(2)得到的层析洗脱液依次进行微滤、超滤；
(4)将步骤(3)得到的超滤液离心，弃上清，将沉淀用无水乙醇洗涤，留取沉淀物；
(5)将步骤(4)得到的沉淀物冻干，即得乌司他丁。
更具体地，本发明所述的乌司他丁纯化方法，包括以下步骤：
(1)取1T pH为4.0-6.5的澄清尿液，将其置于冷冻机中进行冷冻，以氮气为保护气进行真空处理；对真空处理后的尿液在40-60℃下采用微波处理，微波处理功率为200-350w，微波处理时间为6-7min，对微波处理后的尿液进行高速离心，收集浓缩后的离心液加入适量的壳聚糖，并用精密pH试纸测定，调节尿液pH到5.0-6.0；吸附完全后用氨水洗脱0.5-3h，再经过2-5kg硫酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
(2)疏水柱层析(XK50/20层析柱，Phenyl Sepharose6Fast Flow(highsub)填料)
预处理：称取乌司他丁粗品1kg，用10mmol/L HAc-NaAc溶解，搅拌25分钟，离心30分钟，留取离心液，用乙酸调pH至6.0，并加固体氯化钠调节电导至60-70ms/cm；
平衡：使用10mmol/L pH＝5.5的HAc-NaAc缓冲液，并加固体氯化钠调节电导至60-70ms/cm，调节泵流速为20-30.0ml/min，平衡6-8倍柱体积；
上样：以100-120mL/min流速上样，上样结束后，用平衡缓冲液10mmol/L pH＝5.0的HAc-NaAc缓冲液并加固体氯化钠调节电导至60-70ms/cm，复平衡4-6倍柱床体积；
洗脱：使用10mmol/L pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液，调节泵流速为20.0-35.0mL/min，开始洗脱，收集洗脱液；
(3)亲和层析(ProteinA Sepharose CL-4B填料)
具体实施步骤为：
平衡：用5.6L 10mmol/L pH＝6.5的HAc-NaAc缓冲液，加固体氯化钠调节电导至60-70ms/cm平衡亲和层析柱，将疏水柱层析洗脱液流经平衡过的层析柱，流速控制在100-120mL/min；
上样：以100-135mL/min流速上样疏水柱层析的目的溶液，上样结束后，用10mmol/L pH＝6.5的HAc-NaAc缓冲液，加固体硫酸铵调节电导至60-70ms/cm复平衡5-8倍柱体积；
洗脱：使用10mmol/L pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液，调节泵流速为100-125ml/min，开始洗脱，收集洗脱液；
(4)凝胶过滤层析(HR16/70层析柱Sephacryls-100HR填料)
具体实施步骤为：
平衡：用10mmol/L pH＝6.5的HAc-NaAc缓冲液平衡4-6个柱体积，平衡时泵流速为2.5-4.0mL/min；
上样：将亲和层析纯化洗脱液加入适量碱性溶液，上清液上样，上样时泵流速为2.5-4.0mL/min，样品上样量为柱体积的2％-5％；
洗脱：上样完毕后，用10mmol/L pH＝6.5的HAc-NaAc缓冲液，调节泵流速为3.0-5.0mL/min，收集洗脱液；
(5)洗脱液超滤至50-65mL；
(6)洗涤：将步骤(5)得到的超滤液离心，固体用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物；
(7)冻干：将步骤(6)得到的沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得乌司他丁。
上述步骤(4)中所述的碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、组氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种，优选为氨水、组氨酸、精氨酸中的一种。
上述超滤使用的超滤膜的截留分子量可以为4.5-30kD。
经过纯化试验发现乌司他丁的总收率可高达90％以上，总效价在6900iu/mg以上。尤其在一些优选方案中总收率为95.7％和94.9％，总效价为7002iu/mg和6992iu/mg，纯度可高达99.99％，冻干产品乌司他丁的各项生化指标均优于中国药典要求。
本发明取得的有益效果主要体现在：
(1)本发明对尿液采用了真空及微波预处理，并进行了离心浓缩，从而提高了乌司他丁粗品的含量，有助于进一步提高乌司他丁的纯度。
