SU538018A1 - Способ выделени и очистки кислой протеиназы из растворов - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к ферментной отрасли микробиологической промышленности, а именно к способам выделени  и очистки кислой протеиназы из растворов.

Известен способ выделени  и очистки кислой протеиназы из растворов, например кулътуральной жидкости граба Aspergri Eos awciTnopi , предусматривающий сорбцию фермента на ионообменном сорбенте с последующей десорбцией его элюентом 1 При работе по изьесткому способу имеют место большие потери ферм:ента на стади х очистки (до 90%), Получаемый фермент обладает недостаточной активностью, причем из-за больших потерь фермента на стади х очистки работа св зана с увеличением объема исходного материала и большого расхода органического растворител , что повышает себестоимость фермента.

Дл  ликвидации этих недостат-ков согласно преднагаемо1у1у способу в качестве сорбента испопьзуют анионообменный (отечествв ный )гель - сорбент в СС форме, синтезированный на основе поливинилового спирта,имеющий форму;1у

-vH.jT CK-CR5 CH-CH2-CH

и обладающий сорбционной емкостью 0,5О ,8 мг.экв/г, набухаемостью не менее 2О25 мг/г, при этом процесс сорбции осуществл ют при рН 4,0 - 5,0, а процесс десорбции провод т 10%-ным раствором поваренной соли при рН 7,0-8,0.

Дл  перевода анионообменной смолы (АГС1п ) в С1 -форму ее подвергают набуханию в воде, затем отфильтровывают и обрабатывают ЗО-бО мин 5%-ным раствором сол но кислоты в количестве 3-5 об. на 1 об, набухшей смолы. После фильтрации смолу отмывают дистиллированной водой до рН 6,О7 ,0, Расход воды при этом составл ет 1О15 об. на 1 об. смолы.

i

Использование смолы АГС-1п в С1-форме с ионообменной емкостью 0,5-0,8 мг. экв/г и набухаемостью 2 О-25 мл/г обеспечивает 90-94% сорбции кислой протеиназы и 86-90% десорбции фермента, Злюент берут в количестве 8-10% к объему обрабатываемой исходной культуральной жидкости,

В результате такой обработки достигаетс  дес тикратное концентрирование кислой протеиназы и в 5 раз повыщаетс  степень очистки фермента. Из элюента фермент выдел ют одним из известных способов, например осаждением органическими растворител ми ,

Препарат кислой протеиназы, полученный по предлагаемому способу, имеет активность определенную стандартным методом (модифицированный метод Ансона с казеинатом натри ) ПА 200-250 ед/г по активности он в 1ООО-150О раз выше, чем активность его в исходной культуральной жидкости.

Пример 1, Концентрирование и эчистку кислой протеиназы проводили из фильтрата культуральной жидкости Asp- awarnofi 78-2, Процесс сорбции вели в динамических услови х в колонке высотой 30 см и диаметром 3,5 см, Анионообменный гельсорбент АГС-1п в количестве 5 г замачивали и отмьтали дистиллированной водой после чего ионообменник переносили в колонку . Подготовленный таким образом ионообменник занимал 2/3 объема колонки. Обработку проводили 5%-ным раствором НС1, дл  чего через колонку пропускали 600 70О мл этого раствора с последующей отмывкой 1,5 - 2,0 л дистиллированной воды.Затем через колонку пропускали фильтрат культуральной жидкости с активностью 0,15 ед/мл и рН 4,6. Процесс сорбции вели со скороетью 500 мл/час до по влени  в фильтрате фермента 5-10% протеолитической активности от исходной (в расчете на 1 мл). Через колонку &1ЛО пропущено 830 мл фильтрата культуральной жидкости,

Сорбционна  емкость смолы АГС-1п по кислой протеиназе составила 25 ед/г смолы В этих услови х на смоле было сорбировано 94% фермента от содержавшегос  в фильтрате культуральной жидкости.

Десорбцию фермента проводили 1О%-ным раствором NaCl с рН 7,5. Расход элю- ента составил 85 мл, скорость его 15012О мл/час. Десорбци  прощла на 90%, уделна  активность фермента в элюате в 5 раз выше, чем активность в фильтрате культуральной жидкости. Из полученного элюата после предварительной корректировки рН до 4,5 - 5,0 фермент осаждали этанолом в соотношении элюата и этанола 1:4, Осадок отдел ли на центрифуге и высушивали лиофильно ,

П р и м е р 2. Концентрирование и очиску кислой протеиназы проводили из фильтрата культуральной жидкости гриба Aip-qwa-mo 16, Процесс сорбции вели в динамических услови х в колонке высотой 150 см и диаметром 16 см. В колонку загружали 250 г (анионообменного гель-сорбента АГО1п ) по сухому весу после предварительной его обработки и перевода в С1 -форму. Через колонку со скоростью 10 л/час пропускали 8О л фильтрата культуральной жидкости Asp- otwaTnopi 16 с активностью кислой протеиразы 0,2 ед/мл и рН 4,15. Сорбци  фермента в этих услови х прошла на 94%.

Десорбцию кислой лротеиназы проводили

10%-ным раствором NaC при рН 7,0. Элюат в количестве 8 л пропускали через

колонку со скоростью 1,2-1,5 л/час. Десорбци  фермента прошла на 86%. Активност фермента в элюате в 8,5 раз выше чем активность фильтрата культуральной жидкости . Удельна  активность фермента была повышена в 5-7 раз. Фермент из элюата с рН 4,5 осаждали этанолом, осадок отдел ли центрифугированием и высушивали лиофильно . Высокоочищенный препарат кислой протеиназы Протаваморрин Г25Х, полученный по предлагаемому способу, имел активность до 230 ед/г. Содержание белка в препарате 45-50%.

Claims (1)

1. Таким образом, применение смолы АГС-1п по предлагаемому способу позвол ет одновременно концентрировать и очищать кислую протеиназу непосредственно из фипьтрата культуральной жидкости. Достигнута  дес тикратна  степень концентрировани  фермента в 10 раз сокращает расход органических растворителей, примен емых дл  выделени  фермента, и значительно сокращает емкостное оборудование, используемое дл  его производства. При этом в 5 раз повышаетс  степень чистоты получаемого препарата . Формула изобретени  Способ выделени  и очистки кислой протеинааы из растворов,например культуральной жидкости гриба Asperg-Ltfus aivcLmori ,прв дусматривающий сорбцию фермента на ионообменном сорбенте с последующей десорбци- СН.,- СК- СНо- СН-СНп- СИ 1 он о о 1I/X СН CjH4l(C2H5VHC и обладающий сорбционной емкостью 0,50 ,8 мг.экв/г и набухаемостью не менее 2Q25 мл/г, при этом процесс сорбции осуществл ют при рН 4-5, а процесс десорбции при рН 7-8. ей его элюентом, отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода и активности фермента, снижени  его себестоимости , в качестве сорбента используют анионообменный гель-сорбент в Cl -форме, синтезированный на основе поливинилового спирта, имеющий формулу СНоl I сн-он СН2,СН.2 0он о 1I1 -СНо-СН-Ш -СН-СНо-СНИсточники информации, прин тые во внимание при экспертизе: 1. Авторское свидетельство Nb 249329, кл,С12 В 13/1О, 1969 г.