JPH0317095A - ビタミンｂ↓１↓２およびその誘導体の分離回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 く産業上の利用分野〉 本発明は、ビタミンＥ３＋ｚおよびその誘導体の生産を
目的として培養した微生物の培養液から、ビタミンＢ１
！（以下ＶＢＩｚと略記する）およびその誘導体を分離
精製して回収する方法に関する。

く従来の技術〉 ＶＢ１Ｎは核酸代謝、蛋白質代謝、脂質代謝および炭水
化物の代謝において必須の因子であることがよく知られ
ており、ＶＢ＋ｚ欠乏症のほかにも造血機能障害、肝機
能障害、神経疾患の治療薬としてなど、医薬品、あるい
は飼料添加物として広く実用に供され、利用が増大して
いる。

一方、ＶＢ．■の生産供給については、その構造の複雑
さのために化学合戒法が極めて困難で、工業的には現在
および将来にわたって発酵法または生化学的方法による
ほかはないと考えられている．微生物によるＶＢ＋ｚの
生産に関しては、たとえば糖質を炭素源とした、プロビ
オニバクテリウム（ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバク
テリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属・アル
スロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドシ
ュードモナス（Ｒｂｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属
、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、スト
レプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドス
ピリルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕａ）属、アクチ
ノミセス＜Ａｃｔｉｎｏｔｎｙｃｅｓ）属、セレノモナ
ス（Ｓｅ　ｌｅｎｏｍｏｍａｓ　）属、ノカルジア（Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ）属およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ）属などに属する細菌あるいは放線菌に
よる発酵生産や、メタノールを炭素源としたプロタミノ
バクタ−（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、メタ
ノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ　）属、シュード
モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属、プチリバクテ
リウム（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノ
サルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属などに属
する細菌によるＶＢ＋ｚ生産が知られている。

なお有機物を含む廃水をメタン発酵させて処理？る嫌気
性微生物処理装置には、その微生物群中にメタノモナス
属やメタノサルシナ属が含まれているので、当該処理装
置の余剰汚泥中にＶＢ１２およびその誘導体が含有され
ている。当該汚泥中からＶＢ＋ｚおよびその誘導体を分
離回収することも考えられるが、上記処理装置はあくま
で廃水処理を目的とするものであるから、Ｖ　Ｂ　ｒ　
ｚおよびその誘導体の生産を目的として培養した微生物
の培養液からＶＢ．■およびその誘導体を分離回収する
場合と比較して．極めて効率が悪い。

上記のような微生物の培養液からＶＢ＋ｚを分離精製す
る方法としては、たとえばＶＢ＋ｚを菌体内に蓄積する
微生物の場合は、シアンイオンを加えて煮沸したり、８
０％エタノール、５０％アセトン、２０％ビリジンなど
でＶＢ１２を抽出し、抽出液を中性ｐＨ下で吸着樹脂に
接触させてＶＢ＋２を吸着させ、次いで洗浄により非吸
着性の夾雑物質を除去した後、低級アルコール類、低級
ケトン頚、低級エステル類、あるいは低級エーテル類で
ＶＢ目を？８Ｈして回収する方法（特開昭５９−９５２
？９号公ｒｆＦＪ）などを挙げることができる。

また、一般にＶＢ１２はその起源となる微生物種や培養
時の環境により、種々の誘導体として共存しているが、
これらの誘導体を分離する方法としては、たとえば逆相
カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる方法
（アナリティカル・バイオケ嵩ストリー（Ａｎａｌｉｔ
ｙｃａｌ　［ｌｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１１工、３
６５　（１９８６））電気泳動法が、小規模に主として
分析を目的として実施されている。

く発明が解決しようとする課題〉 以上述べたように、Ｖ　Ｂ　ｌｚを生産する微生物の培
養液からＶ　Ｂ　＋■を分離回収する手段としては、従
来から吸着樹脂への吸脱着による精製が行われてきたが
、この方法だけでは精製品に少量のＶＢ１２以外の疎水
性有機物が不純物として混入することが避けられず、さ
らには培養液中に複数のＶＢ１２誘導体が共存した場合
、これらを分離して回収することはできない。

