TWI742377B - 一種重組人胰島素或其類似物的前驅物的製備方法 - Google Patents

一種重組人胰島素或其類似物的前驅物的製備方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI742377B
TWI742377B TW108117907A TW108117907A TWI742377B TW I742377 B TWI742377 B TW I742377B TW 108117907 A TW108117907 A TW 108117907A TW 108117907 A TW108117907 A TW 108117907A TW I742377 B TWI742377 B TW I742377B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
insulin
precursor
hollow fiber
solution
concentration
Prior art date
Application number
TW108117907A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202012433A (zh
Inventor
趙亮亮
韓廣杰
牛寧寧
李娜
劉衍偉
王宏偉
Original Assignee
大陸商江蘇恒瑞醫藥股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商江蘇恒瑞醫藥股份有限公司 filed Critical 大陸商江蘇恒瑞醫藥股份有限公司
Publication of TW202012433A publication Critical patent/TW202012433A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI742377B publication Critical patent/TWI742377B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
    • B01D2311/04—Specific process operations in the feed stream; Feed pretreatment
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
    • B01D2311/06—Specific process operations in the permeate stream
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
    • B01D2311/26—Further operations combined with membrane separation processes
    • B01D2311/2688—Biological processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
    • B01D2311/26—Further operations combined with membrane separation processes
    • B01D2311/2697—Chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2315/00—Details relating to the membrane module operation
    • B01D2315/10—Cross-flow filtration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D63/00—Apparatus in general for separation processes using semi-permeable membranes
    • B01D63/02—Hollow fibre modules

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本文公開了一種重組人胰島素或其類似物的前驅物的製備方法，包括連續流離心和中空纖維膜的使用。一些實施方案中，包括發酵液離心分離、中空纖維微過濾和胰島素前驅物捕獲等工序。本文公開的方法具有步驟精簡、易放大生產、無有機溶劑、收率高等優點，胰島素前驅物純度可高於90%，宿主細胞蛋白去除率高於90%，外源性DNA去除率達到89%及以上、低於0.1ng/mg。

Description

一種重組人胰島素或其類似物的前驅物的製備方法
本申請要求申請日為2018年5月24日的中國專利申請CN201810507928.7的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本發明關於蛋白質多肽類藥物領域，具體關於一種重組人胰島素或其類似物的前驅物的製備方法，從而製備出胰島素類似物藥物治療糖尿病相關疾病。
糖尿病是一種常見的代謝內分泌疾病，是繼癌症、心腦血管病之後，第三大威脅人類生命的疾病。在糖尿病治療中，胰島素是核心藥物。糖尿病患者人數迅猛的增長趨勢使得胰島素的需求量迅速增加。生物技術的飛速發展使得利用微生物平臺、採用基因工程表現人胰島素及其類似物成為工業主流方法。
