BR112020023485A2

BR112020023485A2 - Métodos para preparar um precursor de insulina humana recombinante ou análogo da mesma, insulina humana recombinante ou análogo da mesma e análogo de insulina acilado

Info

Publication number: BR112020023485A2
Application number: BR112020023485-0A
Authority: BR
Inventors: Liangliang ZHAO; Guangjie Han; Ningning Niu; Na Li; Yanwei Liu; Hongwei Wang
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2019-05-23
Publication date: 2021-03-30
Also published as: ZA202007812B; TW202012433A; CN111601819A; US20210198311A1; WO2019223752A1; EP3805257A4; EP3805257A1; AU2019272401A1; JP2021524464A; TWI742377B; KR20210016400A; CA3100869A1

Abstract

é revelado um método para preparar um precursor de uma insulina humana recombinante ou um análogo da mesma, compreendendo: a. fermentação bacteriana, centrifugação de um caldo de fermentação em um fluxo contínuo para coletar um sobrenadante; b. filtrar o sobrenadante na etapa (a) por meio de uma membrana de fibra oca e coletar o filtrado; e c. purificar o filtrado na etapa (b) por meio de uma coluna de cromatografia. o método possui as vantagens de etapas dinamizadas, escalabilidade, nenhum uso de solventes orgânicos, alto rendimento etc. a pureza do precursor da insulina pode exceder 90%, a taxa de remoção de proteína da célula hospedeira excede 90% e a taxa de remoção de dna exógeno é de 89% ou maior, alcançando menos de 0,1 ng/mg.

Description

MÉTODOS PARA PREPARAR UM PRECURSOR DE INSULINA HUMANA RECOMBINANTE OU ANÁLOGO DA MESMA, INSULINA HUMANA RECOMBINANTE OU ANÁLOGO DA MESMA E ANÁLOGO DE INSULINA ACILADO

[001] O presente pedido reivindica prioridade do pedido de patente Chinês CN201810507928.7 depositado em 24 de maio de 2018, o conteúdo do qual é incorporado na presente invenção por referência em sua totalidade. Campo Técnico

[002] A invenção refere-se ao campo das proteínas e fármacos polipeptídicos, em particular a um método para preparar um precursor de insulina humana recombinante ou um análogo da mesma, preparando assim um fármaco análogo de insulina para o tratamento de doenças relacionadas a diabetes. Antecedentes

[003] A diabetes é uma doença metabólica e endócrina comum, e é a terceira doença com risco de vida mais grave, depois do câncer e das doenças cardiovasculares e cerebrovasculares. No tratamento da diabetes, a insulina é o fármaco de primeira linha. O rápido crescimento do número de pacientes diabéticos faz com que a demanda por insulina aumente rapidamente. Com o rápido desenvolvimento da biotecnologia, expressar a insulina humana e seus análogos usando plataformas microbianas e engenharia genética tornou-se um método convencional para a indústria.

[004] Existem uma variedade de análogos de insulina ou seus derivados. O documento WO2005012347 revelou um análogo de insulina no qual o aminoácido na posição B30 é deletado e um ácido glutâmico e um ácido graxo de cadeia longa são ligados na posição B29. Os documentos WO2007074133 e WO2011141407, respectivamente, revelaram preparações dos análogos de insulina acima e método de preparação dos mesmos; o documento WO9507931 revelou um análogo de insulina, uma formulação e método de preparação da mesma, em que o aminoácido na posição B30 é deletado e uma cadeia lateral de tetradecila é ligada na posição B29 do análogo de insulina; o documento WO2018024186 revelou a estrutura e atividade biológica de um derivado acilado de um análogo de insulina humana.

[005] No que diz respeito à preparação de análogos de insulina ou derivados da mesma, em 1982, Genetech e Lilly cooperaram na produção de insulina usando o sistema E. coli. O precursor de insulina, que existia em células de E. coli na forma de corpo de inclusão, foi liberado após a lise celular. Os precursores de insulina com a estrutura correta foram obtidos após a renaturação por lise celular. O documento CN1043719A revelou o uso de um sistema de levedura para a produção de insulina, em que o precursor de insulina pode ser secretado diretamente no caldo de fermentação, e o sobrenadante, após a remoção das bactérias por centrifugação, é passado através de uma coluna de cromatografia, isolando assim o precursor por liofilização. O documento CN106282274A revelou um método para preparar a proteína precursora de insulina por fermentação de alta densidade de P. pastoris e realizar a separação sólido-líquido em caldo de fermentação por centrifugação. O documento US2014057318A revelou um método para clarificar o caldo de fermentação de precursor de insulina usando um sistema de membrana de fibra oca. O documento CN1290299A revelou um método para capturar o precursor de insulina por adsorção com uma resina macroporosa seguida pela eluição com um solvente orgânico. O documento CN105153294A revelou um método em que os preenchimentos da série Capto MMC podem ser usados para carregamento direcionado para obter o precursor de insulina que pode ser usado diretamente para digestão enzimática.

