SU721449A1 - Способ получени сорбента дл выделени и очистки сериновых протеаз - Google Patents

Description

(54) СПСХЗОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕАЗ исходного сырь  (сефарозы и микробные ингибиторы сериновых протеаз в Советском Союзе не производ тс ), многостадийность приготовлени  сорбента. Целью изобретени   вл етс  увеличение .селективности сорбции сериновых протеаз. Поставленна  цель достигаетс  путем использовани  природного полисахарида-хитина , который после предварительнрго измельчени  деминерализуют 3-6 к. |НС2: и отмьгоают водой. Предлагаетс  способ получени  сорбента дл  выделени  и очистки сериновых протеаз, заключающийс  в том, что природный полисахарид-хитин измельчают отбирают фракцию с диаметром частиц О,,4 мм, обрабатывают 3-6 н. НС и промьшают водой до нейтрального зна чейи  рН. Дл  приготовлени  сорбента прбд;7агаемым способом употребл ют широкораспространенный природный хитин. В С ветском Союзе хитин получают в больших количествах как отход производства до .насто щего веремени он не находил широкого практического применени . Полученный сорбент  вл етс  стабильным как механически, так и химически. На нем можно проводить неограниченное число операций очистки сериновых про- теаз. При очистке сериновых протеаз на сорбенте, приготовленном согласно изобретению , удельна  протеолитическа  активность сериновых протеаз из Вас. sula tikis увеличиваетс  4-5 раза, а активность оС -химотрипсина и трипсина - в 2-,5 разаза одну операцию сорбциидесорбции . Благодар  легкой доступности хитина простоте приготовлени  и долговечности в работе сорбента и благодар  достигае мому положительному эффекту при его и пользовании предлагаемый способ  вл ет с  перспективным, .дешевым .дл  примене ни  в крупномасштабном производстве. Предлагаемый способ приготовлени  хитина позвол ет повысить сорбционную емкость сериновых протеаз, при этом удельна  активность сериновых протеаз за одну стадию сорбции-десорбции повышаетс  в 4-5 раз. Выходы по белку и активности составл ют 8О-1ОО%. По сущности процесса сорбции сери ювых протеаз ирш-отовленный предлагае мым способом хитин  вл етс  а})финньгм сорбентом. Пример 1. Обработка хитина. Хитин (ч.МРТУ 6-О9-5 113-68) измельчают , просеивают через набор сит, отбирают фракции с размером частиц 0,3 мм, обрабатьгоают при комнатной температуре 6 н. НСв до прекращени  выделени  СО..- , перемешива  механической мешалкой. Смесь фильтруют через стекл нный фильтр, промьгеают 6 н. НС, а затеммногократно дистиллированной водой, теплыми (50°С) 1%-ными растворами NoC2 и СН„ СООН, дистиллированной водой. П р и м е р 2. Выделение и очистка микробных сериновых протеаз. 6 г хитина, приготовленного, как описано в примере 1, загружают в колонку (1,5x20 см), уравновешенную 0,01М универсальным буфером рН 7,5, и нанос т 4 мл раствора ферментного препарата протосубтилина ГЮх, полученного из Вас. диЪ11 13 в том же буфере рН 7,5. Концентраци  белка 3,О мг/мл, обща  удельна  протеолити- ческа  активность 1,3 ед/мг белка при рН 7,5 и 0,625 ед/мг белка при рН 9,5 (активность сериновых протеаз соответственно 0,24 ед/мг белка при.рН 7,5 и 0,22 ед/мг белка при рН 9,5). Протеолитическую активность во всех случа х определ ют модифицированным методом Ансона Активность сериновых протеаз .Вас. subtitis в протосубтилине ГЮх определ ют после обработки раствора ферментного препарата 0,О 1 М раствором ЭДТА, концентрацию белка - методом Лоури. При элюции 100 мл указанного буфера вымываютчз  металлопротеазы, цротеолитически неактивные белки и краcsuune вещества. Сериновые протеазы элюируютс  при повышении ионной силы линейн 11м градиентом хюристого натри  от О,О1 до 1,ОМ (по -ЮО мл) в том же буфере рН 7,5. Удельна  протеолитическа  активность сериновых протеаз после элюции - 1,28 ед/мг белка при рН 7,5 и 1,12 еп/мг белка при рН 9,5. Пример 3. Выделение и очистка сериновых протеаз животного происхождени . 2 мл раствора с( -химотрипсина (марка А, ТУ 6-О9-646-7 I, Олайнский завод химреактивов) в 0,0 1 М универсальном буфере рН 7,5, содержащего 34 мг/мл белка с удельной протеолитической активностью по казеинату натри  1.4 ед/мг белка, нанос т на колонку.

описанную в примере 2. При элюции 150 мл указанного буфера вымываютс  протеолитически неактивные белки. Л -Хиотрлпси  элюируетс  при повышении ионной силы элюирующего раствора, ана- логично примеру 2 в том же буфере рН 7,5. Удельна  протеолитическа  активность ос -химотрипсина после элюции 2,7 ед/мг белка.

Пример 4. 4 мл раствора трипсина (марка В, Олайнский завод химреактивов ) в 0,0 1 М универсальном буфере рН 7,5 нанос т на колонку , описанную в примере 2. Концентраци  белка 18 мг/мл, удельна  протеолитическа  активность трипсина по казеинату натри  0,9 ед/мг белка. При элюции 15О мл указанного буфера вымываютс  протеолитически неактивные белки. Трипсин элюируетс  при повышении ионной сипы элюи руюшего раствора аналогично примеру 2 в том же буфере рН 7,5. Удельна  протеолитическа  активность трипсина после элюции - 2,1 ед/мг белка.

Claims (3)

1. Патент США № 3331751, кл. 195-62, опублик. 1967.

2; LaveC.R.,Dean P.D.G. Affinilv chro. otpg P it-Of 3orrr, 134, 1974.

3.«S.SGto, S.Muroo. Preparation of 1mmcsbjtized Protease iMhibiior (s-sj) and application to Ensvme ourii AgK B«ot Chem.39,2« 415, 1975 (прототип;.