已有多種胰島素類似物或其衍生物，WO2005012347公開了一種B29位連接一個麩胺酸和長鏈脂肪酸的B30位胺基酸缺失的胰島素類似物，WO2007074133和WO2011141407分別公開了上述胰島素類似物的製劑及其製備方法；WO9507931公開了一種B29位連接一個十四醯基側鏈的B30位胺基酸缺失的胰島素類似物、製劑及其製備方法；WO2018024186公開了一種人胰島素類似物的醯化衍生物的結構和生物活性。
關於胰島素類似物或其衍生物的製備，1982年，Genetech公司和Lilly公司合作使用大腸桿菌系統生產胰島素，胰島素前驅物以包涵體形式存在於大腸桿菌細胞內，細胞破碎後釋放，在經裂解再摺疊獲得結構正確的胰島素前驅物，經酶處理後形成胰島素。CN1043719A公開了使用酵母菌系統生產胰島素，胰島素前驅物可直接分泌到發酵液中，將離心去除菌體後的上清液過管柱，冷凍乾燥分離得到前驅物。CN106282274A公開了一種胰島素前驅物蛋白的畢赤酵母菌高密度發酵方法，採用離心法對發酵液固液分離。US2014057318A公開了利用中空纖維膜系統澄清胰島素前驅物發酵液的方法。CN1290299A公開了大孔樹脂吸附，然後用有機溶劑溶析的方法來捕獲胰島素前驅物。CN105153294A公開了用Capto MMC系列填料可直接上樣，獲得可直接用於酶切的胰島素前驅物。
發酵液澄清是酵母菌分泌表現胰島素前驅物製備程序的第一步，目的是使菌體和蛋白分離，獲得含有胰島素前驅物的發酵上清液。常用的酵母菌固液分離方法包括板框壓濾法、中空纖維膜澄清分離法、離心法、絮凝沉澱法、膨脹床層析等。發酵液經澄清處理後獲得含有胰島素前驅物的澄清液，澄清液在酶切前通常需要經過捕獲工序，因導電度較高，需要稀釋後才能進行離子交換層析。
現有製備重組人胰島素或其類似物的前驅物的方法中存在多種問題，包括：成本高、時間長、操作複雜、引入有機溶劑從而增加生產工場的防爆要求、澄清液體積過大從而需要增加生產中儲罐面積、獲得的胰島素前驅物無法直接酶切、胰島素前驅物產物回收率低等。針對以上問題，迫切需要一種改進的、效率高、收率高、成本低、易放大生產的重組人胰島素或其類似物的前驅物的製備方法。
本發明將連續流離心和中空纖維微過濾有機結合，用於製備重組人胰島素或其類似物的前驅物，適用於大規模工業化生產胰島素前驅物及胰島素。
在一些實施方案中，提供一種製備重組人胰島素或其類似物的前驅物的方法，所述方法包含如下步驟：a、菌體發酵，將發酵液進行連續流離心，收集輕液；b、將步驟a中的輕液經過中空纖維膜過濾，收集濾液；c、將步驟b中的濾液通過管柱進行純化。
在一些實施方案中，經過連續流離心後，可獲得菌體含量低於1%的輕液，經過層析後可獲得純度90%以上的胰島素前驅物。
在一些實施方案中，步驟b的中空纖維膜過濾是切向流循環過濾，中空纖維膜的孔徑選自0.22μm或0.45μm。在至少一個實施方案中，中空纖維膜孔徑是0.22μm。
在一些實施方案中，步驟b的中空纖維膜過濾是切向流循環過濾，所述的中空纖維膜的截留分子量為500-1000kDa。在至少一個實施方案中，中空纖維膜的截留分子量為750kDa。
在一些實施方案中，所述的方法包含如下步驟：a、菌體發酵後將發酵液進行連續流離心，分別收集輕液和重液，重液至少經過一次稀釋後再離心獲得輕液，合併輕液；b、將步驟a中的輕液經過中空纖維膜切向流循環過濾，收集濾液；c、將步驟b中的濾液通過層析進行純化； 其中管柱所用填料為複合型填料，所述的複合型填料包含陽離子交換配位基和疏水配位基。在一些具體的實施方案中，複合型填料層析介質選擇Eshmuno® HCX。
在一些實施方案中，陽離子交換配位基為強陽離子交換配位基。
在一些實施方案中，稀釋採用的稀釋液選自酸性溶液或鹼性溶液，所述酸性溶液選自乙酸-乙酸鈉、檸檬酸鹽緩衝液，所述鹼性溶液選自三羥甲基胺基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩衝液、磷酸鹽緩衝液、甘胺酸氫氧化鈉緩衝液。在至少一個實施方案中，所述的酸性溶液的pH為2.0-6.0，所述鹼性溶液的pH為7.0-9.0。在至少一個實施方案中，所述的酸性溶液的濃度為1mM-100mM、或1mM-50mM、或10mM-20mM、或為或約為10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM。在至少一個實施方案中，所述鹼性溶液的濃度為1mM-100mM、或1mM-50mM、或10mM-30mM、或為或約為10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM。
在一些實施方案中，步驟a中的發酵液在離心前調節pH值為2.0-9.0、或3.0-8.5、或4.0-8.0範圍內的任意值。在至少一個實施方案中，所述pH值為或約為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或8.5。
在一些實施方案中，連續流離心採用碟片式離心機進行。
在一些實施方案中，連續流離心的離心力是8000-14000g範圍內的任意值，例如可以為或約為8000、8500、9000、10000、11000、12000、13000、14000g。