従来、ＶＢ１２誘導体を分離するには、逆用カラムを用
いた高速液体クロマトグラフィーや電気泳？法が主とし
て分析を目的として実施されているが、これらの技術は
経費および操作の煩雑さの点で工業規模の分取に適用す
ることは困難である。

本発明はＶＢ１２およびその誘導体を生産する漱生物の
培養液からＶＢ．２およびその誘導体を回収するにあた
り、前記した吸着樹脂による情製なとでは除去し得なか
った少量の不純物を排除すると同時に該培養液が複数の
ＶＢ１２誘導体を含有する場合にはこれらを安価に効率
よく分離する手段を提供することを目的とするものであ
る。

く課題を解決するための手段〉 本発明者らはＶＢ１ｚおよびその誘導体を生産する能力
を有する微生物の培養液からＶＢ１２およびその誘導体
を分離回収する方法について鋭意研究を重ねた結果、培
養液あるいは当該培養液を公知の方法で抽出して得た抽
出液に含有されるＶ　Ｂ　＋■およびその誘導体を吸着
樹脂により吸着分離（精製）した後、親水性母体の陰イ
オン交換樹脂を用いて、アルカリｐＨ下で塩濃度勾配を
かけるイオン交換クロマトグラフィーを実施することに
より、？価で且つ工業規模への通用が容易な手法で高純
度のＶＢ＋２を得ると同時にＶＢ＋ｚを誘導体に分離し
て回収し得ることを見出し、本発明に到達したものであ
る。

すなわち、本発明はＶＢ１２およびその誘導体を生産す
る能力を有する微生物の培養液から■ＢＩｚおよびその
誘導体を分離回収するにあたり、当該培養液に必要に応
じて抽出などの前処理を施してＶＢ１２およびその誘導
体を比較的高濃度に含有する溶液を得た後、当該含有液
をスチレン−ジビニルベンゼン共重合体よりなるイオン
交換能を有しない吸着樹脂に接触させてＶＢ１２および
その誘導体を吸着させ、次いで該吸着樹脂からＶＢｒｔ
およびその誘導体を有機溶媒を用いて溶離し、さらに該
溶離液中の有機溶媒を除いた後、当該ＷＩ離液をアルカ
リ性とし、あらかしめアルカリ性の溶液で処理した親水
性母体の陰イオン交換樹脂に接触させて、ＶＢｌ２およ
びその誘導体を吸着させ、次いでアルカリ性条件下で塩
溶液の塩濃度を順次上界させながら、当該塩溶液を前記
陰イオン交換樹脂？接触させることにより、ＶＢ１２お
よびその誘導体を分離脱着することを特徴とするＶＢ，
ｔおよびその誘導体の分離回収方法である。

く作用〉 本発明におけるＶＢ１２およびその誘導体を生産する能
力を有する微生物の培養液とは、前述したごとく、プロ
ビオニバクテリウム属、バチルス属、コリネバクテリウ
ム属、アルスロバクター属、ロドシュードモナス属、シ
ュードモナス属、ストレブトミセス属，ロドスビリルム
属、アクチノミセス属、セレノモナス属、ノカルジア属
、クロストリジウム属、プロヌミノバクター属、メタノ
モナス属、プチリバクテリウム属、メタノサルシナ属な
どに属する微生物から選択される単一の微生物を実質的
に純粋培養した培養液を指す。

前記したような、ＶＢ１２およびその誘導体（以下単に
ＶＢ＋ｚという）を生産する能力を有する微生物には、
生産したＶＢ，，を菌体内に蓄積する種類のものと、Ｖ
Ｂ１ｚを菌体内へ分泌する種類のものとが存在するが、
本発明方法はそのいずれの徽？物の培養液にも適用する
ことができる。

すなわち、ＶＢ＋ｚを菌体内に蓄積する微生物種の培養
液の場合には、前処理としてたとえば以下のような抽出
操作を施すことによってＶ　Ｂ　＋■を比較的高濃度に
含有する溶液を得る。

