CN1059703C - 人胰岛素前体基因在大肠杆菌中的直接表达及后加工方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种人胰岛素的基因工程生产方法。本法采用了大肠杆菌表达体系，实现了编码人胰岛素前体基因的直接表达，排除了传统采用的融合方式表达，给后加工带来了极大的方便。本法的表达率在20-30%，经细胞破碎分离包含体，包含体溶解，二硫键还原及重组，只经一根分子筛柱就可得纯度大于90%的人胰岛素前体。此产物可直接用胰酶转肽转为人胰岛素，产品的化学结构、生物活性，与人胰岛素相同。

Description

人胰岛素前体基因在大肠杆菌中的直接表达及后加工方法

所属技术领域：本发明属基因工程领域，是用大肠杆菌体系进行的基因表达，产物加工，得到人胰岛素的方法。

现有技术：胰岛素是治疗胰岛素依赖型糖尿病的特效药，患者必须长期持续使用，临床应用已有70年的历史了。在生物技术出现前，用的都是动物胰岛素，由于动物胰岛素与人胰岛素虽在生物活性上无多大差别，但在化学结构上有一定的差异，因而有不少患者会产生免疫反应。且提取胰岛素的工艺复杂，胰脏的来源也有限。人胰岛素不可能从人的胰脏大量提供，化学方法合成存在费用高的问题。

80年代初，人们发明了将猪胰岛素用胰酶转变为人胰岛素的方法，弥补了人胰岛素的来源的缺陷。由于猪胰岛素与人胰岛素只有B30上的这个氨基酸不同，人胰岛素是Thr而猪胰岛素是Ala，将猪胰岛素B30Ala换成Thr即得人胰岛素。此法有两个途径，其一是用羧肽酶A，先专一性地将B30Ala切下，得到去B30Ala的胰岛素，再用胰酶在水、有机溶剂中将THr酯接在B29Lys后面，分离后脱酯即得人胰岛素[Morihara & Tsuzuk-i，(1979)Xature，280，412-413]；其二是用胰酶直接完成在329Lys后的切割及连接的两个过程，较前一途径更为优越[Jonczyk & Gattner，(1981)Hoppe Seyler′Z Physiol，Chem.，362 1591-1598；Markussen，(1982)USpatent 4,343,898；Rose et al.，(1983)Biochem.J.211，671-676 ]。由于猪胰岛素的来源有限，酶促半合成人胰岛素并不是乐观的事。

随着生物技术的兴起，人们已可以用微生物发酵的方法生产药物。1982年，用基因工程方法生产的人胰岛素作为生物技术的第一个商品进入了市场。从国际市场的发展趋势看，基因工程人胰岛素已逐步取代用提取法制备的动物胰岛素。

国际上基因工程人胰岛素的生产采用了两套系统，其一是用大肠杆菌系统[Goe ddel et al.，(1982)EP patent 0055945]，其二是酵母系统[Thimet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，83，6766-6770；Thim et al.，(1986)EP patent 195691]。酵母系统采用了分泌人胰岛素原类似物的方式，分泌出来的人胰岛素前体已具有了天然的二硫键及正确的N-端，这种类似物可以通过胰蛋白酶转肽的方法(同将猪胰岛素转为人胰岛素)将其转化为人胰岛素。这一系统的优点在于分泌物具有天然的二硫键，缺点是酵母菌生长慢，导致生产周期长，且分泌量太少(1-10毫克/升)。大肠杆菌系统不利于表达小蛋白，产物容易降解，所以采用了融合蛋白形式，将胰岛素A链，B链或胰岛素前体接在一个大的蛋白后面，表达出来后通过溴化氰在X-端Met处裂解，即可释放出所需蛋白，并将其S-磺酸化，形成稳定的单分子衍生物。分别分离得到的S-磺酸型A链及B链需进行二硫键重组，才能得到人胰岛素，S-磺酸型人胰岛素前体需进行二硫键重组及胰酶和羧肽酶B联合作用[Kemmler.et al.，(1971)J.Biol.Chem.，246，6786.，不能将猪胰岛素转为人胰岛素，]才能得到人胰岛素。这一系统的优点在于表达量高(克级/升)，发酵周期短，缺点在于后加工复杂，需进行溴化氰裂解及过多根层析柱，最终产率也较低(约几十毫克/升)。以上两套系统分别为国际上两个人胰岛素生产公司(美国的Lilly公司及丹麦的Novo公司)拥有，年产量相当。下面是在大肠杆菌中以人胰岛素原融合蛋白形式生产人胰岛素的过程：