在一些實施方案中，包含如下步驟：a、菌體發酵後將發酵液調節pH為3.0-8.0，進行連續流離心，收集輕液； b、將步驟a中的輕液經過中空纖維膜切向流過濾系統進行過濾，收集濾液；c、將步驟b中的濾液通過強陽離子-疏水交換配位基管柱進行純化；其中，所述步驟a中包含如下步驟：分別收集輕液和重液，重液至少經過一次稀釋後再離心獲得輕液，合併輕液；所述的稀釋採用的稀釋液選自pH值為3.0-5.0的乙酸-乙酸鈉或pH值為7.0-9.0的三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液。所述步驟b的中空纖維膜孔徑可以為0.22μm。
在一些具體的實施方案中，乙酸-乙酸鈉稀釋液的pH值可以為或約為3.0、4.0、5.0，三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液的pH值可以為或約為7.0、8.0、9.0。
在一些具體的實施方案中，所述的方法步驟c的純化包含平衡、上樣、洗滌和溶析的步驟；平衡和洗滌所用的溶液為乙酸-乙酸鈉緩衝液；溶析所用的溶液為三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液。在一些具體的實施方案中，乙酸-乙酸鈉緩衝液的濃度為1-50mM、或10-40mM、或20-30mM、或為或約為10mM、20mM、30mM、40mM、50mM。所述的三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液濃度為10mM-150mM、或30mM-100mM、或50mM-70mM、或為或約為20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM。所述平衡所用的溶液pH值為3.0-6.0、或4.0-5.0；洗滌所用的溶液的pH值為5.0-7.0、或5.5-6.0。
在一些實施方案中，還提供一種製備人重組胰島素或其類似物的方法，所述的方法包含：(1)酵母菌表現人重組胰島素或其類似物的前驅物，(2)按照上述的方法純化人重組胰島素或其類似物的前驅物，(3)酶切處理人重組胰島素或其類似物的前驅物，得到人重組胰島素或其類似物。
在一些具體的實施方案中，所述的人重組胰島素類似物為B30缺失的人胰島素。
在一些實施方案中，提供一種製備胰島素衍生物的方法，所述胰島素衍生物可以是醯化胰島素類似物，所述的方法包含(1)酵母菌表現人重組胰島素的前驅物，(2)按照上述的方法純化人重組胰島素的前驅物，(3)酶切處理得到人重組胰島素，(4)所述的人重組胰島素經過醯化基團的取代。
在一些實施方案中，所述的醯化取代在B29位的離胺酸處被取代，所述的醯化胰島素類似物可以是或可以不是B30缺失的人重組胰島素。在一些具體實施方案中，所述取代的產物為離胺酸B29(Nε-(Nα-十六烷脂肪二酸-L-離胺酸-Nε-氧代丁醯基))des(B30)人重組胰島素。
在一些具體的實施方案中，高菌體含量(如40%)的發酵液經過連續排渣連續流離心機處理，能快速實現菌體和上清液的初分離，獲得菌體含量低於1%的輕液，再經中空纖維微過濾，得到含有胰島素前驅物的澄清度極高的清液，與單一中空纖維膜過濾相比，澄清液體積減少了70%，與單一連續流離心機相比，澄清度有顯著提升。
在一些實施方案中，上述方法獲得的胰島素及其類似物的前驅物的收率高於60%，純度高於80%，宿主細胞蛋白去除率高於80%，外源性DNA(deoxyribonucleic acid)去除率高於80%。在一些具體的實施方案中，上述方法獲得的胰島素及其類似物的前驅物的收率高於70%，純度高於90%，宿主細胞蛋白去除率高於85%，外源性DNA去除率高於85%。在一些具體的實施方案中，上述方法獲得的胰島素及其類似物的前驅物的收率高於80%，純度高於90%，宿主細胞蛋白去除率高於90%，外源性DNA去除率高於88%。在一些具體的實施方案中，上述方法獲得的胰島素及其類似物的前驅物的收率高於或等於81%，純度高於93%，宿主細胞蛋白去除率高於 95%，外源性DNA去除率高於89%。在一些具體的實施方案中，上述方法獲得的胰島素及其類似物的前驅物的收率高於或等於85%，純度高於93%，宿主細胞蛋白去除率高於96%，外源性DNA去除率高於89%。在一些具體的實施方案中，上述方法獲得的胰島素及其類似物的前驅物的收率高於或等於93%，純度高於90%，宿主細胞蛋白去除率高於或等於91%，外源性DNA去除率高於或等於89%。
[定義]
本文使用的術語「胰島素」是指，結構和性質習知的胰島素激素，包括人胰島素激素。人胰島素具有兩條多肽鏈，命名為A鏈和B鏈。A鏈是21個胺基酸肽和B鏈是30個胺基酸肽，兩條鏈通過雙硫鍵連接：第一個鍵在A鏈位置7上的半胱胺酸與B鏈位置7上的半胱胺酸之間、和第二個鍵在A鏈位置20上的半胱胺酸與B鏈位置19上的半胱胺酸之間、第三個鍵存在於A鏈位置6與11上的半胱胺酸之間。
術語「母胰島素」是指，對其胺基酸序列應用任何修飾之前的胰島素。
術語「胰島素類似物」是指，胰島素的一個或多個胺基酸殘基已被其他胺基酸殘基取代和/或其中一個或多個胺基酸殘基已從胰島素上缺失和/或其中一個或多個胺基酸殘基已添加和/或插入到胰島素中的修飾胰島素。在一些實施方案中，胰島素類似物相對於母胰島素包含少於8個修飾(取代、缺失、添加(包括插入)及其任何組合)，備選地相對於母胰島素少於7個修飾，備選地相對於母胰島素少於6個修飾，備選地相對於母胰島素少於5個修飾，備選地相對於母胰島素少於4個修飾，備選地相對於母胰島素少於3個修飾，備選地相對於母胰島素少於2個修飾。胰島素類似物的實例包括AspB28人胰島素、des(B30)人胰島素。
