CN103102409B - 灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
一种灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法，将从人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制剂粗品溶解于缓冲液中，并于60℃加热，然后吸附于DEAE层析柱后洗脱，得DEAE洗脱液；接着将DEAE洗脱液于硫酸铵溶液上样，并吸附于疏水层析柱，之后使用1M硫酸铵溶液洗脱，得疏水洗脱液；疏水洗脱液经超滤后，于低pH孵化，再经凝胶过滤层析得病毒灭活的人尿胰蛋白酶抑制剂。本发明通过综合运用多种病毒灭活方法，尤其是先经热处理法再由低pH孵化法两种病毒灭活手段，并综合了其它分离介质实现了多种病毒的灭活，进一步提高了人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒灭活效果，提高用药的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及一种药用生物制品制备方法，尤其涉及一种将从人尿提取的胰蛋白酶抑制剂中所含病毒灭活的方法。
背景技术
人尿胰蛋白酶抑制剂(human Urinary Trypsin Inhibitor，hUTI)是一种从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化出来的糖蛋白，由143个氨基酸组成，SDS-PAGE测得的相对分子质量范围40kDa-45kDa(Eur.J.Biochem.，158，417-422)。其属于蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶及粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、巯基酶和纤溶酶等多种酶具有抑制作用。此外，其还具有稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶的释放，抑制心肌抑制因子(MDF)产生，清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用。人尿胰蛋白酶抑制剂还可改善手术刺激引起的免疫功能下降、蛋白代谢异常和肾功能降低，治疗关节炎，治疗严重急性呼吸综合征，防止手术刺激引起的对内脏器官与细胞的损伤以及改善休克时的循环状态等(CN102205115A、CN101024075A、CN1751740A、CN1449823A、CN101837121A、CN101954072A、CN101954071A、CN101972471A、CN101020048A和CN101095948A)。
对于人尿胰蛋白酶抑制剂的分离纯化的研究已开展几十年，已知的这些纯化方法有阴离子交换色谱、金属螯合树脂分离、超滤、凝胶过滤、亲和性色谱、无机吸附剂处理、盐析、等电点沉淀法、脱乙酰壳多糖吸附和不溶性胰蛋白酶处理等(特开昭51-51579、特开昭51-118810、特开昭51-123810、特开昭55-160724、特开昭56-99427、特开昭57-140728、特开昭60-260518、特开昭61-37736和特开平5-9200)。中国发明专利ZL 200610000200.2和ZL 200610000601.8在特开平5-9200所公开技术的基础上分别提供了一种获得高纯度乌司他丁的方法，所得乌司他丁浓度为5万单位/ml时，在405nm处光吸收值不超过0.2，人尿激肽原酶含量不超过0.0005PNAU，抑制胰蛋白酶的活性不低于3500单位/mg蛋白(凯氏定氮法测定蛋白含量)。