まず、シアンイオンを含む塩類、たとえばシアン化カリ
ウムを最終濃度０．００５〜０．　５重量％好ましくは
０．０１〜０．３重量％となるように菌体を含むＶＢ＋
ｚ培養液に添加した後、塩酸などの酸溶液でｐＨを５．
０〜７．０、好ましくはｐ　Ｈを６．０〜６．５に調整
し、８０〜１００℃好ましくは９５〜ｌＯＯ℃に加熱す
るか、あるいは加圧下でｌ００〜１２１℃に加熱して１
５〜６０分間、好ましくは２０〜４０分間ＶＢ＋ｚを抽
出する。ＶＢ＋ｚ抽出後、遠心分離などの操作で固液分
離を行い、ＶＢ２を含んだ上澄液を得る・。

以上の操作において、シアンイオンはＶＢ．■分子中に
存在するコバルト原子の上方配位子をシアノ基に置換し
てモノシアノ型とし、ＶＢ．■抽出以降の操作中にＶＢ
１２が光や熱により分解されるこ？を防ぐ目的で添加す
る。しかしこの濃度があまり低いと、ＶＢ，．分子中の
コバルト原子の上方配位子がシアノ基で置換されていな
いＶＢ１２が残在し、光や熱による分解を受けて収量の
著しい低下をきたす。また、あまりに多量のシアンイオ
ンを使用することは、シアンイオンが強い毒性を有する
ことから好ましくない。また、抽出温度はあまりに低い
温度では菌体の破壊が不十分でＶＢ１ｚが十分に抽出液
側へ移行せず、一方あまりに高い温度ではＶＢ１２抽出
率は変わらず却って他の夾雑物質を多量に抽出し、後段
の分離精製において不利である。なお、抽出時間につい
ても、抽出温度と同様なことが言える。

次に、多量のｖＢＩｚを菌体外へ分泌する微生物種を回
分式で培養した場合には、前処理として菌体を含むＶＢ
＋ｚ培養液を遠心分離などの操作で固液分離して菌体を
除き、ＶＢ＋ｚを比較的高濃度に含有する上澄液を得て
これを吸着樹脂による精製に供する．この際、菌体中に
残留する少量のＶＢ１２をも抽出する場合には、固液分
離操作で得られ？沈殿に、前記の、菌体内に多量のＶＢ
．■を蓄積する微生物種の培養液に実施したと同様の抽
出操作を行えばよい。また、多量のＶＢ＋ｚを菌体外へ
分泌する微生物種をたとえばシリカやガラスを素材とす
る多孔性担体に付着させてこれをカラムなど６こ充填し
、当該カラムに液体培地を連続的に通液して付着微生物
を培養する、いわゆる固定床式で培養した場合には、菌
体をほとんど含まず、しかもＶＢ．ｔおよびその誘導体
を比較的高濃度に含有する溶液を連続的に得ることがで
き、この場合には得られたＶＢ．■含有液を何ら前処理
することなく直接吸着樹脂による精製に供することが可
能である。

なお上述したＶＢ＋ｚを菌体外に分泌する微生物種を培
養して得られたＶＢ１２含有液を使用する場合で、ここ
までのＶＢ１２含有液調整操作の中でＶＳ＋Ｚがシアノ
化されていない時は、吸着樹脂へのＶＢ．ｚの吸着に先
立って以下のようにしてＶＢ＋ｚ分子中のコバルト原子
の上方配位子をシアノ基で置換したモノシアノ型とし、
以降の分離精製操作？にＶＢ＋ｚが光により分解される
ことを防ぐことができる。すなわち、ＶＢ１２含有液に
シアンイオンを含む塩類たとえばシアン化カリウムを最
終濃度０．　０　０　５〜０．　５重量％、好ましくは
０．０１〜０．３重量％となるように添カロした後、塩
酸などの酸溶液でｐ■４を５．０〜７．０１好ましくは
ｐ　Ｈ　６．　０〜６．５に調整し、かつ液温を約５０
℃として１〜１０時間、好ましくは２〜５時間放置して
、ＶＢＨｚをモノシアノ型とする。

また、このシアノ化の操作は、後述するＶＢの吸着樹脂
への吸着が完了した後に、ＶＢ＋ｚを吸着した吸着樹脂
を、前記と同様の濃度およびｐＨのシアンイオンを含む
溶液と約５０℃の温度条件下で接触させて行うこともで
きる。

