CN105753977A - 一种规模化生产高纯度乌司他丁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种规模化生产高纯度乌司他丁的方法。该方法将壳聚糖与海藻酸盐与初步过滤后的尿液混合,然后采用超滤与乙醇分级沉淀联用的方式进行纯化。本申请提供的规模化生产高纯度乌司他丁的方法,操作方便,可控性强,纯化工艺简单,适于大规模生产,而且,乌司他丁的收率高达72%,纯化得到的蛋白分子量为67000±200D,抑制胰蛋白酶的活性高于4780IU/mg蛋白。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种规模化生产高纯度乌司他丁的方法。
背景技术
乌司他丁,又名人尿胰蛋白酶抑制剂(humanurinarytrypsininhibitor,H-UTI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,表观相对分子量为66-68kD,等电点为2-3。它是一种糖蛋白,含糖量高达20%-30%。
由于结构中的两个活性功能区均具有很广的抑酶谱,所以能同时抑制胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明质酸酶、弹性蛋白酶等多种水解酶的活性;而且,乌司他丁分解形成的低分子量成分也具有很强的抑制水解酶的作用。乌司他丁不仅是一种广谱的蛋白酶抑制剂,还具有抑制心肌抑制因子的产生、改善休克时的循环状态、稳定溶酶体膜、抑制炎症介质的释放等功能。大量临床试验结果显示,乌司他丁在治疗急性胰腺炎、辅助治疗休克、改善手术刺激引起的免疫功能下降、尤其是减少体外循环并发症等方面有重要的作用,加上其本身来源于人体,无免疫原性,安全性高。
但由于尿液中乌司他丁的含量较少,其分离及纯化工艺成为制约其应用的关键因素。
目前国内纯化尿胰蛋白酶抑制剂的方法主要为气泡提取法结合亲和层析、离子交换法、亲和层析法、分子筛层析、金属螯合层析和疏水层析法等,以及尿胰蛋白抑制剂和尿激肽释放酶联产工艺。
据检索,国内已公开的专利申请文献较少,比如:
中国专利CN103073638B公开了一种亲和层析纯化乌司他丁的方法,该方法是以健康成年男性新鲜尿液为原料,经过甲壳质吸附、氨水洗脱、硫酸铵盐析、吸附柱层析以及亲和层析等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的乌司他丁,可以将总收率提高到70%以上,比活力不低于5000IU/mg。
中国专利申请CN2015108204251《一种树脂再生提高柱效纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁复溶性的药物组合物》和CN2014108077092《一种树脂再生提高柱效乌司他丁的方法及含有乌司他丁的药物组合物》均利用阴离子交换柱、亲和层析柱及超滤相结合的方法对乌司他丁粗品进行纯化的方法。
申请人在之前的专利文献CN2006100002002《纯化的乌司他丁及其制备方法和含有该乌司他丁的药物组合物》中采用阴离子交换柱、超滤和金属螯合柱、疏水柱和凝胶柱结合对乌司他丁粗品进行纯化。
但上述方法均需要结合多步层析、工艺步骤复杂不易放大等问题;另外,多步层析使用的纯化介质成本昂贵,不利于规模化工业生产。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题,提供一种规模化生产高纯度乌司他丁的方法,在保证乌司他丁的纯度和收率的同时,以减化其纯化工艺,达到节约成本、减少时间和人力成本的目的。
为了实现上述发明目的,本发明提供了一种规模化生产高纯度乌司他丁的方法,其具体步骤如下:
1)取澄清尿液,调节pH至6-6.5,以硅胶∶尿液=8-12kg/t的比例加入硅胶,搅拌,过滤,得滤液,调节滤液pH至4.5-6,以壳聚糖∶尿液=8-12kg/t的比例加入壳聚糖,以重量比为海藻酸盐∶壳聚糖=1-5%的比例加入海藻酸盐,搅拌,静置,弃去上清液,得下层沉淀物1;
2)向沉淀物1中加水冲洗,弃去上清液,加入硫酸铵缓冲溶液,调节pH至5-7,得混合液1,将混合液1超滤得截留液1,其中,截留液1的体积为混合液1体积的1/10-1/5;