(2)对乌司他丁的纯化采用了层析柱纯化处理，操作简单，且优选的填料和流速等参数提高了生产效率，降低生产成本，具有进一步开发利用的价值。
(3)通过试验证实，本发明具体实施例中可以看到，乌司他丁的收率，比活性要优于已公开发明，通过溶解冻干粉使产品稳定性均高于已公开产品。
具体实施方式
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
实施例1一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法
(1)取1T pH＝6的澄清尿液，将其置于冷冻机中进行冷冻，以氮气为保护气进行真空处理；对真空处理后的尿液在45℃下采用微波处理，微波处理功率为250w，微波处理时间为6min，对微波处理后的尿液进行高速离心浓缩，收集浓缩后的离心液不断搅拌，缓慢加入15kg壳聚糖，并用精密pH试纸测定，使用醋酸调节尿液pH到6.0；吸附完全后用氨水洗脱1.5h，再经过3.5kg硫酸铵盐析，静置20小时，沉淀、离心后置于用无水硫酸镁吸水剂的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得乌司他丁粗品；
(2)疏水柱层析
XK50/20层析柱，Phenyl Sepharose6Fast Flow(highsub)填料
预处理：称取乌司他丁粗品1kg，用10mmol/L HAc-NaAc溶解，搅拌30分钟，离心20分钟，留取离心液，用醋酸调pH至6.0，加固体硫酸铵调节电导至65ms/cm；
平衡：使用10mmol/L pH＝6.5的HAc-NaAc缓冲液，加固体氯化钠调节电导至70ms/cm，调节泵流速为25.0mL/min，平衡6倍柱体积；
上样：以130mL/min流速上样，上样结束后，用10mmol/L pH＝6.5的HAc-NaAc缓冲液，加固体硫酸铵调节电导至60ms/cm复平衡7倍柱床体积；
洗脱：使用10mmol/L pH＝9的Tris-HCl缓冲液洗脱，调节泵流速为30.0mL/min，开始洗脱，收集洗脱液；
(3)亲和层析
填料为ProteinA Sepharose CL-4B
具体实施步骤为：
平衡：用5L 10mmol/L pH＝6.5的HAc-NaAc缓冲液，加固体氯化钠调节电导至65ms/cm平衡亲和层析柱，将疏水柱层析洗脱液流经平衡过的层析柱，流速控制在120mL/min；
上样：以120mL/min流速上样疏水柱层析的目的溶液，上样结束后，用10mmol/L pH＝6.0的HAc-NaAc缓冲液复平衡6倍柱体积；
洗脱：使用10mmol/L pH＝9的Tris-HCl缓冲液洗脱，调节泵流速为125mL/min，开始洗脱，收集洗脱液；
(4)凝胶过滤层析
HR16/70层析柱，Sephacryls-100HR填料
具体实施步骤为：
平衡：用10mmol/L pH＝6.5的HAc-NaAc平衡7个柱体积，平衡时泵流速为4.0ml/min；
上样：将亲和层析纯化洗脱液加入1ml 20％的氨水，上清液上样，上样时泵流速为4.0mL/min，样品上样量为柱体积的4％；
洗脱：上样完毕后，用10mmol/LpH＝6.5的HAc-NaAc缓冲液，调节泵流速为3.5mL/min，收集洗脱液；
(5)洗脱液经微滤膜微滤至250mL，微滤液中反复加入50mM碳酸氢钠溶液，反复微滤至250mL，使用截留分子量为25kD的超滤膜最终超滤至67.9mL；
(6)洗涤：将步骤(5)得到的超滤液离心，固体用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物；
(7)冻干：将步骤(6)得到的沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得乌司他丁。
实施例2一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法
与实施例1的区别在于将步骤(1)中微波处理处理时间设置为5min；将步骤(4)上样洗脱液中的1mL 20％的氨水换成1g的精氨酸。
对比例1一种乌司他丁纯化方法
步骤(1)为取1T pH为6.5的澄清尿液，缓慢加入15kg壳聚糖，并用精密pH试纸测定，使用醋酸调节尿液pH到6.0；吸附完全后用氨水洗脱1.5h，再经过3.5kg硫酸铵盐析，静置20小时，沉淀、离心后置于用无水硫酸镁吸水剂的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得乌司他丁粗品；
步骤(2)-(7)同实施例1。
