SU668348A1 - Способ выделени -амилазы - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к ферментной отрасли микробиологической промышленности и может быть использовано дп  вы делени  грибной амилазы из раствора нативной культуральной жидкости. Известен способ выделени  Л -амилазы из культуральной жидкости Asperg-i us предусгматривающий ее обработку . анионообменным гель-сорбентом, десорб1ШГО фермента в присутствии хлористого натри  с последующим выделением фермен та из элюента (1 . Однако при использовании анионообмен ного галь-сорбента (АГС) с сорбиионной емкостью 3,05-3,09 мг-экв/г, набухаемостью 8,4-11,4 МП/г в ОН-форме cqj6ци  сорбента из раствора составл ет 6О80%j используемый в качестве элюента 10%-ный раствор хлористого натри  обёспечивает 63-83%-ную десорбцию ферменTaj кроме того, указанный гель-сорбент гфимен етс  дл  очистки фермента без его концентрировани . Целью изобретени   вл етс  повьпненив выхода и получение болре очищенного препарата. Дл  достижени  этой цели из анионообменных гелЕ -сорбентов используют гельсорбент в С -форме, десорбцию фермента осуществл ют ацетатным буфером рН 6,0- 6 ,2, при этом концентрацию хлористого натри  устанавливают в пределах 0,51 ,0 М, а выделение фермента осуществл ют введением хлористого кальци  концентрацией 0,5-1,5% при одновременном подкислении полученной среды до рН 6,06 ,2 с последующим осаждением органическим растворителем. Способ выделени  Х -амилазы из культуральной жидкости Asperp iCCus включает в себ  следующие этапы: сорбцию фермента на гель-сорбенте АГС-1а: десорбцию фермента с гель-сорбента АГСа: осаждение фермента из эпюата; л бфильное высушивание препфата высокоочтценной с -амилазы. 3 . e Проца::с осуществ1 -тот следующим образом . :Культуральную жндкбстьприестеставнном значений рН 7,5-8,0 обрабатывают в стат)ческйх или динамических услови х гель-сорбентом АГС-1а, синтезированном на основе поливинилового спирта, с сорб1ШОННОЙ емкостью гель-сорбента 1,49 мг экв/г, набухаа 4остыо 43,0 мп/г, в Cf.форме , так как предв ительные исследовани  показали, что гель-сс бент в С8форме про вл ет высокую избирательную сорбционную способность к амилазе (см. табл. 1). . Таблица 1 В качестве десорбента рёкомбнхогётсЯ 1 М раствор ацетатного буфера рН 6,0, который с еспечивает десфбшпо фермент на 90-100% при 10 кратном концентрировании раствора. И цеп х восстановлени  активных гру гепь-сорбента в раствор эгаюеита одновре менно внос т ионы хлора в-виде натриевой сопи (1,О М), Это дает возможность использовать гель-сорбент 5-7 раз без регенерации его срп ной кислотой, котора  требует большой затраты времени дл  отмывки сорбента водой до значени  рН 7,0. Внесение ионов в раствор элюе та позвол ет использовать его в последующем цикле сразу после промывки водопроводной и дистиллированной водой до значени  рН 7,0. Промыва т г еттьсорбент водопроводной водой Гтргем  объемами) и три раза дистиллированной водой (двум  объемами). После 5-7 циклов испотьзовани  проводитс  полна  регевфаии  гель-сорбента щелочью (один раз 7%-ным и два раза 5%-1НЫМ раствором) из расчета 3 объоиа щелочи на 1 объем смолы, затем от 484 мьюают его водопроводной водой до рН 7,0 и обрабатывают раствором соп 1 й кислоты (трем  объемами: один раз 7%-ным раствором и два раза 5%-ным раствором) с последующим отмыванием гель-сорбента водопроводной и дистиллированной водой до рН 7,0. Полна  регенераци  восстанавливает сорбшюнные свойства гель-сорбента, обеспечива  его 15-2 О-кратное использование. Пример 1 (контроль) . Используют гель-сорбент А ГС в ОН-форме с сорбционной елкостью 3,5 мг-экв/г, на- бухаемостью 8,4-.11,4мл/г, Элюирующий раствс 10%-ный хлористый натрий. Объем куттьтуральной жидкости ЮОмл, амилолитическа  активность 2,6 ед/мл; обща  активность 2.6О- остаточна  активность 57. Сорбци  достигает 78%. Получают 1ОО мл элюата с активностью 1,68 ед/мл: обща  активность 168. Общий выход 64%. Десорбци  83%. Пример 2. Провод т сорбцию а лилазы из культуральной нативной жидкости в статических услови х на гельсорбенте АГС-Ja в СВ-ффме, сорбционна  емкость 1,49 мг экв/г, набухаемость 43,О мг/г. Содержание гель-сорбента 2% по сухому весу. Амилолитическа  активность культуральной жидкости 13,0-16,0 ед/мл; рН 7,5-8,0. Обработка культуральной жидкости гель-сорбентом проводитс  в емкости , снабженной мешалкой. Дпительность cqэбции 1 ч. Смола отдел етс  от раствфа фильтрованием и снова пер&нсюитс  в емкость дл  проведени  десорбвди фермента. В качестве элюента используетс  ацетатный буфер (1 М) в присутствии ионов хлора (1,0 NaCf) рН 6,0-6,2. Количество элюента берут из расчета степени концентрировани  фермента (в 3-10 раз меньше вз того на обработку раствора).. Десорёци  проводитс  также при перемешивании раствора в течение 45 мин. Смолу отдел ют фильтрованием и промывают водой дл  последующего 1шкла . . Данньде опыта сведены в табл. 2.