3)向截留液1中加入溶液A并调节pH至7-8,搅拌,得混合液2,将混合液2进行二级超滤,得截留液2,其中,溶液A为三乙胺和异丙醇的混合溶液,超滤的压力为0.1-0.7MPa,温度为4-30℃,截留分子量为3×104;
4)向截留液2中加入其体积1.1-1.9倍体积浓度为95%的乙醇进行分级沉淀,过板框;向上清液中加其体积1.9-4倍相同浓度的乙醇,过板框,得沉淀物2;
5)将沉淀物2干燥,即得纯乌司他丁。
其中,本申请中所用壳聚糖,为甲壳素经脱乙酰作用得到,根据脱乙酰基程度的不同,分为水溶性壳聚糖和非水溶性壳聚糖,优选地,为脱乙酰度为大于90%的壳聚糖,分子量为2万-5万。
优选地,所述海藻酸盐为海藻酸钠或海藻酸钾,进一步优选为分子量为2万-5万的海藻酸钠。
优选地,步骤2)中超滤的条件为:压力为0.1-0.7MPa,温度为4-30℃,截留分子量为5×104-7×104。
优选地,本申请超滤所用的超滤膜为聚醚砜膜、聚丙烯膜、再生纤维素膜、醋酸纤维素膜、聚砜膜和聚偏氟乙烯膜中的一种或至少两种的复合膜;进一步优选为聚醚砜膜与醋酸纤维素膜的复合膜;
优选地,超滤膜的结构为中空纤维式、平板式、管式和卷式中的一种;进一步优选为管式。
优选地,步骤3)中三乙胺和异丙醇的体积比为1∶(0.1-0.5)。
优选地,步骤5)中所述的干燥为板框干燥。
优选地,本申请中调节pH所用的溶液为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、枸椽酸、酒石酸、氢氧化钠、氨水、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠和乙醇钠溶液中的一种或任意组合;
进一步优选为盐酸、磷酸、乙酸、氨水和氢氧化钠溶液中的一种或任意组合。
本申请超滤过程中,每隔4-5小时对滤膜进行反洗清洁。
本申请中在酸性条件下将壳聚糖与海藻酸盐通过静电吸附得到分子量较大的结构,利用壳聚糖与目标蛋白质(乌司他丁)之间的相互作用,增大超滤膜截留分子量,可除去大部分杂质,此步骤可提高超滤的精度。
在三乙胺和异丙醇混合溶液存在的情况下,海藻酸盐、壳聚糖与乌司他丁分离,进一步通过二级超滤以及乙醇沉淀将目标蛋白质与海藻酸盐、壳聚糖以及其它小分子实现分离。
与现有技术相比,本申请所提供的分离纯化乌司他丁的方法具有如下优点:
(1)采用超滤这种动态过滤方式,操作方便,可控性强;采用不同截留分子量、膜材质不同、多级超滤联用进行梯度超滤的方式,相比现有技术中每2小时即需对滤膜进行清洗的情况相比,本申请(每隔4-5小时对滤膜进行反洗清洁)延长了清洗所需时间,提高了超滤效率,节约了生产的时间成本。
(2)纯化工艺简单,适于大规模生产,而且,乌司他丁的收率高达72%,纯化得到的蛋白分子量为67000±200D,抑制胰蛋白酶的活性高达4780IU/mg蛋白(1个IU的定义为:以BAEE为底物,在25度时,每分钟使△A253增加0.001所需的乌司他丁的量)。
(3)缩短了乌司他丁的制备时间,本申请避开了耗时较长的柱纯化步骤,仅纯化步骤即可至少节约12-24h。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目的,而不限制本发明的范围和实质。
其中,本申请以下实施例中所用超滤膜为非对称性膜,膜的孔隙率为70-80%;
步骤2)中的一级超滤的超滤膜为聚砜膜,超滤膜结构为管式;
步骤3)中的二级超滤的滤膜为聚醚砜膜和醋酸纤维素膜的复合膜(聚醚砜膜和醋酸纤维素膜的活化层同向设置);超滤膜结构为管式;
超滤膜的具体结构参数及超滤具体工艺采用本领域常规技术手段。
实施例1
1)取1t澄清尿液,调节pH至6,加入8kg硅胶,搅拌,过滤,得滤液,调节滤液pH至4.5,加入8kg壳聚糖(分子量为3万)和0.4kg海藻酸钠(分子量为2万),搅拌,静置,弃去上清液,得下层沉淀物1;
2)向沉淀物1中加水冲洗,弃去上清液,加入硫酸铵缓冲溶液,调节pH至5,得混合液1,将混合液1超滤得截留液1,其中,截留液1的体积为混合液1体积的1/5,截留分子量为5×104;
3)向截留液1中加入溶液A并调节pH至7.5,搅拌,得混合液2,将混合液2进行二级超滤,得截留液2,其中,溶液A为三乙胺和异丙醇的体积比为1∶0.1的混合溶液,超滤的截留分子量为3×104;