对比例2一种乌司他丁纯化方法
去掉实施例1中步骤(3)，其他步骤和方法与实施例1相同。
对比例3一种乌司他丁纯化方法
将实施例1步骤(3)的亲和层析柱用强离子交换柱代替，所用强阴离子交换柱为STREAMLINE Q XL，其使用方法为STREAMLINE Q XL柱的常规使用方法(具体参考其使用说明)；其他步骤和方法与实施例1相同。
对比例4一种乌司他丁纯化方法
将实施例1步骤(3)的亲和层析柱用弱阴离子交换柱代替，所用的弱阴离子交换柱为DEAE Sepharose A-50，其使用方法为DEAE Sepharose A-50柱的常规使用方法(具体参考其使用说明)；其他步骤和方法与实施例1相同。
对比例5
将实施例1步骤(3)中填料ProteinA Sepharose CL-4B用填料ProteinASepharose 4FF代替，其使用方法为ProteinA Sepharose 4FF的常规使用方法(具体参考其使用说明)；其他步骤和方法与实施例1相同。
对比例6
将实施例1步骤(4)的凝胶柱用阳离子层析柱代替，所用的阳离子层析柱为XK50/30层析柱，Source30S填料，其使用方法为XK50/30层析柱和Source30S填料的常规使用方法(具体参考其使用说明)；其他步骤和方法与实施例1相同。
对比例7
将实施例1中步骤(2)和(4)去掉，在步骤(3)亲和层析前加吸附层析，所用吸附层析柱为阴离子交换柱Q-Sephadex C-50，其使用方法为Q-Sephadex C-50的常规使用方法(具体参考其使用说明)；其他步骤和方法与实施例1相同。
对比例8为中国专利201610280456.7中的实施例7中公开的纯化方法。
对比例9
与实施例1的区别在于将步骤(3)中亲和层析柱的上样速度由120mL/min提高300mL/min，其他步骤与方法与实施例1相同。
对比例10
与实施例1的区别在于将步骤(1)中微波处理时间设置为15min，其他步骤与方法与实施例1相同。
指标观察：
(1)对实施例与对比例所得到的乌司他丁收率、比活、电泳纯度、HPLC纯进行测定，结果如表1。
表1实施例组各项指标考察结果
通过表1可以看出，实施例1与实施例2两个实施例的主要区别在于改变了微波处理时间为5min并将凝胶柱中所加的氨水换成了精氨酸，从数值上看，将两种物质改变并没有很大程度的改变所的产品的收率，收率分别达到了95.7％和94.9％，并且电泳纯度、HPLC纯度、比活稳定性和内毒素的数值都比其他实施例高；对比例1与实施例1的主要区别在于对比例1对澄清尿液处理时只是进行了简单的吸附、洗脱、盐析和干燥处理，在一定程度上影响了乌司他丁的收率，其收率为83.2％，远低于实施例1。对比例10对澄清尿液进行预处理时设置微波处理时间为15min，通过检测数据可以看出乌司他丁的收率、电泳纯度、比活稳定性都很大程度的降低，这可能是由于微波处理时间过长会使乌司他丁部分失活，从而一定程度的影响了乌司他丁的收率和比活。实际上，在蛋白质领域，微波对蛋白质活性的影响并没有定论。一方面，微波本身的光子能量并不足以断开蛋白质分子中的共价键使之结构坍塌变性。另一方面，微波在特定条件下可以影响水分子的水合作用或大分子的介电特性等。也就是说微波对蛋白质化学键的影响(也就是对蛋白质三维结构和活性的影响)并没有定论。本发明意外地发现，在尿液前处理时引入短时间(5-10min/吨尿液)的微波处理使得最终纯化的收率和比活都有一定提高，推测这种现象可能是因为短时间的微波处理对乌司他丁蛋白确实释放出一定的能量，影响其分子间的相互作用使之更容易富集纯化，但并不足以打断乌司他丁分子内的化学键，不足以影响到其结构及活性。本发明对澄清尿液进行冷冻、真空及短时间的微波处理等前处理，并结合使用疏水柱、亲和柱和凝胶柱可以更高质高量的对乌司他丁进行纯化。其他对比例在一定程度上对实施例1的方案和步骤进行了改变，但并没有达到本发明所得到的乌司他丁的收率和比活稳定性。
(2)将实施例与对比例获得的冻干粉加入5ml的蒸馏水溶解，观察生化指标如表2所示。
表2实施例组各项生化指标考察结果
性状 澄清度 纯度
实施例1 白色粉末 符合规定 99.99
实施例2 白色粉末 符合规定 99.99
对比例1 白色粉末 符合规定 99.98
对比例2 黄色粉末 不符合规定 80.12
对比例3 白色粉末 符合规定 99.76
对比例4 白色粉末 符合规定 99.56
对比例5 白色粉末 符合规定 99.89
对比例6 白色粉末 符合规定 99.90
对比例7 白色粉末 符合规定 99.96
对比例8 白色粉末 符合规定 99.92