由于人尿胰蛋白酶抑制剂一般从新鲜人尿中分离提取而得，具有被病毒污染的潜在风险。前述这些研究大都集中于对人尿胰蛋白酶抑制剂的分离纯化，但是对于其中所可能含有的病毒(如：人免疫缺陷病毒、脑心肌炎病毒、伪狂犬病毒、水疱性口炎病毒和肝炎病毒等)去除方面所给予的关注较少。特开昭61-37736公开了一种去除人尿胰蛋白酶抑制剂中所含肝炎病毒的方法，该方法采用在pH2-8(尤以3-5为佳)溶液中60℃加热处理10小时，去除混杂在原料中的病原性肝炎病毒。其结果表明经过10小时60℃加热处理，人尿胰蛋白酶抑制剂在酸性下稳定，而在pH8以上的碱性则表现出不稳定。
除了热处理法(包括干热处理、蒸汽处理和巴斯德加热处理法)以外，其它方法如：有机溶剂/表面活性剂(S/D)处理法、胃蛋白酶处理方法、紫外线照射处理方法、低pH孵化法、纳米膜过滤法和低温乙醇分离法等也可被用于病毒灭活。周锡鹏等人验证了人尿胰蛋白酶抑制剂生产工艺中采用的60℃水浴10小时和乙醇处理3小时的病毒灭活方法(中国生化药物杂志[J]，2009，6，407-410)，虽然具有较好的灭活效果，但有机溶剂(乙醇)会残留在终产品中，进而影响用药的安全。
虽然现有技术已在灭活人尿胰蛋白酶抑制剂所含病毒方面进行了初步研究，但是这些技术或适用于灭活肝炎病毒，或仍对用药安全性产生影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法，通过综合运用多种病毒灭活方法，不断调整灭活条件和其它手段相配合，进一步提高病毒的灭活效果。
本发明的另一个目的在于提供一种灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法，与人尿胰蛋白酶抑制剂的分离纯化过程相配合，在分离过程中实现病毒的灭活。
本发明提供的一种灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法，其主要步骤如下：
将从人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制剂粗品溶解于pH5.0缓冲液，并于60℃加热10小时，然后吸附于DEAE层析柱，之后使用pH4.0含NaCl浓度为0.3M的0.1M醋酸缓冲液洗脱，得DEAE洗脱液；接着将DEAE洗脱液于1.5M-2.5M硫酸铵溶液上样，并吸附于疏水层析柱，之后使用1M硫酸铵溶液洗脱，得疏水洗脱液；疏水洗脱液经超滤后，于25℃，低pH孵化5小时后，再经凝胶过滤层析得病毒灭活的人尿胰蛋白酶抑制剂。
人尿胰蛋白酶抑制剂粗品的配置浓度，与病毒的去除有一定的关联。本发明优先选择浓度为50mg/ml-100mg/ml的溶液。
本发明采用的低pH孵化，其pH为1.5-4.5，优先选择2.5-4，如：但不仅限于，2.5、2.7、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9和4。
本发明吸附于DEAE层析柱所用的缓冲液为pH4.0含NaCl浓度为0.1M的0.1M醋酸缓冲液。
本发明超滤所用的超滤膜分子量为10K。
本发明提供的另一种灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法，其主要步骤如下：
将从人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制剂粗品溶解于pH5.0缓冲液，制成浓度为50mg/ml-100mg/ml的溶液，并于60℃加热10小时，然后将溶液于pH4.0含NaCl浓度为0.1M的0.1M醋酸缓冲液中上样，并吸附于DEAE层析柱，之后使用pH4.0含NaCl浓度为0.3M的0.1M醋酸缓冲液洗脱，得DEAE洗脱液；接着将DEAE洗脱液于1.5M-2.5M硫酸铵溶液上样，并吸附于疏水层析柱，之后使用1M硫酸铵溶液洗脱，得疏水洗脱液；疏水洗脱液经10K膜超滤后，于25℃，pH2.5-3.5条件5小时后，再经凝胶过滤层析得病毒灭活的人尿胰蛋白酶抑制剂。