術語「胰島素衍生物」是指，化學修飾的母胰島素或其類似物，其中修飾是以連接醯胺、碳水化合物、烷基、醯基、酯、PEG化等的形式。一個實例是離胺酸B29(Nε-(Nα-十六烷脂肪二酸-L-離胺酸-Nε-氧代丁醯基))des(B30)人胰島素。
本發明相對於現有技術，有以下的優點：1、結合連續流離心和中空纖維微過濾，快速實現發酵液澄清，與單獨的中空纖維膜過濾方式相比，顯著降低了澄清液體積和儲罐體積，減少了廠房的建築面積，同時顯著縮短下游層析的上樣時間，特別適合畢赤酵母菌高密度發酵液澄清的工業化生產；2、澄清液具備較高澄清度，可直接進行層析上樣，減少了後續處理；3、澄清液進行一步層析，去除色素和HCP(host cell protein，宿主細胞蛋白)的同時得到可直接酶切的高濃度胰島素前驅物，採用容量更高和價格更低的填料，顯著降低了捕獲程序的生產成本；4、獲得的胰島素或類似物的前驅物的收率高、純度高、雜質(包括宿主細胞蛋白和外源性DNA等)的去除率高。
圖1：使用實施例9的方法製備獲得的胰島素前驅物捕獲樣品HPLC檢測圖。
圖2：使用實施例10的方法製備獲得的胰島素前驅物捕獲樣品HPLC檢測圖。
圖3：使用實施例11的方法製備獲得的胰島素前驅物捕獲樣品HPLC檢測圖。
以下結合實施例用於進一步描述本發明，但並非限制本發明的範圍。
材料：MaxCell中空纖維柱、切向流過濾系統購於通用電氣(中國)醫療集團、Eshmuno® HCX購於默克密理博中國。
畢赤酵母菌：本領域常規的發酵用畢赤酵母菌均可以用於本文，例如可以是CN106282274A中採用的GS115型畢赤酵母菌(購自Invitrogen公司，美國)發酵表現重組人胰島素前驅物。
重組人胰島素及其前驅物：本文的重組人胰島素及其前驅物，可以是任一種重組人胰島素及其前驅物，例如PCT/CN2019/074146中的重組人胰島素離胺酸B29(Nε-(Nα-十六烷脂肪二酸-L-離胺酸-Nε-氧代丁醯基))des(B30)人胰島素及其前驅物。
人胰島素結構確證：本文重組人胰島素前驅物純化後，可使用例如V8蛋白酶對目標產物進行酶切，並對酶解產物進行LC-MS(liquid chromatography-mass spectrometry)分析。重組人胰島素：本文的重組人胰島素，可以是任一種重組人胰島素，例如PCT/CN2019/074146中的重組人胰島素離胺酸B29(Nε-(Nα-十六烷脂肪二酸-L-離胺酸-Nε-氧代丁醯基))des(B30)人胰島素。
實施例1 發酵液離心分離
用畢赤酵母菌發酵表現胰島素前驅物，菌體含量為40%的50L發酵液用乙酸調節pH值至4.0，經阿法拉伐流式離心機T20處理，離心力10000g，流速60L/h，排渣頻率次/2min。收集輕液25L，重液25L。重液加入10mM乙酸-乙酸鈉pH 4.0稀釋至50L再次離心，又收集25L輕液，兩次共50L，胰島素前驅物總收率為90%，菌體含量小於1%。
實施例2 發酵液離心分離
用畢赤酵母菌發酵表現胰島素前驅物，菌體含量為40%的50L發酵液用Tris(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羥甲基胺基甲烷)調節pH值至5.0，經阿法拉伐流式離心機T20處理，離心力10000g，流速60L/h，排渣頻率次/2min。收集輕液25L，重液25L。重液加入10mM乙酸-乙酸鈉pH 5.0稀釋至50L再次離心，又收集25L輕液，兩次共50L，胰島素前驅物總收率為95%，菌體含量小於1%。
實施例3 發酵液離心分離
用畢赤酵母菌發酵表現胰島素前驅物，菌體含量為34%的500L發酵液用Tris調節pH值至5.0，經連續流離心機處理，離心力10000g，進料速度1000L/h，輕液出口壓5bar。收集輕液210L，重液290L。重液加入10mM乙酸-乙酸鈉pH 5.0稀釋至400L再次離心，又收集120L輕液，兩次共330L，胰島素前驅物總收率為88%，菌體含量小於1%。
實施例4 發酵液離心分離
用畢赤酵母菌發酵表現胰島素前驅物，菌體含量為41%的350L發酵液用乙酸調節pH值至3.0，經連續流離心機處理，離心力10000g，進料速度800L/h，輕液出口壓5bar。收集輕液110L，重液240L。加入10mM乙酸-乙酸鈉pH 3.0將重液稀釋至350L再次離心，又收集120L輕液，兩次共230L，胰島素前驅物總收率為85%，菌體含量小於1%。
實施例5 發酵液離心分離
用畢赤酵母菌發酵表現胰島素前驅物，菌體含量為40%的350L發酵液用5M NaOH溶液調節pH值至8.0，經阿法拉伐流式離心機T20處理，離心力10000g，進料速度1000L/h，流速60L/h，輕液出口壓5bar。收集輕液130L，重液220L。加入20mM Tris-HCl pH 8.0將重液稀釋至350L再次離心，又收集140L輕液，兩次共270L，胰島素前驅物總收率為95%，菌體含量小於1%。
實施例6 中空纖維微過濾
用平衡液10mM乙酸-乙酸鈉pH 4.0循環沖洗0.22μm中空纖維柱，至回流端與進口端pH相等，取實施例1所得50L輕液進行中空纖維微過濾，跨膜壓15psi，透過端收集濾液約48L，胰島素前驅物收率為95%。
實施例7 中空纖維微過濾