对比例9 微黄色粉末 符合规定 95.89
对比例10 白色粉末 符合规定 99.97
通过表2可以看出，通过本发明的纯化方法制备的乌司他丁具有很高的纯度，其纯度可高达99.99％(实施例1和2)，即改变凝胶柱中的碱性物质对乌司他丁的纯度并没有很大的影响；对比例1与实施例1的主要区别在于对比例1对尿液处理时只是进行了简单的吸附、洗脱、盐析和干燥处理，在一定程度上影响了尿液中乌司他丁提取的纯度；对比例10对澄清尿液进行预处理时设置微波处理时间为15min，通过检测数据可以看出乌司他丁纯度与实施例1比较并没有很大变化，由此可知微波处理时间过长使乌司他丁失活从而影响了乌司他丁的收率，但是通过本发明的纯化处理是得到的乌司他丁纯度依然在99.95％以上。本发明对澄清尿液进行冷冻、真空及微波处理等前处理，并结合使用疏水柱、亲和柱和凝胶柱可以更高质高量的对乌司他丁进行纯化。其他对比例在一定程度上对实施例1的方案和步骤进行了改变，但并没有达到本发明对乌司他丁的纯化程度。
综合以上两表的数据可以看出，对比例2没有亲和层析的乌司他丁为黄色粉末，并且纯度很低，内毒素不合格；实施例1和2都使用了亲和层析柱并对尿液进行了前处理其收率和纯度达到了最高值，而其他对比例在一定程度上对样品预处理方式、微波处理时间、层析柱种类以及对样品流速进行改变，都在一定程度上导致收率、电泳纯度、HPLC纯度、内毒素、比活不同程度的降低。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取适量pH为4-6.5的澄清尿液，首先在氮气保护下对其进行的冷冻真空处理，在真空条件下进行微波处理，然后离心浓缩，收集浓缩尿液中加入适量壳聚糖，并用精密pH试纸调节尿液pH为4.5-6.5；吸附完全后用氨水洗脱0.5-3h,在经过2-5kg硫酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
(2)对步骤(1)得到的乌司他丁粗品进行层析柱纯化；
(3)将步骤(2)得到的层析洗脱液依次进行微滤、超滤；
(4)将步骤(3)得到的超滤液离心，弃上清，将沉淀用无水乙醇洗涤，留取沉淀物；
(5)将步骤(4)得到的沉淀物冻干，即得乌司他丁。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述的微波处理，处理温度为40-60℃；处理功率为200-350w；微波处理时间为每吨尿液5-10min。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的层析柱选自亲和层析柱、离子交换柱、疏水柱、吸附柱、金属螯合柱和凝胶过滤层析柱中的一种或几种；优选地，上述层析柱为亲和层析柱、疏水柱和凝胶过滤层析柱。
4.根据权利要求3所述的层析柱，其特征在于，所述离子交换柱可以选自Q SepharoseH.P、Q Sepharose F.F、Q Sepharose 4F.F、Q Sepharose XL、QAE Sephadex A-25、STREAMLINE Q XL、DEAE Sepharose F.F、DEAE Sepharose A-25、DEAE Sepharose A-50或STREAMLINE DEAE。
5.根据权利要求3所述的层析柱，其特征在于，所述金属螯合柱的填料可以选自Chelating Sepharose Fast Flow、Co Sepharose FF、Ni Sepharose FF和Cu SepharoseFF中的一种。
6.根据权利要求3所述的层析柱，其特征在于，所述亲和层析柱的填料可以选自CM-SephadexA-25、CM-Sephadex A-50、CM-Sephadex C-25、CM-Sephadex C-50、SP-Sepharose2B、HiTrapr ProteinA FF、SP-Sepharose4B、SP-Sepharose6B、SP-SepharoseCL-2B、SP-Sepharose CL-4B、SP-Sepharose CL-6B或HiTrapr ProteinA HF中的一种；优选地，上述的亲和层析柱的填料可以选自HiTrapr ProteinA FF或/和ProteinA SepharoseCL-4B。
7.根据权利要求3所述的层析柱，其特征在于，所述疏水柱的填料可以选自：ButylSepharose 4Fast Flow、Octyl Sepharose 4Fast Flow、Phenyl Sepharose 6Fast Flow、Butyl-s Sepharose 6Fast Flow、Butyl Sepharose 4B或Octyl Sepharose CL-4B中的一种；优选地，上述疏水柱的填料为Phenyl Sepharose6Fast Flow。