[006] A clarificação do caldo de fermentação é a primeira etapa do preparo do precursor de insulina secretado e expresso pela levedura, que visa separar a bactéria e a proteína e obter o sobrenadante da fermentação contendo o precursor de insulina. Os métodos convencionais para separar o sólido e o líquido de levedura incluem placa e armação de filtro prensa, clarificação e separação usando membrana de fibra oca, centrifugação, floculação e sedimentação, cromatografia em leito expandido e assim por diante. Depois que o caldo de fermentação é clarificado, um líquido transparente contendo o precursor de insulina é obtido. O líquido claro geralmente precisa passar por um processo de captura antes da digestão enzimática. Devido à alta condutividade, o líquido claro precisa ser diluído antes da cromatografia de troca iônica.

[007] Existem muitos problemas nos métodos existentes para a preparação de precursores de insulina humana recombinante ou seus análogos, incluindo: alto custo, procedimento demorado, operação complicada, aumento dos requisitos à prova de explosão da planta de produção devido ao uso de solventes orgânicos, demanda para expansão da área do tanque de armazenamento devido ao volume excessivo do líquido claro, a incapacidade do precursor de insulina obtido ser digerido diretamente, e a baixa taxa de recuperação do produto precursor de insulina etc. Em vista dos problemas acima, existe uma necessidade urgente para um método melhorado para preparar precursores de insulina humana recombinante ou análogos dos mesmos com produção de alta eficiência, alto rendimento, baixo custo e fácil produção em escala. Sumário da invenção

[008] A presente invenção combina organicamente centrifugação de fluxo contínuo e microfiltração de fibra oca para preparar precursores de insulina humana recombinante ou análogos dos mesmos, que é adequado para produção industrial em larga escala de insulina e precursores de insulina.

[009] Algumas modalidades forneceram um método para preparar um precursor de insulina humana recombinante ou um análogo da mesma, compreendendo as seguintes etapas: a. realizar centrifugação de fluxo contínuo no caldo de fermentação obtido após a fermentação bacteriana, e coletar um líquido leve; b. filtrar o líquido leve da etapa a por filtração com membrana de fibra oca e coletar o filtrado obtido; c. purificar o filtrado da etapa b por coluna de cromatografia.

[010] Em algumas modalidades, após a centrifugação de fluxo contínuo, um líquido leve com teor bacteriano menor do que 1% pode ser obtido, e um precursor de insulina com uma pureza maior do que 90% pode ser obtido após a cromatografia.

[011] Em algumas modalidades, a membrana de fibra oca da etapa b possui, preferencialmente, um tamanho de poro de 0,22 μm ou 0,45 μm. Em pelo menos uma modalidade, a membrana de fibra oca possui um tamanho de poro de 0,22 μm.

[012] Em algumas modalidades, a filtração por membrana de fibra oca da etapa b é uma filtração de fluxo tangencial cíclico, a membrana de fibra oca possui um peso molecular de corte de 500 a 1000 KDa. Em pelo menos uma modalidade, a membrana de fibra oca possui um peso molecular de corte de 750 KDa.

[013] Em algumas modalidades, o método compreende as seguintes etapas: a. realizar centrifugação de fluxo contínuo no caldo de fermentação obtido após a fermentação bacteriana, e coletar, respectivamente, um líquido leve e um líquido pesado; diluir o líquido pesado pelo menos uma vez e então, realizar a centrifugação novamente para obter outro líquido leve, e juntar os dois líquidos leves obtidos em um;

b. filtrar o líquido leve obtido da etapa a por filtração de fluxo tangencial cíclico usando uma membrana de fibra oca e coletar o filtrado; c. purificar o filtrado da etapa b por coluna de cromatografia, em que o preenchimento usado em coluna de cromatografia é um preenchimento composto que compreende um ligante de troca catiônica e um ligante hidrofóbico. Em algumas modalidades específicas, Eshmuno®HCX é selecionado como um meio de cromatografia do preenchimento composto.

[014] Em algumas modalidades, o ligante de troca catiônica é um ligante de troca catiônica forte.

[015] Em algumas modalidades, a diluição descrita adota um diluente que é selecionado a partir de uma solução ácida ou uma solução alcalina, em que a solução ácida é selecionada a partir de um tampão ácido acético-acetato de sódio e um tampão citrato, e a solução alcalina é selecionada a partir de um tampão tri-hidroximetil-aminometano-ácido clorídrico (Tris-HCl), um tampão fosfato e um tampão hidróxido de sódio de glicina. Em pelo menos uma modalidade, a solução ácida possui um pH de 2,0 a 6,0, e a solução alcalina possui um pH de 7,0 a 9,0. Em pelo menos uma modalidade, a concentração da solução ácida é 1 mM a 100 mM, ou 1 mM a 50 mM, ou 10 mM a 20 mM, ou é ou é cerca de 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM ou 100 mM. Em pelo menos uma modalidade, a concentração da solução alcalina é 1 mM a 100 mM, ou 1 mM a 50 mM, ou 10 mM a 30 mM, ou é ou é cerca de 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM ou 100 mM.