用平衡液10mM乙酸-乙酸鈉pH 5.0循環沖洗0.22μm中空纖維柱，至回流端與進口端pH相等，取實施例2所得50L輕液進行中空纖維微過濾，跨膜壓15psi，透過端收集濾液約48L，胰島素前驅物收率為90%。
實施例8 中空纖維微過濾
用平衡液20mM Tris-HCl pH 8.0循環沖洗0.22μm中空纖維柱，至回流端與進口端pH相等，取實施例5所得270L輕液進行中空纖維微過濾，跨膜壓15psi，透過端收集濾液約255L，胰島素前驅物收率為93%。
實施例9 胰島素前驅物捕獲
將實施例6所得濾液進行陽離子層析，採用複合型層析介質Eshmuno® HCX，用平衡液(10mM乙酸-乙酸鈉緩衝液，pH 4.0)沖洗3倍柱體積，濾液直接上樣，上樣量為60g/L，然後用洗滌液(10mM乙酸-乙酸鈉緩衝液沖，pH 5.8)沖洗5倍柱體積以去除部分色素及HCP，最後用溶析液(100mM Tris-HCl,pH 8.0)溶析，收集溶析峰，得到純度93.1%的胰島素前驅物，收率為81%，結果見附圖1，溶析峰檢測宿主細胞蛋白和外源性DNA，濾液經過一步層析後，宿主細胞蛋白去除率達到95.6%，外源性DNA去除率達到89.6%，結果見表1。
實施例10 胰島素前驅物捕獲
將實施例7所得濾液進行陽離子層析，採用複合型層析介質Eshmuno® HCX，用平衡液(10mM乙酸-乙酸鈉緩衝液，pH 5.0)沖洗3倍柱體積，濾液 直接上樣，上樣量為80g/L，然後用洗滌液(10mM乙酸-乙酸鈉緩衝液沖，pH 6.0)沖洗5倍柱體積以去除部分色素及HCP，最後用溶析液(30mM Tris-HCl,pH 8.5)溶析，收集溶析峰，得到純度93.5%的胰島素前驅物，收率為85%，結果見附圖2，溶析峰檢測宿主細胞蛋白和外源性DNA，濾液經過一步層析後，宿主細胞蛋白去除率達到96.8%，外源性DNA去除率達到89.8%，結果見表1。
實施例11 胰島素前驅物捕獲
將實施例8所得濾液調pH至5.0後進行陽離子層析，採用複合型層析介質Eshmuno® HCX，用平衡液(10mM乙酸-乙酸鈉緩衝液，pH 5.0)沖洗3倍柱體積，濾液直接上樣，上樣量為80g/L，然後用洗滌液(10mM乙酸-乙酸鈉緩衝液沖，pH 6.0)沖洗5倍柱體積以去除部分色素及HCP，最後用溶析液(30mM Tris-HCl,pH 8.5)溶析，收集溶析峰，得到純度90.1%的胰島素前驅物，收率為93%，結果見附圖3，溶析峰檢測宿主細胞蛋白和外源性DNA，濾液經過一步層析後宿主細胞蛋白去除率達到91.0%，外源性DNA去除率達到89.0%，結果見表1。
Figure 108117907-A0305-02-0014-1
 備註：其中HCP檢測方法為中國藥典2015年版四部通則3414，採用市售試劑盒進行檢測。HCD採用基於SYBR Green螢光染劑的即時螢光定量PCR法(q-PCR法，quantitative polymerase chain reaction)進行檢測。
雖然以上描述了本發明的具體實施方式，但是本領域的技術人員應當理解，這些僅是舉例說明，在不背離本發明的原理和實質的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改。因此，本發明的保護範圍由所附申請專利範圍界定。

Claims (25)

  1. 一種製備重組人胰島素或其類似物的前驅物的方法，所述方法包含如下步驟：a、表現人重組胰島素前驅物的畢赤酵母菌體發酵，將發酵液進行連續流離心，離心力是8000-14000g，收集輕液；b、將步驟a中的輕液經過中空纖維膜過濾，收集濾液；其中所述的中空纖維膜的孔徑為0.22μm或0.45μm；或，所述的中空纖維膜的截留分子量為500-1000kDa；c、將步驟b中的濾液通過管柱進行純化，其中管柱所用填料為複合型填料，所述的複合型填料包含陽離子交換配位基和疏水配位基。
  2. 如請求項1所述的方法，其中所述的中空纖維膜的截留分子量為750kDa。
  3. 如請求項1或2所述的方法，其中步驟b的中空纖維膜過濾是切向流循環過濾。
  4. 如請求項1所述的方法，包含如下步驟：a、菌體發酵後將發酵液進行連續流離心，分別收集輕液和重液，重液至少經過一次稀釋後再離心獲得輕液，合併輕液；b、將步驟a中的輕液經過中空纖維膜切向流循環過濾，收集濾液；c、將步驟b中的濾液通過管柱進行純化，其中所述的陽離子交換配位基為強陽離子交換配位基。
  5. 如請求項4所述的方法，其中步驟a中，稀釋採用的稀釋液選自酸性溶液或鹼性溶液，所述酸性溶液選自乙酸-乙酸鈉、檸檬酸鹽緩衝液，所述鹼 性溶液選自三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、甘胺酸氫氧化鈉緩衝液。
  6. 如請求項5所述的方法，所述的酸性溶液的pH值為2.0-6.0，所述鹼性溶液的pH值為7.0-9.0。
  7. 如請求項5或6所述的方法，所述的酸性溶液的濃度為1mM-100mM；所述鹼性溶液的濃度為1mM-100mM。
  8. 如請求項7所述的方法，所述的酸性溶液的濃度為10mM-20mM；所述鹼性溶液的濃度為10mM-30mM。
  9. 如請求項7所述的方法，所述的酸性溶液的濃度為10mM；所述鹼性溶液的濃度為20mM。
  10. 如請求項1所述的方法，其中步驟a中的發酵液在離心前調節pH值為2.0-9.0。
  11. 如請求項10所述的方法，其中步驟a中的發酵液在離心前調節pH值為4.0-8.0。