8.根据权利要求3所述的层析柱，其特征在于，所述凝胶过滤层析柱的填料可以选自Superdex30perp grade、Superdex75perp grade、Superdex200perp grade、Superdex6perpgrade、Sephacryl S-100HR、Sephacryl S-400HR、Sepharose 2B或Sephadx G-75中的一种；优选地，上述凝胶过滤层析柱的填料为Sephacryl S-100HR。
9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取1T pH为4.0-6.5的澄清尿液，将其置于冷冻机中进行冷冻，以氮气为保护气进行真空处理；对真空处理后的尿液在40-60℃下采用微波处理，微波处理功率为200-350w，微波处理时间为6-7min，对微波处理后的尿液进行高速离心，收集浓缩后的离心液加入适量的壳聚糖，并用精密pH试纸测定，调节尿液pH到5.0-6.0；吸附完全后用氨水洗脱0.5-3h，再经过2-5kg硫酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
(2)疏水柱层析
采用XK50/20层析柱，填料为Phenyl Sepharose6Fast Flow；
预处理：称取乌司他丁粗品1kg，用10mmol/L HAc-NaAc溶解，搅拌25分钟，离心30分钟，留取离心液，用乙酸调pH至6.0，并加固体氯化钠调节电导至60-70ms/cm；
平衡：使用10mmol/L pH＝5.5的HAc-NaAc缓冲液，并加固体氯化钠调节电导至60-70ms/cm，调节泵流速为20-30.0ml/min，平衡6-8倍柱体积；
上样：以100-120mL/min流速上样，上样结束后，用平衡缓冲液10mmol/L pH＝5.0的HAc-NaAc缓冲液并加固体氯化钠调节电导至60-70ms/cm，复平衡4-6倍柱床体积；
洗脱：使用10mmol/L pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液，调节泵流速为20.0-35.0mL/min，开始洗脱，收集洗脱液；
(3)亲和层析
填料为ProteinA Sepharose CL-4B；
具体实施步骤为：
平衡：用5.6L 10mmol/L pH＝6.5的HAc-NaAc缓冲液，加固体氯化钠调节电导至60-70ms/cm平衡亲和层析柱，将疏水柱层析洗脱液流经平衡过的层析柱，流速控制在100-120mL/min；
上样：以100-135mL/min流速上样疏水柱层析的目的溶液，上样结束后，用10mmol/L pH＝6.5的HAc-NaAc缓冲液，加固体硫酸铵调节电导至60-70ms/cm复平衡5-8倍柱体积；
洗脱：使用10mmol/L pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液，调节泵流速为100-125ml/min，开始洗脱，收集洗脱液；
(4)凝胶过滤层析
采用HR16/70层析柱，填料为Sephacryls-100HR；
具体实施步骤为：
平衡：用10mmol/L pH＝6.5的HAc-NaAc缓冲液平衡4-6个柱体积，平衡时泵流速为2.5-4.0mL/min；
上样：将亲和层析纯化洗脱液加入适量碱性溶液，上清液上样，上样时泵流速为2.5-4.0mL/min，样品上样量为柱体积的2％-5％；
洗脱：上样完毕后，用10mmol/L pH＝6.5的HAc-NaAc缓冲液，调节泵流速为3.0-5.0mL/min，收集洗脱液；
(5)洗脱液超滤至50-65mL；
(6)洗涤：将步骤(5)的超滤液离心，固体用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物；
(7)冻干：将步骤(6)的沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得乌司他丁。
10.根据权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，步骤(5)中所述超滤使用的超滤膜的截留分子量为4.5-30kD。
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