本发明所使用的人尿胰蛋白酶抑制剂粗品，其活性为200单位/mg-3000单位/mg，可采用目前现有各种方法制得，如：但不仅限于，特开昭51-51579、特开昭51-118810、特开昭51-123810、特开昭55-160724、特开昭56-99427、特开昭57-140728、特开昭60-260518、特开昭61-37736、特开平5-9200、中国发明专利ZL200610000200.2和中国发明专利ZL200610000601.8。
为配合本发明病毒灭活方法，本发明提供的一种人尿胰蛋白酶抑制剂的分离方法，其步骤如下：
1)将新鲜收集的尿液倾入搅拌池中，边搅拌，边将pH调至8.5-9.0，静置后取上清尿液；
2)调节上清尿液pH至4.5-6.5后，按每吨上清尿液加入25kg脱乙酰壳多糖，边加边搅拌，静置后取沉淀，并滤干得吸附物。
3)所得吸附物加入3倍重量的水漂洗并滤干，重复2次以上；
4)每千克吸附物加入1.0-2.0升pH为10.5-12.0的3N氨水溶液，洗脱吸附物，并收集氨水洗脱液；
5)根据按每升氨水洗脱液加入400g-450g固体硫酸铵，至全部溶解，静置过夜；
6)以硅藻土作底，抽滤，即得抽滤物；
7)每公斤抽滤物加入10升水溶解，将pH调至5.5-6.5后，离心，取上清液；
8)上清液用10K超滤膜，得超滤浓缩液；
9)每升超滤浓缩液加入1倍体积无水乙醇沉淀，并静置过夜；之后取下层混悬液离心，得清液，再加入和清液相同体积的无水乙醇沉淀，并静置过夜；再取下层混悬液离心，将沉淀物干燥，即得人尿胰蛋白酶抑制剂粗品。
本发明提供的人尿胰蛋白酶抑制剂的分离方法，与本发明灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法相配合，能在分离过程中实现病毒的灭活，无需再经其它病毒灭活步骤即可完成。
本发明技术方案实现的有益效果：
本发明提供的灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法，通过综合运用多种病毒灭活方法，尤其是先经热处理法再由低pH孵化法两种病毒灭活手段，实现了产品无有机溶剂残留，提高了用药安全性。此外，还综合了其它分离介质(阴离子和疏水介质)实现了多种病毒(如：人免疫缺陷病毒、脑心肌炎病毒、伪狂犬病毒和水疱性口炎病毒)的灭活，进一步提高了人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒灭活效果，使用药的安全性得到进一步提高。
本发明还通过与人尿胰蛋白酶抑制剂的分离方法的综合，在分离人尿胰蛋白酶抑制剂的过程中实现了其中所含病毒的同步灭活，无需再经其它病毒灭活步骤即可完成，有效减少了物料损失。
具体实施方式
以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自于西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。
实施例1
1)将新鲜收集的尿液倾入搅拌池中，边搅拌，边将pH调至8.5，静置后取上清尿液；
2)调节上清尿液pH至4.5后，按每吨上清尿液加入25kg脱乙酰壳多糖，边加边搅拌，静置后取沉淀，并滤干得吸附物。
3)所得吸附物加入3倍重量的水漂洗并滤干，重复2次；
4)每千克吸附物加入1.0升pH为10.5的3N氨水溶液，洗脱吸附物，并收集氨水洗脱液；
5)根据按每升氨水洗脱液加入400固体硫酸铵，至全部溶解，静置过夜；
6)以硅藻土作底，抽滤，即得抽滤物；
7)每公斤抽滤物加入10升水溶解，将pH调至5.5后，离心，取上清液；
8)上清液用10K超滤膜，得超滤浓缩液；
9)每升超滤浓缩液加入1倍体积无水乙醇沉淀，并静置过夜；之后取下层混悬液离心，得清液，再加入和清液相同体积的无水乙醇沉淀，并静置过夜；再取下层混悬液离心，将沉淀物干燥，即得人尿胰蛋白酶抑制剂粗品；
10)人尿胰蛋白酶抑制剂粗品溶解于pH5.0缓冲液，制成浓度为50mg/ml的溶液，并于60℃加热10小时，然后将溶液于pH4.0含NaCl浓度为0.1M的0.1M醋酸缓冲液中上样，并吸附于DEAE层析柱，之后使用pH4.0含NaCl浓度为0.3M的0.1M醋酸缓冲液洗脱，得DEAE洗脱液；接着将DEAE洗脱液于2.0M硫酸铵溶液上样，并吸附于疏水层析柱，之后使用1M硫酸铵溶液洗脱，得疏水洗脱液；疏水洗脱液经10K膜超滤后，于25℃，pH3±0.1条件5小时后，再经凝胶过滤层析得病毒灭活的人尿胰蛋白酶抑制剂。