[016] Em algumas modalidades, o caldo de fermentação da etapa (a) é ajustado para um pH de 2,0 a 9,0, ou 3,0 a 8,5, ou qualquer ponto entre 4,0 e 8,0 antes da centrifugação. Em pelo menos uma modalidade, o pH é ou é cerca de 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0 ou 8,5.

[017] Em algumas modalidades, a centrifugação de fluxo contínuo é realizada por uma centrífuga de disco.

[018] Em algumas modalidades, a força centrífuga de centrifugação de fluxo contínuo é qualquer valor na faixa de 8000g e 14000g, por exemplo, é ou é cerca de 8000, 8500, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000 ou 14000g.

[019] Em algumas modalidades, o método compreende as seguintes etapas: a. ajustar o caldo de fermentação para um pH de 3,0 a 8,0 após a fermentação bacteriana, realizar centrifugação de fluxo contínuo e coletar um líquido leve; b. filtrar o líquido leve obtido da etapa a por um sistema de filtragem de fluxo tangencial cíclico usando uma membrana de fibra oca e coletar o filtrado; c. purificar o filtrado da etapa b por coluna de cromatografia usando um ligante de troca catiônica-hidrofóbica forte; em que, a etapa a compreende, adicionalmente, as seguintes etapas: coletar líquido leve e líquido pesado, respectivamente, diluir o líquido pesado pelo menos uma vez e então, realizar a centrifugação para obter outro líquido leve e juntar dois líquidos leves em um; a diluição adota um diluente que é selecionado a partir de um tampão ácido acético-acetato de sódio com um pH de 3,0 a 5,0 ou um tampão Tris-HCl com um pH de 7,0 a 9,0. A membrana de fibra oca da etapa b pode possuir um tamanho de poro de 0,22 μm.

[020] Em algumas modalidades específicas, o pH do diluente de ácido acético-acetato de sódio pode ser ou é cerca de 3,0, 4,0 ou 5,0, e o pH do tampão Tris-HCl pode ser ou é cerca de 7,0, 8,0 ou 9,0.

[021] Em algumas modalidades específicas, a purificação da etapa (c) compreende as etapas de equilíbrio, carregamento, lavagem de impurezas e eluição; o equilíbrio e a lavagem usam uma solução de tampão ácido acético-

acetato de sódio, e a eluição usa uma solução de tampão Tris-HCl. Em algumas modalidades específicas, a concentração do tampão ácido acético-acetato de sódio é 1 a 50 mM, ou 10 a 40 mM, ou 20 a 30 mM, ou é ou é cerca de 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM ou 50 mM. A concentração do tampão Tris-HCl é 10 mM a 150 mM, ou 30 mM a 100 mM, ou 50 mM a 70 mM, ou é ou é cerca de 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM ou 150 mM. A solução usada no equilíbrio possui um pH de 3,0 a 6,0, ou 4,0 a 5,0; a solução usada na lavagem de impurezas possui um pH de 5,0 a 7,0, ou 5,5 a 6,0.

[022] Algumas modalidades também fornecem um método para preparar uma insulina humana recombinante ou um análogo da mesma, em que o método compreende: 1) expressar um precursor de insulina humana recombinante ou um análogo da mesma em levedura; 2) purificar o precursor de insulina humana recombinante ou o análogo da mesma de acordo com o método como definido acima; 3) realizar a digestão enzimática no precursor de insulina humana recombinante ou análogo da mesma para obter a insulina humana recombinante ou o análogo da mesma.

[023] Em algumas modalidades específicas, o análogo de insulina humana recombinante é insulina humana com deleção de B30.

[024] Algumas modalidades fornecem um método para preparar um derivado de insulina acilado, o derivado de insulina pode ser um análogo de insulina acilado, em que o método compreende: 1) expressar um precursor de insulina humana recombinante em levedura; 2) purificar o precursor de insulina humana recombinante de acordo com o método como definido acima; 3) realizar a digestão enzimática na insulina humana recombinante obtida; 4) conduzir uma substituição de um grupo de acilação na insulina humana recombinante.

[025] Em algumas modalidades, a substituição acilada é substituída na lisina na posição B29, o análogo de insulina acilado pode ser ou não uma insulina humana recombinante com deleção de B30. Em algumas modalidades específicas, a substituição possui um produto de insulina recombinante humana des(B30) Lisina B29 (Nε-(Nα-ácido hexadecanodioico-L-lisina-Nε-oxobutanoil)).

[026] Em algumas modalidades específicas, o caldo de fermentação com alto teor de células (tal como 40%) é processado por escória contínua usando centrífuga de fluxo contínuo, que pode alcançar rapidamente a separação inicial da célula e do sobrenadante, e obter um líquido leve com teor de células menor do que 1%. O líquido leve é filtrado por microfiltração de fibra oca para obter um líquido claro contendo precursor de insulina com alta clareza. Em comparação com a única filtração por membrana de fibra oca, o volume do líquido claro é reduzido em 70%; em comparação com a única centrífuga de fluxo contínuo, cuja clareza foi significativamente aprimorada.