Т а 6 п и ц

Пример 3; Провод т сорбшпо амилазы из культур апьной нативной жидкости на гель-сорбенте. АГС-7а в С8-фор ме в динамических услови х: сфбционна  емкость 1,49 мг-экв/г, набухаемость 43,0.мл/г. Раствор культурапьной жидкости (АС-20 ед/мл, рН 7,8) пропускают через колонку заполненную 40 г гель-сорбента , предварительно подготовленного . к работе. Скорость пропускани  раствора 1,.0 л/ч. Пропускают 2,0 п культуральной жидкости из расчета, что СОЕ по амилазе составл ет 750-100О ед АС/г, гельсс бента . Сорбци  достш ает 100%. Десорбцию провод т ацетатным буфером {1 М) в присутствии ионов хлора (1,О MNaC ), рН 6,0. Скорость десорбции 0,5 п/ч. Степень концентрировани  раствора 6 раз. Получено 334 мл эпюата с активност 12О ед.АС/МЛ. Общий выход 98%. Преимущество метода сорбдии амилаз . на гель-сорбенте А ГС-Га закл1очйетс  в том, что данный образен анионита позвол ет работать в промышленных услови х с нативными растворами культуральной жийкости без предварительного диализа, обеспечивает концентрирование фермен- та за счет кспользовани  меныиих объемов элюента в 3-10 раз и приводит к 2-й Зт-кратной . очистке фермента по белку. Сорбци  ф мента составл ет 98-1ОО%, десорбци  9О-1ОО%. Общий выход фермента . после сорбции - десорбции 88-98%. Второй этап очистки включает в себ  вьшеление фермента из элюата путем осаждени  органическими растворител ми. Услови  осаждени  амилазы из элюатов , полученных с гель-сорбента АГО-|а, следующие.. Элюат охлаждают до -4 С, внос т ионы кальци  (CaCPg ) в концентрации 0,5% и рН раствора довод т уксусной кислотой (0,5 Н) до значений 6,0-6,2. Органические растворители этиловый спирт или ацетон - охлаждают до Рю) (-15) С. Осаждение белка гфоводитс  при непрерывном перемешивании раствора. Расход сннрта составл ет 2,5 объема на 1 объем элюата. при осаждении достигают 15-20%. Общий выход вьк:рко«очищенного препарата от исходной активности составл ет 75%. Полученные пр& параты про вл ют активность 1000О120000 ед АС/Г при содержании белка 60%. Расход ацетона 1,5 объема на 1 объем элюата. Получены препараты с активностью 7500-8000 ед АС/г и с содфжанием белка 56%. Выход активности 72%.

Ацетон (25) 4275ОО 41,0

Этиповый

спирт (о,33) 440ОО

Claims (1)

1. 2,75 Таким образом, предлагаемый способ .выдепени  ot -амипазы позвол ет интенсифицировать процессы очистки и кондеитр ровани  ферментов, увеличить выход фермента на стадии концентрировани  до 8898% и обеспечить общий выход высокоочищенного препарата на стадии осаждени  из эпюата по отношению исходной активности культур апьной жидкости 70-75%. Формула изобретени  Способ выделени  сХ-амилазы из культуральной жидкости AspergiEtuer or-jrae прещгсматривающий ее обработку анионообменным гель-сорбентом, десорбцию фермента в присутствии хлористого натри  с последующим выделением фермента из

   79ОО

   324ООО

   72

   75

   ЗЗООО

   12000

   75

   75 эпюата, отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода и получени  более очищенного препарата, из анионообменных гель-сорбентОв испопьзуют гель-сорбент в СЕ -форме, десорбцию фермента осуществл ют ацетатным буфером рН 6,0-6,2, при этом концентрацию хлористого натри  устанавливают в пределах О, 5-1, О М, а выделение фермента осуществл ют введением хлористого кальци  концентрацией О,5-1,5% при одновременном подкйслении полученной среды до рН 6,0-6,2 с последующим осаждением органическим растворителем. Источники информации, . прин тыево внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР № 319615, кл. d 08 F 216/06, 1969.