选择不同的种类的病毒为代表分别进行病毒灭活效果检测，如：以人免疫缺陷病毒代表逆转录病毒；脑心肌炎病毒和水疱性口炎病毒代表单链RNA病毒；伪狂犬病毒代表双链DNA病毒。
将制得的人尿胰蛋白酶抑制剂送至军事医学科学院微生物流行病研究所和上海生物制品研究所分别进行人免疫缺陷病毒(HIV-1)和脑心肌炎病毒、伪狂犬病毒以及水疱性口炎病毒的病毒灭活委托检测。结果表明，60℃条件下，经10小时可使初始滴度值(LgTCID50/ml)为11.50的HIV-1病毒下降6个Lg以上，初始滴度值(LgTCID50/ml)为6.50的脑心肌炎病毒病毒60℃1/2小时处理后下降4个Lg，1小时后检测不到活体病毒。25℃，pH3±0.1条件下，经5小时可使初始滴度值(LgTCID50/ml)为5.6的伪狂犬病毒下降4个Lg以上，初始滴度值(LgTCID50/ml)为6.50的水疱性口炎病毒病毒下降4个Lg以上。热处理(pH5.0，60℃，10小时)蛋白回收≥90％，效价回收95％。低pH孵化法(25℃，pH3±0.1，5小时)蛋白回收≥90％，效价回收95％。
实施例2
1)将新鲜收集的尿液倾入搅拌池中，边搅拌，边将pH调至9.0，静置后取上清尿液；
2)调节上清尿液pH至6.5后，按每吨上清尿液加入25kg脱乙酰壳多糖，边加边搅拌，静置后取沉淀，并滤干得吸附物。
3)所得吸附物加入3倍重量的水漂洗并滤干，重复3次；
4)每千克吸附物加入2.0升pH为12.0的3N氨水溶液，洗脱吸附物，并收集氨水洗脱液；
5)根据按每升氨水洗脱液加入450g固体硫酸铵，至全部溶解，静置过夜；
6)以硅藻土作底，抽滤，即得抽滤物；
7)每公斤抽滤物加入10升水溶解，将pH调至6.5后，离心，取上清液；
8)上清液用10K超滤膜，得超滤浓缩液；
9)每升超滤浓缩液加入1倍体积无水乙醇沉淀，并静置过夜；之后取下层混悬液离心，得清液，再加入和清液相同体积的无水乙醇沉淀，并静置过夜；再取下层混悬液离心，将沉淀物干燥，即得人尿胰蛋白酶抑制剂粗品。
10)人尿胰蛋白酶抑制剂粗品溶解于pH5.0缓冲液，制成浓度为70mg/ml的溶液，并于60℃加热10小时，然后将溶液于pH4.0含NaCl浓度为0.1M的0.1M醋酸缓冲液中上样，并吸附于DEAE层析柱，之后使用pH4.0含NaCl浓度为0.3M的0.1M醋酸缓冲液洗脱，得DEAE洗脱液；接着将DEAE洗脱液于2.0M硫酸铵溶液上样，并吸附于疏水层析柱，之后使用1M硫酸铵溶液洗脱，得疏水洗脱液；疏水洗脱液经10K膜超滤后，于25℃，pH3±0.1条件5小时后，再经凝胶过滤层析得病毒灭活的人尿胰蛋白酶抑制剂。
将制得的人尿胰蛋白酶抑制剂按实施例1的方法分别进行人免疫缺陷病毒HIV-1和脑心肌炎病毒、伪狂犬病毒以及水疱性口炎病毒的病毒灭活委托检测。结果表明，60℃条件下，经10小时可使初始滴度值(LgTCID50/ml)为11.31的HIV-1病毒下降6个Lg以上，初始滴度值(LgTCID50/ml)为6.70的脑心肌炎病毒病毒60℃1/2小时处理后下降4个Lg，1小时后检测不到活体病毒。25℃，pH3±0.1条件下，经5小时可使初始滴度值(LgTCID50/ml)为5.5的伪狂犬病毒下降4个Lg以上，初始滴度值(LgTCID50/ml)为6.50的水疱性口炎病毒病毒下降4个Lg以上。热处理(pH5.0，60℃，10小时)蛋白回收≥90％，效价回收95％。低pH孵化法(25℃，pH3±0.1，5小时)蛋白回收≥90％，效价回收95％。
实施例3
1)将新鲜收集的尿液倾入搅拌池中，边搅拌，边将pH调至9.0，静置后取上清尿液；
2)调节上清尿液pH至6.5后，按每吨上清尿液加入25kg脱乙酰壳多糖，边加边搅拌，静置后取沉淀，并滤干得吸附物。
3)所得吸附物加入3倍重量的水漂洗并滤干，重复2次以上；