  12. 如請求項10所述的方法，其中步驟a中的發酵液在離心前調節pH值，所述的pH值約為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或8.5。
  13. 如請求項1所述的方法，其中步驟a中連續流離心採用碟片式離心機進行。
  14. 如請求項1所述的方法，包含如下步驟：a、菌體發酵後將發酵液調節pH為3.0-8.0，進行連續流離心，收集輕液；b、將步驟a中的輕液經過中空纖維膜切向流過濾系統進行過濾，收集濾液； c、將步驟b中的濾液通過強陽離子-疏水交換配位基管柱進行純化；其中，所述步驟a中包含如下步驟：分別收集輕液和重液，重液至少經過一次稀釋後再離心獲得輕液，合併輕液；所述的稀釋採用的稀釋液選自pH為3.0-5.0的乙酸-乙酸鈉或pH為7.0-9.0的三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液；所述步驟b的中空纖維膜孔徑為0.22μm。
  15. 如請求項1所述的方法，其中步驟c的純化包含平衡、上樣、洗滌和溶析的步驟；所述平衡、洗滌所用的溶液為乙酸-乙酸鈉緩衝液，所述溶析所用的溶液為三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液。
  16. 如請求項15所述的方法，所述乙酸-乙酸鈉緩衝液的濃度為1-50mM；所述的三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液濃度為10mM-150mM。
  17. 如請求項16所述的方法，所述乙酸-乙酸鈉緩衝液的濃度為10mM；所述的三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液濃度為30mM-100mM。
  18. 如請求項15-17任一項所述的方法，所述平衡所用的溶液的pH值為3.0-6.0；洗滌所用的溶液的pH值為5.0-7.0。
  19. 如請求項18所述的方法，所述平衡所用的溶液的pH值為4.0-5.0；洗滌所用的溶液的pH值為5.5-6.0。
  20. 一種製備人重組胰島素或其類似物的方法，所述的方法包含：(1)畢赤酵母菌表現人重組胰島素或其類似物的前驅物；(2)按照如請求項1-19任一項所述的方法純化人重組胰島素或其類似物的前驅物；(3)酶切處理人重組胰島素或其類似物的前驅物得到人重組胰島素或其類似物。
  21. 如請求項20所述的方法，所述人重組胰島素類似物為B30缺失的人胰島素。
  22. 一種製備醯化胰島素類似物的方法，所述的方法包含：(1)畢赤酵母菌表現人重組胰島素的前驅物；(2)按照如請求項1-19任一項所述的方法純化人重組胰島素的前驅物；(3)酶切處理得到人重組胰島素；(4)所述的人重組胰島素經過醯化基團的取代。
  23. 如請求項22所述的方法，所述的取代在B29位的離胺酸處被取代。
  24. 如請求項22所述的方法，所述的醯化胰島素類似物是B30缺失的人重組胰島素。
  25. 如請求項22所述的方法，所述取代的取代產物為離胺酸B29(Nε-(Nα-十六烷脂肪二酸-L-離胺酸-Nε-氧代丁醯基))des(B30)人重組胰島素。
TW108117907A 2018-05-24 2019-05-23 一種重組人胰島素或其類似物的前驅物的製備方法 TWI742377B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810507928.7 2018-05-24
CN201810507928 2018-05-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202012433A TW202012433A (zh) 2020-04-01
TWI742377B true TWI742377B (zh) 2021-10-11

Family

ID=68616602

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108117907A TWI742377B (zh) 2018-05-24 2019-05-23 一種重組人胰島素或其類似物的前驅物的製備方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20210198311A1 (zh)
EP (1) EP3805257A4 (zh)
JP (1) JP2021524464A (zh)
KR (1) KR20210016400A (zh)
CN (1) CN111601819A (zh)
AU (1) AU2019272401A1 (zh)
BR (1) BR112020023485A2 (zh)
CA (1) CA3100869A1 (zh)
TW (1) TWI742377B (zh)
WO (1) WO2019223752A1 (zh)
ZA (1) ZA202007812B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7393425B2 (ja) * 2018-11-15 2023-12-06 中国科学院大▲連▼化学物理研究所 階層的細孔を有するｔｓ－１分子篩の製造方法