164克湿细胞在5体积的裂解缓冲液中破细胞：离心沉淀包含体；变性剂中溶解包含体，水稀释沉淀得融合蛋白；融合蛋白在甲酸中溴化氰裂解，减压蒸去溶剂；裂解物在变性剂中进行S-磺酸解；S-磺酸解粗产物上Sephadex G25脱盐，DEAE-Sephadex A25分离，活性组分超滤浓缩后上Sephadex G50分离，以上三根柱中流动相均含尿素，最后Sephadex G25脱盐；纯化的S-磺酸型人胰岛素原(209毫克)进行二硫键重组；DEAE-Sephadex A25，Sephadex G50分离人胰岛素原，或用HPLC分离；胰酶和羧肽酶B联合作用得人胰岛素。

1992年Lilly公司实研室在J.Biol.Chem.(267，419-425)上发表了倒置胰岛素原(A-C-B，正常为B-C-A)在大肠杆菌系统的非融合形式表达，有一定的意义。它的目的是为了得到高活性的人胰岛素原类似物，同时也希望能用于生产人胰岛素。它的提取过程如下：

43.5克湿细胞破细胞后离心得包含体；变性剂中溶解包含体：S-磺酸解，透析，调pH3.6沉淀S-磺酸解粗产物；FPLC阴离子交换分离，流动相含尿素，得147毫克S-磺酸型倒置胰岛素原；二硫键重组，RP-HPLC分离，得37毫克倒置胰岛素原；胰酶和羧肽酶B联合作用得人胰岛素。

在上面的体系中，倒置胰岛素原得到了10％的表达，后加工也有所简化，但仍存在不少缺点：

(1)表达率并不太高；

(2)仍采用S-磺酸解的转换；

(3)用了昂贵的仪器，流动相中含尿素；

(4)存在N-端不均一性(Met°-A-C-B占80％，A-C-B占20％)；

(5)倒置胰岛素原转成人胰岛素比胰岛素原转成人胰岛素难，副反应强烈。

发明的目的

由于用大肠杆菌系统以融合蛋白形式生产人胰岛素的过程非常繁琐，倒置胰岛素原的途径也不太可取，本发明的目的在于选用一种非融合形式高表达人胰岛素原类似物，避开融合蛋白的溴化氰裂解，也避开前人用的S-磺酸解过程，尽可能采用简单的设备，并通过分离纯化条件的改变，极大地降低生产成本。

发明的内容及方案将编码人胰岛素前体的基因直接克隆到表达质粒启动子的下游进行表达的工作前人一直没有成功，我们认为关键是表达效率太低，诱导时间过长(10小时)，生成产物几乎完全降解。我们通过高表达质粒的选用，用极短的时间(1小时)就可完成，实现了高的表达率。在后加工中，避开前人用的S-磺酸解过程，采用简单的条件，简单的设备，只经过一根分子筛柱就可得到纯度大于90％的人胰岛素前体，极大地降低了生产成本。具体方法包括：

1.将编码人胰岛素前体的基因重组到表达质粒启动子的下游，转化大肠杆菌细胞，进行诱导表达，前体基因包括：1)将编码人胰岛素原的基因；2)编码小C肽人胰岛素前体的基因；3)编码大C人胰岛素前体的基因；4)编码在B1Phe前插入C-端为Lys或Arg的小多肽的前体基因。

2.表达产物以包含体形式生成，通过包含体的溶解、还原及重组，可通过分子筛柱一步得到纯度大于90％的前体分子；其中重组产物所过分子筛柱的流动相pH为9-12，转肽产物用DEAE离子交换分离时，流动相为20-50％的异丙醇-水溶液。

3.前体分子可直接用胰酶在水--有机液中进行转肽，得到人胰岛素。其中转肽反应底物Thr酯为L-ThrOBut及L-Thr(But)OBut的混合物。在步骤2、3中重组人胰岛素前体，人胰岛素酯，人胰岛素均通过超滤浓缩，调pH4-6沉淀，离心、干燥得干粉。