4)每千克吸附物加入1.5升pH为11.0的3N氨水溶液，洗脱吸附物，并收集氨水洗脱液；
5)根据按每升氨水洗脱液加入450g固体硫酸铵，至全部溶解，静置过夜；
6)以硅藻土作底，抽滤，即得抽滤物；
7)每公斤抽滤物加入10升水溶解，将pH调至6.5后，离心，取上清液；
8)滤过液用10K超滤膜，得超滤浓缩液；
9)每升超滤浓缩液加入1倍体积无水乙醇沉淀，并静置过夜；之后取下层混悬液离心，得清液，再加入和清液相同体积的无水乙醇沉淀，并静置过夜；再取下层混悬液离心，将沉淀物干燥，即得人尿胰蛋白酶抑制剂粗品。
10)人尿胰蛋白酶抑制剂粗品溶解于pH5.0缓冲液，制成浓度为100mg/ml的溶液，并于60℃加热10小时，然后将溶液于pH4.0含NaCl浓度为0.1M的0.1M醋酸缓冲液中上样，并吸附于DEAE层析柱，之后使用pH4.0含NaCl浓度为0.3M的0.1M醋酸缓冲液洗脱，得DEAE洗脱液；接着将DEAE洗脱液于2.0M硫酸铵溶液上样，并吸附于疏水层析柱，之后使用1M硫酸铵溶液洗脱，得疏水洗脱液；疏水洗脱液经10K膜超滤后，于25℃，pH3±0.1条件5小时后，再经凝胶过滤层析得病毒灭活的人尿胰蛋白酶抑制剂。
将制得的人尿胰蛋白酶抑制剂按实施例1的方法分别进行人免疫缺陷病毒HIV-1和脑心肌炎病毒、伪狂犬病毒以及水疱性口炎病毒的病毒灭活委托检测。结果表明，60℃条件下，经10小时可使初始滴度值(LgTCID50/ml)为12.1的HIV-1病毒下降7个Lg以上，初始滴度值(LgTCID50/ml)为6.40的脑心肌炎病毒病毒60℃经半小时处理后下降4个Lg，1小时后检测不到活体病毒。25℃，pH3±0.1条件下，经5小时可使初始滴度值(LgTCID50/ml)为5.5的伪狂犬病毒下降4个Lg以上，初始滴度值(LgTCID50/ml)为6.44的水疱性口炎病毒病毒下降4个Lg以上。热处理(pH5.0，60℃，10小时)蛋白回收≥90％，效价回收95％。低pH孵化法(25℃，pH3±0.1，5小时)蛋白回收≥90％，效价回收95％。
实施例4
根据特开昭51-51579公开的方法制得的人尿胰蛋白酶抑制剂粗品溶解于pH5.0缓冲液，制成浓度为50mg/ml的溶液，并于60℃加热10小时，然后将溶液于pH4.0含NaCl浓度为0.1M的0.1M醋酸缓冲液中上样，并吸附于DEAE层析柱，之后使用pH4.0含NaCl浓度为0.3M的0.1M醋酸缓冲液洗脱，得DEAE洗脱液；接着将DEAE洗脱液于2.0M硫酸铵溶液上样，并吸附于疏水层析柱，之后使用1M硫酸铵溶液洗脱，得疏水洗脱液；疏水洗脱液经超滤10K后，于25℃，pH3±0.1条件5小时后，再经凝胶过滤层析得病毒灭活的人尿胰蛋白酶抑制剂。
结果表明，经60℃条件下，经10小时可使初始滴度值(LgTCID50/ml)为11.50的HIV-I病毒下降4个lg，初始滴度值(LgTCID50/ml)为6.50的脑心肌炎病毒病毒下降4个lg；25℃，pH3±0.1条件5小时可使初始滴度值(LgTCID50/ml)为5.6的伪狂犬病毒下降3个lg，初始滴度值(LgTCID50/ml)为6.50的水疱性口炎病毒病毒下降3个lg。热处理(pH5.0，60℃，10小时)蛋白回收≥90％，效价回收90％。低pH孵化法(25℃，pH3±0.1，5小时)蛋白回收≥90％，效价回收90％。
比较1：
根据特开昭51-51579公开的方法制得的人尿胰蛋白酶抑制剂粗品溶解于pH5.0缓冲液，制成浓度为50mg/ml的溶液，并于25℃，pH3±0.1条件5小时然后将溶液于pH4.0含NaCl浓度为0.1M的0.1M醋酸缓冲液中上样，并吸附于DEAE层析柱，之后使用pH4.0含NaCl浓度为0.3M的0.1M醋酸缓冲液洗脱，得DEAE洗脱液；接着将DEAE洗脱液于2.0M硫酸铵溶液上样，并吸附于疏水层析柱，之后使用1M硫酸铵溶液洗脱，得疏水洗脱液；疏水洗脱液经超滤10K后，于60℃加热10小时，后，再经凝胶过滤层析得病毒灭活的人尿胰蛋白酶抑制剂。