WO2020097878A1 (zh) * 2018-11-15 2020-05-22 中国科学院大连化学物理研究所 一种制备多级孔ts-1分子筛的方法
CN113563413A (zh) * 2021-08-17 2021-10-29 汉肽生物医药集团有限公司 毕赤酵母高密度发酵过程中色素的去除方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102439154A (zh) * 2009-03-12 2012-05-02 比格科技私人有限公司 一种多核苷酸和多肽链序列及其方法
CN107446039A (zh) * 2016-05-31 2017-12-08 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种人胰岛素类似物前体及其制备方法

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU641631B2 (en) 1988-12-23 1993-09-30 Novo Nordisk A/S Human insulin analogues
CN1059703C (zh) * 1993-04-10 2000-12-20 北京大学 人胰岛素前体基因在大肠杆菌中的直接表达及后加工方法
WO1995007931A1 (en) 1993-09-17 1995-03-23 Novo Nordisk A/S Acylated insulin
US6268487B1 (en) * 1996-05-13 2001-07-31 Genzyme Transgenics Corporation Purification of biologically active peptides from milk
KR100253916B1 (ko) 1997-12-29 2000-05-01 김충환 사람 인슐린 전구체의 제조방법
DE60321473D1 (de) * 2002-09-25 2008-07-17 Novo Nordisk As Aufreinigungsverfahren, das eine mikrofiltration bei erhöhten temperaturen beinhaltet
AU2003281982A1 (en) * 2002-11-26 2004-06-18 Novo Nordisk A/S Process for purifying a fermentation-derived product
EP2264065B1 (en) 2003-08-05 2017-03-08 Novo Nordisk A/S Novel insulin derivatives
CN101389650B (zh) 2005-12-28 2012-10-10 诺沃-诺迪斯克有限公司 包含酰化胰岛素和锌的组合物以及制备所述组合物的方法
AU2007311946A1 (en) * 2006-10-20 2008-04-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-cancer agent comprising anti-HB-EGF antibody as active ingredient
CN101717442A (zh) * 2008-10-09 2010-06-02 重庆富进生物医药有限公司 聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素及其制备方法和应用
WO2011141407A1 (en) 2010-05-10 2011-11-17 Novo Nordisk A/S Process for the preparation of insulin-zinc complexes
WO2014122653A1 (en) * 2013-02-07 2014-08-14 Valin Technologies Ltd. Process for preparing insulin
WO2014122651A1 (en) * 2013-02-07 2014-08-14 Valin Technologies Ltd. Process for preparing insulin
WO2016144658A1 (en) * 2015-03-10 2016-09-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Process for preparing recombinant insulin using microfiltration
CN106282274B (zh) 2015-06-29 2021-05-11 宜昌东阳光长江药业股份有限公司 一种胰岛素前体蛋白的毕赤酵母高密度发酵方法
CN105153294B (zh) 2015-08-31 2019-02-12 济南康和医药科技有限公司 一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法
CN105111304B (zh) * 2015-09-30 2018-12-14 山东阿华生物药业有限公司 重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法