以上のようにして得られたＶＢ１２含有液を吸着樹脂に
よる吸着分離（精製）処理に供する。ここで使用する吸
着樹脂としては、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体
よりなるイオン交換能を有しない吸着樹脂で、たとえば
アンパーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−２０
００　　（０−ムア？ドハース社ｆＭ）　、あるいはこ
れらの同等物を使用することができる。吸着樹脂はＶＢ
１２含有液との接触に先立ってあらかしめメタノール、
エタノールなどで膨潤させ、次いで脱気純水で置換して
おき、その後Ｖ　Ｂ　＋　２含有液との接触に供する。

Ｖ　Ｂ　＋■含有液と吸着樹脂の接触方法は、吸着樹脂
をカラムに充填し、これにＶＢ，．含有液を下降流、ま
たは上昇流で通液するカラム法によってもよいし、ＶＢ
．■含有液を適当な容器に採り、適量の吸着樹脂を添加
して攪拌することにより接触させるバノチ法によっても
よい。

ＶＢ１２の吸着が完了した後、当該湿潤樹脂に対し、５
〜３　０　Ａ／ｅ−湿潤樹脂、好ましくは１０〜２　０
　ｇ／ｆｆ−湿潤樹脂の量の脱気純水で洗浄し、非吸着
性の夾雑物質を除去する。

以上の吸着樹脂への■Ｂｌｚおよびその誘導体の吸着と
非吸着性物質の洗浄の操作において、ＶＢｌ■誘導体の
種類によっては、脱気純水に代えて特定のｐＨの溶液を
使用し、■Ｂｌ■およびその誘導体の吸着樹脂への吸着
効率、あるいは夾雑物質の洗浄効率を高めることもでき
る。すなわち、ＶＢ２誘導体がその分子中に含有する解
離基の種類に応じて適当なｐＨを設定し、その解離基の
′Ｆｇ離を押さえることにより、該ＶＢ＋ｚ誘導体をよ
り疎水性として吸着樹脂への吸着効率を高め、同時に当
該ｐ　Ｉ１において、より親水性となる夾雑物質が存在
した場合には、これらの洗浄をより容易とすることがで
きる。たとえばＶＢ＋２分子中のテトラビロール環の外
側に位置するアミド基が、カルボキシル基で置換された
誘導体くコビリン酸など〉を多量に含むｖＢＩ！含有液
を処理する場合には、吸着樹脂へのＶＢ１ｚおよびその
誘導体の吸着と、非吸着性物質の洗浄の操作において脱
気純水に代えてｐ　Ｈ　５以下、好ましくはｐ　Ｈ　３
．　０〜５．０さらに好ましくは１）Ｈ約４の酸性溶液
、たとえば酢酸緩衝液などを使用することにより、吸着
樹脂へのＶＳ＋Ｚおよびその誘導体の吸着効率を高める
ことができる。

次に、吸着樹脂よりＶＢＩｚを脱着させるには、１〜５
　１／ｌ−湿潤樹脂のメタノールなどの低級？ルコール
類や、アセトンなどの低級ケトン類、酢酸エチルなどの
低級エステル類、またはジエチルエーテルなどの低級エ
ーテル類の有機溶媒、あるいはこれらの水溶液を吸着樹
脂に接触させ、■Ｂ１２を吸着樹脂より溶離させる。

得られたＶＢＩ２粗精製液をたとえばロータリーエハポ
レーターを用いて減圧下に加熱するなどの操作によって
前記有機溶媒を除き、ＶＢ１２粗精製品を得る。このＶ
Ｂ．■粗精製品は、なお少量の夾雑物質を含有し、また
ＶＢ．ｚそのものについても培養した微生物種とその培
養条件により複数の■ｌｆｆ２１体の混合物として得ら
れている。

このＶ　Ｂ　ｌ　２粗精製品に対し、下記のようにイオ
ン交換クロマトグラフィーを実施することにより、残留
する少量の夾雑物質を排除すると同時にＶＢ２を複数の
各ｍＮ体に分離して回収することが可能となる。

当該イオン交換クロマトグラフィーで使用する陰イオン
交換樹脂としては、デキストラン、アガロース、セルロ
ースなどの親水性高分子を母体と？、第４級アンモニウ
ム基、あるいは第３級アミン基などの塩基性基をイオン
交換基とする樹脂、たとえばＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
　Ａ−２５、Ａ−５０、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ　
（ファルマシア社製）などや、あるいはこれらの同等物
を使用することができる。