4)向截留液2中加入1.1倍体积浓度为95%的乙醇进行分级沉淀,过板框;向上清液中加1.9倍相同浓度的乙醇,过板框,得沉淀物2;
5)将沉淀物2冷冻干燥,即得纯乌司他丁。
得到的乌司他丁纯品为白色粉末;采用中国药典(2010)推荐的高效液相色谱法测得分子量为66985D;采用凯氏定氮法测得蛋白含量,其抑制胰蛋白酶的活性为4521IU/mg蛋白;乌司他丁的收率为77%。
实施例2
1)取1t澄清尿液,调节pH至6.5,加入12kg硅胶,搅拌,过滤,得滤液,调节滤液pH至6,加入12kg壳聚糖(分子量为3万)和0.36kg海藻酸钠(分子量为5万),搅拌,静置,弃去上清液,得下层沉淀物1;
2)向沉淀物1中加水冲洗,弃去上清液,加入硫酸铵缓冲溶液,调节pH至6,得混合液1,将混合液1超滤得截留液1,其中,截留液1的体积为混合液1体积的1/5,截留分子量为6×104;
3)向截留液1中加入溶液A并调节pH至8,搅拌,得混合液2,将混合液2进行二级超滤,得截留液2,其中,溶液A为三乙胺和异丙醇的体积比为1∶0.5的混合溶液,超滤的截留分子量为3×104;
4)向截留液2中加入1.2倍体积浓度为95%的乙醇进行分级沉淀,过板框;向上清液中加4倍相同浓度的乙醇,过板框,得沉淀物2;
5)将沉淀物2干燥,即得纯乌司他丁。
其中,本实施例得到的乌司他丁纯品为白色粉末;采用中国药典(2010)推荐的高效液相色谱法测得分子量为67098D;采用凯氏定氮法测得蛋白含量,其抑制胰蛋白酶的活性为4780IU/mg蛋白;乌司他丁的收率为72%。
实施例3
1)取1t澄清尿液,调节pH至6.5,加入10kg硅胶,搅拌,过滤,得滤液,调节滤液pH至5,加入10kg壳聚糖(分子量为5万)和0.1kg海藻酸钠(分子量为5万),搅拌,静置,弃去上清液,得下层沉淀物1;
2)向沉淀物1中加水冲洗,弃去上清液,加入硫酸铵缓冲溶液,调节pH至7,得混合液1,将混合液1超滤得截留液1,其中,截留液1的体积为混合液1体积的1/5,截留分子量为7×104;
3)向截留液1中加入溶液A并调节pH至7,搅拌,得混合液2,将混合液2进行二级超滤,得截留液2,其中,溶液A为三乙胺和异丙醇的体积比为1∶0.2的混合溶液,超滤的截留分子量为3.5×104;
4)向截留液2中加入1.5倍体积浓度为95%的乙醇进行分级沉淀,过板框;向上清液中加4倍相同浓度的乙醇,过板框,得沉淀物2;
5)将沉淀物2真空干燥,即得纯乌司他丁。
其中,本实施例得到的乌司他丁纯品为白色粉末;采用中国药典(2010)推荐的高效液相色谱法测得分子量为66898D;采用凯氏定氮法测得蛋白含量,其抑制胰蛋白酶的活性为4667IU/mg蛋白;乌司他丁的收率为79%。
对比例1
1)称取1tpH小于6.5的澄清尿液,不断搅拌,缓慢加入16.5kg甲壳质,并用精密pH试纸测定,调节尿液pH到6.0;吸附完全后用氨水洗脱1h,再经过3.5kg硫酸铵盐析,过夜沉淀、离心后置于用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥器中真空干燥,干燥后即得乌司他丁粗品;
2)称取乌司他丁粗品1kg,用8.5L的洗脱液A溶解,搅拌30分钟,离心20分钟,留取离心液;所述洗脱液A为0.01-0.3mol/L的醋酸盐缓冲液;阴离子交换柱用3.0L的洗脱液B平衡,将上述离心液流经平衡好的阴离子交换柱,流速控制在130mL/mim,所述洗脱液B为0.01-0.5mol/L醋酸钠和0.1-5mol/LNaCl的缓冲液;用33L的洗脱液B溶液洗脱,流速控制在130mL/min,得洗脱液1;
3)将洗脱液1调节pH=7.5后进行超滤,得截留液1,其中,超滤的压力为0.1MPa,温度为30℃,截留分子量为3×104;
4)将截留液1冷冻干燥,即得纯乌司他丁。
其中,本实施例得到的乌司他丁纯品为白色粉末;采用中国药典(2010)推荐的高效液相色谱法测得分子量为75000D;采用凯氏定氮法测得蛋白含量,其抑制胰蛋白酶的活性为4200IU/mg蛋白;乌司他丁的收率为58%。
对比例2
1)取1t澄清尿液,调节pH至6.5,加入12kg硅胶,搅拌,过滤,得滤液,调节滤液pH至6,加入12kg壳聚糖(分子量为3万),搅拌,静置,倒出上清,得下层沉淀物1;