[027] Em algumas modalidades, o rendimento de precursores de insulina e análogos dos mesmos obtidos de acordo com o método acima é maior do que 60%, a pureza é maior do que 80%, a taxa de remoção da proteína da célula hospedeira é maior do que 80% e a taxa de remoção de DNA exógeno é maior do que 80%. Em algumas modalidades específicas, o rendimento dos precursores da insulina e análogos da mesma obtidos de acordo com o método acima é maior do que 70%, a pureza é maior do que 90%, a taxa de remoção de proteína da célula hospedeira é maior do que 85% e a taxa de remoção de DNA exógeno é maior do que 85%. Em algumas modalidades específicas, o rendimento dos precursores da insulina e análogos da mesma obtidos de acordo com o método acima é maior do que 80%, a pureza é maior do que 90%, a taxa de remoção de proteína da célula hospedeira é maior do que 90% e taxa de DNA exógeno é maior do que 88%. Em algumas modalidades específicas, o rendimento dos precursores da insulina e análogos da mesma obtidos de acordo com o método acima é maior do que ou igual a 81%, a pureza é maior do que 93%, a taxa de remoção de proteína da célula hospedeira é maior do que 95% e a taxa de remoção de DNA exógeno é maior do que 89%. Em algumas modalidades específicas, o rendimento dos precursores da insulina e análogos da mesma obtidos de acordo com o método acima é maior do que ou igual a 85%, a pureza é maior do que 93%, a taxa de remoção de proteína da célula hospedeira é maior do que é maior do que 96% e a taxa de remoção de DNA exógeno é maior do que 89%. Em algumas modalidades específicas, o rendimento dos precursores da insulina e análogos da mesma obtidos de acordo com o método acima é maior do que ou igual a 93%, a pureza é maior do que 90%, a taxa de remoção de proteína da célula hospedeira é maior do que ou igual a 91% e a taxa de remoção de DNA exógeno é maior do que ou igual a 89%. Definições

[028] O termo 'insulina', conforme usado na presente invenção, refere-se a hormônios insulina com estrutura e propriedades bem conhecidas, incluindo hormônios insulina humana. A insulina humana possui duas cadeias polipeptídicas, denominadas cadeia A e cadeia B. Uma cadeia é um peptídeo de 21 aminoácidos e a cadeia B é um peptídeo de 30 aminoácidos. As duas cadeias são conjugadas por pontes dissulfeto: a primeira ponte localiza-se entre a cisteína na posição 7 da cadeia A e a cisteína na posição 7 da cadeia B, e a segunda ponte localiza-se entre a cisteína na posição 20 da cadeia A e a cisteína na posição 19 da cadeia B. A terceira ponte localiza-se entre as cisteínas nas posições 6 e 11 da cadeia A.

[029] O termo "insulina precursora" refere-se à insulina antes de qualquer modificação ser aplicada à sua sequência de aminoácidos.

[030] O termo "análogo de insulina" refere-se à insulina modificada em que um ou mais resíduos de aminoácidos de insulina foram substituídos por outros resíduos de aminoácidos e/ou um ou mais resíduos de aminoácidos foram deletados da insulina e/ou um ou mais aminoácidos foram adicionados e/ou inseridos na insulina. Em algumas modalidades, os análogos de insulina contêm menos que 8 modificações (substituições, deleções, adições (incluindo inserções) e qualquer combinação dos mesmos) em relação à insulina precursora, alternativamente menos que 7 modificações em relação à insulina precursora, alternativamente menos que 6 modificações relativas para a insulina precursora, alternativamente menos que 5 modificações em relação à insulina precursora, alternativamente menos que 4 modificações em relação à insulina precursora, alternativamente menos que 3 modificações em relação à insulina precursora, alternativamente menos que 2 modificações em relação à insulina precursora. Exemplos de análogos de insulina incluem insulina humana AspB28 e insulina humana des(B30).

[031] O termo "derivado de insulina" refere-se a uma insulina precursora quimicamente modificada ou um análogo da mesma, em que a modificação está na forma de amida, carboidrato, alquila, acila, éster, PEGuilação ligada etc. Um exemplo é insulina humana des(B30) Lisina B29 (Nε-(Nα-ácido hexadecanodioico- L-lisina-Nε-oxobutanoil)).