イオン交換クロマトグラフィーに先立って、陰イオン交
換樹脂を常法にしたがって、あらかじめｐＨ　８．　０
〜１２．０、好ましくはｐ　Ｈ　８．　５〜１０．０の
アルカリ性の溶液、たとえば緩衝溶液で平衡化させてお
く。緩衝溶液としては０．０３〜０．５Ｍ、好ましくは
０．０５〜０．　１　Ｍのグリシン緩衝液、あるいは同
濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液
などで、中性塩としてたとえば塩化ナトリウムなどを０
．　０　０　５〜０．　０　５　Ｍ、好ましくは０．０
１〜０．０３Ｍ有する物を使用することができる． ＶＢ１２を陰イオン交換樹脂へ吸着させるには、前記の
Ｖ　Ｂ　＋　２粗精製品を、たとえば前記の陰イオン交
換樹脂を平衡化させたのと同一の緩衝液で溶解してアル
カリ性とし、陰イオン交換樹脂力ラム？流速５　〜４　
０　ｃ＠／　ｈ、好ましくは工５〜２５ｃｍ／ｈでａ？
夜して吸着させる。

吸着後、引き続いて当該緩衝液を同一の流速で通液し、
非吸着性の物質を溶出する。

さらに、アルカリ性条件下、たとえばｐ　Ｈ　８〜ｌ２
、好ましくはｐ　Ｈ　８．　５〜１０．０の緩衝液中の
塩濃度を初！ｔ１１　濃度から２．０Ｍまで直線的（線
形）、あるいは段階的に上昇させることにより、夾雑物
質とＶＢ．■を分離するとともに、ＶＢ１２を各３Ａ　
ＡＹ体に分離して回収する。

また、上述のようにして得たＶ　Ｂ　ｌ■画分、あるい
はその誘導体の両分を常法にしたがってゲルろ過などの
方法で脱塩した後、真空凍結乾燥などの方法で乾燥する
ことによりＶＢ１２あるいはその誘導体の結晶粉末とし
て得ることができる。

〈発明の効果〉 以上説明したように本発明のＶＢ，．およびその誘導体
の分離回収方法によれば、ＶＢＩ■およびそのＲＭ　ｉ
体の生産を目的として培養した微生物の培養液から安価
で、且つ工業規模に適用可能な手法？よりＶＢ１２を各
誘導体に分離して回収することができる。

く実施例〉 以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限られるものではない。

ＶＢ１２生産菌である、メタノサルシナ属に属するメタ
ノサルシナバーケリＤＳＭ８　０　４を固定床弐で連続
培養してＶＢ１２を比較的高濃度に含む流出液（以下Ｖ
Ｂ．２含有液という）を得た。

得られたＶＢ１２含有液のＶＢ１２含有量は、７．０■
／ｌであり、ｐＨは６．５であった。なおＶＢ．．含有
量はＶＢ．■をジシアノ型とした後、ＵＶ値（ε：＋ａ
ｖ＝　３　０．　４　Ｘ　１　０　３Ｍ−’（Ｊ−’）
で測定した。

このＶＢ＋ｚ含有’ｔ＆１１を以下の分離精製の原料と
した。

あらかじめ１００％メタノール中で一晩浸漬しておいた
吸着樹脂アンバーライトＸＡＤ−２　　（口−ムアンド
ハース社製）５０ｍ６をカラム（内径２ｃｆｆｉφ、高
さ１６ｃｍ）に充填し脱気純水で置換し、？着樹脂の前
処理を完了した。次いで前記のＶＢｌ■含有液を脱気し
た後、アンバーライトＸＡＤ−２充填カラムに通液し、
ＶＢ．■を吸着させた。ＶＢ＋２含有液を全量通液した
後、脱気した０．３重量％シアン化カリウム溶液（ｐ　
Ｈ６．５）　　ｌ　Ｏ　Ｏｍｌを５０℃に加温しながら
通液し、Ｖ　Ｂ　＋　ｔのモノシアノ化を行った。次に
、脱気純水４　０　０ｍｌを通液して非吸着性の夾雑物
質を排除し、続いて１００％メタノーノレ２　５　０ｍ
ｌを通液してＶＢ．■を冫容離した。このＶＢ＋！？容
離液をロータリーエバボレーター（４０℃）によって蒸
発乾固させ、ＶＢ．■粗精製品を得た。