2)向沉淀物1中加水冲洗,倒出上清;加入硫酸铵缓冲溶液,搅拌后离心,得上清2,将上清2中加入调节pH至6.5,进行超滤,压力为0.1-0.3MPa,温度为30℃,截留分子量为3×104;然后加入1.1-1.9倍体积浓度为95%的乙醇进行分级沉淀,过板框;向上清液中加1.9-4倍相同浓度的乙醇,过板框,得沉淀物2;
3)将沉淀物2干燥,即得纯乌司他丁。
其中,本实施例得到的乌司他丁纯品为白色粉末;采用中国药典(2010)推荐的高效液相色谱法测得分子量为66889D;采用凯氏定氮法测得蛋白含量,其抑制胰蛋白酶的活性为4012IU/mg蛋白;乌司他丁的收率为52%。
上述实施例仅作为解释本发明的目的,本发明的范围不受此限制。对本领域的技术人员来说所做的修改是显而易见的,本发明仅受所附权利要求范围的限制。
Claims (10)
1.一种规模化生产高纯度乌司他丁的方法,其具体步骤如下:
1)取澄清尿液,调节pH至6-6.5,以硅胶∶尿液=8-12kg/t的比例加入硅胶,搅拌,过滤,得滤液,调节滤液pH至4.5-6,以壳聚糖∶尿液=8-12kg/t的比例加入壳聚糖,以重量比为海藻酸盐∶壳聚糖=1-5%的比例加入海藻酸盐,搅拌,静置,弃去上清液,得下层沉淀物1;
2)向沉淀物1中加水冲洗,弃去上清液,加入硫酸铵缓冲溶液,调节pH至5-7,得混合液1,将混合液1超滤得截留液1,其中,截留液1的体积为混合液1体积的1/10-1/5;
3)向截留液1中加入溶液A并调节pH至7-8,搅拌,得混合液2,将混合液2进行二级超滤,得截留液2,其中,溶液A为三乙胺和异丙醇的混合溶液,超滤的压力为0.1-0.7MPa,温度为4-30℃,截留分子量为3×104;
4)向截留液2中加入其体积1.1-1.9倍体积浓度为95%的乙醇进行分级沉淀,过板框;向上清液中加其体积1.9-4倍相同浓度的乙醇,过板框,得沉淀物2;
5)将沉淀物2干燥,即得纯乌司他丁。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,超滤所用的超滤膜为聚醚砜膜、聚丙烯膜、再生纤维素膜、醋酸纤维素膜、聚砜膜和聚偏氟乙烯膜中的一种或至少两种的复合膜;所述超滤膜的结构为中空纤维式、平板式、管式和卷式中的一种。
3.根据权利要求2所述的方法,其中,所述超滤膜为聚醚砜膜和醋酸纤维素膜的复合膜;所述超滤膜的结构为管式。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤1)中所述的海藻酸盐为分子量为2万-5万的海藻酸钠。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤1)中所述的壳聚糖为脱乙酰度为大于90%,分子量为2万-5万的壳聚糖。
6.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤2)中超滤的条件为:压力为0.1-0.7MPa,温度为4-30℃,截留分子量为5×104-7×104。
7.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤3)中三乙胺和异丙醇的体积比为1∶(0.1-0.5)。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中,调节溶液pH所用的溶液为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、枸椽酸、酒石酸、氢氧化钠、氨水、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠和乙醇钠溶液中的一种或任意组合。
9.根据权利要求8所述的方法,其中,调节溶液pH所用的溶液为盐酸、磷酸、乙酸、氨水、氢氧化钠和碳酸氢钠溶液中的一种或组合。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中,步骤5)中所述的干燥为板框干燥。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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