[032] Em comparação com o estado da técnica, a presente invenção possui as seguintes vantagens:

1. a combinação de centrifugação de fluxo contínuo e microfiltração de fibra oca pode alcançar a clarificação rápida do caldo de fermentação. Em comparação com o método de única filtração por membrana de fibra oca, reduz significativamente o volume do líquido clarificado e o volume do tanque de armazenamento, reduz a área de construção da planta e encurta significativamente o tempo de carregamento da cromatografia a jusante, que é particularmente adequada para produção industrial de clarificação de caldo de fermentação de alta densidade de Pichia pastoris;

2. o líquido clarificado possui alta clareza e pode ser carregado diretamente para cromatografia, reduzindo assim o processamento subsequente;

3. a cromatografia de etapa única do líquido clarificado pode remover o pigmento e HCP e obter uma alta concentração de precursor de insulina que pode ser digerido diretamente pela enzima, simultaneamente. A utilização de preenchimentos de maior carga e menor custo reduz significativamente o custo de produção do processo de captura;

4. Os precursores de insulina obtidos ou análogos dos mesmos possuem alto rendimento, alta pureza e alta taxa de remoção de impurezas (incluindo proteínas da célula hospedeira e DNA exógeno etc.). Breve descrição dos desenhos

[033] Figura 1: Gráfico de detecção de HPLC da amostra capturada da amostra de precursor de insulina preparada pelo método do Exemplo 9.

[034] Figura 2: Gráfico de detecção de HPLC da amostra capturada da amostra de precursor de insulina preparada pelo método do Exemplo 10.

[035] Figura 3: Gráfico de detecção de HPLC da amostra capturada da amostra de precursor de insulina preparada pelo método do Exemplo 11. Descrição detalhada da modalidade preferida

[036] Os exemplos a seguir são usados para descrever adicionalmente a presente invenção, mas a escopo de presente invenção não é limitado a isso.

[037] Materiais: A coluna de fibra oca MaxCell e o sistema de filtração de fluxo tangencial foram adquiridos do General Electric Medical Group (China); Eshmuno®HCX foi adquirido da Merck Millipore China.

[038] Pichia pastoris: Todas as Pichia pastoris convencionais para fermentação no estado da técnica podem ser usadas na presente invenção, por exemplo, a Pichia pastoris tipo GS115 (adquirida da Invitrogen, EUA) no documento CN106282274A pode ser usada para fermentar e expressar o precursor de insulina humana recombinante.

[039] Insulina humana recombinante e precursores da mesma: A insulina humana recombinante e precursores da mesma na presente invenção podem ser qualquer tipo de insulina humana recombinante e precursores da mesma, como a insulina humana recombinante des(B30) Lisina B29 (Nε-(Nα-ácido hexadecanodioico-L-lisina-Nε-oxobutanoil)) e precursores da mesma.

[040] Confirmação da estrutura de insulina humana: Após purificação dos precursores de insulina humana recombinante na presente invenção, o produto alvo pode ser digerido com, por exemplo, protease V8, e o produto digerido pode ser analisado por LC-MS. Insulina humana recombinante: a insulina humana recombinante na presente invenção podem ser qualquer tipo de insulina humana recombinante, tal como a insulina humana recombinante des(B30) Lisina B29 (Nε-(Nα-ácido hexadecanodioico-L-lisina-Nε-oxobutanoil)) no documento PCT/CN2019/074146. Exemplo 1 - Separação centrífuga de caldo de fermentação

[041] Pichia pastoris foi usada para fermentar e expressar o precursor de insulina. 50 L de um caldo de fermentação de 50L com 40% de teor bacteriano foi ajustado para pH 4,0 com ácido acético e tratado com uma centrífuga de fluxo Alfa Laval T20 com uma força centrífuga de 10.000 g, uma taxa de fluxo de 60L/h e uma frequência de descarga de escória uma vez a cada 2 min. Foram coletados 25L de líquido leve e 25L de líquido pesado. O líquido pesado foi diluído para 50L com ácido acético-acetato de sódio a 10 mM de pH 4,0 e centrifugado novamente, e outros 25L de líquido leve foram coletados, coletando assim um total de 50L de líquido leve. O rendimento total do precursor de insulina foi de 90% e o teor bacteriano foi menor que 1%. Exemplo 2 - Separação centrífuga de caldo de fermentação

[042] Pichia pastoris foi usada para fermentar e expressar o precursor de insulina. 50 L de um caldo de fermentação de com 40% de teor bacteriano foi ajustado para pH 5,0 com Tris, e tratado com uma centrífuga de fluxo Alfa Laval T20 com uma força centrífuga de 10.000 g, uma taxa de fluxo de 60 L/h e uma frequência de descarga de escória uma vez a cada 2 min. Foram coletados 25 L de líquido leve e 25 L de líquido pesado. O líquido pesado foi diluído para 50 L com ácido acético-acetato de sódio a 10 mM de pH 5,0 e centrifugado novamente, e outros 25 L de líquido leve foram coletados, coletando assim um total de 50 L de líquido leve. O rendimento total do precursor de insulina foi de 95% e o teor bacteriano foi menor que 1%. Exemplo 3 - Separação centrífuga de caldo de fermentação