CN106554410B (zh) * 2016-06-02 2019-11-26 陕西东大生化科技有限责任公司 一种重组人源胶原蛋白及其编码基因和制备方法
CN114478747B (zh) 2016-08-02 2024-06-14 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种人胰岛素或其类似物的酰化衍生物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102439154A (zh) * 2009-03-12 2012-05-02 比格科技私人有限公司 一种多核苷酸和多肽链序列及其方法
CN107446039A (zh) * 2016-05-31 2017-12-08 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种人胰岛素类似物前体及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
董鵬，重組人胰島素原在畢赤酵母中的表達及分離純化的研究，北京化工大學碩士研究生學位論文，2006年6月1日。

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021524464A (ja) 2021-09-13
KR20210016400A (ko) 2021-02-15
CN111601819A (zh) 2020-08-28
BR112020023485A2 (pt) 2021-03-30
WO2019223752A1 (zh) 2019-11-28
EP3805257A1 (en) 2021-04-14
ZA202007812B (en) 2021-10-27
CA3100869A1 (en) 2019-11-28
US20210198311A1 (en) 2021-07-01
AU2019272401A1 (en) 2021-01-14
TW202012433A (zh) 2020-04-01
EP3805257A4 (en) 2022-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI742377B (zh) 一種重組人胰島素或其類似物的前驅物的製備方法
US10428107B2 (en) Method for isolating and purifying recombinant human serum albumin from transgenic rice grain
HUE027178T2 (en) Process for producing high purity polysilic acid
CN111018933A (zh) 一种罗汉果提取物产品及其制备方法与用途
CN101570565A (zh) 一种从蚯蚓制备的促进微生物生长及提高培养单位的功能成分及其制备方法
CN116970095A (zh) 一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法
CN1336434A (zh) 胰激肽原酶的制备及其亲和层析纯化方法
CN116425810B (zh) 一种混合液中3-岩藻糖基乳糖的纯化方法
CN112409426B (zh) 一种硫酸西索米星的制备方法
US20230331772A1 (en) Method for purification of recombinant proteins
US7439337B2 (en) Three-phase partitioning method for purifying a protein
CN103642794A (zh) 一种大量制备BCG-CpG-DNA的方法
CN110862427B (zh) 一种庆大霉素C1a的纯化方法
CN102617727B (zh) 一种胸腺法新化合物及其新制法
CN113913415B (zh) 一种分离人尿激肽原酶和凝血酶调节蛋白的方法
CN110343170B (zh) 纤溶酶抑制剂rPI-T1的分离纯化方法
CN1919864A (zh) 高纯度血促性素的生产方法
RU2445116C1 (ru) СПОСОБ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ НАТИВНОГО О-АНТИГЕНА Vidrio cholerae
Sinha et al. Advances in downstream processing techniques
CN108017688B (zh) 一种目的蛋白的纯化方法
CN112812142A (zh) 一种单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的精制方法
RU2253676C2 (ru) Способ получения полигалактуроназного ферментного препарата
RU2634408C1 (ru) Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3
WO2020088207A1 (zh) 一种从基因工程水稻种子中分离纯化低铁饱和度的重组人乳铁蛋白的方法
CN105753977A (zh) 一种规模化生产高纯度乌司他丁的方法