结果表明，25℃，pH3±0.1条件5小时可使初始滴度值(LgTCID50/ml)为5.6的伪狂犬病毒下降3个Lg，初始滴度值(LgTCID50/ml)为6.50的水疱性口炎病毒病毒下降3个Lg；60℃条件下，经10小时可使初始滴度值(LgTCID50/ml)为11.50的HIV-1病毒下降4个Lg，初始滴度值(LgTCID50/ml)为6.50的脑心肌炎病毒病毒下降3个Lg。低pH孵化法(25℃，pH3±0.1，5小时)蛋白回收≥85％，效价回收80％。热处理(pH5.0，60℃，10小时)蛋白回收≥85％，效价回收80％。
Claims (4)
1.一种灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法，其主要步骤如下：
将从人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制剂粗品溶解于pH5.0缓冲液，并于60℃加热10小时，然后将所述溶液于pH4.0含NaCl浓度为0.1M的0.1M醋酸缓冲液中上样，并吸附于DEAE层析柱，之后使用pH4.0含NaCl浓度为0.3M的0.1M醋酸缓冲液洗脱，得DEAE洗脱液；接着将所述DEAE洗脱液于1.5M-2.5M硫酸铵溶液上样，并吸附于疏水层析柱，之后使用1M硫酸铵溶液洗脱，得疏水洗脱液；所述疏水洗脱液经超滤10K后，于25℃，pH2.5-3.5条件5小时后，再经凝胶过滤层析得病毒灭活的人尿胰蛋白酶抑制剂。
2.根据权利要1所述的灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法，其特征在于所述人尿胰蛋白酶抑制剂粗品的配置浓度为50mg/ml-100mg/ml的溶液。
3.一种灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法，其主要步骤如下：
1）将新鲜收集的尿液倾入搅拌池中，边搅拌，边将pH调至8.5-9.0，静置后取上清尿液；
2）调节所述上清尿液pH至4.5-6.5后，按每吨所述上清尿液加入25kg脱乙酰壳多糖，边加边搅拌，静置后取沉淀，并滤干得吸附物。
3）所得吸附物加入3倍重量的水漂洗并滤干，重复2次以上；
4）每千克所述吸附物加入1.0-2.0升pH为10.5-12.0的3N氨水溶液，洗脱所述吸附物，并收集氨水洗脱液；
5）根据按每升所述氨水洗脱液加入400g-450g固体硫酸铵，至全部溶解，静置过夜；
6）以硅藻土作底，抽滤，即得抽滤物；
7）每公斤所述抽滤物加入10升水溶解，将pH调至5.5-6.5后，离心，取上清液；
8）所述上清液用10K超滤膜，得超滤浓缩液；
9）每升所述超滤浓缩液加入1倍体积无水乙醇沉淀，并静置过夜；之后取下层混悬液离心，得清液，再加入和所述清液相同体积的无水乙醇沉淀，并静置过夜；再取下层混悬液离心，将沉淀物干燥，即得人尿胰蛋白酶抑制剂粗品；
10）将从人尿中提取的所述人尿胰蛋白酶抑制剂粗品溶解于pH5.0缓冲液，制成浓度为50mg/ml-100mg/ml的溶液，并于60℃加热10小时，然后将所述溶液于pH4.0含NaCl浓度为0.1M的0.1M醋酸缓冲液中上样，并吸附于DEAE层析柱，之后使用pH4.0含NaCl浓度为0.3M的0.1M醋酸缓冲液洗脱，得DEAE洗脱液；接着将所述DEAE洗脱液于1.5M-2.5M硫酸铵溶液上样，并吸附于疏水层析柱，之后使用1M硫酸铵溶液洗脱，得疏水洗脱液；所述疏水洗脱液经10K膜超滤后，于25℃，pH2.5-3.5条件5小时后，再经凝胶过滤层析得病毒灭活的人尿胰蛋白酶抑制剂。
4.根据权利要求1或3所述的灭活人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂所含病毒的方法，其特征在于所述病毒为人免疫缺陷病毒、脑心肌炎病毒、伪狂犬病毒和水疱性口炎病毒之至少一种。
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