[043] Pichia pastoris foi usada para fermentar e expressar o precursor de insulina. 500 L de um caldo de fermentação com 34% de teor bacteriano foi ajustado para pH 5,0 com ácido acético, e tratado com uma centrífuga de fluxo contínuo com uma força centrífuga de 10.000 g, uma velocidade de alimentação de 1000 L/h e uma pressão de saída de líquido leve de 500 KPa (5 bar). Foram coletados 210 L de líquido leve e 290 L de líquido pesado. O líquido pesado foi diluído para 400 L com ácido acético-acetato de sódio a 10 mM de pH 5,0 e centrifugado novamente, e outros 120 L de líquido leve foram coletados, coletando assim um total de 330 L de líquido leve. O rendimento total do precursor de insulina foi de 88% e o teor bacteriano foi menor que 1%. Exemplo 4 - Separação centrífuga de caldo de fermentação

[044] Pichia pastoris foi usada para fermentar e expressar o precursor de insulina. 350 L de um caldo de fermentação de com 41% de teor bacteriano foi ajustado para pH 3,0 com ácido acético, e tratado com uma centrífuga de fluxo contínuo com uma força centrífuga de 10.000 g, uma velocidade de alimentação de 800 L/h e uma pressão de saída de líquido leve de 500 KPa (5 bar). Foram coletados 110 L de líquido leve e 240 L de líquido pesado. O líquido pesado foi diluído para 350 L com ácido acético-acetato de sódio a 10 mM de pH 3,0 e centrifugado novamente, e outros 120 L de líquido leve foram coletados, coletando assim um total de 230 L de líquido leve. O rendimento total do precursor de insulina foi de 85% e o teor bacteriano foi menor que 1%. Exemplo 5 - Separação centrífuga de caldo de fermentação

[045] Pichia pastoris foi usada para fermentar e expressar o precursor de insulina. 350 L de um caldo de fermentação de com 40% de teor bacteriano foi ajustado para pH 8,0 com solução de NaOH a 5M, e tratado com uma centrífuga de fluxo Alfa Laval T20 com uma força centrífuga de 10.000 g, uma taxa de fluxo de 60 L/h, uma velocidade de alimentação de 800 L/h e uma pressão de saída de líquido leve de 500 KPa (5 bar). Foram coletados 130 L de líquido leve e 220 L de líquido pesado. O líquido pesado foi diluído para 350 L com Tris-HCl a 20 mM de pH 8,0 e centrifugado novamente, e outros 140 L de líquido leve foram coletados, coletando assim um total de 270 L de líquido leve. O rendimento total do precursor de insulina foi de 95% e o teor bacteriano foi menor que 1%. Exemplo 6 - Microfiltração de fibra oca

[046] Uma coluna de fibra oca de 0,22 μm foi lavada ciclicamente com uma solução de equilíbrio (ácido acético-acetato de sódio a 10 mM, pH 4,0), até que o pH no final do refluxo e na entrada de alimentação sejam iguais. 50 L do líquido leve obtido no Exemplo 1 foram submetidos a microfiltração de fibra oca, com uma pressão transmembrana de 103421 Pa (15 psi). Cerca de 48 L de filtrado foram coletados da saída do permeado e o rendimento do precursor de insulina foi de 95%. Exemplo 7 - Microfiltração de fibra oca

[047] Uma coluna de fibra oca de 0,22 μm foi lavada ciclicamente com uma solução de equilíbrio (ácido acético-acetato de sódio a 10 mM, pH 5,0), até que o pH no final do refluxo e na entrada de alimentação sejam iguais. 50 L do líquido leve obtido no Exemplo 2 foram submetidos a microfiltração de fibra oca, com uma pressão transmembrana de 103421 Pa (15 psi). Cerca de 48 L de filtrado foram coletados da saída do permeado e o rendimento do precursor de insulina foi de 90%. Exemplo 8 - Microfiltração de fibra oca

[048] Uma coluna de fibra oca de 0,22 μm foi lavada ciclicamente com uma solução de equilíbrio (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0), até que o pH no final do refluxo e na entrada de alimentação sejam iguais. 270 L do líquido leve obtido no Exemplo 5 foram submetidos a microfiltração de fibra oca, com uma pressão transmembrana de 103421 Pa (15 psi). Cerca de 255 L de filtrado foram coletados da saída do permeado e o rendimento do precursor de insulina foi de 93%. Exemplo 9 - Captura do precursor de insulina

[049] O filtrado obtido no Exemplo 6 foi submetido a cromatografia catiônica, Eshmuno®HCX foi usado como meio de cromatografia composto, e a coluna de cromatografia foi lavada 3 vezes o volume de coluna com uma solução de equilíbrio (tampão ácido acético-acetato de sódio a 10 mM, pH 4,0). O filtrado foi carregado diretamente para a coluna com um volume de amostra de 60 g/L, em seguida, a coluna foi lavada 5 vezes o volume da coluna com uma solução de lavagem (tampão ácido acético-acetato de sódio a 10 mM, pH 5,8) para remover porção do pigmento e HCP. Finalmente, um eluente (Tris-HCl a 100 mM, pH 8,0) foi usado para eluição e o pico de eluição foi coletado para obter o precursor de insulina com uma pureza de 93,1% e um rendimento de 81%. Os resultados são mostrados na Figura 1. Ao detectar a proteína da célula hospedeira e o DNA exógeno no pico de eluição, verificou-se que a taxa de remoção da proteína de célula hospedeira e do DNA exógeno atingiu 95,6% e 89,6% respectivamente após uma etapa de cromatografia do filtrado. Os resultados são mostrados na