优点及效果

与报道的融合人胰岛素前体及非融合A-C-B人胰岛素原生产人胰岛素比较，本发明专利有如下优点：

(1)表达率较高，为20-30％，利于后面的纯化，且产率较高；

(2)可避开溴化氰的使用，减小后面纯化的难度，也减少了环境污染；

(3)避开了S-磺酸解的转换，降低了成本；

(4)选用了简单的操作程序及仪器，利于生产；

(5)流动相中不含变性剂，降低了成本。

实施例

(一)直接表达人胰岛素原：

编码人胰岛素原的基因的表达率为20-30％，比Lilly实验室报道的A-C-B人胰岛素原的表达率(10％)高。后加工过程如下：

80克湿细胞于4-10倍体积的缓冲液中(0.05M Tris-HCl，5％Triton，8％ sucrose，0.05M EDTA，pH8.0)超声或高压匀浆破细胞，5000-10000g离心；15克沉淀(主要为包含体)用0.1M Tris-HCl，pH8.0，含8M尿素的溶液溶解，5000-10000g离心；上清加80mgDTT，30-37℃还原两小时，用水稀释四倍得沉淀；沉淀溶解后稀释至2升0.05MGly-NaOH，pH10.8缓冲液中，4-10℃重组24小时得人胰岛素原的粗液；超滤浓缩后上Sephadex G 50，用同样缓冲液洗脱，活性峰超滤后调pH5～6得沉淀，抽干后得80-150毫克人胰岛素原干粉(纯度＞90％)；胰酶转肽得15-30毫克人胰岛素。

产物经氨基酸组成分析知B1前含一个Met，是细胞翻译后加工不完全所致，通过溴化氰裂解，可得正常N-端的人胰岛素。

(二)直接表达小C肽人胰岛素原：

为了增强胰岛素二硫健的正确配对率，可选用小C肽人胰岛素原，小C肽由6个、2个氨基酸组成的小C肽人胰岛素原，甚至A1与B29直接相连，无C肽的人胰岛素前体，都得到了5-10％的表达。产物后加工同(一)。

(三)直接表达大C肽人胰岛素原：

由于在大肠杆菌系统中对于氨基酸残基数在120-250范围的蛋白表达，一般表达率都较高，说明其可较稳定存在于细胞中。我们通过基因操作，将C肽加大，以提高直接表达率，基于A.B链间存在足够的结构信息，C肽大小对二硫键的配对仅有一点影响，我们选择了大的C肽，使其内部不含半胱氨酸，以防止影响二硫键的正确配对，可得到满意的结果。我们将C肽加大了约一倍，将其直接表达，得到了20-30％的表达率。产物后加工除用Sephadex G75代替Sephadex G50外，其他同(一)。

(四)直接表达Lys-人胰岛素原基因：

由于(一)中表达产物呈Met-人胰岛素原的形式，我们通过基因突变，得到Lys-人胰岛素原基因，使其直接表达，表达产率、后加工成Met-Lys-人胰岛素原的过程及产率与(一)相当。

Met-Lys-人胰岛素原可通过胰酶转肽很容易得到N-端正确的人胰岛素。

Claims (5)

1.一种人胰岛素前体基因在大肠杆菌中的直接表达及后加工方法，其特征在于所述方法包括：

(1)将编码人胰岛素前体的基因重组到表达质粒启动子的下游，转化大肠杆菌细胞，进行诱导表达；

(2)表达产物以包含体形式生成，通过包含体的溶解、还原及重组，可通过分子筛柱一步得到纯度大于90％的前体分子；

(3)前体分子可直接用胰酶在水一有机液中进行转肽，得到人胰岛素。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中所述人胰岛素前体基因的特征在于：

(1)编码人胰岛素原的基因；

(2)编码小C肽人胰岛素前体的基因；

(3)编码大C肽人胰岛素前体的基因；

(4)编码在B1Phe前插入C-端为Lys或Arg的小多肽的前体基因。

3.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)特征是重组产物所过分子筛柱的流动相pH为9-12，转肽产物用DEAE离子交换分离时，流动相为20-50％的异丙醇-水溶液。

4.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中特征是转肽反应底物Thr酯为L-ThrOBut及L-Thr(But)OBut的混合物。

5.根据权利要求1的方法，其中步骤中(2)、(3)特征是重组人胰岛素前体，人胰岛素酯，人胰岛素均通过超滤浓缩，调pH4-6沉淀，离心、干燥得干粉。