次に、このＶＢＩ！粗精製品を０．０５Ｍグリシン０．
０１Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）１０ｍｌで
溶解し、その内のｌｍｊ２をあらかしめ同一の緩衝液で
常法にしたがって平衡化させてあるロＡＥ−Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ　Ａ−２５　（ファルマシア社製〉のカラム（内
径１ｃｌｌφ、高さ１２ｃｍ）に流速０．　３　ｍ　＃
　／ｍ　ｉ　ｎ　（２　３ｃＩＭ／　ｈ）で通液して吸
着させた。引き続いて当該緩衝液を吸着時と同一流速で
１時間？１　８ｍＡ）通液した後、４時間をかけて緩衝
液中の塩化ナトリウム濃度を０．ＯＩＭから０．１Ｍと
する線形濃度勾配を与え、Ｖ　Ｂ　＋　２を各々の誘導
体に分離して溶出させた。

図面は本実施例におけるイオン交換クロマトグラフィー
のクロマトグラムを示しており、図面において横軸はフ
ラクション思を示し、■フラクションあたりの液量は３
．Ｑ　ｍ　ｌである。左側の縦軸は波長３　６　０　ｎ
ｍの吸光度を示し、右側の縦軸は塩化ナトリウムの濃度
を示している。また、図の上部に記入した物質名はＶＢ
Ｉｆｆｉ誘導体の名称であり、各々の物質の溶出した位
置を示している。

図面に示すフラクションＮ［１３〜６、Ｎ［１９〜ｌ２
、およびｌｔ１４〜２２を各々集め、常法にしたがって
Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１５　（ファルマシア社製）で
脱塩し、ＶＢ１２精製品を得た。

得られたＶＢ＋ｚ精製品について電気泳動と高速液体ク
ロマトグラフィーにより、誘導体の同定を行ったところ
、図面における寛３〜６の画分が■Ｂ１２ファクター■
、弘９〜１２の両分がＶＢ＋ｚフ？クターＢであり、階
１４〜２２の画分がコビリン酸であることが分かった。

各々の誘導体の収量は、ＶＢ，ファクターＩＩ１　１．
４ｍｇ／ｌ一原料Ｖ　Ｂ　＋　ｔ含有液、■Ｂ１２ファ
クターＢ２．６■／１一原料ＶＢ，．含有液、コビリン
酸２．６ｒｒｇｌ１一原料ＶＢ１２含有液であった。

【図面の簡単な説明】

図面は実施例におけるイオン交換クロマトグラフィーの
クロマトグラムを示す． フラクションＮＯ．

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ビタミンＢ＿１２およびその誘導体を生産する能力を有
   する微生物の培養液からビタミンＢ＿１２およびその誘
   導体を分離、回収するにあたり、当該培養液に必要に応
   じて抽出などの前処理を施してビタミンＢ＿１２および
   その誘導体を比較的高濃度に含有する溶液を得た後、当
   該含有液をスチレン−ジビニルベンゼン共重合体よりな
   るイオン交換能を有しない吸着樹脂に接触させてビタミ
   ンＢ＿１２およびその誘導体を吸着させ、次いで該吸着
   樹脂からビタミンＢ＿１２およびその誘導体を有機溶媒
   を用いて溶離し、さらに該溶離液中の有機溶媒を除いた
   後、当該溶離液をアルカリ性とし、あらかじめアルカリ
   性の溶液で処理した親水性母体の陰イオン交換樹脂に接
   触させてビタミンＢ＿１２およびその誘導体を吸着させ
   、次いでアルカリ性条件下で塩溶液の塩濃度を順次上昇
   させながら、当該塩溶液を前記陰イオン交換樹脂に接触
   させることにより、ビタミンＢ＿１２およびその誘導体
   を分離、脱着することを特徴とするビタミンＢ＿１２お
   よびその誘導体の分離回収方法。