Tabela 1. Exemplo 10 - Captura do precursor de insulina

[050] O filtrado obtido no Exemplo 7 foi submetido a cromatografia catiônica, Eshmuno®HCX foi usado como meio de cromatografia composto, a coluna de cromatografia foi lavada 3 vezes o volume de coluna com uma solução de equilíbrio (tampão ácido acético-acetato de sódio a 10 mM, pH 5,0). O filtrado foi carregado diretamente para a coluna com um volume de amostra de 80 g/L, em seguida, a coluna foi lavada por 5 vezes o volume da coluna com uma solução de lavagem (tampão ácido acético-acetato de sódio a 10 mM, pH 6,0) para remover porção do pigmento e HCP. Finalmente, um eluente (Tris-HCl a 30 mM, pH 8,5) foi usado para eluição e o pico de eluição foi coletado para obter o precursor de insulina com uma pureza de 93,5% e um rendimento de 85%. Os resultados são mostrados na Figura 2. Ao detectar a proteína da célula hospedeira e o DNA exógeno no pico de eluição, verificou-se que a taxa de remoção da proteína de célula hospedeira e do DNA exógeno atingiu 96,8% e 89,8% respectivamente após uma etapa de cromatografia do filtrado. Os resultados são mostrados na Tabela 1. Exemplo 11 - Captura do precursor de insulina

[051] O filtrado obtido no Exemplo 8 foi ajustado para pH 5,0, seguido por cromatografia catiônica, Eshmuno®HCX foi usado como meio de cromatografia composto, a coluna de cromatografia foi lavada 3 vezes o volume de coluna com uma solução de equilíbrio (tampão ácido acético-acetato de sódio a 10 mM, pH 5,0). O filtrado foi carregado diretamente para a coluna com um volume de amostra de 80 g/L, em seguida, a coluna foi lavada 5 vezes o volume da coluna com uma solução de lavagem (tampão ácido acético-acetato de sódio a 10 mM, pH 6,0) para remover porção do pigmento e HCP. Finalmente, um eluente (Tris- HCl a 30 mM, pH 8,5) foi usado para eluição e o pico de eluição foi coletado para obter o precursor de insulina com uma pureza de 90,1% e um rendimento de 93%. Os resultados são mostrados na Figura 3. Ao detectar a proteína da célula hospedeira e o DNA exógeno no pico de eluição, verificou-se que a taxa de remoção da proteína de célula hospedeira e do DNA exógeno atingiu 91,0% e 89,0% respectivamente após uma etapa de cromatografia do filtrado. Os resultados são mostrados na Tabela 1. Tabela 1 Resultados de detecção e taxa de remoção de HCP e HCD na amostra de captura de precursor Exemplo Taxa de remoção Taxa de remoção Nome da amostra correspondente de HCP de HCD Líquido de Exemplo 9 95,6% 89,6% captura Líquido de Exemplo 10 96,8% 89,8% captura Líquido de Exemplo 11 91,0% 89,0% captura Nota: O método de detecção de HCP é a Regra Geral 3414 do Volume VI da Farmacopeia Chinesa, edição de 2015, e kits comerciais são usados para detecção. HCD foi detectado pelo método de PCR quantitativo fluorescente em tempo real (método q-PCR) baseado no corante fluorescente SYBR Green.

[052] Deve ser entendido para técnicos no assunto que a descrição anterior de exemplos específicos é puramente ilustrativa, e que várias mudanças e modificações podem ser feitas a estes exemplos sem se afastar do princípio e da essência da presente invenção. Portanto, o escopo de proteção da presente invenção é definido pelas reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para preparar um precursor de insulina humana recombinante ou um análogo da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a. realizar centrifugação de fluxo contínuo no caldo de fermentação obtido após a fermentação bacteriana, e coletar um líquido leve; b. filtrar o líquido leve da etapa a por filtração com membrana de fibra oca e coletar o filtrado obtido; c. purificar o filtrado da etapa b por coluna de cromatografia.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a membrana de fibra oca possui, preferencialmente, um tamanho de poro de 0,22 μm ou 0,45 μm, mais preferencialmente 0,22 μm; ou, a membrana de fibra oca possui um peso molecular de corte de 500 a 1000 KDa, preferencialmente 750 KDa.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a filtração com membrana de fibra oca na etapa b é uma filtração de fluxo tangencial cíclico.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a. realizar centrifugação de fluxo contínuo no caldo de fermentação obtido após a fermentação bacteriana e coletar, respectivamente, um líquido leve e um líquido pesado; diluir o líquido pesado pelo menos uma vez e, em seguida, realizar a centrifugação novamente para obter outro líquido leve, e juntar dois líquidos leves obtidos em um; b. filtrar o líquido leve obtido na etapa a por uma filtração de fluxo tangencial cíclico usando uma membrana de fibra oca e coletar o filtrado; c. purificar o filtrado da etapa b por uma coluna de cromatografia usando um preenchimento composto como preenchimento, que compreende um ligante de troca catiônica e um ligante hidrofóbico, e o ligante de troca catiônica preferencial é um ligante de troca catiônica forte.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a diluição na etapa a adota um diluente que é selecionado a partir de uma solução ácida ou uma solução alcalina, em que a solução ácida é selecionada a partir de um tampão acetato de ácido acético-acetato de sódio e um tampão citrato, e a solução alcalina é selecionada a partir de um tampão tri-hidroximetil- aminometano-ácido clorídrico, um tampão fosfato e um tampão hidróxido de sódio de glicina.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a solução ácida possui um pH de 2,0 a 6,0, e a solução alcalina possui um pH de 7,0 a 9,0.

7. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a solução ácida possui uma concentração de 1 mM a 100 mM, preferencialmente 1 mM a 50 mM, mais preferencialmente 10 mM a 20 mM, ainda mais preferencialmente 10 mM; a solução alcalina possui uma concentração de 1 mM a 100 mM, preferencialmente 1 mM a 50 mM, mais preferencialmente 10 mM a 30 mM, ainda mais preferencialmente 20 mM.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o caldo de fermentação da etapa a é ajustado a um pH de 2,0 a 9,0, preferencialmente um pH de 3,0 a 8,5, mais preferencialmente um pH de 4,0 a 8,0 antes da centrifugação.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o pH do caldo de fermentação da etapa a é ajustado para cerca de 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0 ou 8,5 antes da centrifugação.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,

caracterizado pelo fato de que a centrifugação de fluxo contínuo da etapa a é realizada por uma centrífuga de disco e seleciona, preferencialmente, uma força centrífuga de 8000 a 14000g.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a. ajustar o caldo de fermentação para um pH de 3,0 a 8,0 após a fermentação bacteriana, realizar centrifugação de fluxo contínuo e coletar um líquido leve; b. filtrar o líquido leve obtido na etapa a por um sistema de filtragem de fluxo tangencial cíclico usando uma membrana de fibra oca e coletar o filtrado; c. purificar o filtrado da etapa b por coluna de cromatografia usando um ligante forte de troca catiônica-hidrofóbica; em que a etapa a compreende as seguintes etapas: coletar o líquido leve e líquido pesado, respectivamente, diluir o líquido pesado pelo menos uma vez e, em seguida, realizar a centrifugação para obter outro líquido leve e juntar dois líquidos leves em um; a diluição adota um diluente que é selecionado a partir de um tampão ácido acético-acetato de sódio com um pH de 3,0 a 5,0 ou um tampão tri-hidroximetil-aminometano-ácido clorídrico com um pH de 7,0 a 9,0; a membrana de fibra oca na etapa b possui um tamanho de poro de 0,22 μm.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a purificação da etapa c compreende etapas de equilíbrio, carregamento, lavagem de impurezas e eluição; em que o equilíbrio e a lavagem usam uma solução de tampão ácido acético-acetato de sódio, e a eluição usa uma solução de tampão tri-hidroximetil-aminometano-ácido clorídrico.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o tampão ácido acético-acetato de sódio possui uma concentração de 1 a 50 mM, preferencialmente 10 mM; o tampão tri-hidroximetil-aminometano-ácido clorídrico possui uma concentração de 10 mM a 150 mM, preferencialmente 30 mM a 100 mM.

14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a solução usada para o equilíbrio possui um pH de 3,0 a 6,0, preferencialmente 4,0 a 5,0; a solução usada para lavagem de impurezas possui um pH de 5,0 a 7,0, preferencialmente 5,5 a 6,0.

15. Método para preparar uma insulina humana recombinante ou um análogo da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende: 1) expressar um precursor de insulina humana recombinante ou um análogo da mesma em levedura; 2) purificar o precursor de insulina humana recombinante ou o análogo da mesma conforme o método definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14; 3) realizar digestão enzimática no precursor de insulina humana recombinante ou no análogo da mesma para obter a insulina humana recombinante ou o análogo da mesma; em que o análogo de insulina humana recombinante é preferencialmente uma insulina humana com deleção de B30.

16. Método para preparar um análogo de insulina acilado, caracterizado pelo fato de que compreende: 1) expressar um precursor de insulina humana recombinante em levedura; 2) purificar o precursor de insulina humana recombinante conforme o método definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14; 3) realizar digestão enzimática na insulina humana recombinante obtida; 4) conduzir uma substituição de um grupo de acilação na insulina humana recombinante; em que a substituição é preferencialmente uma substituição de lisina na posição B29.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o análogo acilado de insulina é uma insulina humana recombinante com deleção de B30, preferencialmente a substituição possui um produto de insulina recombinante humana des(B30) Lisina B29 (N ε-(Nα-ácido hexadecanodioico-L- lisina-Nε-oxobutanoil)).